抗微生物劑的制作方法

專利名稱：抗微生物劑的制作方法
抗微生物劑本發(fā)明涉及具有改進(jìn)的針對革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌作用的修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體。所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體包含細(xì)胞內(nèi)溶素以及融合于該細(xì)胞內(nèi)溶素的陽離子肽，從而增強(qiáng)了所述細(xì)胞內(nèi)溶素的陽離子性(cationicity)。本發(fā)明還涉及用包含下述核酸序列的核酸轉(zhuǎn)化的微生物，所述核酸序列編碼具有增強(qiáng)的陽離子性的修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素。本發(fā)明還涉及使用下述微生物作為生產(chǎn)生物產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)溶素變體的方法，所述微生物經(jīng)編碼根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的核酸轉(zhuǎn)化。具體而言，本發(fā)明涉及下述細(xì)胞內(nèi)溶素變體，所述變體包含融合了具有膜或LPS 破壞活性的肽段(peptide stretch)的細(xì)胞內(nèi)溶素。而且，本發(fā)明涉及編碼所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的核酸分子、包含所述核酸分子的載體以及包含所述核酸分子或所述載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生所述細(xì)胞內(nèi)溶素變體的方法。此外，本發(fā)明涉及所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體用作藥物，特別是用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌感染，用作診斷手段、消毒劑或作為美容用物質(zhì)。本發(fā)明還涉及去除或減少或防止食品或食物加工裝置、食品加工廠、與食品相接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院和手術(shù)中的表面的革蘭氏陰性細(xì)菌污染。此外，本發(fā)明涉及所述細(xì)胞內(nèi)溶素變體作為診斷手段在醫(yī)學(xué)、食物或飼料或環(huán)境診斷中的用途。最后，本發(fā)明涉及包含所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的藥物組合物。細(xì)胞內(nèi)溶素為噬菌體(或細(xì)菌的病毒)編碼的肽聚糖水解酶。其在噬菌體復(fù)制的裂解周期中的晚期基因表達(dá)過程中合成，并通過降解細(xì)菌肽聚糖來介導(dǎo)后代病毒體從受感染的細(xì)胞的釋放。其為β (1，4)_糖基化酶(溶菌酶)、轉(zhuǎn)糖基酶、酰胺酶或內(nèi)肽酶。細(xì)胞內(nèi)溶素的抗微生物應(yīng)用已經(jīng)在1991年由Gasson(GB2243611)提出。盡管細(xì)胞內(nèi)溶素的殺滅能力久為人知，由于抗生素的成功和主宰地位，忽略了這些酶作為抗細(xì)菌劑的用途。僅在多重抗生素抗性細(xì)菌出現(xiàn)后，用細(xì)胞內(nèi)溶素對抗人類病原體這一簡單概念方才受到注意。出現(xiàn)了令人矚目的開發(fā)全新類型的抗細(xì)菌劑的需求，且用作酶抗生素(enzybiotics)( “酶” 和“抗生素”的組合術(shù)語)的細(xì)胞內(nèi)溶素完美地符合該需求。在2001年，F(xiàn)ischetti及其同事首次闡明了噬菌體Cl細(xì)胞內(nèi)溶素對A組鏈球菌的治療潛力(Nelson等，2001)。從此， 多份公開物確立了細(xì)胞內(nèi)溶素作為控制細(xì)菌感染，特別是革蘭氏陽性細(xì)菌的有吸引力和補(bǔ)充的替代手段。接著，證明了針對其他革蘭氏陽性病原體如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) (Loeff Ier 等，2001)、炭 Iil 芽 3 If 菌(Bacillus anthracis) (Schuch 等， 2002)、無乳鏈球菌(S. agalactiae) (Cheng 等，200 和金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus) (Rashel等，2007)的不同細(xì)胞內(nèi)溶素作為酶抗生素的效力?，F(xiàn)在，細(xì)胞內(nèi)溶素療法最重要的挑戰(zhàn)在于革蘭氏陰性細(xì)菌由于外膜屏蔽細(xì)胞內(nèi)溶素接近肽聚糖而對細(xì)胞內(nèi)溶素的外源作用不敏感。這一點(diǎn)現(xiàn)在阻止了細(xì)胞內(nèi)溶素的有效范圍擴(kuò)張至重要的革蘭氏陰性病原體。革蘭氏陰性細(xì)菌具有外膜，其特點(diǎn)為特征性的不對稱雙分子層。外膜的雙分子層由含有磷脂(主要為磷脂酰乙醇胺)的內(nèi)側(cè)單分子層和主要由單一糖脂——脂多糖(LPS) 構(gòu)成的外側(cè)單分子層組成。