結核病rv2386c蛋白、組合物及其用途的制作方法

專利名稱：結核病rv2386c蛋白、組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于治療或預防結核病(特別是用于治療或預防潛伏結核病以及預防或延緩結核病的再活化)的多肽和多核苷酸(以及涉及相關方法)。本發明進一步涉及包含所述多肽和多核苷酸的藥物和免疫原性組合物，以及涉及結核病(特別是潛伏結核病) 的診斷方法。
背景技術：
結核病(TB)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)和其它分枝桿菌種類的感染引起的慢性傳染疾病。它是世界上發展中國家的一種主要疾病，并成為發達區域日益嚴重的問題。超過20億人被認為感染了 TB桿菌，每年新增約920萬TB病例和 170萬死亡病例。其中10%感染TB桿菌的人會發展為活動性TB，每位患有活動性TB的人平均每年感染10-15其他人。盡管在全球的年均發病率已經達到頂峰，由于人口增長，死亡數和病例數依然在上升(World Health Organisation Tuberculosis Facts 2008)。結核分枝桿菌通過呼吸道途徑感染個體。肺泡巨噬細胞吸入該細菌，但它能夠通過抑制具有酸性溶酶體的吞噬體融合存活和增殖。隨后發生涉及CD4+和CD8+T細胞的復雜免疫應答，最終導致肉芽腫的形成。結核分枝桿菌成為病原體的關鍵在于該分離但未根除的細菌可長期存在，使得個體容易在隨后發展為活動性TB。在感染后的第一年，少于5%的感染個體會發展為活動性TB。該肉芽腫可存在數十年，并被認為在缺乏氧和營養的休眠狀態下包含活結核分枝桿菌。然而，最近表明，大部分處于休眠狀態的細菌位于遍布體內的非巨噬細胞的細胞類型中(Locht等人，Expert Opin. Biol. Ther. 20077(11) :1665-1677)。當宿主的天然免疫和病原體之間的平衡發生變化時(例如由于免疫抑制事件)則發展為活動性TB(Anderson P Trends in Microbiology 200715(1) :7-13 ；Ehlers S Infection 2009 37(2) :87-95)。也已提出描述潛伏TB和活動性TB之間的平衡的動力學假設(Cardana P-J Inflammation & Allergy-Drug Targets 2006 6 :27-39 ；Cardana P-J Infection 2009 37(2) :80-86)。盡管感染在相當長時間內可以是無癥狀的，活動性疾病最常顯現為肺的急性炎癥，從而導致疲勞、體重下降、發燒和持續咳嗽。如果未經治療，通常可導致嚴重的并發癥和死亡。結核病通常可采用長期抗生素療法進行控制，盡管該種治療并不足以防止該疾病的擴散。感染的個體可以是無癥狀的，但在一定時間具有傳染性。此外，盡管對治療方案的順應性是關鍵的，但患者的行為很難監測。一些患者并未完成治療周期，這可能導致無效治療和耐藥性的形成。多重耐藥性TB (MDR-TB)是一種對一線藥物沒有應答的形式。所有TB病例中有5% 是MDR-TB，每年估計有490，000新MDR-TB病例。當耐受針對MDR-TB開發的二線藥物時，產生廣泛耐藥TBO(DR-TB)。據估計每年產生40，000實際無法治療的)(DR-TB新病例(WorldHealth Organisation Tuberculosis Facts 2008)。即使完成抗生素治療的整個療程，結核分枝桿菌的感染可能無法從感染個體根除，并可保留為能夠再活化的潛伏感染。為了控制結核病擴散，對疾病的有效免疫和準確早期診斷是最為重要的。潛伏TB感染的診斷通常是采用結核菌素皮試來完成的，該皮試包括皮內暴露至結核菌素蛋白-純化的衍生物(PPD)。抗原特異性T細胞應答導致注射后在注射部位48-72 小時的可測量硬結，其表示暴露至分枝菌抗原。然而，該測試的靈敏度和特異性是一個問題，且接種了 BCG的個體并不能始終容易地與感染個體相區別(這對于BCG無法對潛伏感染形成保護的事實特別重要)。一般而言，已經接受BCG但未被結核分枝桿菌感染的個體顯示了直徑小于IOmm的PPD反應，而具有直徑在IOmm以上的PPD反應的人被認為已經被結核分枝桿菌感染。然而，這一原則不適用于由于HIV感染而免疫抑制的個體，后者可導致直徑小于IOmm的PPD反應；或者在發病地區，被非結核分枝桿菌感染的人能顯示直徑在IOmm 以上的PPD反應。近些年在體外基于T細胞的測定上已經取得了進展，該測定基于干擾素-gamma釋放并采用比PPD對結核分枝桿菌更具特異性的抗原，稱為ESAT-6和CFP-10。這些高特異性測試看來至少具有結核菌素皮試的靈敏度，且由于BCG接種而顯示更少的交叉反應性。有關潛伏 TB 診斷的最近綜述參見 Pai M 等人 Expert Rev. Mol. Diagn. 2006 6(3) :413_422。 然而，由于ESAT-6/CFP-10是初期抗原，基于ESAT-6/CFP-10的測定僅能在新近感染的人員中最佳實施。因此，與潛伏結核病特異性相關的新抗原的鑒定有助于能夠檢測更長期潛伏感染的更靈敏測定的開發。對于治療和預防結核病(特別是治療和預防潛伏TB以及預防TB的再活化)的有效策略存在著需求。發明綜述本發明總體涉及作為TB抗原(特別是與潛伏TB相關的抗原)的Rv2386c的鑒定， 并涉及預防和治療TB (尤其是預防和治療潛伏TB以及預防或延緩TB再活化)的相關方法和用途。本發明提供了分離的多肽，其包含(i) Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。本發明還提供了多肽，其包含
(i) Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該多肽用作藥劑。本發明另一方面涉及治療或預防TB的方法，其包括向有此需要的對象施用安全和有效量的多肽，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者
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(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；其中所述多肽誘導免疫應答，特別是抗結核分枝桿菌的免疫應答。多肽在用于制備治療或預防TB的藥物中的用途，該多肽包含
(i) Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該用途代表了本發明的另一方面。本發明提供了包含編碼多肽的核酸序列的分離多核苷酸，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。還提供了包含編碼多肽的核酸序列的分離多核苷酸，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該多核苷酸用作藥劑。本發明另一方面涉及治療或預防TB的方法，其包括向有此需要的對象施用安全和有效量的包含編碼多肽的核酸序列的多核苷酸，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；其中所述多核苷酸誘導免疫應答，特別是抗結核分枝桿菌的免疫應答。包含編碼多肽的核酸序列的多核苷酸在用于制備治療或預防TB的藥物中的用途，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該用途代表了本發明的另一方面。另外，提供了藥物組合物，其包含(a)多肽，其包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含編碼(a)的多肽的核酸序列的多核苷酸；以及(c)藥學上可接受的載體或賦形劑。進一步地，提供了免疫原性組合物，其包含(a)多肽，其包含(i)Rv2386c 蛋白序列；
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(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含編碼(a)的多肽的核酸序列的多核苷酸；以及(c)非特異性免疫應答增強劑。適當地，該藥物和免疫原性組合物包含了 Rv2386c和第二異種結核病抗原成分的組合。還提供了包含編碼多肽的核酸序列的表達載體，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。用所述表達載體轉化的宿主細胞構成了本發明進一步的方面。另外提供了重組表達多肽的宿主細胞，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。進一步提供了生產多肽的方法，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；所述方法包括在宿主細胞內重組表達所述多肽的步驟。另外提供了與多肽特異性結合的抗體或其片段，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。還提供了所述抗體在診斷中的用途(例如診斷結核病的方法，其包括在來自測試對象的生物樣本中確定與本發明多肽特異性結合的抗體或其片段的存在)。還提供了診斷試劑盒，其包含(a)本發明的多肽；(b)使所述多肽與來自個體的樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)充分接觸的設備；和(c)對樣本的T細胞應答進行定量的裝置。本發明的另一方面涉及診斷試劑盒，其包含(a)本發明的多肽；和(b)使所述多肽與患者的真皮細胞充分接觸的設備。在一個實施方式中，接受本發明的多肽、多核苷酸或組合物的對象可患有活動性結核病(例如被結核分枝桿菌活動性感染)。在第二實施方式中，該對象可具有潛伏結核病 (例如，被結核分枝桿菌潛伏感染)。在第三實施方式中，該對象可未患結核病(例如，未被結核分枝桿菌感染)。
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接受本發明的多肽、多核苷酸或組合物的對象可能之前已經進行結核接種(例如，針對結核分枝桿菌的感染接種)，例如已用卡介桿菌(BCG)接種。替代性地，接受本發明的多肽、多核苷酸或組合物的對象可未曾進行結核接種(例如，未針對結核分枝桿菌的感染接種)，例如未曾用卡介桿菌(BCG)接種。


圖1 在第21天(即，第二次接種后7天)來自免疫CB6F1小鼠的表達IFN-gamma 和/或IL-2和/或TNF-alpha細胞因子的⑶4和⑶8細胞的百分比。圖2 免疫CB6F1小鼠中抗原特異性⑶4應答在第21天(即，第二次接種后7天) 的細胞因子分布(profile)。圖3 免疫CB6F1小鼠中抗原特異性⑶8應答在第21天(即，第二次接種后7天) 的細胞因子分布。圖4:在第35天(即，第三次接種后7天)來自免疫CB6F1小鼠的表達IFN-gamma 和/或IL-2和/或TNF-alpha細胞因子的⑶4和⑶8細胞的百分比。圖5 免疫CB6F1小鼠中抗原特異性⑶4應答在第35天(即，第三次接種后7天) 的細胞因子分布。圖6 免疫CB6F1小鼠中抗原特異性⑶8應答在第35天(即，第三次接種后7天) 的細胞因子分布。圖7 在第21天(S卩，第二次接種后7天)來自免疫C57BL/6小鼠的表達IFN-gamma 和/或IL-2和/或TNF-alpha細胞因子的⑶4和⑶8細胞的百分比。圖8 免疫C57BL/6小鼠中抗原特異性⑶4應答在第21天(即，第二次接種后7 天)的細胞因子分布。圖9 免疫C57BL/6小鼠中抗原特異性⑶8應答在第21天(即，第二次接種后7 天)的細胞因子分布。列出的序列描述SEQ ID No 1 來自結核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No 2 來自結核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2386c的多核苷酸序列。SEQ ID No 3 來自結核分枝桿菌⑶C1551菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No 4 來自結核分枝桿菌Fll菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No 5 來自結核分枝桿菌Haarlem A菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No 6 來自結核分枝桿菌C菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQ ID No :7 來自 BCG 的 Rv2386c 的多肽序列。SEQ ID No 8 :Mtb8. 4 的多肽序列。SEQ ID No 9 :Mtb9. 8 的多肽序列。SEQ ID No 10 :Mtb9. 9 的多肽序列。SEQ ID No 11 :Ral2 的多肽序列。SEQ ID No 12 :Ra35 的多肽序列。SEQ ID No 13 :TbH9 的多肽序列。SEQ ID No 14 :Mtb40 的多肽序列。
SEQID N。15Mtb41的多肽序歹0。
SEQID N。16ESA／一6的多肽序歹0。
SEQID N。17Ag85A的多肽序歹0。
SEQID N。18Ag85B的多肽序歹0。
SEQID N。19alpha一晶體蛋白的多肽序列。[Ol 27] SEQID N。20MP／64的多肽序歹0。[Ol 28] SEQID N。2lMtb32A的多肽序歹0。[Ol 29] SEQID N。22Ser／Ala突變成熟Mtb32A的多肽序列。
SEQID N。23／BIO．4的多肽序歹0。
SEQID N。24Mtb72f的多肽序歹0。
SEQID N。25M72的多肽序歹0。[Ol 33] SEQID N。26Mtb7if的多肽序歹0。[Ol 34] SEQID N。27M92融合體的多肽序列。[Ol 35] SEQID N。28M103融合體的多肽序列。[Ol 36] SEQID N。29M114融合體的多肽序列。
SEQID N。30推定人CD4細胞表位l。
SEQID N。3l推定人CD4細胞表位2。
SEQID N。32推定人CD4細胞表位3。
SEQID N。33推定人CD4細胞表位4。
SEQID N。34推定人CD4細胞表位5。
SEQID N。35推定人CD4細胞表位6。
SEQID N。36推定人CD4細胞表位7。
SEQID N。37推定人CD4細胞表位8。
SEQID N。38推定人CD4細胞表位9。
SEQID N。39推定人CD4細胞表位lo。
SEQID N。40推定人CD4細胞表位11。
SEQID N。4l推定人CD4細胞表位12。
SEQID N。42推定人CD4細胞表位13。
SEQID N。43推定人CD4細胞表位14。
SEQID N。44推定人CD4細胞表位15。
SEQID N。45推定人CD4細胞表位16。
SEQID N。46推定人CD4細胞表位17。
SEQID N。47推定人CD4細胞表位18。
SEQID N。48推定人CD4細胞表位19。
SEQID N。49推定人CD4細胞表位20。
SEQID N。50推定人CD4細胞表位2l。
SEQID N。5l推定人CD4細胞表位22。
SEQID N。52推定人CD4細胞表位23。
SEQID N。53推定人CD8細胞表位l。0161]SEQDNo54 推定人CD8細胞表位2。0162]SEQDNo55推定人CD8細胞表位3。0163]SEQDNo56推定人CD8細胞表位4。0164]SEQDNo57推定人CD8細胞表位5。0165]SEQDNo58推定人CD8細胞表位6。0166]SEQDNo59推定人CD8細胞表位7。0167]SEQDNo60推定人CD8細胞表位8。0168]SEQDNo61推定人CD8細胞表位9。0169]SEQDNo62推定人CD8細胞表位10。0170]SEQDNo63推定人⑶8細胞表位11。0171]SEQDNo64 推定人CD8細胞表位12。0172]SEQDNo65推定人CD8細胞表位13。0173]SEQDNo66推定人CD8細胞表位14。0174]SEQDNo67推定人CD8細胞表位15。0175]SEQDNo68推定人CD8細胞表位16。0176]SEQDNo69推定人CD8細胞表位17。0177]SEQDNo70推定人CD8細胞表位18。0178]SEQDNo71推定人CD8細胞表位19。0179]SEQDNo72推定人CD8細胞表位20。0180]SEQDNo73推定人⑶8細胞表位21。0181]SEQDNo74 推定人⑶8細胞表位22。0182]SEQDNo75推定人CD8細胞表位23。0183]SEQDNo76推定人CD8細胞表位M。0184]SEQDNo77推定人CD8細胞表位25。0185]SEQDNo78推定人CD8細胞表位沈。0186]SEQDNo79推定人CD8細胞表位270187]SEQDNo80推定人CD8細胞表位觀。0188]SEQDNo81推定人CD8細胞表位四。0189]SEQDNo82推定人CD8細胞表位30。0190]SEQDNo83推定人⑶8細胞表位31。0191]SEQDNo84 推定人⑶8細胞表位32。0192]SEQDNo85推定人CD8細胞表位33。0193]SEQDNo86推定人CD8細胞表位34。0194]SEQDNo87推定人CD8細胞表位35。0195]SEQDNo88推定人CD8細胞表位36。0196]SEQDNo89推定人CD8細胞表位37。0197]SEQDNo90推定人CD8細胞表位38。0198]SEQDNo91推定人CD8細胞表位39。0199]SEQDNo92推定人CD8細胞表位40。