在細(xì)菌界，LPS結(jié)構(gòu)具有廣闊的多樣性，且LPS結(jié)構(gòu)可響應(yīng)主導(dǎo)的環(huán)境條件而受到修飾。LPS層的穩(wěn)定性以及不同LPS分子之間的相互作用主要通過二價(jià)離子(Mg2+、Ca2+)與LPS分子的陰離子組分(脂質(zhì)A中的磷酸基團(tuán)和KDO的內(nèi)核和羧基基團(tuán)) 的靜電相互作用達(dá)成。因此，陽離子結(jié)合位點(diǎn)對于外膜的完整性是必需的(Vaara，1992)。 聚陽離子劑如聚-L-賴氨酸聚合物(至少20個(gè)殘基的)通過置換這些起穩(wěn)定作用的二價(jià)陽離子來增加外膜的滲透性。此外，它們施加了所謂“自促攝入(self-promoted uptake)” 機(jī)理(Hancock和Wong，1984)。由于其體積龐大，其破壞了外膜的正常屏障功能，并產(chǎn)生暫時(shí)的裂縫，從而促進(jìn)其自身的攝入(Vaara和Vaara，1983)。此外，由于缺乏不飽和脂肪酸所致，脂質(zhì)A疏水部分的密集而有序的包裝形成具有高粘性的剛性結(jié)構(gòu)。這使其較不易被親脂性分子滲透，并賦予外膜(OM)額外的穩(wěn)定性。然而，微生物對抗生素抗性的增加對治療愈來愈多的細(xì)菌導(dǎo)致的感染造成了困難。具體的困難出現(xiàn)于由革蘭氏陰性細(xì)菌如銅綠假單胞菌O^seudomonas aeruginosa)和腸桿菌科細(xì)菌(Enterobacteriaceae)導(dǎo)致的感染。因此，有對針對革蘭氏陰性細(xì)菌的新型抗微生物劑的需要。該目標(biāo)通過權(quán)利要求中限定的主題所解決。下述附示了本發(fā)明。

圖1是顯示重組產(chǎn)生(POLY)n_gpl44((POLY)n_KZ144)的質(zhì)粒構(gòu)建的概略性綜述。 之前，通過 TAIL· PCR 構(gòu)建了 pEXP5CT/P0LY-gpl44(pEXP5CT/P0LY-KZ144)(在 5，TAIL 引物中帶有BamHI限制性位點(diǎn)和第一聚陽離子盒)。將質(zhì)粒用BamHI直鏈化，脫磷酸并與含有粘性BamHI末端的盒連接。該盒來源于兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸的雜交，并編碼9個(gè)荷正電的殘基。 在第一和第二盒的連接位點(diǎn)制造一個(gè)附加的正電精氨酸殘基，以及一個(gè)絲氨酸。類似地，通過重復(fù)的循環(huán)構(gòu)建更長的 PEXP5CT/ (POLY)n-gp 144 (pEXP5CT/ (POLY)n-KZ 144)變體。圖2顯示巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的P0LY_gpl44表達(dá)和分泌。將巴斯德畢赤酵母X33表達(dá)培養(yǎng)物的30 μ 1量的上清[1日之后(方形)，3日之后(三角形) 和4日之后(圓形)]添加至270 μ 1經(jīng)氯仿滲透的銅綠假單胞菌PAOlp細(xì)胞。緩沖液環(huán)境為P0LY-gpl44的最適酶環(huán)境(KH2P04/K2HP04) I = 120mMpH 6. 2)。隨后，通過分光光度法記錄吸光度。吸光度的下降指示巴斯德畢赤酵母的溶壁酶(muralytic enzyme)的分泌。作為陰性對照，包括了無表達(dá)質(zhì)粒的巴斯德畢赤酵母X33(菱形)。圖3在圖示中顯示了未經(jīng)修飾的phiKZgpl44和ELgp 188細(xì)胞內(nèi)溶素，包含含有9 個(gè)荷正電的氨基酸殘基的肽段的修飾變體P0LY-gpl44和P0LY-gpl88以及包含含有18個(gè)荷正電的氨基酸殘基的肽段的修飾變體(POLY)2-gpl44和(POLY)2-gpl88對銅綠假單胞菌 PAOlp細(xì)胞的抗菌活性。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖4顯示經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE的照片，顯示未經(jīng)修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素PSP3gplO 及其修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體PKPSP3gplO的表達(dá)和純化結(jié)果。LMW泳道為大小標(biāo)記(LMW 梯型分子量標(biāo)記)。之后的三個(gè)泳道為M2+親和層析之后純化蛋白在洗脫緩沖液(20mM NaH2PO4-NaOH pH7. 4 ；0. 5M NaCl ；500mM咪唑)中的蛋白質(zhì)級(jí)分。泳道FT為流過物而泳道 W為廢級(jí)分。在純化的蛋白質(zhì)級(jí)分中僅可見很少的次級(jí)條帶，表明重組蛋白的高純度(> 90% )。圖5中A至D顯示未經(jīng)修飾的PSP3gplO和經(jīng)修飾的PKPSP3gplO在不同組合物中在室溫不振蕩的條件下溫育之后針對幾種指數(shù)生長期間的革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性的圖示。每個(gè)菌種的革蘭氏陰性細(xì)菌用包含0.5mM EDTA但不含細(xì)胞內(nèi)溶素的組合物、包含1. 315 μ M未經(jīng)修飾的PSP3gplO但不含EDTA的組合物、包含1. 315 μ M修飾的PKPSP3gplO 但不含EDTA的組合物、包含1. 315 μ M未經(jīng)修飾的PSP3gplO和0. 5mM EDTA的組合物以及包含1. 315 μ M修飾的PKPSP3gplO和0. 5mM EDTA的組合物溫育30分鐘。在圖5A中，表示了針對銅綠假單胞菌PAOlp細(xì)胞的抗菌活性，在圖5B中表示了針對銅綠假單胞菌Br667細(xì)胞的抗菌活性，在圖5C中表示了針對大腸桿菌(E.coli)WK 6細(xì)胞的抗菌活性，而在圖5D 中表示了針對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)細(xì)胞的抗菌活性。“Δ”給出了對應(yīng)的PSP3gplO和PKPSP3gplO樣品之間的活性差異。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6顯示了經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE的照片，顯示未經(jīng)修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素P2gp09 及其修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體PKP2gp09的表達(dá)和純化結(jié)果。LMW泳道為大小標(biāo)記(LMW梯型分子量標(biāo)記)。之后的三個(gè)泳道為M2+親和層析之后純化蛋白在洗脫緩沖液(20mM NaH2PO4-NaOH pH7. 4 ；0. 5M NaCl ；500mM咪唑)中的蛋白質(zhì)級(jí)分。泳道FT為流過物而泳道 W為廢級(jí)分。在純化的蛋白質(zhì)級(jí)分中僅可見很少的次級(jí)條帶，表明重組蛋白的高純度(> 95% )。圖7的A至F顯示未經(jīng)修飾的P2gp09和經(jīng)修飾的PKP2gp09在不同組合物中在室溫不振蕩的條件下溫育之后針對幾種指數(shù)生長期間的革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性的圖示。每個(gè)菌種的革蘭氏陰性細(xì)菌用包含0.5mM EDTA但不含細(xì)胞內(nèi)溶素的組合物、包含 1. 315 μ M未經(jīng)修飾的P2gp09但不含EDTA的組合物、包含1. 315 μ M經(jīng)修飾的PKP2gp09但不含EDTA的組合物、包含1. 315 μ M未經(jīng)修飾的P2gp09和0. 5mM EDTA的組合物以及包含 1. 315 μ M經(jīng)修飾的PKP2gp09和0. 5mM EDTA的組合物溫育30分鐘。在圖7A中，表示了針對銅綠假單胞菌PAOlp細(xì)胞的抗菌活性，在圖7B中表示了針對銅綠假單胞菌Br667細(xì)胞的抗菌活性，在圖7C中表示了針對大腸桿菌(E. coli)WK 6細(xì)胞的抗菌活性，在圖7D中表示了針對類鼻疽伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia pseudomallei)細(xì)胞的抗菌活性，在圖7E 中表示了針對惡臭假單胞菌O^seudomonas putida)Gl細(xì)胞的抗菌活性而在圖7F中表示了針對鼠傷寒沙門氏菌LT2 (SGSC N0 2317)細(xì)胞的抗菌活性?！?Δ ”給出了對應(yīng)的P2gp09和 PKP2gp09樣品之間的活性差異。誤差棒代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖8顯示了經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE的照片，顯示未經(jīng)修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素 OBPgpLYS及其修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體I3KOBPgpLYS的表達(dá)和純化結(jié)果。LMW泳道為大小標(biāo)記(LMW梯型分子量標(biāo)記)。之后的三個(gè)泳道為M2+親和層析之后純化蛋白在洗脫緩沖液 (20mM NaH2PO4-NaOH pH7. 4 ；0. 5M NaCl ；500mM咪唑)中的蛋白質(zhì)級(jí)分。泳道FT為流過物而泳道W為廢級(jí)分。在純化的蛋白質(zhì)級(jí)分中僅可見很少的次級(jí)條帶，表明重組蛋白的高純度(> 90% )。圖9的A至F顯示未經(jīng)修飾的OBPgpLYS和經(jīng)修飾的I3KOBPgpLYS的不同組合物在室溫不振蕩的條件下溫育之后針對幾種指數(shù)生長期間的革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性的圖示。每個(gè)菌種的革蘭氏陰性細(xì)菌用包含0.5mM EDTA但不含細(xì)胞內(nèi)溶素的組合物、包含 1. 315 μ M未經(jīng)修飾的OBPgpLYS但不含EDTA的組合物、包含1. 315 μ M經(jīng)修飾的PKOBPgpLYS 但不含EDTA的組合物、包含1. 315 μ M未經(jīng)修飾的OBPgpLYS和0. 5mM EDTA的組合物以及包含1. 315 μ M經(jīng)修飾的I3KOBPgpLYS和0. 5mM EDTA的組合物溫育30分鐘。在圖9A中，表示了針對大腸桿菌WK 6細(xì)胞的抗菌活性，在圖9B中表示了針對鼠傷寒沙門氏菌LT2(SGSC N0 2317)細(xì)胞的抗菌活性，在圖9C中表示了針對銅綠假單胞菌PAOlp細(xì)胞的抗菌活性，在圖9D中表示了針對銅綠假單胞菌Br667細(xì)胞的抗菌活性，在圖9E中表示了針對惡臭假單胞菌Gl細(xì)胞的抗菌活性而在圖9F中表示了針對類鼻疽伯克霍爾德氏菌細(xì)胞的抗菌活性。 “ Δ ”給出了對應(yīng)的OBPgpLYS和I3KOBPgpLYS樣品之間的活性差異。誤差棒代表平均值的標(biāo)