SEQIDNo93 推定人⑶8細胞表位41。
SEQIDNo94 推定人⑶8細胞表位42。
SEQIDNo95 推定人⑶8細胞表位43。
SEQIDNo96 推定人⑶8細胞表位44。
SEQIDNo97 推定人 ⑶8細胞表位45。
SEQIDNo98 推定人⑶8細胞表位46。
SEQIDNo99 推定人⑶8細胞表位47。
SEQIDNo100推定人CD8細胞表位48。
SEQIDNo101推定人CD8細胞表位49。
SEQIDNo102推定人CD8細胞表位50。
SEQIDNo103推定人⑶8細胞表位51。
SEQIDNo104推定人CD8細胞表位52。
SEQIDNo105推定人CD8細胞表位53。
SEQIDNo106推定人CD8細胞表位M。
SEQIDNo107推定人CD8細胞表位55。
SEQIDNo108推定人CD8細胞表位56。
SEQIDNo109推定人CD8細胞表位57。
SEQIDNo110推定人CD8細胞表位58。
SEQIDNo111推定人CD8細胞表位59。
SEQIDNo112推定人CD8細胞表位60。
SEQIDNo113推定人⑶8細胞表位61。
SEQIDNo114推定人CD8細胞表位62。
SEQIDNo115推定人CD8細胞表位63。
SEQIDNo116推定人CD8細胞表位64。
SEQIDNo117推定人CD8細胞表位65。
SEQIDNo118推定人CD8細胞表位66。
SEQIDNo119推定人CD8細胞表位67。
SEQIDNo120推定人CD8細胞表位68。
SEQIDNo121推定人CD8細胞表位69。
SEQIDNo122推定人CD8細胞表位70。
SEQIDNo123推定人⑶8細胞表位71。
SEQIDNo124推定人CD8細胞表位72。
SEQIDNo125推定人CD8細胞表位73。
SEQIDNo126推定人CD8細胞表位74。
SEQIDNo127推定人CD8細胞表位75。
SEQIDNo128推定人CD8細胞表位76。
SEQIDNo129推定人CD8細胞表位77。
SEQIDNo130推定人CD8細胞表位78。
SEQIDNo131推定人CD8細胞表位79。
SEQIDNo132推定人CD8細胞表位80。
SEQIDNo133推定人CD8細胞表位81。
SEQIDNo134推定人CD8細胞表位82。
SEQIDNo135推定人CD8細胞表位83。
SEQIDNo136推定人CD8細胞表位84。
SEQIDNo137推定人CD8細胞表位85。
SEQIDNo138推定人CD8細胞表位86。
SEQIDNo139推定人CD8細胞表位87。
SEQIDNo140推定人CD8細胞表位88。
SEQIDNo141推定人CD8細胞表位89。
SEQIDNo142推定人CD8細胞表位90。
SEQIDNo143推定人CD8細胞表位91。
SEQIDNo144 推定人CD8細胞表位92。
SEQIDNo145推定人CD8細胞表位93。
SEQIDNo146推定人CD8細胞表位94。
SEQIDNo147推定人CD8細胞表位95。
SEQIDNo148推定人CD8細胞表位96。
SEQIDNo149推定人CD8細胞表位97。
SEQIDNo150推定人CD8細胞表位98。
SEQIDNo151推定人CD8細胞表位99。
SEQIDNo152推定人CD8細胞表位100。
SEQIDNo153推定人CD8細胞表位101。
SEQIDNo154推定人CD8細胞表位102。
SEQIDNo155來自結核分枝桿菌H37Rv菌株的Rvl753c的多肽序列。
SEQIDNo156來自結核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2707c的多肽序列。發明詳述目前，用活菌接種是誘導保護性免疫最有效的方法。用于該目的的最常用的分枝桿菌是卡介桿菌(BCG)，這是60多年前開發的牛分枝桿菌的無毒性菌株。然而，BCG的安全性和有效性成為爭論的來源-盡管在兒童中顯示了對嚴重疾病的保護，BCG并不能預防成年人中潛伏TB的形成或者肺部疾病的再活化。此外，在一些國家，例如美國，并未用這種藥劑來給普通人群接種。幾乎所有目前在臨床開發中的新一代TB疫苗均被設計為暴露前(pre-exposure) 疫苗。其中包括了亞基疫苗，其在加強由先前的BCG接種誘導的免疫中特別有效，還包括高級活分枝桿菌疫苗，其用于將BCG替換為更有效和/或更安全的菌株。盡管這些疫苗的目的在于改進對感染的耐受性，它們在潛伏TB病例中作為暴露后或治療性疫苗的效力可能相對較低(Lin MY 等人 Endocrine, Metabolic & Immune Disorders-Drug Targets 2008 8 :15-29)。這些蛋白中有多種在分枝桿菌感染早期被強烈表達，據顯示它們可在動物接種模型中提供很強的保護效力。然而，用感染早期高度表達的抗原接種可能無法提供處理感染
17后期的最佳免疫應答。對感染后期的充分控制可能需要T細胞，其特異性針對在該時期表達的特定抗原。直接靶向持續休眠菌的暴露后疫苗可能有助于針對TB再活化的保護，從而強化 TB控制，或者甚至能清除感染。因此，靶向潛伏TB的疫苗可以顯著和經濟地降低全球TB感染率。基于后期抗原的亞基疫苗還可與早期抗原聯合使用以提供多階段疫苗。替代性地，后期抗原可用于補充和改善BCG接種(通過促進BCG應答或者通過形成高級重組BCG 菌株)。Rv2386c,也稱為MbtI，可通過將分支酸鹽轉化為水楊酸鹽催化分枝桿菌素生物合成中的初始轉化(Zwahlen等人Biochemistry 2007 46 =954-964) Rv2386之前已被鑒定為與應激狀態下的表達相關，盡管在豚鼠模型中作為DNA疫苗施用時未形成保護(Vipond 等人 Vaccine 2006 24:6340-6350)。最近，基于對結核分枝桿菌基因組的全基因組生物信息學分析(Zvi等人BMC Medical Genetics 2008 1 :18)和對活動性和潛伏感染個體中差異表達蛋白的測試 (Schuck SD等人PLoS ONE 2009 4(5) :e5590)已經提出了一些結核分枝桿菌疫苗候選物。盡管已顯示巨噬細胞是分枝桿菌免疫性的首要效應物，T細胞是該種免疫性的主要誘導物。T細胞在針對結核病的保護中的關鍵作用解釋為人免疫缺陷病毒感染個體中 (由于CD4+T細胞的相關耗竭)增加的TB再活化速率。此外，在針對結核分枝桿菌初次免疫應答的頂點進行的CD4+T細胞的繼承轉移已顯示賦予T細胞缺陷型小鼠中針對結核分枝桿菌的保護(Orme 等人 J. Exp. Med. 1983 158 :74-83)。分枝桿菌活性⑶4+T細胞據顯示是Y-干擾素(IFN-γ)的有效生產者，這進而顯示觸發在小鼠中巨噬細胞的抗分枝桿菌作用(Flyrm等人J.Exp. Med. 1993 178 2249-2254)。盡管對IFN-γ在人體內的作用所知更少，研究已顯示，1，25-二羥基-維生素D3單獨或者與IFN- γ或腫瘤壞死因子-alpha組合激活人巨噬細胞以抑制結核分枝桿菌感染。此外，已知IFN-Y刺激人巨噬細胞來制備1，25_ 二羥基-維生素D3。類似地，已顯示白介素-12(IL-12)在刺激針對結核分枝桿菌感染的耐受性上起作用。有關結
Chan & Kaufmarm， tuberculosis :Pathogenesis， Protection and Control (Bloom 編輯，1994), tuberculosis (第 2 版，Rom 禾口 Garay,編輯 2003),禾口 Harrison' s Principles of Internal Medicine,第 150 章，pp 953-966 (第 16 版，Braunwald,等人，編輯 2005)。本發明總體涉及作為TB抗原(特別是與潛伏TB相關的抗原)的Rv2386c的鑒定， 并涉及預防和治療TB (尤其是預防和治療潛伏TB以及預防或延緩TB再活化)的相關方法和用途。因此，本發明提供了 Rv2386c蛋白、其變體或其免疫原性片段，或者編碼所述蛋白、變體或片段的多核苷酸，以用于治療或預防TB。適當地，該用途可特別針對潛伏TB的預防和治療(尤其是潛伏TB的治療)。替代性地，該用途可針對TB再活化的預防或延緩(特別是TB再活化的延緩，例如延緩數月、數年或甚至無限期)。術語“結核復合物(complex)的分枝桿菌種類”包括通常被認為引起結核病疾病的種類，以及引起免疫缺陷患者(例如患有AIDS的患者)的結核病和肺部疾病的分枝桿菌環境和機會種，例如結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、牛分枝桿菌(M. bovis) 或非洲分枝桿菌(M. africanum)、BCG、鳥結核分枝桿菌(M. avium)、胞內分枝桿菌 (M. intracellulare)、隱藏分枝桿菌(M. celatum)、日內瓦分枝桿菌(M. genavense)、嗜血分枝桿菌(M. haemophilum)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、猿分枝桿菌(M. simiae)、牝牛分枝桿菌(M. vaccae)、偶發分枝桿菌(M. fortuitum)以及瘰疬分枝桿菌(M. scrofulaceum) (參見，例如，Harrison’ s Principles of Internal Medicine,第 150 章，pp 953-966 (第 16版，Braimwald，等人，編輯，2005)。本發明特別涉及結核分枝桿菌的感染。術語“活動性感染”指具有已顯現的疾病癥狀和/或損傷(合適地具有顯現的疾病癥狀)的感染(例如，結核分枝桿菌感染)。術語“非活動性感染”、“潛伏感染”或“潛伏性感染”指未顯示疾病癥狀和/或損傷(合適地未顯示疾病癥狀)的感染(例如，結核分枝桿菌感染)。術語“原發結核病”指在感染(例如，結核分枝桿菌感染)后直接形成的臨床疾病 (疾病癥狀的顯現)。參見 Harrison's Principles of Internal Medicine，第 150 章，pp 953-966 (第 16 版，Braunwald,等人，編輯，2005)。術語“繼發性結核病”或“原發后結核病”指潛伏、非活動性或潛伏性感染(例如， 結核分枝桿菌感染)的再活化。參見Harrison’ s Principles of Internal Medicine，第 150 章，pp 953-966 (第 16 版，Braunwald,等人，編輯，2005)。術語“結核病再活化”指感染測試呈陽性(例如，在結核菌素皮試中呈陽性，合適地在體外基于T細胞的測定中呈陽性)但沒有明顯的疾病癥狀的個體隨后顯現疾病癥狀。 該陽性診斷測試表明該個體被感染，然而，該個體可能曾顯示或未曾顯示已進行過充分治療以將結核病帶入非活動性或潛伏狀態的活動性疾病的癥狀。應當認識到，預防、延緩或治療結核病再活化的方法可在顯現活動性疾病癥狀的個體內啟動。術語“耐藥性”結核病指感染(例如，被結核分枝桿菌感染)，其中該感染菌株不被一種或多種能夠有效治療結核病的所謂“一線”化療劑(例如，異煙胼、利福平、乙胺丁醇、 鏈霉素和吡嗪酰胺)所壓制或殺死(即，耐受)。術語“多重耐藥性”結核病指耐受兩種或更多種能夠有效治療結核病的“一線”化療劑的感染菌株的感染(例如，被結核分枝桿菌感染)。“化療劑”指本領域已知并用于治療結核病(例如，被結核分枝桿菌感染)的藥劑。 用于治療結核病的示范性的藥劑包括，但不限于，阿米卡星、氨基水楊酸、卷曲霉素、環絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙胼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素類(即，利福平、利福噴汀和利福布汀)、鏈霉素、氧氟沙星、環丙沙星、克拉霉素、阿齊霉素和氟喹諾酮類。用于治療非耐藥性結核病的“一線”或“前線”化療劑包括異煙胼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺。用于治療對一種或多種“一線”藥物顯示了耐藥性的結核病的“二線”化療劑包括氧氟沙星、環丙沙星、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環絲氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。參見 Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman and Limbird編輯，2001第48章中綜述的這些藥劑。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在此可互換使用以表示氨基酸殘基的聚合物。該術語還可用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應天然存在氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物，還可用于天然存在氨基酸聚合物和非天然存在氨基酸聚合物。合適地，根據本發明的多肽將僅由天然存在氨基酸殘基(特別是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸)組成。術語“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在氨基酸的方式發揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸為由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后被修飾的氨基酸，例如，羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學結構的化合物，即，與氫連接的α碳，羧基基團，氨基基團以及R基團，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。該種類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的一般化學結構不同的結構，但功能上與天然存在的氨基酸類似的化合物。合適地，氨基酸為天然存在的氨基酸或氨基酸類似物，特別是天然存在的氨基酸，尤其是由遺傳密碼編碼的氨基酸。“核酸”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。該術語包括含有合成、天然存在的和非天然存在的、與參考核酸具有類似結合特性的且與參考核苷酸以類似方式代謝的已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連鎖的核酸。該種類似物的范例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-0-核糖核苷酸甲酯、肽核酸(PNAs)。合適地，術語“核酸”指天然存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另行指明，特定的核酸序列還意指包含其保守修飾的變體(例如，簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確指出的序列(合適地，它指明示指出的序列)。特別地，簡并密碼子置換可通過生成其中一個或多個選定的(或者所有的)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基所置換的序列來實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19 5081(1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8 :91-98 (1994))。術語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。本文的氨基酸可用常見的三個字母的符號表示或者可通過IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號表示。同樣地，核苷酸也可采用其通常接受的單字母密碼來表不。本文所用的術語“Rv2386c蛋白序列”指SEQ ID No 1中提供的多肽序列或其同源物，其來自結核復合物的分枝桿菌種類，例如，結核分枝桿菌、牛分枝桿菌或非洲分枝桿菌等種類，或者環境性和機會性的并引起免疫缺陷宿主(例如，患有AIDS的患者)的機會性感染如肺部感染的分枝桿菌種類，例如，BCG，鳥結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌、隱藏分枝桿菌、日內瓦分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、猿分枝桿菌、牝牛分枝桿菌、偶發分枝桿菌和瘰疬分枝桿菌(參見，例如，Harrison，s Principles of Internal Medicine, 第 150 章，pp 953-966，第 16 版，Braunwald,等人，編輯，2005)。為了確保在接種宿主中的高效力比例，疫苗的成分應當在具有臨床意義的菌株中良好保藏。合適地，Rv2386c蛋白來自于結核分枝桿菌H37Rv(即，SEQ ID No 1中提供的多肽序列)或者是來自其它結核分枝桿菌菌株(例如CDC1551、Fll、Haarlem A和C菌株) 的同源物。與耐藥性相關的結核分枝桿菌菌株(例如，MDR或特別是)(DR)是Rv2386c蛋白序列的特別有價值的基礎。感興趣的菌株包括CDC1551-可傳遞且強毒性菌株