準(zhǔn)偏差。如本文中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)/蛋白”與術(shù)語“多肽”所指相同。本文中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)/蛋白”指氨基酸殘基通過肽鍵以特定順序連接的直鏈聚合物。蛋白的氨基酸殘基可通過例如共價(jià)附著多種基團(tuán)如糖和磷酸來修飾。其他的物質(zhì)如血紅素或脂質(zhì)可更松散的與多肽鏈相聯(lián)系，得到偶合的蛋白，其也包含于本文中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)/蛋白”中。 有多種方式闡明多肽鏈的折疊，特別是針對α螺旋和β折疊片。如本文中使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)/蛋白”指所有四種類型的蛋白，即全α、全β、α/β和α加上β (aplus^)0如本文中使用的術(shù)語“融合蛋白”指由兩個(gè)核酸序列融合所得的表達(dá)產(chǎn)物。上述蛋白可例如在重組DNA表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。而且，如本文中使用的術(shù)語“融合蛋白”指第一氨基酸序列特別是細(xì)胞內(nèi)溶素、自溶素和/或其他肽聚糖水解酶與第二或更進(jìn)一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更進(jìn)一步的氨基酸序列優(yōu)選為肽段，特別是陽離子肽和/或聚陽離子肽。優(yōu)選地，所述第二和/或更進(jìn)一步的氨基酸序列對于所述第一氨基酸序列為外源的，并且不與第一氨基酸序列的任何域?qū)嵸|(zhì)上同源。本文中使用的術(shù)語“修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體”與術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)溶素變體”所指相同。 兩個(gè)術(shù)語均指包含細(xì)胞內(nèi)溶素和肽段特別是陽離子肽和/或聚陽離子肽的融合蛋白。如本文中使用的術(shù)語“肽段”指任何類型的連接于蛋白如細(xì)胞內(nèi)溶素、自溶素和/ 或肽聚糖水解酶的肽。具體而言如本文中使用的術(shù)語“肽段”指陽離子肽和/或聚陽離子肽。然而，在本發(fā)明的含義中，肽段并不指His標(biāo)記、Str印標(biāo)記、Avi標(biāo)記、Myc標(biāo)記、Gst 標(biāo)記、JS標(biāo)記、半胱氨酸標(biāo)記、FLAG標(biāo)記或本領(lǐng)域已知的其他標(biāo)記，硫氧還蛋白或者麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)。與如本文中使用的術(shù)語“肽段”相對，術(shù)語“標(biāo)記”指可用于促進(jìn)多肽的表達(dá)和/或親和純化，將多肽固定于表面或者充當(dāng)標(biāo)志物或標(biāo)簽部分以供檢測多肽(例如通過在不同的ELISA測定形式中的抗體結(jié)合)的肽，只要使該標(biāo)記可用于上述列舉的輔助作用之一的功能并非由所述肽所荷的正電荷所致即可。然而，His標(biāo)記可能取決于相應(yīng)的pH， 亦可荷正電，但卻是因?yàn)槠浣Y(jié)合于固定化的二價(jià)陽離子而用作親合純化工具而并非用作根據(jù)本發(fā)明的肽段。如本文中使用的術(shù)語“肽”指由約2至約100個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約4至約50 個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約5至30個(gè)氨基酸殘基組成的短多肽，其中一個(gè)氨基酸殘基的氨基基團(tuán)通過肽鍵連接于另一個(gè)氨基酸殘基的羧基基團(tuán)。肽可具有特定功能。肽可為天然存在的肽或合成設(shè)計(jì)和產(chǎn)生的肽。所述肽可例如通過酶法或化學(xué)剪切來源于天然蛋白或從天然蛋白移出，或者可使用常規(guī)的肽合成技術(shù)(例如，固相合成)或分子生物學(xué)技術(shù)(參見 Sambrook,J.等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))來制備。優(yōu)選的合成產(chǎn)生的肽為例如陽離子肽或聚陽離子肽。如本文中使用的術(shù)語“陽離子肽”指具有荷正電的氨基酸殘基的肽。