Haarlem家族(例如Haarlem A)-在擁擠人群中發現的耐藥性菌株。結核分枝桿菌菌株中的Haarlem家族成員已在世界各地被發現。該家族的第一個代表成員發現于荷蘭的 Haarlem。KZN4207-從南非KwaZulu-Natal的患者得到的藥物敏感分離物。KZm435_從南非KwaZulu-Natal的患者得到的多重耐藥(MDR)分離物。KZN605-從南非KwaZulu-Natal的患者得到的廣泛耐藥O(DR)分離物。C-在紐約市高度傳遞。在一項研究中發現該菌株在注射藥物使用者中更為常見， 且耐受活性氮中間體(Friedman 等人 J. hfect. Dis. 1997 176(2) :478-84)。94 M4M1A-1994年在舊金山從一名出生于中國的患者分離得到。該菌株曾通過基因缺失分析進行分析(Gagneux 等人，PNAS 2006 103(8) :2869-2873) 02 1987-2002年在舊金山從一名出生于南韓的患者分離得到。該菌株曾通過基因缺失分析進行分析(Gagneux 等人，PNAS 2006 103(8) :2869-2873) T92-1999年在舊金山從一名出生于菲律賓的患者分離得到。該菌株發表于Hirsh 等人 PNAS 2004 101 :4871_4876。T85-1998年在舊金山從一名出生于中國的患者分離得到。該菌株發表于Hirsh等人PNAS 2004 101 :4871_4876。EAS0M-1993年在舊金山從一名出生于印度的患者分離得到。該菌株曾通過基因缺失分析進行分析(Gagneux 等人，PNAS 2006 103(8) :2869-2873) Gagneux 等人，PNAS 2006 103(8) :2869-2873 和 Herbert 等人 Infect. Immun. 2007 75(12) :5798-5805為已知存在的結核分枝桿菌菌株范圍提供了有價值的背
景知識。最適宜地，Rv2386c蛋白選自SEQ ID No 1和3-7、特別是SEQ ID No :1和3_6(例如SEQ ID No 1)中提供的多肽序列。特別感興趣的多核苷酸是包含(例如由其組成)編碼如下的序列的那些多核苷酸(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。多核苷酸將合適地包含(例如由其組成)編碼Rv2386c蛋白的免疫原性片段的 SEQ ID NO 2的變體或SEQ ID NO 2的片段。組合本發明的RW836C相關的多肽可進一步包含設計用于增強其免疫原性或在其它方面改善這些抗原的其它成分。例如，可通過在抗原的一端添加一段組氨酸殘基(通常稱 Shis-tag)來促進多肽抗原的改善分離。術語“his-tag”指參考序列中插入的一串組氨酸殘基，通常是六個殘基。為了最小化對與參考序列相關的活性的破壞，his-tag—般被插在N-末端，通常緊鄰起始蛋氨酸殘基，或者插在C-末端。它們對于天然序列通常是異源的，但由于它們可通過改善與固定化金屬親和層析樹脂(IMAC)的蛋白結合促進分離而被整合入天然序列。通常而言，從引發針對參考蛋白的所需免疫應答而言his-tag的存在與否并不重要。然而，為了避免針對
21his-tag本身的不良反應的風險，據認為最好最小化his-tag的長度，例如，降低至四個或更少的殘基，特別是兩個殘基(或者完全不用his-tag)。為了提高引發的免疫應答的強度和/或幅度，本發明的組合物、多肽和核酸可包含來自分枝桿菌種類(特別是結核分枝桿菌)的本發明抗原和/或另外的異源多肽(或編碼它們的多核苷酸)的多個拷貝。本領域技術人員將認識到，當一些成分組合使用時，精確的存在可發生變化。例如，Rv2386c成分和本發明的抗原或另外的異源抗原成分的另外拷貝可以如下方式存在(1)兩種單獨的多肽成分；(2)包含兩種多肽成分的融合蛋白；(3) 一種多肽和一種多核苷酸成分；(4)兩種單獨的多核苷酸成分；(5)編碼兩種單獨多肽成分的單個多核苷酸；或者(6)編碼包含兩種多肽成分的融合蛋白的單個多核苷酸。這種靈活性可同樣應用于三種或更多種成分組合使用的情況。然而，為方便起見， 通常期望當存在多種成分時，它們包含于單個融合蛋白中或編碼單個融合蛋白的多核苷酸中。在本發明的一個實施方式中，所有的抗原成分以多肽提供(例如，在單個融合蛋白中)。 在本發明的一個替代性的實施方式中，所有抗原成分以多核苷酸提供(例如，單個多核苷酸，例如編碼單個融合蛋白的多核苷酸)。在用于表示核酸的部分時，術語“異源的”表示該核酸包含兩種或更多種被發現性質上關系彼此不相同的子序列。例如，該核酸通常重組生成，具有兩個或更多個來自無關基因的序列并排列為生成新的功能核酸，例如，來自一個來源的啟動子和來自另一來源的編碼區。類似地，異源蛋白表示該蛋白包含兩種或更多種被發現性質上關系彼此不相同的子序列(例如，融合蛋白)。“融合多肽，，或“融合蛋白，，指具有直接或通過氨基酸接頭共價連接的至少兩種異源多肽(例如，至少兩種分枝桿菌屬多肽)的蛋白。形成融合蛋白的多肽通常將C-末端連接至N-末端，盡管它們也可將C-末端連接至C-末端，N-末端連接至N-末端，或者將N-末端連接至C-末端。融合蛋白的多肽可以呈任意順序。該術語還指構成該融合蛋白的抗原的保守修飾的變體、多形態變體、等位基因、突變體、免疫原性片段和種間同源物。結合分枝桿菌抗原描述于Cole等人，Nature 393 :537 (1998)，其披露了整個結核分枝桿菌基因組。 對應于結核分枝桿菌抗原的來自其它分枝桿菌種類的抗原可通過例如采用本文所述的序列比較算法或者本領域技術人員已知的其它方法(例如，雜交測定和抗體結合測定)進行鑒定。術語“融合”指融合蛋白中兩個多肽之間的共價鍵。多肽通常通過肽鍵彼此直接連接或經氨基酸接頭連接。任選地，肽可通過本領域技術人員已知的非肽共價鍵連接。可與Rv2386c結合的示范性結核分枝桿菌抗原包括如下(例如(i)至(xii)的一種或多種)的一種或多種(例如，1-5種，如1-3種，特別是1種)(i)Mtb8.4(也稱為 DPV 和 Rvll74c)，其多肽序列描述于 TO97/09428 的 SEQ ID No :102(cDNA 以 SEQ ID No :101 顯示)和 Coler 等人 Journal of Immunology 1998 161 2356-2364中。特別感興趣的是成熟Mtb8. 4序列，其缺失前導信號肽(即，W097/09428的SEQ ID No 102的氨基酸殘基15-96)。Mtb8. 4的全長多肽序列以SEQ ID No 8顯示；(ii)Mtb9. 8(也稱為 MSL 和 Rv0287)，其多肽序列描述于 W098/53075 的 SEQ ID No: 109(MSL的片段披露于W098/53075的SEQ ID No :110_124，特別感興趣的是SEQ ID No :119 和120)以及Coler等人Vaccine 2009 27 :223-233 (特別是其中圖2所示的活性片段)中。 Mtb9. 8的全長多肽序列以SEQ ID No 9顯示；(iii)Mtb9. 9(也稱為 Mtb9. 9A、MTI、MTI-A 和 Rvl793)，其多肽序列描述于 W098/53075 的 SEQ ID No 19 和 Alderson 等人 Journal of Experimental Medicine 2000 7 :551-559 (MTI的片段披露于W098/53075的SEQ ID No :17和51-66，特別感興趣的是SEQ ID No :17、51、52、53、56 和 62-65)。一些 MTI 多肽變體描述于 W098/53075 的 SEQ ID No: 21、23、25、27、29 和 31 以及 Alderson 等人 Journal of Experimental Medicine 20007 551-559中。Mtb9. 9的全長多肽序列以SEQ ID No 10顯示；(iv) Ral2 (也稱為Mtb32A C-末端抗原)，其多肽序列描述于W001/98460的SEQ ID No 10 和 Skeiky 等人 Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 中。Ral2 的全長多肽序列以SEQ ID No 11顯示；(v)Ra35(也稱為Mtb32A N-末端抗原)，其多肽序列描述于W001/98460的SEQ ID No :8 和 Skeiky 等人 Journal of Immunology 2004172 :7618-7682 中。Ra!35 的全長多肽序列以SEQ ID No 12顯示；(vi)TbH9(也稱為 Mtb39、Mtb39A、TbH9FL 禾Π Rvl 196)，其多肽序列描述于 W097/09428 的 SEQ ID No 107 以及 Dillon 等人 hfection abd Immunity 1999 67(6) 294H950 和 Skeiky 等人 Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 中。TbH9 的全長多肽序列以SEQ ID No 13顯示；(vii)Mtb40 (也稱為 HTCCl 和 Rv3616c)，其多肽序列描述于 W098/53075 的 SEQ ID No :138(cDNA 描述于 SEQ ID No :137)。Mtb40 的全長多肽序列以 SEQ ID No 14 顯示；(viii)Mtb41(也稱為MTCC2和Rv0915c)，其多肽序列描述于W098/53075 的 SEQ ID No :142 (cDNA 描述于 SEQ ID No :140)和 Skeiky 等人 Journal of Immunology 2000 165 7140-7149中。Mtb41的全長多肽序列以SEQ ID No 15顯示；(ix)ESAT_6(也稱為 esxA 和 Rv3875)，其多肽序列描述于 W097/09428 的 SEQ ID No :103(cDNA 以 SEQ ID No :104 描述)和 Sorensen 等人 hfection and Immunity 1995 63(5) :1710-1717中。ESAT-6的全長多肽序列以SEQ ID No 16顯示；(x)Ag85復合抗原(例如Ag85A，也稱為fbpA和Rv38(Mc ；或者Ag85B，也稱為fbpB 和 Rvl886c)，其在例如，Content 等人 hfection and Immunity 1991 59 :3205-3212 和 Huygen 等人 Nature Medicine 1996 2(8) :893-898 中討論。Ag85A 的全長多肽序列以 SEQ ID No :17顯示(特別感興趣的是殘基43-338的成熟蛋白，S卩，缺失信號肽)。Ag85B的全長多肽序列以SEQ ID No:18顯示(特別感興趣的是殘基41-325的成熟蛋白，S卩，缺失信號肽)；(xi) Alpha-晶體蛋白(也稱為 hspX 和 Rv2031c)，其描述于 Verbon 等人 Journal of Bacteriology 1992 174 1352-1359 禾口 Friscia 等人 Clinical and Experimental Immunology 1995 102 :53-57 (特別感興趣的是對應于殘基 71-91、21-40、91_110 和 111-130的片段)。alpha-晶體蛋白的全長多肽序列以SEQ ID No 19顯示；
(xii)Mpt64(也稱為 Rvl980c)，其描述于 Roche 等人 kandinavian Journal of Immunology 1996 43:662-670。MPT64的全長多肽序列以SEQ ID No :20顯示(特別感興趣的是殘基對_2觀的成熟蛋白，即，缺失信號肽)；(xiii)Mtb32A，其多肽序列描述于 W001/98460 的 SEQ ID No:2(全長)和 SEQ ID No 4的殘基8-330(成熟)，特別是具有催化三聯體突變的至少一個的變體(例如，催化絲氨酸殘基，其可例如突變為丙氨酸)。Mtb32A的全長多肽序列以SEQ ID No :21顯示。具有 Ser/Ala突變的Mtb32A的成熟形式以SEQ ID No 22顯示；(xiv)TBlO. 4，TB10. 4 的全長多肽序列以 SEQ ID No 23 顯示；(XV) Rvl753c,來自于結核分枝桿菌H37Rv的Rvl753c的全長多肽序列以SEQ ID No 155顯示；和/或(XV) Rv2707c，來自于結核分枝桿菌H37Rv的Rv2707c的全長多肽序列以SEQ ID No 156 顯示。或其組合，例如(如(a)至(g)的組合)(a)Ral2、TbH9和Ra35成分的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtb72f。Mtb72f的多月太序列描述于 W02006/117240 的 SEQ ID No :6 (cDNA 以 SEQ ID No:5 描述)以及 Skeiky 等人 Journal of Immunology 2004 172 :7618-7682 (其中結合了任選的 His-tag來幫助純化，當應用于本發明中時，合適地，Mtb72f不具有該任選的組氨酸殘基)。Mtb72f的多肽序列以SEQ ID No 24顯示；(b)Ral2、TbH9和Ser/Ala突變的Ra35 (即，催化絲氨酸殘基被丙氨酸替換)成分的組合，例如呈融合蛋白形式，如M72。M72的多肽序列描述于W02006/117240的SEQ ID No 4(cDNA以SEQ ID No :3描述)，其中結合了任選的雙組氨酸來幫助生產，當應用于本發明中時，M72也可結合雙組氨酸，但合適地，M72不含該任選的雙組氨酸(即，特別感興趣的是 W02006/117240 的 SEQ ID No 4 的殘基 4-725)。M72 的多肽序列以 SEQ ID No 25 顯示；(c)Mtb8. 4、Mtb9. 8、Mtb9. 9和Mtb41成分的組合，例如呈融合蛋白形式，如 Mtb71f。Mtb71f 的多肽序列描述于 W099/051748 的 SEQ ID No :16(cDNA 以 SEQ ID No 15 描述)，其中結合了任選的His-tag來幫助純化，當應用于本發明中時，合適地，Mtb71f對應于來自W099/051748的SEQ ID No 16的氨基酸殘基9-710。Mtb71f的多肽序列以SEQ ID No 26顯示；(d)Mtb72f或M72(合適地不具有任選的幫助表達的組氨酸殘基)與Mtb9. 8和 Mtb9. 9的組合，例如呈融合蛋白形式。M72-Mtb9. 9_Mtb9. 8融合體的多肽序列以SEQ ID No 27(M92融合)顯示，在用于本發明時，該M72-Mtb9. 9_Mtb9. 8融合體可任選地在起始蛋氨酸
殘基后結合雙組氨酸以幫助生產。(e)Mtb72f或M72(合適地不具有任選的幫助表達的組氨酸殘基)與Ag85B的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtbl03f。Mtbl03f的多肽序列描述于W003/070187的SEQ ID No :18(cDNA以SEQ ID No :10描述)，其結合了任選的His-tag以幫助純化，當用于本發明時,合適地，Mtbl03f對應于W003/070187的SEQ ID No :18的氨基酸殘基8-1016。還特別感興趣的是M103，即Mtbl03f結合了 Ra35成分中的Ser/Ala突變，當用于本發明時，合適地，M103對應于W003/070187的SEQ ID No 18的氨基酸殘基8-1016，其中在第710位的Ser殘基被替換為Ala。M103的多肽序列以SEQ ID No 顯示，當用于本發明時，該M72-Mtb9. 9-Mtb9. 8融合體可任選地在起始蛋氨酸殘基后結合雙組氨酸以幫助生產；(f)Mtb72f或M72(合適地不具有任選的幫助表達的組氨酸殘基)與Mtb41的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtbll4f。Mtbll4f的多肽序列描述于W003/070187的SEQ ID No :16(cDNA描述于SEQ ID No :9)，其結合了任選的His-tag以幫助純化，當用于本發明時，合適地，Mtbl 14f對應于W003/070187的SEQ ID No 16的氨基酸殘基8-1154。還特別感興趣的是M114，即MtblHf結合了 Ra35成分中的Ser/Ala突變，當用于本發明時，合適地，M114對應于W003/070187的SEQ ID No :16的氨基酸殘基8-1154，其中在第710位的Ser殘基被替換為Ala。Ml 14的多肽序列以SEQ ID No : 顯示，當用于本發明時，該 M72-Mtb9. 9-Mtb9. 8融合體可任選地在起始蛋氨酸殘基后結合雙組氨酸以幫助生產；(g)Ag85B 和 ESAT-6 成分的組合，例如在 Doherty 等人 Journal of Infectious Diseases 2004 190 :2146-2153所述的融合體中；和/或(h)Ag85B 和 TB10. 4 成分的組合，例如在 Dietrich 等人 Journal of Immunology 2005 174(10) :6332-6339 190 :2146-2153 所述的融合體中。特別感興趣的是Rv2386c成分和Mtb40成分的組合。顯然，該種組合可任選地包含其它附加的抗原成分(例如，M72成分)。另一感興趣的組合包含Rv2386c成分和M72成分。另一感興趣的組合包含Rv2386c成分和Rvl753c成分。其它感興趣的組合包括那些包含Rv2386c成分和Rv2707c成分的組合。另外的感興趣的組合包含Rv2386c成分和alpha-晶體蛋白成分。本領域技術人員將認識到，這些組合并不依賴于上文(i)-(xvi)和(a)-(h)中所述的特定序列，且所述序列的保守修飾的變體(例如，具有至少70%—致性，例如至少80% 一致性，特別是至少90%—致性，尤其至少95%—致性)或免疫原性片段(例如，全長抗原的至少20%，例如該抗原的至少50%，特別是至少70%，尤其是至少80% )可用于實現相同的實際效果。上述單獨抗原序列的每一個還披露于Cole等人Nature 1998 393 :537-544和 Camus Microbiology 2002 148 2967-29730公眾已可獲得結核分枝桿菌H37Rv的基因組，例如可見 Welcome Trust Sanger Institute 的網站(www.sanger.ac.uk/Projects/M_ tuberculosis/)以及其它途徑。上述抗原中的多個還披露于美國專利申請號08/523，435、08/523，436、 08/658，800,08/659, 683,08/818, 111,08/818,112,08/942,341,08/942, 578,08/858,998、 08/859，381,09/056, 556,09/072, 596,09/072, 967,09/073, 009,09/073, 010,09/223, 040、 09/287，849 以及 PCT 專利申請 PCT/US98/10407、PCT/US98/10514、PCT/US99/03265、PCT/ US99/03268、PCT/US99/07717、W097/09428 和 W097/09429、W098/16645、W098/16646，其每一個在此引入作為參考。本發明的組合物、多肽和核酸還可包含來自其它來源的另外的多肽。例如，本發明的組合物和融合蛋白可包含多肽或編碼多肽的核酸，其中該多肽增強抗原的表達，例如， NS1，流感病毒蛋白(參見例如W099/40188和W093/04175)。本發明的核酸可根據所選種類，例如人(當進行體內表達時)或特定細菌(當進行多肽生產時)的密碼子偏好進行工程改造。
Rv2386c成分還可與一種或多種抗結核病(例如，結核分枝桿菌感染)有效的化療劑施用。這些化療劑的范例包括，但不限于，阿米卡星、氨基水楊酸、卷曲霉素、環絲氨酸、 乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙胼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素類(即、利福平、利福噴汀和利福布汀)、鏈霉素、氧氟沙星、環丙沙星、克拉霉素、阿齊霉素和氟喹諾酮類。該種化療可由主治醫生采用優選藥物組合的判斷來確定。用于治療非耐藥性結核病(例如，結核分枝桿菌感染)的“一線”化療劑包括異煙胼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺。用于治療已證明對一種或多種“一線”藥物有耐藥性的結核病(例如，結核分枝桿菌感染)的“二線” 化療劑包括氧氟沙星、環丙沙星、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環絲氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。傳統的化療劑通常在相對較長的周期內給藥(約9個月)。傳統化療劑與根據本發明的Rv2386c成分給藥的組合可縮短化療治療周期(例如，縮短至8個月、7個月、6個月、 5個月、4個月、3個月或更短)而不降低效力。特別感興趣的是Rv2386c成分與卡介桿菌(BCG)的聯用。例如，以重組表達 Rv2386c (或其如本文所述的變體或片段)的修飾BCG的形式。替代性地，該Rv2386c成分可用于通過同時給藥或通過促進之前的BCG免疫來增強對象對于BCG免疫的應答。當用于增強對象對BCG接種的應答時，該Rv2386c成分可顯然地以多肽或多核苷酸(任選地結合上述另外的抗原成分)的形式提供。本領域技術人員將認識到，成分的組合不必同時給藥，并可按如下方式應用單獨或組合；同時、相繼或在短時間內；通過相同或不同的途徑。然而，為方便起見，通常期望將成分的組合作為單種組合物給藥(當給藥方案相容時)。本發明的多肽、多核苷酸和組合物通常向人給藥，但對包括家養哺乳動物(例如， 狗、貓、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、南美栗鼠)和農用哺乳動物(例如，牛、豬、綿羊、山羊、 馬)等其它哺乳動物也有效。免疫原性片段T細胞表位是被T細胞(例如，⑶4+或⑶8+T細胞)識別的氨基酸的短連續片段。T細胞表位的鑒定可通過本領域技術人員公知的表位定位實驗實現(參見，例如Paul， Fundamental Immunology，第 3 版，243—247 (1993) ；Bei β barth 等人 Bioinformatics 2005 21(Supp1. 1) :i29-i37)。替代性地，可采用實施例中所述的方法預測表位。由于結核病中T細胞應答的關鍵參與，顯然包含至少一個T細胞表位的全長 Rv2386c多肽的片段將具有免疫原性并有助于免疫保護。該種片段在此稱為免疫原性片段。根據本發明的免疫原性片段將通常包含全長多肽序列的至少9個連續氨基酸(例如，至少10個)，例如至少12個連續氨基酸(例如，至少15或至少20個連續氨基酸)，特別是至少50個連續氨基酸，例如至少100個連續氨基酸(例如至少200個連續氨基酸)。 合適地，該免疫原性片段將是該全長多肽序列長度的至少20%，例如至少50%、至少70% 或至少80%。應當理解，在不同的遠系交配群體(例如人)中，不同的HLA類型表示該特定表位可能不被該群體所有成員所識別。因此，為了最大化識別的水平以及對多肽的免疫應答的強度，通常期望該免疫原性片段包含來自該全長序列的多個表位(適當時為全部表位)。
可以使用的Rv2386c蛋白的具體片段包括包含至少一個⑶4+表位、適當地包含至少兩個⑶4+表位、特別是包含所有⑶4+表位(例如實施例和SEQ ID No :30-52中所述的那些表位，特別是與多個HLA等位基因相關的表位，例如與2、3、4、5或更多個等位基因相關的表位)的那些Rv2386c蛋白。可以使用的Rv2386c蛋白的其它片段包括包含至少一個⑶8表位、適當地包含至少兩個⑶8表位、特別是包含所有⑶8表位(例如實施例和SEQ ID No =53-154中所述的那些表位，特別是與多個HLA等位基因相關的表位，例如與2、3、4、5或更多個等位基因相關的表位)的那些Rv2386c蛋白。當使用全長多肽的單獨片段時，該種片段在其引發的應答達到參考序列在PBMC 或全血對特定抗原的體外再刺激測定(例如，在數小時至長達兩周之間，例如長達一天、1 天至1周或者1至2周的時間內再刺激)中活性的至少20%、合適地至少50%且特別是至少75% (例如至少90%)時被認為是免疫原性的，其中該測定通過培養懸浮液中淋巴組織增殖、細胞因子生成(通過ELISA、CBA等測量)或者通過胞內和胞外染色(例如，采用特異性針對免疫標記物的抗體，例如CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa、IFNg、CD40L、CD69等)然后以流式細胞儀分析T和B細胞應答特征來測量細胞的活化。合適地，當片段引發參考序列在T 細胞增殖和/或IFN-gamma生成測定中的活性的至少20%、合適地至少50%且特別是至少 75% (例如至少90%)的應答時被認為具有免疫原性。在一些情況下，全長多肽的多個片段(其可與全長序列重疊或不重疊并且覆蓋或不覆蓋該全長序列的全部)可被用于獲得與全長序列本身同等的生物應答。例如，至少兩個(例如三個、四個或五個)上述免疫原性片段組合提供的活性是該參考序列在PBMC或全血的體外再刺激測定(例如，T細胞增殖和/或IFN-gamma生成測定)中活性的至少50%、 合適地至少75%且尤其是至少90%。變體“變體”或“保守修飾變體”可同時用于氨基酸和核酸序列。對于特定的核酸序列， 保守修飾的變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者當該核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡并，大量功能相同的核酸編碼任意給定蛋白。例如，密碼子GCA、 GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子限定的每個位置，該密碼子可被改為所述的任意相應的密碼子而不改變編碼的多肽。該種核酸變體可導致“沉默”或 “簡并”變體，其為保守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每個核酸序列也描述了該核酸每個可能的沉默變異。本領域技術人員將認識到核酸中的每個密碼子(除了 AUG，其通常是蛋氨酸的唯一密碼子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)可被修飾以得到功能相同的分子。因此，每個所述的序列中暗示了編碼多肽的核酸的每個沉默變異。本發明的多核苷酸與參考序列相比可包含多個沉默變異(例如，1-50個，例如 1-25個，特別是1-5個，尤其是1個密碼子被更改)。本發明的多核苷酸與參考序列相比可包含多個非沉默保守變異(例如，1-50個，例如1-25個，特別是1-5個，尤其是1個密碼子被更改)。非沉默變異是那些可導致編碼氨基酸序列的變化(通過氨基酸殘基的置換、缺失或添加)的變異。本領域技術人員將認識到，特定的多核苷酸序列可同時包含沉默和非沉默保守變異。
對于蛋白序列的變體，本領域技術人員將認識到改變、添加或缺失單個氨基酸或少量百分比的氨基酸的多肽的單獨置換、缺失或添加是“保守修飾變體”，其中該改變導致以功能類似的氨基酸置換氨基酸或者殘基的置換/缺失添加基本不影響該變體的生物功能。提供功能類似的氨基酸的保守置換表是本領域公知的。該種保守修飾的變體附加于且不排除本發明多形態變體、種間同源物以及等位基因。本發明的多肽與參考序列相比可包含多個保守置換(例如，1-50個，例如1-25個， 特別是1-10個，尤其是1個氨基酸殘基被更改)。總體而言，該種保守置換將落入下文限定的氨基酸分組之一，盡管在一些情況下，也可能有其它置換而可能基本不影響該抗原的免疫原性。以下八組各包含了彼此可進行典型保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸⑶，蘇氨酸⑴；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見，例如，Creighton，Proteins 1984)。合適地，該種置換不發生在表位區域，因此對該抗原的免疫原性不具有明顯影響。蛋白變體還可包括相對于參考序列其中插入了另外氨基酸的那些蛋白變體，例如，該種插入可發生在1-10個位置(例如1-5個位置，合適地1或2個位置，特別是1個位置)，并可以，例如，在每個位置添加50或更少的氨基酸(例如20個或更少，特別是10個或更少，尤其是5個或更少)。合適地，該種插入不發生在表位區域，因此對該抗原的免疫原性不具有明顯影響。插入的一個實施例包括一段短的組氨酸殘基(例如，2-6個殘基)以幫助目的抗原的表達和/或純化。蛋白變體包括相對于參考序列氨基酸已經缺失的那些蛋白變體，例如，該種缺失可發生在1-10個位置(例如1-5個位置，合適地1或2個位置，特別是1個位置)，并可以， 例如，涉及在每個位置缺失50或更少的氨基酸(例如20個或更少，特別是10個或更少，尤其是5個或更少)。合適地，該種缺失不發生在表位區域，因此對該抗原的免疫原性不具有明顯影響。本領域技術人員將認識到特定的蛋白變體可包括置換、缺失和添加(或其任意組
合)ο確定抗原表位區域的方法在實施例中描述和示范。變體優選地顯示相對于相關參考序列至少約70% —致性，更優選地至少約80% 一致性和最優選地至少約90%—致性(例如至少約95%，至少約98%或至少約99% )。上下文中兩個或更多核酸或多肽序列的“一致性”或百分比“一致性”指，當比較和比對得到比較窗口中的最大對應或指定區域采用下列序列比較算法之一測量或通過人工比對和視覺觀察時，兩個或更多個序列或子序列彼此相同或具有一定百分比的相同(即，相對指定區域70%一致性，任選地75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的一致性)的氨基酸殘基或核苷酸。這樣的序列隨后可被稱為“基本一致的”。該定義還指測試序列的結果(compliment)。任選地，該一致性存在于長度至少約25至約50個氨基酸或核苷酸的區域，或者任選地長度為75-100個氨基酸或核苷酸的區域。合適地，該比較在對應于參考序列全長的窗口進行。在序列比較中，通常將一個序列作為參考序列，將測試序列與之比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，指定子序列坐標，并在需要時指定序列算法程序參數。可采用默認程序參數，或指定供選參數。隨后序列比較算法將根據程序參數計算測試序列相對于參考序列的序列一致性的百分比。本文所用的“比較窗口 ”指對兩個序列進行最佳比對后，其中序列可與相同數量連續位置的參考序列比較的片段。通過比對序列進行比較的方法已為本領域所熟知。通過序列的最佳比對進行比較可通過下述方法實現，例如，通過Smith & Waterman， Adv. App 1. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性算法，通過 Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比對算法，通過 Pearson & Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)的相似性搜索法，通過這些算法的計算機執行(GAP，BESTFIT, FASTA， 以及 Wisconsin 遺傳學軟件包中的 TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison, WI)，或者通過人工比對和視覺觀察(參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等人，編輯，1995 supplement))。