優(yōu)選地，陽離子肽具有9.0或更高的pKa值。通常，所述陽離子肽的至少四個(gè)氨基酸殘基可荷正電，例如為賴氨酸或精氨酸?！昂烧姟敝杆霭被釟埢膫?cè)鏈在接近生理?xiàng)l件下具有凈正電荷。如本文中使用的術(shù)語“陽離子肽”還指聚陽離子肽。如本文中使用的術(shù)語“聚陽離子肽”指主要由荷正電的氨基酸殘基特別是賴氨酸、 精氨酸和/或組氨酸殘基(更優(yōu)選賴氨酸和/或精氨酸殘基)構(gòu)成的合成設(shè)計(jì)和產(chǎn)生的肽。 如果氨基酸殘基的至少約20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或約100%是荷正電的氨基酸殘基，特別是賴氨酸和/或精氨酸殘基，則肽主要由荷正電的氨基酸殘基構(gòu)成。作為不荷正電的氨基酸殘基的氨基酸殘基可為電中性的氨基酸殘基和/或荷負(fù)電的氨基酸殘基和/或疏水氨基酸殘基。優(yōu)選地，作為不荷正電的氨基酸殘基的氨基酸殘基為電中性的氨基酸殘基，特別是絲氨酸和/或甘氨酸。本文中使用的術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)溶素”指適于水解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶?！凹?xì)胞內(nèi)溶素”包含至少一個(gè)具有至少一個(gè)下述活性的“酶活性域(EAD) ”:內(nèi)肽酶、N-乙?；?胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、N-乙?；邗０访?、N-乙?；?氨基葡萄糖苷酶(溶菌酶) 或轉(zhuǎn)糖基酶。此外，所述細(xì)胞內(nèi)溶素還可含有不具酶活性并結(jié)合于宿主細(xì)菌細(xì)胞壁的區(qū)，即所謂CBD (細(xì)胞壁結(jié)合域)。所述細(xì)胞內(nèi)溶素可含有一個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)CBD。然而，如本文中使用的術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)溶素”還指具有至少一個(gè)EAD但沒有CBD的酶。一般而言，細(xì)胞壁結(jié)合域能夠結(jié)合細(xì)菌表面上不同的組分。優(yōu)選地，所述細(xì)胞壁結(jié)合域?yàn)殡木厶墙Y(jié)合域并結(jié)合于細(xì)菌的肽聚糖。如本文中使用的術(shù)語“細(xì)胞壁”指所有構(gòu)成革蘭氏陰性細(xì)菌外細(xì)胞圍繞物 (enclosure)并由此確保其完整性的組分。具體而言，如本文中使用的術(shù)語“細(xì)胞壁”指肽聚糖、革蘭氏陰性細(xì)菌具有脂多糖的外膜、細(xì)菌細(xì)胞膜，但也指沉積于肽聚糖上的其他層例如被膜(capsule)、外蛋白層或粘液(slime)。如本文中使用的術(shù)語“自溶素”指與細(xì)胞內(nèi)溶素相關(guān)的酶，但其由細(xì)菌編碼并涉及例如細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁代謝。關(guān)于自溶素的綜述可見于“Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar ；32 (2) :259_86”。如本文中使用的術(shù)語“EAD”指細(xì)胞內(nèi)溶素的酶活性域。EAD負(fù)責(zé)水解細(xì)菌肽聚糖。 其呈現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)溶素的至少一種酶活性。EAD還可由超過一種酶活性模塊構(gòu)成。本文中使用的術(shù)語“EAD”與術(shù)語“催化域”同義。如本文中使用的術(shù)語“缺失”指從對應(yīng)的起始序列去除1、2、3、4、5或更多個(gè)氨基
酸殘基。如本文中使用的術(shù)語“插入”或“添加”指向?qū)?yīng)的起始序列插入或添加1、2、3、4、
5或更多個(gè)氨基酸殘基。如本文中使用的術(shù)語“取代”指用不同的氨基酸殘基替換位于某個(gè)位置的氨基酸殘基。本發(fā)明涉及針對革蘭氏陰性細(xì)菌的改進(jìn)的抗菌劑，在修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的情況下(in casu)，包含融合于具有破壞脂多糖(LPQ或一般性地破壞膜的活性的肽的細(xì)胞內(nèi)溶素。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要組分。其增加細(xì)胞膜的負(fù)電荷，并保護(hù)細(xì)胞膜免受某些種類的化學(xué)攻擊。某種程度上說，所述LPS也保護(hù)革蘭氏陰性細(xì)菌的膜免受從所述細(xì)菌外添加的細(xì)胞內(nèi)溶素的作用。然而，可通過具有LPS破壞活性的肽段如荷正電的肽來破壞LPS。而且，所述肽段可涉及外膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理，外膜結(jié)構(gòu)蛋白的去穩(wěn)定化和/或脂質(zhì)依存性去穩(wěn)定化。本發(fā)明的發(fā)明人令人意想不到地發(fā)現(xiàn)，具有LPS破壞活性或一般性膜破壞活性的肽段促進(jìn)融合于所述肽段的細(xì)胞內(nèi)溶素穿過革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜。在細(xì)胞內(nèi)溶素受到推進(jìn)穿過革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜之后，革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁可更易被細(xì)胞內(nèi)溶素破壞或崩解，這是由于肽聚糖層的降解繼以當(dāng)無法繼續(xù)對抗菌的胞內(nèi)壓力時(shí)發(fā)生的滲透裂解。因此，本發(fā)明涉及由具有降解革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的活性的細(xì)胞內(nèi)溶素和具有膜破壞活性的肽段構(gòu)成的融合蛋白，其中所述肽段在N端和/或C端融合于酶。本發(fā)明的所述融合蛋白也可稱為修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體或簡稱為細(xì)胞內(nèi)溶素變體或修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素。修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的細(xì)胞內(nèi)溶素部分優(yōu)選由對革蘭氏陰性細(xì)菌具有特異性的噬菌體編碼，所述革蘭氏陰性細(xì)菌如包含人或動(dòng)物病原性菌株的細(xì)菌組(group)、科、 屬或種的革蘭氏陰性細(xì)菌，如腸桿菌科(埃希氏菌屬Escherichia)特別是大腸桿菌、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬Shigella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)特別是肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、摩根氏菌屬(Morganella)、 變形桿菌屬(Proteus)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、沙雷氏菌屬(krratia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia))、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(假單胞菌屬(Pseudomonas) 特別是銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、伯克霍爾德氏菌屬(BurW10Ideria)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鞘胺酉享單胞菌屬(Sphingomonas)、 叢毛單胞菌屬(Comamonas))、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、 弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、博德特氏菌屬(Bordetella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、考克斯氏體屬(Coxiella)、嗜血菌屬(Haemophilus)、巴斯德氏菌屬 (Pasteurella)、曼氏菌屬(Mannheimia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、力口德納氏菌屬(Gardnerella)、螺旋體科(Spirochaetaceae)(密螺旋體屬(Treponema)禾口疏螺旋體屬(Borrelia))、鉤端螺旋體科(Leptospiraceae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、螺菌屬(Spirillum)、鏈桿菌屬(Str印tobacillus)、類桿菌科 (Bacteroidaceae)(類桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、普雷沃氏菌屬 (Prevotella)、口卜啉單胞菌屬(Porphyromonas))、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、特別是鮑氏不動(dòng)桿菌(A. baumanii)。