一種有用算法的實施例為PILEUP。PILEUP采用漸進的，雙序列比對建立了來自一組相關序列的多重序列比對，從而顯示相關性和序列一致性百分比。它還繪制了可顯示用于建立比對的聚類關系的樹狀圖或系統樹圖。PILEUP采用了簡化的i^eng & Doolittle， J. Mol. Evol. 35 :351-360(1987)的漸進比對法。所采用的方法與 Higgins & Sharp， CABI0S5 :151-153(1989)所描述的方法類似。該程序可對高達300個序列進行比對，每個序列的最大長度為5，000個核苷酸或氨基酸。該多重比對程序始于對兩個最為相似的序列的成對比對，從而產生兩個比對序列的聚類。然后將該聚類與下一個最相關的序列或比對序列的聚類進行比對。兩個序列聚類通過將兩個單獨序列的成對比對的簡單擴展進行比對。 最終比對可通過一系列的漸進，雙序列比對實現。該程序通過指定特定的序列及其氨基酸或核苷酸坐標為序列比較區域并指定程序參數來運行。使用PILEUP時采用下列參數通過比較參考序列和其它測試序列以確定序列一致性關系百分比默認gap weight (3. 00)，默認 gap length weight (0· 10)，以及 weighted end gaps。PILEUP 可以從 GCG 序列分析軟件包的 7. 0 版等版本中獲取(Devereaux 等人，Nuc. Acids Res. 12 :387-395 (1984)。適于確定序列一致性和序列相似性百分比的算法的另一實施 例為BLAST和 BLAST2. 0 算法，其分別描述于 Altschul 等人，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul等人，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)。可進行BLAST分析的軟件可通過國家生物技術信息中心公開獲取(網址在www. ncbi. nlm. nih. gov)。該算法包括首先通過鑒定待測序列中長度為W的短字來鑒定高得分序列對(HSR)，其中該短字與數據庫序列中相同長度的字比對時匹配或滿足某些正數值閾值得分Τ。T指鄰近字得分閾值(Altschul等人， 同前)。這些初始鄰近字采樣數(word hits)作為種子啟動對包含它們的更長HSR的搜索。該字采樣數沿著每個序列的兩個方向伸展，直至累計比對得分增加。對核苷酸序列的累計分數采用參數M(對一對匹配殘基的獎賞分數；總是>0)和N(對不匹配殘基的懲罰分數；總是<0)進行計算。對于氨基酸序列，可使用得分矩陣來計算累計分數。以下情況下字采樣數向各方向的伸展被停止累計比對分數較其最大獲得值小數量X ；由于一個或多個負得分殘基比對的累積，累計分數降至0或以下；或者達到了任一序列的末端。BLAST 算法的參數W、T和X確定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)用默認字長⑷為11，預期(E)為5，M = 5，N = -4，并同時對兩條鏈進行比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序用默認字長(w)為3，和預期(E)為10，以及該BL0SUM62得分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915(1989))的比對(B)為 50，預期 (E)為10，M = 5，N = -4，并對兩條鏈進行比較。BLAST算法還可進行兩個序列間的相似度統計學分析(例如，參見Karlin & Altschul,Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 90 :5873-5787 (1993))。由 BLAST 算法所提供的一種相似度檢測為最小總可能性(P(N))，它對兩個核苷酸或氨基酸序列之間偶然產生匹配的可能性提供了指示。例如，當測試核酸與參考核酸之間比較得到的最小總可能性小于約0. 2， 更優選小于約0. 01，最優選小于約0. 001時，該核酸被認為與參考核酸相類似。本發明還涉及多核苷酸，其包含在適度嚴格條件(例如高度嚴格條件)下與編碼多肽的第二核苷酸序列的補體選擇性雜交的第一核苷酸序列，該多肽包含(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。短語“高度嚴格雜交條件”指探針與其目標子序列(通常在核酸的復雜混合物中)而不與其它序列進行雜交時的條件。高度嚴格條件為序列依賴性的且在不同的環境中將不同。更長序列特別在更高的溫度下雜交。對于核酸雜交的全面指導可參見Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridisation and the strategy of nucleic acid assays"(1993) 0 一般而言，高度嚴格條件可選定為較限定離子強度pH下具體序列的熱熔點(Tm)低大約5-10°C。Tm為(在限定離子強度、pH和核酸濃度下)平衡時50%的與目標互補的探針與目標序列進行雜交時的溫度(由于目標序列為過量存在，因此在平衡時在Tm下50%的探針被占用)。高度嚴格條件將是在pH7. 0至8. 3下鹽濃度小于約1. OM鈉離子，通常為約0. 01至1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，且對于短探針(例如，10至50個核苷酸)，溫度為至少約30°C，以及對長探針(例如，大于50個核苷酸)，溫度為至少約60°C的條件。高度嚴格條件還可通過添加去穩定劑例如甲酰胺實現。對于選擇性或特異性雜交， 陽性信號是背景的至少兩倍，任選地為背景雜交的10倍。示例性的高度嚴格雜交條件可以是如下條件50%甲酰胺、5x SSC以及SDS， 42°C下孵育，或者切SSC, 1% SDS，65°C下孵育，并在65°C下用0. hSSC和0. 1% SDS洗滌。當核酸編碼的多肽基本一致時，在高度嚴格條件下不能彼此雜交的該核酸仍然功能相同。這發生于，例如，當核酸的拷貝是通過遺傳密碼允許的最大密碼子簡并所生成時。 在該種情況下，該核酸通常在適度嚴格雜交條件下雜交。示例性的“適度嚴格雜交條件”包括在37°C下于40%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS的緩沖液中雜交，并在45°C下于IX SSC中洗滌。陽性的雜交是背景的至少兩倍。本領域普通
30技術人員將容易認識到，可采用替代性的雜交和洗滌條件以提供具有類似嚴格度的條件。短語“選擇性(或特異性)雜交”指在嚴格雜交條件下，當特定核苷酸序列存在于復合混合物(例如，總細胞或文庫DNA或RNA)中時，一種分子僅與該特定序列結合、雙聯或雜交。在任意情況下，多肽序列的變體將具有與參考序列基本相同的活性(對于多核苷酸，變體多核苷酸序列將編碼與參考序列具有基本相同活性的多肽)。基本相同的活性指參考序列在PBMC或全血對特定抗原的體外再刺激測定(例如，再刺激數小時至長達兩周之間，例如長達一天、1天至1周或者1至2周的時間)中活性的至少50%、合適地至少75% 且特別是至少90%，其中該測定通過培養懸浮液中淋巴組織增殖、細胞因子生成(通過 ELISA、CBA等測量)或者胞內和胞外染色(例如，采用特異性針對免疫標記物的抗體，例如 CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa、IFNg、CD40L、CD69等)然后以流式細胞儀分析T和B細胞應答特征來測量細胞的活化。合適地，基本相同的活性指參考序列在T細胞增殖和/或IFN-gamma 生成測定中的活性的至少50%、合適地至少75%且尤其是至少90%。多核苷酸組合物本文所用的術語“多核苷酸”指經過分離不含特定種類的總基因組DNA的分子。因此，編碼多肽的多核苷酸指包含一個或多個編碼序列，且從獲得該多核苷酸的種類的總基因組DNA基本分離或純化的多核苷酸片段。本領域技術人員將能理解，本發明的多核苷酸可包括表達或可改造為表達蛋白、 多肽、肽等的基因組序列、基因組外和質粒編碼的序列以及更小的工程改造基因片段。該種片段可天然分離，或人工修飾合成。本文所用的“分離”指多核苷酸與其它編碼序列基本分開，且該多核苷酸不包含大比例的無關編碼DNA，例如大染色體片段或其它功能基因或多肽編碼區。分離的核酸與位于該基因側翼并編碼與該基因不同的蛋白的其它開放閱讀框架相隔離。當然，這是指原始分離的DNA片段，且不排除隨后通過人工向該片段添加的基因或編碼區。本領域技術人員將能理解，多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，且可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其包含內含子并以一對一的方式與DNA分子相對應，還包括不包含內含子的mRNA分子。本發明的多核苷酸中可存在但不必須存在另外的編碼或非編碼序列，且多核苷酸可以(但不必須)與其它分子和/或支撐材料連接。多核苷酸可包含天然序列(即，編碼分枝桿菌抗原或其部分的內源性序列)或可包含該種序列的變體、生物或功能等價物。多核苷酸變體可包含一個或多個置換、添加、缺失和/或插入，如下文進一步描述，優選地使得所編碼多肽的免疫原性相對于參考蛋白未減小。對編碼多肽的免疫原性的影響可總體上通過下文所述方法評估。在另外的實施方式中，本發明提供了包含與本文所述序列的一個或多個相同或互補的序列的各種長度的連續片段的多核苷酸和多肽。例如，本發明提供了包含本文所述的參考序列的至少約30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或者更多個連續核苷酸以及其中任意中間長度的連續核苷酸的多核苷酸。可以容易地理解，上下文中的“中間長度”指舉例數值之間的任意長度，例如30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等; 150、151、152、153 等；包括所有 200-500,500-1000 中的整數，等等。
此外，本領域技術人員將能理解，由于遺傳密碼簡并的結果，存在多種編碼本文所述多肽的核苷酸序列。這些多核苷酸中一部分與任意天然基因的核苷酸序列的一致性相對低。然而，本發明特別預期了由于密碼子使用的不同而變化的多核苷酸，例如，對人和/或靈長動物密碼子選擇優化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本發明的范圍內。等位基因是由于核苷酸的一個或多個突變(例如缺失、添加和/ 或置換)而被改變的內源性基因。所得的mRNA和蛋白可以(但非必須)具有不同的結構或功能。等位基因可采用標準技術鑒定(例如雜交、擴增和/或數據庫序列比較)。多核苷酸鑒定和表征多核苷酸可通過各種成熟技術中的任意一種進行鑒定、制備和/或操作。例如，多核苷酸可通過篩選cDNA的微陣列(將在下文詳細描述)進行鑒定。該種篩選可，例如，采用Synteni微陣列(Palo Alto, CA)參照生產商的說明實施(且基本如khena等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :10614-10619(1996)和 Heller 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :2150-2155(1997)所述)。替代性地，多核苷酸可由cDNA擴增得到，該cDNA從表達本文所述的蛋白的細胞(例如結核分枝桿菌細胞)制備。該種多核苷酸可通過聚合酶鏈式反應 (PCR)擴增。對于該種方法，序列特異性引物可基于本文提供的序列設計，以及可購買或合成得到。多核苷酸的擴增部分可用于通過公知技術從合適的文庫(例如，結核分枝桿菌 cDNA文庫)分離全長基因。在該種技術中，可采用適于擴增的一種或多種多核苷酸探針或引物篩選文庫(cDNA或基因組)。優選地，文庫可經大小選擇以包括更大的分子。隨機引物文庫也可優選用于鑒定基因的5’和上游區域。基因組文庫優選用于獲得內含子和延伸5’ 序列。對于雜交技術，可采用公知技術標記部分序列(例如，通過切口平移或以32P進行末端標記)。然后通過包含具有標記探針的變性細菌集落(或包含噬菌斑的菌苔)的雜交過濾器(hybridising filters)總體篩選細菌或噬菌體文庫(參見Sambrook等人，Molecular Cloning =A Laboratory Manual (2000))。選擇和擴增雜交菌落或噬菌斑，且分離DNA以供進一步分析。通過例如采用來自該部分序列的引物和來自該載體的引物的PCR分析cDNA 克隆以確定添加序列的量。可生成限制性圖譜和部分序列以鑒定一種或多種重疊克隆。然后可采用標準技術(可包括生成一系列缺失克隆)確定完整的序列。然后所得的重疊序列可被裝配入單個連續序列。可采用公知技術通過連接適合的片段生成全長cDNA分子。替代性地，有多種擴增技術以從部分cDNA序列獲得全長編碼序列。在這些技術中，擴增通常通過PCR進行。各種市售的試劑盒中的任意一種均可用于實施該擴增步驟。引物可采用例如本領域已知的軟件進行設計。引物優選具有22-30個核苷酸的長度，具有至少50%的GC含量且在約68°C _72°C的溫度下退火至目標序列。擴增區域可按上述方式測序，且重疊序列被裝配進入連續序列。一種這樣的擴增技術是反向PCR(參見iTriglia等人，Nucl. Acids Res. 16 8186(1988))，其采用限制性內切酶生成該基因已知區域的片段。該片段然后通過分子內連接環化，并用作PCR的模板，該PCR采用從已知區域衍生的趨異(divergent)弓丨物。在替代性的方法中，鄰近部分序列的序列可通過采用針對接頭序列的引物和特異性針對已知區域的引物的擴增重新獲得。該擴增的序列通常進行第二輪擴增，該第二輪擴增采用相同的接頭引物和特異性針對已知區域的第二引物。WO 96/38591中描述了該步驟的一種變異， 其中采用了從已知序列的相反方向啟動延伸的兩種引物。另一種該類技術被稱為“cDNA 末端快速擴增”或RACE。該技術包括采用內部引物和外部引物，其與polyA區域或載體序列雜交，以鑒定已知序列的5’和3’的序列。另外的技術包括捕捉PCR(Lagerstr0m等人， PCR Methods Applic. 1 111-19 (1991))和步行 PCR(Parker 等人，Nucl. Acids. Res. 19 3055-60(1991))。采用擴增的其它方法也被用于獲得全長cDNA序列。在某些情況下，有可能通過在表達序列標記(EST)數據庫(例如可從GenBank獲得)中提供的序列的分析獲得全長cDNA序列。對重疊ESTs的檢索通常可采用公知程序 (例如NCBI BLAST檢索)進行，該ESTs可用于生成連續全長序列。全長DNA序列還可通過基因組片段分析獲得。多核苷酸在宿主細胞中的表達編碼多肽、或融合蛋白或其功能等價物的多核苷酸序列或其片段可用于重組DNA 分子以引導多肽在合適的宿主細胞中的表達。由于遺傳密碼的固有簡并，可生成編碼基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列，且這些序列可用于克隆或表達給定多肽。本領域技術人員將能理解，生成具有非天然存在的密碼子的多肽編碼核苷酸序列在某些情況下是有利的。例如，可以選擇被特定的原核或真核宿主所優選的密碼子以提高蛋白表達率或生成具有所需特性(例如具有比從天然存在的序列生成的轉錄物的半衰期更長的半衰期)的重組RNA轉錄物。此外，該多核苷酸序列可通過本領域通常已知的方法工程改造，從而為了各種理由改變多肽編碼序列，該理由包括但不限于，調節基因產物的克隆、加工和/或表達的改變。例如，通過隨機片段化的DNA改組和基因片段的PCR重組以及合成寡核苷酸可用于對核苷酸序列進行改造。此外，定點突變可用于插入新的限制性內切位點、改變糖基化模式、 改變密碼子偏好、生成剪切變體或弓I入突變等等。天然、修飾或重組核酸序列可被連接至異源性序列以編碼融合蛋白。例如，為了在肽文庫篩選多肽活性的抑制劑，編碼能被市售的抗體識別的嵌合蛋白是有用的。融合蛋白還可通過工程改造以包含位于多肽編碼序列和異源性蛋白序列之間的裂解位點，使得該多肽可被裂解并從異源性部分純化。編碼所需多肽的序列可采用本領域公知的方法完全或部分合成(參見 Caruthers, M. H.等人，Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp 215-223(1980)，Horn 等人，Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp 225-232(1980))。替代性地，該蛋白本身可利用合成多肽的氨基酸序列或其部分的化學方法生產。例如，肽合成可利用各種固相技術(Roberge等人， Science 269 :202-204 (1995))實現，且可例如利用 ABI 431A 肽合成儀(Perkin Elmer, Palo Alto, CA)實現自動化合成。新合成的肽可通過制備型高壓液相色譜(例如，Creightonjroteinsjtructures and Molecular Principles (1983))或本領域其它相當的技術基本上純化。合成肽的組合物可通過氨基酸分析或測序(例如，Edman降解方法)確認。另外，多肽或其任一部分的氨基酸序列可在直接合成中改變和/或通過化學方法與來自其它蛋白或其任意部分的序列合并，以生成變體多肽。為了表達所需的多肽，編碼該多肽或其功能等同物的核苷酸序列可被插入合適的