而且，所述細(xì)胞內(nèi)溶素優(yōu)選具有針對下述革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁降解活性，所述革蘭氏陰性細(xì)菌為包含人或動(dòng)物病原性菌株的細(xì)菌組(group)、科、屬或種的革蘭氏陰性細(xì)菌，如腸桿菌科(埃希氏菌屬特別是大腸桿菌、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、 愛德華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬特別是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌屬、 變形桿菌屬、普羅維登斯菌屬、沙雷氏菌屬、耶爾森氏菌屬)、假單胞菌科(假單胞菌屬特別是銅綠假單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、希瓦氏菌屬、鞘胺醇單胞菌屬、叢毛單胞菌屬)、奈瑟氏菌屬、莫拉氏菌屬、弧菌屬、氣單胞菌屬、布魯氏菌屬、弗朗西斯氏菌屬、博德特氏菌屬、軍團(tuán)菌屬、巴爾通氏體屬、考克斯氏體屬、嗜血菌屬、巴斯德氏菌屬、曼氏菌屬、 放線桿菌屬、加德納氏菌屬、螺旋體科(密螺旋體屬和疏螺旋體屬)、鉤端螺旋體科、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、螺菌屬、鏈桿菌屬、類桿菌科(類桿菌屬、梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬、嚇啉單胞菌)、不動(dòng)桿菌屬、特別是鮑氏不動(dòng)桿菌。優(yōu)選地，所述細(xì)胞內(nèi)溶素部分來源于下表中所示的噬菌體或野生型細(xì)胞內(nèi)溶素
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其包含融合了具有膜或LPS破壞活性的肽段的細(xì)胞內(nèi)溶素。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述融合于所述細(xì)胞內(nèi)溶素的肽段是陽離子肽，更優(yōu)選為聚陽離子肽。
3.權(quán)利要求1或2的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述肽段包含至少一個(gè)選自下組的氨基酸殘基精氨酸、組氨酸和賴氨酸殘基，特別是精氨酸和賴氨酸殘基。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中包含于所述肽段中至少70% 的氨基酸殘基是精氨酸、組氨酸和/或賴氨酸殘基，特別是精氨酸和/或賴氨酸殘基。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述肽段包含約5至約100個(gè)氨基酸殘基，特別是約5至50個(gè)氨基酸殘基，特別是約5至30個(gè)氨基酸殘基。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述肽段融合于細(xì)胞內(nèi)溶素的 N和/或C端，特別是細(xì)胞內(nèi)溶素的N端。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述細(xì)胞內(nèi)溶素具有降解革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的活性，特別是降解選自下組的革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁的活性Iif禾4" (Enterobacteriaceae)，特別是埃希氏菌屬Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬 (Shigella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、摩根氏菌屬 (Morganel la)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、沙雷氏菌屬 (Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)，假單胞菌禾斗(Pseudomonadaceae),特別是假單胞菌屬O^seudomonas)、伯克霍爾德氏菌屬(BurW10Ideria)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、鞘胺醇單胞菌屬(Sphingomonas)和叢毛單胞菌屬(Comamonas),奈瑟氏菌屬(Neisseria)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、布魯氏菌屬(Brucella)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、博德特氏菌屬(Bordetella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、考克斯氏 WM (Coxiella) > Bf ifil^ M (Haemophilus) > E ΤK ^ M (Pasteurella) > M K^M (Mannheimia)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、加德納氏菌屬(Gardnerella)、螺旋體科 (Spirochaetaceae)，特別是密螺旋體屬(Ti^ponema)和疏螺旋體屬(Borrelia)，鉤端螺旋體科(Leptospiraceae)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬 (Helicobacter)、螺菌屬(Spirillum)、鏈桿菌屬(Streptobacillus),類桿菌科 (Bacteroidaceae)特別是類桿菌屬(Bacteroides)、梭桿菌屬(FuscAacterium)、普雷沃氏菌屬 (Prevotella)、口卜H|木單胞菌屬(Porphyromonas)，禾口不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，特別是鮑氏不動(dòng)桿菌(A. baumanii)。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述細(xì)胞內(nèi)溶素選自下組SEQ ID NO :1 的 phiKZgpl44、SEQ ID NO :2 的 ELgpl88、SEQ ID NO :3 的沙門氏菌屬細(xì)胞內(nèi)溶素、SEQ ID NO :4的腸桿菌噬菌體"Γ4細(xì)胞內(nèi)溶素、SEQ ID NO :5的鮑氏不動(dòng)桿菌細(xì)胞內(nèi)溶素， SEQ ID NO 6的大腸桿菌噬菌體KlF細(xì)胞內(nèi)溶素、SEQ ID NO 8的PSP3沙門氏菌細(xì)胞內(nèi)溶素和SEQ ID NO 9的大腸桿菌噬菌體P2細(xì)胞內(nèi)溶素。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述肽段包含至少一個(gè)KRK基序，特別是其中所述肽段包含選自下組的序列SEQ ID NO 10至30。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其中所述細(xì)胞內(nèi)溶素變體包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 35至49、53、57、62至64和66至78。
11.一種分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的核苷酸序列。
12.—種載體，其包含權(quán)利要求11的核酸分子。
13.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11的核酸分子或權(quán)利要求12的載體，其中所述宿主細(xì)胞特別是細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
14.一種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的方法，包括在權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述細(xì)胞內(nèi)溶素變體。
15.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其用作藥物、診斷手段、消毒劑或美容用物質(zhì)。
16.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體，其用作治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染的藥物。
17.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體用于去除、減少和/或防止食品、食物加工裝置、食品加工廠、與食品相接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院和手術(shù)中的表面的革蘭氏陰性細(xì)菌污染的用途。
18.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體作為診斷手段在醫(yī)療、食物或飼料或者環(huán)境診斷中的用途。
19.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞內(nèi)溶素變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及下述細(xì)胞內(nèi)溶素變體，所述變體包含融合了的具有膜或LPS破壞活性的肽段(peptide stretch)的細(xì)胞內(nèi)溶素。而且，本發(fā)明涉及編碼所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的核酸分子、包含所述核酸分子的載體以及包含所述核酸分子或所述載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生所述細(xì)胞內(nèi)溶素變體的方法。此外，本發(fā)明涉及所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體作為藥物，特別是用于治療或預(yù)防革蘭氏陰性細(xì)菌感染，作為診斷手段、消毒劑或作為美容用物質(zhì)的用途。本發(fā)明還涉及去除或減少或防止食品或食物加工裝置、食品加工廠、與食品相接觸的表面、醫(yī)療設(shè)備、醫(yī)院和手術(shù)中的表面的革蘭氏陰性細(xì)菌污染。此外，本發(fā)明涉及所述細(xì)胞內(nèi)溶素變體作為診斷手段在醫(yī)學(xué)、食物或飼料或環(huán)境診斷中的用途。最后，本發(fā)明涉及包含所述修飾的細(xì)胞內(nèi)溶素變體的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102197132SQ200980142373
公開日2011年9月21日 申請日期2009年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者伊維斯·布賴爾斯, 吉多·沃爾克凱爾特, 羅布·拉維格尼 申請人:勒芬天主教大學(xué)，K.U.勒芬R&D