33表達載體，即，包含插入編碼序列轉錄和翻譯的必需元件的載體。可采用本領域技術人員公知的方法構建包含編碼目標多肽的序列和適當的轉錄和翻譯控制元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、合成技術以及體內遺傳重組。這些技術描述于Sambrook等人， Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2000),以及 Ausubel 等人，Current Protoeols in Molecular Biology (每年更新)。各種表達載體/宿主系統可用于包含和表達多核苷酸序列。其包括，但不限于，微生物，例如用重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達載體轉化的細菌；以酵母表達載體轉化的酵母；以病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；以病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV ；煙草花葉病毒，TMV)或以細菌表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或動物細胞系統。存在于表達載體中的“控制元件”或“調節序列”是載體的非翻譯區域一增強子、 啟動子、5’和3’未翻譯區域一其與宿主細胞蛋白相互作用以進行轉錄和翻譯。該元件可在強度和特異性上變化。根據所用的載體系統和宿主，可采用任意數量的合適轉錄和翻譯元件，包括組成型或誘導型啟動子。例如，在細菌系統中克隆時，可以使用誘導型啟動子例如 PBLUESCRIPT 噬菌粒(Stratagene, La Jolla, Calif.)或 PSPORT1 質粒(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)等的雜交IacZ啟動子。在哺乳動物細胞系統中，通常優選來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子。如果有必要生成包含編碼多肽的序列的多個拷貝的細胞系，基于SV40或EBV的載體可有利地與具有合適的可選擇標記一起使用。在細菌系統中，根據被表達多肽的目標用途，可選擇多種表達載體。例如， 在需要較大的量時，例如對于抗體的誘導，可使用引導能被容易地純化的融合蛋白高水平表達的載體。該載體包括，但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達載體如 BLUESCRIPTGtratagene)，其中該編碼目標多肽的序列可被連接進入載體，并與氨基末端Met和的β -半乳糖苷酶的后續7個殘基的序列同框，從而生成雜交蛋白；ρΙΝ載體 (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 2M =55O3-55O9 (I989))等；pGEX 載體(Promega， Madison,Wis.)也可用于表達作為具有谷胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。 一般而言，該融和蛋白為可溶的，并能通過吸附至谷胱甘肽-瓊脂糖珠，然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫從裂解的細胞容易地純化。在該系統中制備的蛋白可被設計為包括肝素、凝血酶或XA因子蛋白酶裂解位點，從而可根據需要使得克隆的目標多肽從GST部分釋放。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用一些包含組成型或誘導型啟動子的載體，例如alpha因子、醇氧化酶和PGH。包含組成型或誘導型啟動子的其它載體包括GAP、PGK、GAL和ADH。綜述可參見Ausubel等人(同上)以及Grant等人，Methods Enzymol. 153 :516-544(1987)和 Romas 等人 Yeast 8 423-88(1992)。當采用植物表達載體時，編碼多肽的序列的表達可通過多種啟動子的任意一種驅動。例如，CaMV的35S和19S啟動子等病毒啟動子可單獨使用或與來自TMV的omega前導序列合并使用(Takamat su, EMBO J. 6 :307-311 (1987))。替代性地，可使用作為RUB I SCO的小亞基或熱休克啟動子等植物啟動子(Coruzzi等人，EMBO J. 3 :1671-1680(1984) ；Broglie 等人，Science 224 :838-843 (1984)；和 Winter 等人，Results Probl. Cell Differ. 17 85-105(1991))。這些構建體可通過直接DNA轉化或病原體介導的轉染被引入植物細胞。這些技術描述于一些通常可獲得的綜述中(參見，例如，Hobbs in McGraw Hill Yearbook ofScience and Technology pp 191-196(1992))。昆蟲系統也可用于表達目標多肽。例如，在一個這樣的系統中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)被用作載體來表達草地夜蛾 (Spodoptera frugiperda)細胞或粉紋夜蛾幼蟲(Trichoplusia larvae)中的外源基因。 編碼該多肽的序列可被克隆進入病毒的非必需區，例如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動子的控制下。該多肽編碼序列的成功插入將使該多角體蛋白基因失活，并生成缺乏外殼蛋白的重組病毒。該重組病毒可隨后用于感染，例如，可表達目標多肽的草地夜蛾細胞或粉紋夜蛾幼蟲(Engelhard 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91 :3224-3227 (1994))。在哺乳動物宿主細胞中，通常可獲得一些基于病毒的表達系統。例如，當采用腺病毒作為表達載體時，可將編碼感興趣的多肽的序列連接進入由晚期啟動子和三聯前導序列組成的腺病毒轉錄/翻譯復合物。在病毒基因組的非必需El區和E3區中的插入可用于獲得能在感染宿主細胞內表達多肽的活病毒(Logan & Sienk，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 81 :3655-3659 (1984))。此外，轉錄增強子例如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強子，可用于增強哺乳動物宿主細胞中的表達。用腺病毒載體進行工作的方法和方案綜述于Wold， Adenovirus Methods and Protocols，1998。有關腺病毒載體用途的其它參考可參見 Adenovirus :A Medical Dictionary, Bibliography, and Annotated Research Guide to Internet References, 2004。特定的起始信號也可用于實現編碼目標多肽的序列的更有效翻譯。這類信號包括 ATG起始密碼子和鄰近序列。當序列編碼該多肽時，其起始密碼子和上游序列被插入合適的表達載體，可無需另外的轉錄或翻譯控制信號。然而，當僅插入了編碼序列或其部分時，應當提供包含ATG起始密碼子的外源性翻譯控制信號。此外，該起始密碼子應當位于正確的閱讀框內以確保整個插入物的翻譯。外源性翻譯元件和起始密碼子可來自天然和合成的各種來源。可通過包含適用于所用的特定細胞系統的增強子來增強表達效力，該增強子如描述于文獻中的那些(Scharf.等人，Results Probl. Cell Differ. 20 125-162 (1994))。此外，可選擇宿主細胞菌株的調節插入序列表達或者以所需方式加工表達蛋白的能力。這些多肽的修飾包括，但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、酯化和酰化。裂解該蛋白的“Pr印ro”形式的翻譯后加工也可用于促進正確插入、折疊和/或功能。不同的宿主細胞細胞(例如，CH0、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)對該種翻譯后活動具有特定的細胞結構和特征機制，可經選擇以確保該外源蛋白的正確修飾和加工。通常優選穩定表達以進行重組蛋白的長期高產量生產。例如，穩定表達目標多核苷酸的細胞系可用表達載體轉化，該表達載體可能包含病毒復制起點和/或外源性表達元件以及在相同或不同載體上的選擇性標記基因。在導入載體后，可將細胞在富集培養基中生長1-2天，然后轉入選擇性培養基。該選擇性標記的目的在于賦予對選擇的耐受性，其存在允許成功表達該導入序列的細胞的生長和回收。穩定轉化細胞的耐受性克隆可采用適于該細胞類型的組織培養技術增殖。任意數量的選擇系統可用于回收轉化細胞系。這些選擇系統包括，但不限于，可分別應用于tk. sup.-或aprt. sup—細胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11 223-32(1977))和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等人，Cell 22 :817-23(1990))基因。此外，抗代謝產物、抗生素或除草劑抗性可用作選擇的基礎；例如，賦予對氨甲喋呤的抗性的dhfr (Wigler 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 77 :3567-70 (1980))；賦予對氨基糖苷類、 新霉素和 G-418 的抗性的 npt (Colbere-Garapin 等人，J. Mol. Biol. 150 :1-14(1981))； 以及分別賦予對氯磺隆(chlorsulfuron)和膦絲菌素乙酰基轉移酶的抗性的als和 ？站⑶證巧，同上文)。其它的可選擇基因已有描述，例如，trpB，其允許細胞利用吲哚來代替色氨酸，或者hisD，其允許細胞利用組氨醇來代替組氨酸(Hartman & Mulligan，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :8047-51 (1988))。最近，可見標記的使用已經得到普及，其中這些標記物如花青素、β -葡糖醛酸酶及其底物GUS以及螢光素酶及其底物螢光素不僅被廣泛用于識別轉化體，還被廣泛用于對由特定載體系統得到的瞬時或穩定蛋白表達進行定量 (Rhodes 等人，Methods Mol. Biol. 55 121-131 (1995))。盡管標記基因表達的存在/缺失表明目標基因也存在，它的存在和表達可能需要確認。例如，如果編碼多肽的序列被插入標記基因序列內，包含序列的重組細胞可通過標記基因功能的缺失進行鑒定。替代性地，標記基因可與多肽編碼序列在單個啟動子的控制下串聯。該標記基因響應誘導或選擇的表達通常還指示了該串聯基因的表達。替代性地，包含和表達所需多核苷酸序列的宿主細胞可通過本領域技術人員已知的各種方法進行鑒別。這些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白生物測定或免疫測定技術，其包括用于核酸或蛋白的檢測和/或定量的基于膜、溶液或芯片的技術。本領域已知采用特異性針對多核苷酸編碼產物的多克隆或單克隆抗體檢測和測量該產物表達的各種方案。實施例包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA) 和熒光激活細胞分類(FACS)。在一些應用中優選采用對在給定多肽上的兩個非干擾表位具有活性的單克隆抗體的二位的、基于單克隆的免疫測定，但也可采用競爭性結合測定。 這些和其它測定描述于，其中包括，Hampton等人，Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)和 Maddox 等人，J. Exp. Med. 158 :1211-1216 (1983)。各種標記和結合技術已為本領域技術人員所知，并可用于各種核酸和氨基酸測定。生成用于檢測與多核苷酸相關的序列的標記的雜交或PCR探針的方法包括低聚標記、 切口平移、末端標記或采用標記核苷酸的PCR擴增。替代性地，該序列或其任意部分可被克隆進入載體以生成mRNA探針。該載體在本領域已知，并且已有市售，其可用于通過添加合適的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6以及標記的核苷酸體外合成RNA探針。這些方法可采用各種市售的試劑盒進行。可以使用的合適的報道分子或標記包括放射性核素、酶、熒光的、 化學發光的或者生色的試劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。用目標多核苷酸序列轉化的宿主細胞可在適于蛋白從細胞培養物中表達和回收的條件下進行培養。根據所用的序列和/或載體，通過重組細胞生成的蛋白可被分泌或包含在胞內。本領域技術人員將能理解，包含多核苷酸的表達載體可被設計為包含信號序列， 該信號序列引導編碼的多肽通過原核或真核細胞膜分泌。其它重組構建體可用于將編碼目標多肽的序列連接至編碼能促進可溶性蛋白純化的多肽結構域的核苷酸序列。該種有助純化的結構域包括，但不限于，金屬鰲合肽(例如允許在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊，允許在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，以及在FLAGS伸展/親和純化系統使用的結構域(Immimex Corp, Seattle Wash.))。在該純化結構域和編碼多肽之間包含的可裂解接頭序列例如特異性針對XA因子或腸激酶anvitrogen. San Diego, Calif.) 可用于促進純化。一種該類表達載體提供了包含目標多肽和在硫氧還蛋白或腸激酶裂解
36位點之前的核酸編碼6個組氨酸殘基的融合蛋白的表達。該組氨酸殘基促進了如Porath 等人，Prot. Exp. Purif. 3 =263-281 (1992)所述的在IMIAC(固定化金屬親和層析)上的純化，該腸激酶裂解位點提供了從該融合蛋白純化所需多肽的方法。Kroll等人，DNA Cell Biol. 12 :441-453(1993))提供了包含融合蛋白的載體的討論。體內多核苷酸傳遞技術在另外的實施方式中，包含本發明的一種或多種多核苷酸的遺傳構建體被體內導入細胞。這可通過本領域公知的任意多種技術實現，下文概述了其中一些技術以進行說明。1.腺病毒用于體內傳遞一種或多種核酸序列的優選方法中的一種包括使用腺病毒表達載體。“腺病毒表達載體”意在包括如下構建體，該構建體包含了足以(a)支持構建體的包裝和(b)以正義和反義方向表達已經克隆在構建體中的多核苷酸的腺病毒序列。當然，在反義構建體方面，表達不需要該基因產物被合成。該表達載體包含腺病毒的遺傳工程改造的形式。有關腺病毒，一種361Λ的線性雙鏈DNA病毒的遺傳結構的知識允許用高達71Λ的外源序列置換大部分的腺病毒 DNA(Grunhaus & Horwitz，1992)。與逆轉錄病毒不同，宿主細胞的腺病毒感染并不導致染色體整合，因為腺病毒DNA可以游離方式復制而沒有潛在的基因毒性。此外，腺病毒是結構穩定的，且在廣泛擴增后未檢測到基因組重排。腺病毒可實際感染所有上皮細胞，而與其細胞周期階段無關。目前為止，腺病毒感染似乎僅與輕微的疾病有關(例如人的急性呼吸道疾病)。腺病毒特別適合用作基因轉移載體，因為它具有中等大小的基因組、容易操作、高效價、廣泛的靶細胞范圍以及高傳染性。病毒基因組的兩端均含有100-200堿基對反向重復(ITRs)，它們是病毒DNA復制和包裝所必需的順式元件。基因組的早期(E)和晚期(L) 區包含了被病毒DNA復制的起始所分開的不同轉錄單元。El區(ElA和ElB)編碼負責調節病毒基因組和少量細胞基因的轉錄的蛋白。E2區(E2A和E2B)區的表達導致用于病毒DNA 復制的蛋白的合成。這些蛋白涉及DNA復制、晚期基因表達和宿主細胞關閉(Renan，1990)。 晚期基因的產物(包括大部分病毒衣殼蛋白)僅在主要的晚期啟動子(MLP)形成的單個主要轉錄物的重要加工后表達。MLP(位于16. 8m. u.)在感染晚期特別有效，從該啟動子形成的所有mRNA具有5 ‘_三聯前導(TPL)序列，這使得它們成為翻譯的優選mRNA。在當前的系統中，重組腺病毒是從穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組生成的。由于兩個前病毒載體之間可能的重組，可從該過程生成野生型的腺病毒。因此，重要的是從單個噬菌斑分離單個的病毒克隆，并檢驗其基因組結構。目前復制缺陷性的腺病毒載體的生成和繁殖取決于代號四3的獨特的輔助細胞系，它是通過Ad5DNA片段和組成表達El蛋白由人胚胎腎細胞轉化得到(Graham等人， 1977)。由于E3區在腺病毒基因組中是非必需的(Jones & Sienk，1978)，目前的腺病毒載體在293細胞的幫助下攜帶E1、D3或兩個區中的外源DNA(Graham & Prevec，1991)。腺病毒在性質上可以包裝約105%的野生型基因組((ihosh-Choudhury等人，1987)，提供約額外 2kB DNA的容量。結合El和E3區中約5. 5kB的可置換DNA，目前的腺病毒載體的最大容量在7. 5kB以下，或者是載體總長的約15%。超過80%的腺病毒的病毒基因組保留在載體骨架中，并且是載體攜帶的細胞毒性的來源。此外，El-缺失病毒的復制缺陷是不完整的。例如，在高多重性感染(MOI)下現有載體中觀察到了病毒基因表達的遺漏(Mulligan，1993)。輔助細胞系可來自于人胚胎腎細胞、肌肉細胞、造血細胞或其它人胚胎間充質或上皮細胞等人類細胞。替代性地，該輔助細胞可來自于人腺病毒允許的其它哺乳動物種類的細胞。這些細胞包括，例如，Vero細胞或其它猴胚胎間充質或上皮細胞。如上所述，目前優選的輔助細胞系是四3。Racher等人(19卯)披露了培養293細胞和繁殖腺病毒的改良方法。在一種形式下，可通過將單個細胞接種進入含100-200ml培養基的1升硅化轉瓶(Techne，Cambridge， UK)中生長天然細胞聚集物。在40rpm下攪拌后，用臺盼藍評估細胞活性。在另一形式中， Fibra-Cel微載體(Bibby Sterlin, Stone, UK) (5g/l)按如下應用。將重新懸浮于5ml培養基的細胞接種物添加至250mlErlenmeyer燒瓶中的載體(50ml)并靜置，偶爾攪拌，持續 1至4小時。然后用50ml新鮮培養基更換該培養基并開始振蕩。為了生成病毒，將細胞生長至約80%匯合，然后更換培養基(至25%的終體積)，并以0.05的MOI添加腺病毒。將培養物靜置過夜，然后將體積增加至100%，并開始振蕩另外72小時。除了該腺病毒載體是復制缺陷型或者至少條件性缺陷的要求之外，腺病毒載體的性質對于本發明成功實施并不認為是關鍵的。腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞組A-F的任意一種。亞組C的5型腺病毒是優選的起始材料，以獲得用于本發明的條件性復制缺陷型腺病毒載體，因為5型腺病毒是人腺病毒，人們已知有關于它的大量生化和遺傳信息，且已經被歷史性地用于以腺病毒為載體的大多數構建體中。如上所述，根據本發明的典型載體是復制缺陷型的，且不具有腺病毒El區。因此， 可極為方便地將編碼目標基因的多核苷酸導入該El-編碼序列被去除的位置。然而，該構建體在腺病毒序列內的插入位置對于本發明而言并非關鍵。編碼目標基因的多核苷酸也可被插入Karlsson等人(1986)所述的E3替換載體中替代缺失的E3區或者插入輔助細胞系或輔助病毒與E4缺陷互補的E4區。腺病毒易于生長和操作，并顯示了廣泛的體外和體內宿主范圍。該組病毒可以高效價獲得，例如IO9-IO11噬菌斑形成單位/ml，且它們具有高感染性。腺病毒的生命周期不要求整合進入宿主細胞基因組。由腺病毒載體傳遞的外源基因是游離的，且因此對于宿主細胞具有低基因毒性。在用野生型腺病毒接種的研究中未有副作用的報導(Couch等人， 1963 ；Top等人，1971)，證明了它們作為體內基因傳遞載體的安全性和治療潛力。腺病毒載體已用于真核基因表達(Levrero等人，1991 ；Gomez-Foix等人，
1992)和疫苗開發(Grunhaus& Horwitz，1992 ;Graham & Prevec，1992)。最近，動物研究顯示，重組腺病毒可用于基因療法Gtratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991 ； Stratford-Perricaudet等人，1990 ；Rich等人，1993)。向不同組織施用重組腺病毒的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等人，1991 ；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，
1993)、外周靜脈注射(Herz& Gerard，1993)以及立體定向接種至腦中(Le Gal La Salle 等人，1993)。腺病毒載體可來源于人腺病毒。替代性地，它們可來源于其它物種的腺病毒，例如，黑猩猩，其可具有一定優勢，即該病毒載體不會被針對許多人類對象體內循環的人腺病毒的抗體所中和(參見，例如Tatsis N等人Gene Therapy 2006 13:421-429)。35型腺病毒相對不常見，因此它們對于載體本身具有低水平的預存免疫，且已被用作正在開發中的某些結核病疫苗的傳遞系統(參見，例如，Radosevic等人hfection and Immunity 2007 75(8) :4105-4115)。35型腺病毒在本發明中作為傳遞載體也具有特定的價值。2.逆轉錄病毒逆轉錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征在于通過逆轉錄過程在感染細胞內將它們的RNA轉化為雙鏈DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得的DNA作為前病毒穩定地整合進入細胞染色體并引導病毒蛋白的合成。該整合導致病毒基因序列保留在接受者細胞及其后代中。該逆轉錄病毒基因組包含三個基因，gag、pol和erw，其分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜成分。在gag基因上游發現的序列包含了將基因組包裝進入病毒體的信號。兩個長末端重復(LTR)序列存在于病毒基因組的5’和3’末端。它們包含強啟動子和增強子序列，且也為宿主細胞基因組的整合所需(Coffin，1990)。為了構建逆轉錄病毒載體，編碼一種或多種目標寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸被插入病毒基因組中某些病毒序列的位置，以生成具有復制缺陷的病毒。為了生成病毒體， 構建了包含gag、pol和env基因但不包含LTR和包裝成分的包裝細胞系(Marm等人，1983)。 當包含cDNA以及逆轉錄病毒LTR和包裝序列的重組質粒被導入該細胞系時(例如通過磷酸鈣沉淀導入)，該包裝序列允許該重組質粒的RNA轉錄物被包裝進入病毒顆粒，后者可隨后分泌進入培養基(Nicolas & Rubenstein，1988 ；Temin, 1986 ；Mann 等人，1983)。然后收集包含重組逆轉錄病毒的培養基，任選地進行濃縮，并用于基因轉移。逆轉錄病毒載體能夠感染各種各樣的細胞類型。然而，整合和穩定表達需要宿主細胞的分裂(Paskind等人， 1975)。最近已開發設計用于允許特異性靶向逆轉錄病毒載體的新型方法，該方法基于通過向該病毒包膜化學添加乳糖殘基對逆轉錄病毒進行化學修飾。該修飾可允許通過唾液酸糖蛋白受體特異性感染肝細胞。還設計了靶向重組逆轉錄病毒的不同方法，其中使用了針對逆轉錄病毒包膜蛋白和針對特異性細胞受體的生物素化抗體。該抗體通過采用鏈霉親和素與生物素成分偶聯 (Roux等人，1989)。采用針對主要組織相容性復合物I或II類抗原的抗體，它們證明了親嗜性病毒對攜帶這些表面抗原的各種人細胞的體外感染(Roux等人，1989)。3.腺相關病毒AAV (Ridgeway, 1988 ；Hermonat & Muzycska，1984)是一種細小病毒，其作為腺病毒儲藏中的污染被發現。它是一種未與任何疾病關聯的獨特病毒(85% US人群中存在抗體)。它還被分類為依賴病毒，因為它的復制依賴于輔助病毒(例如腺病毒)的存在。已分離出五種血清型，其中AAV-2得到了最好的鑒定。AAV具有單鏈線性DNA，其被衣殼化進入衣殼蛋白VPl、VP2和VP3，以形成直徑為 20-24nm 的二十面體病毒體(Muzyczka & McLaughlin，1988)。AAV DNA大約為4. 7千堿基長。它包含兩個閱讀框，并且側翼有兩個ITR。在AAV 基因組中有兩個主要的基因r印和cap。r印基因編碼負責病毒復制的蛋白，而cap編碼衣殼蛋白VP1-3。每個ITR形成T-形發夾結構。這些末端重復為染色體整合唯一必需的 AAV順式元件。因此，AAV可被用作載體，該載體去除了所有病毒編碼序列并由用于傳遞的基因盒取代。已鑒定了三個病毒啟動子，并根據它們的圖譜位置命名為P5、pl9和p40。p5
39和P19的轉錄導致了 r印蛋白的生成，p40的轉錄生成衣殼蛋白(Hermonat & Muzyczka， 1984)。有多個因素激發研究人員研究以rAAV作為表達載體的可能性。其中一個因素是傳遞基因以整合進入宿主染色體的要求令人吃驚的少。其必須有145-bpITR，這僅是AAV基因組的6%。這為在載體中裝配4.5-1Λ DNA插入物提供了空間。盡管這種攜帶能力可能阻止AAV傳遞大的基因，它十分適于傳遞反義構建體。由于其安全性，AAV也是傳遞載體的良好選擇。存在一種相對復雜的援救機制移動rAAV不僅需要野生型腺病毒，還需要AAV基因。同樣地，AAV不具有病原性，并且不與任何疾病相關。病毒編碼序列的去除使得對病毒基因表達的免疫反應最小化，因此，rAAV不會激發炎癥反應。4.作為表達構建體的其它病毒載體其它的病毒載體可在本發明中用作表達構建體以將寡核苷酸或多核苷酸序列傳遞至宿主細胞。可采用從牛痘病毒(Ridgeway，1988 ；Coupar等人，1988)、慢病毒、脊髓灰質炎病毒和皰疹病毒等病毒衍生的載體。其它的痘病毒衍生載體，例如雞痘衍生載體，也預期可被使用。它們提供了對于各種哺乳動物細胞的多個具有吸引力的特征(Friedmarm，1989 ； Ridgeway, 1988 ；Coupar 等人，1988 ；Horwich 等人，1990)。隨著最近對缺陷型肝炎B病毒的認識，對于不同病毒序列的結構-功能關系已經有了新的認識。體外研究顯示，即使刪除了基因組的多達80%，該病毒仍能保留輔助依賴性包裝和反轉錄的能力(Horwich等人，1990)。這提示了該基因組的大部分可被外源性遺傳材料替換。嗜肝性和持續性(整合)對于肝定向基因轉移而言是特別有吸引力的特性。 Chang等人(1991)將氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因導入鴨肝炎B病毒基因組中聚合酶、表面和前表面(pre-surface)編碼序列處。它與野生型病毒共轉染進入鳥類肝癌細胞系。包含高效價重組病毒的培養基用于感染原始小鴨肝細胞。在轉染后至少M天檢測到了穩定的CAT基因表達(Chang等人，1991)。另外的“病毒”載體包括類病毒顆粒(VLPs)和噬菌體。5.非病毒載體為了實現本發明的寡核苷酸或多核苷酸序列的表達，該表達構建體必須被傳遞進入細胞。該傳遞可如在轉化細胞系的實驗室步驟中在體外實現，或者如某些疾病階段的治療在體內或離體實現。如上所述，一種優選的用于傳遞的機制是通過病毒感染，其中該表達構建體被包裝進入感染性病毒顆粒中。一旦該表達構建體被傳遞進入細胞，編碼所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸可在不同的位置定位和表達。在某些實施方式中，編碼該構建體的核酸可被穩定整合進入該細胞的基因組中。這種整合可通過同源性重組(基因替換)特定地定位和定向或者可整合進入隨機的非特異性位置(基因增強)。在進一步的實施方式中，該核酸可作為單獨的附加型DNA片段被穩定維持在細胞中。這些核酸片段或“附加體”編碼足以允許獨立于宿主細胞周期或與宿主細胞周期同步的維持和復制的序列。表達構建體如何傳遞進入細胞和該核酸在細胞內的位置取決于所用的表達構建體的類型。在本發明的某些實施方式中，包含一個或多個寡核苷酸或多核苷酸序列的表達構建體可由裸重組DNA或質粒簡單組成。該構建體的傳遞可通過，例如，物理或化學透過細胞膜的任意方法實施。這特別適用于體外傳遞，但也可用于體內傳遞。Dubensky等人(1984) 以磷酸鈣沉淀的形式成功地將多瘤病毒DNA注入了成年和新生小鼠的肝和脾，顯示了活性病毒復制和急性感染。Benvenisty & Reshef (1986)還證實了直接腹腔內注射磷酸鈣沉淀質粒導致轉染基因的表達。可以預期編碼目標基因的DNA也可以類似方式體內傳遞并表達
基因產物。用于將裸DNA表達構建體傳遞進入細胞的本發明的另一實施方式可包括粒子轟擊。該方法取決于將DNA-包被的微粒加速至高速以允許它們穿透細胞膜并進入細胞而不殺傷細胞的能力(Klein等人，1987)。已經開發了多種用于加速小顆粒的裝置。其中一種這樣的裝置依靠高壓放電生成電流，并進而提供推動力(Yang等人，1990)。所用的微粒包含生物惰性物質如鎢或金珠。所選的器官包括已經被體內轟擊的大鼠和小鼠的肝、皮膚和肌肉組織(Yang等人，1990 ；Zelenin等人，1991)。這可能要求手術暴露該組織或細胞，以消除槍和靶器官之間的任何干擾組織，即，離體處理。又，編碼特定基因的DNA可通過該方法被傳遞并仍然被引入。細菌也可用作傳遞方法(例如，李斯特菌，參見W02004/11048)，特別是BCG。多肽組合物在其它方面，本發明提供了多肽組合物。一般地，本發明的多肽是分離多肽(即，與其通常發現天然伴隨的那些成分相分
離 ) 。例如，當與天然系統中部分或所有共存物質相分離時，天然存在的蛋白是分離的。 優選地，該種多肽的純度為至少約90%，更優選至少約95%，最優選至少約99%。當例如多核苷酸被克隆進入并非天然環境一部分的載體時，該多核苷酸被認為是分離的。多肽可通過各種公知技術中的任意一種制備。由上述DNA序列編碼的重組多肽可利用本領域普通技術人員已知的各種表達載體中的任意一種由該DNA序列容易地制備。表達可在以包含了編碼重組多肽的DNA分子的表達載體轉化或轉染的任意合適宿主細胞中實現。合適的宿主細胞包括原核細胞、酵母和更高級的真核細胞，例如哺乳動物細胞和植物細胞。優選地，所用的宿主細胞為大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞系如COS或CH0。來自于將重組蛋白或多肽分泌進入培養基的合適宿主/載體系統的上清液可首先通過已有市售的過濾器濃縮。濃縮后，該濃縮物可被應用至合適的純化基質如親和基質或離子交換樹脂。 最后，可采用一個或多個反相HPLC步驟來進一步純化重組多肽。本發明的多肽、其免疫原性片段以及其它的變體具有小于約100個氨基酸，且通常小于約50個氨基酸，并且還能利用本領域普通技術人員公知的技術采用合成手段生成。例如，這些多肽可采用市售的固相技術的任意一種合成，例如Merrifield固相合成法，其中氨基酸被順序添加至生長中的氨基酸鏈。參見Merrifield，J. Am. Chem. Soc. 85 2149-2146(1963)。自動化合成多肽的設備可從如 Perkin Elmer/Applied Bio Systems Division (Foster City, CA)等供應商處購得，并可參照生產商的說明進行操作。在某些特定實施方式中，多肽可以是包含多個本文所述的多肽的融合蛋白，或者是包含至少一個本文所述的多肽和一個不相關序列的融合蛋白，該種蛋白的范例包括破傷風、結核病和肝炎蛋白(參見，例如，Stoute等人，New Engl. J. Med. 336 :86-91 (1997))。融合伙伴可以，例如，協助提供T輔助表位(免疫原性融合伙伴)，優選為被人識別的T輔助表位，或者可協助以比天然重組蛋白更高的產率表達該蛋白(表達增強子)。某些優選的融合伙伴既是免疫原性的也是表達增強的融合伙伴。可選擇其它的融合伙伴，以增強該蛋白的溶解度或者使該蛋白靶向所需的胞內區室。其它進一步的融合伙伴包括親和標記，其促進該蛋白的純化。融合蛋白通常可采用包括化學綴合的標準技術制備。優選地，融合蛋白作為重組蛋白表達，允許在表達系統中相對于非融合蛋白以更高水平生成。簡言之，編碼該多肽成分的DNA序列可被單獨裝配，并連接進入合適的表達載體。編碼一個多肽成分的DNA序列的 3’端經過或不經過肽接頭被連接至編碼第二多肽成分的DNA序列的5’端，使得該序列的閱讀框架協調(in phase) 0這允許翻譯成為保留了兩種成分多肽的生物活性的單個融合蛋白。肽接頭序列可用于通過足以確保每個多肽能折疊成為其二級和三級結構的距離來分隔該第一和第二多肽成分。該種肽接頭序列通過本領域公知的標準技術被結合進入融合蛋白。合適的肽接頭序列可根據如下因素選擇(1)它們采用靈活延伸構象的能力；(2) 不會形成與第一和第二多肽的功能性表位相互作用的二級結構；以及(3)不具有可能與多肽功能性表位相互反應的疏水或帶電殘基。優選的肽接頭序列包含Gly、Asn和kr殘基。 其它接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala也可用于接頭序列。有可能用作接頭的氨基酸序列包括披露于 Maratea 等人，Gene 40 39-46 (1985) ；Murphy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :8258-8262(1986)；美國專利4，935，233和美國專利4，751，180中的那些。接頭序列的長度通常可為1至約50個氨基酸。當第一和第二多肽具有可用于分隔功能結構域和防止空間干擾的非必需N末端氨基酸區時，不要求有接頭序列。在優選的實施方式中，免疫原性融合伙伴來自于蛋白D，這是一種革蘭氏陰性菌B 型流感嗜血桿菌的表面蛋白(W0 91/18擬6)。優選地，蛋白D衍生物包含了該蛋白的約首三分之一(例如，N末端首100-110氨基酸)，且蛋白D衍生物可被脂化。在某些優選的實施方式中，脂蛋白D融合伙伴的首109個殘基被包括在N末端以提供具有另外的外源性T細胞表位的多肽并提高在大腸桿菌中的表達水平(因此被用作表達增強子)。脂質尾端確保了對抗原呈遞細胞最好的抗原呈遞。其它的融合伙伴包括來自流感病毒NSl (血凝素蛋白) 的非結構性蛋白。典型地，可采用N末端81個氨基酸，盡管可采用包括了 T輔助表位的不同片段。在另一實施方式中，該免疫原性融合伙伴是已知為LYTA或其部分(優選C末端部分)的蛋白。LYTA來自于肺炎鏈球菌，其合成已知為酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；Gene 43 :265-292 (1986))。LYTA是一種特異性降解肽聚糖骨架中的某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C-末端結構域負責對膽堿或對部分膽堿類似物如 DEAE的親和性。這種特性已被利用來開發用于表達融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達質粒。在氨基末端包含C-LYTA片段的雜交蛋白的純化已有描述(參見Biotechnology 10: 795-798(1992))。在優選的實施方式中，LYTA的重復部分可被結合進入融合蛋白。重復部分發現于C末端區，起始于殘基178。特別優選的重復部分結合殘基188-305。T 細胞免疫治療性組合物還可包含，或者替代性地包含，特異性針對分枝桿菌抗原的T細胞。該種細胞通常可采用標準方法在體外或離體制備。例如，T細胞可采用已有市售的細胞分離系統，例如可由Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA)獲得的Isolex 系統， 從患者骨髓、外周血或者骨髓或外周血的部分分離得到(還可參見美國專利5，240, 856、美國專利 5，215，926、W0 89/06280,WO 91/16116 以及 WO 92/07243)。替代性地，T 細胞可由相關或不相關的人、非人哺乳動物、細胞系或培養物中獲得。T細胞可以本發明的多肽、編碼該種多肽的多核苷酸和/或表達該種多肽的抗原呈遞細胞(APC)進行刺激。在一定條件下進行該種刺激并進行一段足以允許生成特異性針對該多肽的T細胞的時間。優選地，該多肽或多核苷酸存在于傳遞載體中，例如微球體中， 從而促進特異性T細胞的生成。當T細胞特異性增殖、分泌細胞因子或者殺死涂覆該多肽或者表達編碼該多肽的基因的目標細胞時，該T細胞被認為特異性針對本發明的多肽。T細胞的特異性可利用多種標準技術中的任意一種進行評估。例如，在鉻釋放測定或增殖測定中，與陰性對照相比在裂解和/或增殖上超過兩倍的刺激指數表示τ細胞特異性。這些測定可例如，如Chen等人， Cancer Res. 54 :1065-1070(1994))所述實施。替代性地，T細胞的增殖的檢測可通過多種已知技術實現。例如，T細胞增殖可通過測量DNA合成的增加率進行檢測(例如，通過氚化胸腺嘧啶對T細胞進行脈沖標記培養并測量結合進入DNA的氚化胸腺嘧啶的數量)。與本發明的多肽(lOOng/ml-lOO μ g/ml，優選200ng/ml-25 μ g/ml)接觸3-7天應導致T細胞增殖至少上升兩倍。如上所述接觸2-3小時應導致T細胞的激活，這可通過標準細胞因子測定測得，其中細胞因子(例如，TNF或IFN-γ)釋放水平上升兩倍是T細胞激活的指征(參見 Coligan 等人，Current Protocols in Immunology，vol. 1 (1998))。在響應多肽、多核苷酸或多肽表達APC中已被激活的T細胞可以是CD4+和/或CD8+。蛋白特異性T細胞可采用標準技術擴增。在優選的實施方式中，該T細胞來自于患者、相關供體或不相關供體，且在刺激和擴增后被施用至患者。為治療目的，在響應多肽、多核苷酸或APC中增殖的CD4+或CD8+T細胞可在體外或體內大量擴增。該種T細胞的體外增殖可通過多種方式實現。例如，該種T細胞可被重新暴露至多肽，或暴露至對應于該多肽的免疫原性部分的短肽，暴露時添加或不添加T細胞生長因子，例如，白介素-2，和/或合成多肽的刺激細胞。替代性地，在該蛋白存在下增殖的一種或多種T細胞可通過克隆大量擴增。克隆細胞的方法已為本領域公知，且包括有限稀釋。藥物組合物在另外的實施方式中，本文所述的多核苷酸、多肽、T細胞和/或抗體組合物將在藥學可接受或生理可接受的溶液中配制，以單獨或聯合一種或多種其它治療形式向細胞或動物給藥。還應當理解，如果需要，表達本文所述的多肽的核酸片段(例如，RNA或DNA)可與其它試劑以及例如，其它蛋白或多肽或各種藥學活性試劑，包括有效抗結核分枝桿菌感染的化療劑聯合給藥。事實上，對可以包含的其它成分實際上沒有限制，只要該另外的藥劑在與靶細胞或宿主組織接觸時不引起明顯的副作用。該組合物因此可根據具體實例中的需求與各種其它試劑一同傳遞。該種組合物可從宿主細胞或其它生物來源純化，或者替代性地按本文所述進行化學合成。同樣地，該種組合物可進一步包含取代的或衍生化的RNA或DNA組合物。正如將本文所述的特定組合物用于各種治療方案的合適的給藥和治療方案的開發，藥學可接受的賦形劑和載體溶液的制劑已為本領域技術人員公知，包括，例如，口服、腸胃外、靜脈內、鼻內和肌肉內給藥和制劑。其它的給藥途徑包括通過粘膜表面給藥。典型地，包含治療有效量的制劑每次給藥傳遞約0. 1 μ g至約1000 μ g的多肽，更典型地每次給藥傳遞約2. 5μ g至約100 μ g多肽。對于多核苷酸組合物，這些制劑典型地每次給藥傳遞約IOyg至約20mg本發明的多核苷酸，更典型地每次給藥傳遞約0. Img至約 IOmg本發明的多核苷酸。自然地，在每種治療有用的組合物中活性化合物的量可以如下方式制備以化合物的任意給定單位劑量獲得合適的劑量。制備該種藥物制劑的本領域技術人員將預期例如溶解性、生物利用度、生物半衰期、給藥途徑、產品保質期以及其它藥理方面等因素，這樣， 可期望各種劑量和治療方案。1. 口服傳遞在某些應用中，本文披露的藥物組合物可通過口服給藥傳遞給動物。這樣，這些組合物可聯合惰性稀釋劑或聯合可吸收食用載體配制，或者它們可被包封在硬殼或軟殼凝膠膠囊中，或者它們可被壓縮為片劑，或者它們可被直接混入日常食物中。該活性化合物甚至可混入賦形劑并以可攝取片劑、口腔片劑、糖錠、膠囊、酏劑、 懸浮劑、糖漿、圓片等形式使用(Mathiowitz等人，1997 ；Hwang等人，1998 ；美國專利 5，641，515 ；美國專利5，580，579和美國專利5，792，451，每一個在此全文特別引入作為參考)。這些片劑、糖錠、丸劑、膠囊等還可包含如下成分粘合劑，如黃芪樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸氫鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如可加入蔗糖、乳糖或糖精，或者調味劑，例如薄荷、冬青樹油或櫻桃調味劑。當該劑量單位形式為膠囊時，它可在上述類型的物質外包含液體載體。 各種其它的材料可作為涂層存在，或以調節該劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以蟲膠、糖或兩者涂覆。酏劑的糖漿可包含活性成分、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的甲基和丙基苯甲酸酯、染料和調味劑如櫻桃或柑橘口味。當然，用于制備任意劑量單位形式的任意材料應當是制藥純的，且在所用的量下基本無毒。此外，該活性成分可被混合進入緩釋制劑和配方。對于口服給藥，本發明的組合物可替代性地以漱口液、潔牙劑、口腔片劑、口服噴霧或舌下口服給藥制劑的形式混合一種或多種賦形劑。例如，漱口液可通過將所需量的活性成分混合進入合適的溶劑如硼酸鈉溶液(Dobell溶液)中進行制備。替代性地，該活性成分可被混合進入口服溶液，例如包含硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的口服溶液中，或者分散在潔牙劑中，或者以治療有效量添加至可能包含水、粘合劑、研磨料、調味劑、起泡劑和潤濕劑的組合物中。替代性地，該組合物可被制成可置于舌下或以其他方式溶解于口中的片劑或溶液形式。2.可注射傳遞在某些情況下，將需要腸胃外、靜脈內、肌肉內、皮內或甚至腹腔傳遞本文所述的藥物組合物，如美國專利5，543，158、美國專利5，641，515和美國專利5，399，363所述(每一個在此全文具體引入作為參考)。作為游離堿或藥學上可接受的鹽的活性化合物的溶液
44可在與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)適當混合的水中制備。還可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中制備分散劑。在常規貯存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長。適于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散液以及用于可無菌注射溶液或分散液的臨時制劑的無菌粉末(美國專利5，466，468，特別在此全文引入作為參考)。在所有情況下，該形式應當無菌且就容易注射而言應當是液體。它在生產和貯存條件下應保持穩定，并應當抗微生物(例如細菌和真菌)的污染。該載體可以是一種溶劑或分散介質，其包含，例如，水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油，丙二醇，以及液體聚乙二醇等)及其適當的混合物和/或植物油。適當的流動性可通過多種方式維持，例如，通過使用如卵磷脂等涂層，通過針對分散劑時對所需的粒度的維持，以及通過表面活性劑的使用。微生物作用的預防可通過各種抗菌和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等) 實現。在許多情況下，該組合物中優選包含等張劑，例如，糖或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中使用延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來實現。對于在水溶液中進行腸胃外給藥，例如，該溶液應當在需要時適當緩沖，且液體稀釋劑先用足量的鹽水或葡萄糖成為等張液體。這些特定的水溶液特別適用于靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內給藥。就此而言，根據本披露，可以使用的無菌水性介質將為本領域技術人員公知。例如，一個劑量可溶解于Iml等張NaCl溶液中，并被添加至IOOOml的皮下灌注液體中或者在預期灌注部位注射(參見，例如，Remington，s Pharmaceutical Sciences, 第15版，pp 1035-1038和1570-1580)。根據待治療對象的狀況，在劑量上可能需要發生一些變化。在任意情況下，負責給藥的人員將確定針對個體對象的合適劑量。此外，對于人類給藥，制劑應滿足FDA生物制品標準辦公室所要求的無菌性、致熱性和總體安全性和純度標準。無菌可注射溶液可通過將含于合適溶劑的所需量的活性化合物混合進入各種上述列舉的其它成分后根據要求過濾滅菌制備得到。一般而言，分散劑可通過將各種無菌活性成分與包含基礎分散介質和上述列舉的所需其它成分的無菌載體結合得到。對于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，其優選制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術，其得到的粉末包含活性成分和從其之前無菌過濾溶液得到的任何附加所需成分。本文披露的組合物可配制為中性或鹽的形式。藥學可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)，其可與無機酸(例如，氫氯酸、磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。也可由無機堿(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機堿(例如異丙胺、三乙胺、組氨酸、普魯卡因等)衍生得到與游離羧酸基團形成的鹽。在配制時，溶液將以與劑型相容的方式和治療有效的量給藥。該制劑可以各種劑型(例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等)容易地給藥。本文所用的“載體”包括任意和所有的溶劑、分散介質、溶媒、涂層、稀釋劑、抗細菌和抗真菌劑、等張和吸收延緩劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。用于藥物活性物質的該種介質和試劑的使用為本領域公知。除了與該活性成分不相容的任意傳統介質或試劑外，其在治療性組合物中的用途在預期之內。補充性活性成分也可混合進入該組合物。短語“藥學上可接受的”指在給藥給人時不生成過敏性或類似不良反應的分子實體和組合物。包含作為活性成分的蛋白的水性組合物的制備已被本領域充分理解。典型地，該種組合物被制備為可注射的，既可作為液體溶液也可作為懸浮液；也可制備在注射前溶解于或懸浮于液體中的固體形式。該制劑也可被乳化。3.鼻部和口腔傳遞在某些實施方式中，該藥物組合物可通過鼻內噴霧、口腔噴霧、吸入和/或其它氣溶膠傳遞載體傳遞。用于直接向肺傳遞基因、核酸和肽組合物的方法，例如通過鼻和口腔氣溶膠噴霧傳遞已描述于，例如，美國專利5，756，353和美國專利5，804，212(每一個特別在此全文引入作為參考)。同樣地，采用鼻內微粒樹脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂甘油化合物(美國專利5，725，871，特別在此全文引入作為參考)的藥物傳遞也已為制藥領域公知。同樣地，以聚四氟乙烯支撐基質形式的穿粘膜藥物傳遞描述于美國專利5，780，045(特別地在此全文引入作為參考)。4.脂質體、納米膠囊和微粒介導的傳遞在某些實施方式中，本發明人預期采用脂質體、納米膠囊、微粒、微球體、脂質顆粒、囊泡等將本發明的組合物導入合適的宿主細胞。具體而言，本發明的組合物可被配制為包封于脂質顆粒、脂質體、囊泡、納米球體或納米顆粒等進行傳遞。該種制劑對本文披露的核酸或構建體的藥學上可接受的制劑引入而言是優選的。脂質體的形成和使用通常已為本領域技術人員公知(參見，例如，Couvreur等人， 1977 ；Couvreur, 1988 ；Lasic, 1998 ；其描述了用于胞內細菌感染和疾病的靶向抗生素療法中脂質體和納米膠囊的使用)。最近開發了具有改進的血清穩定性和循環半衰期的脂質體 (Gabizon & Papahadjopoulos, 1988 ；Alien 和 Choun，1987 ；美國專利 5，741，516，特別地在此全文引入作為參考)。此外，對于作為潛在藥物載體的脂質體和類脂質體制劑的各種方法已有綜述(Takakura, 1998 ；Chandran 等人，1997 ；Margalit, 1995 ；美國專利 5，567，434 ；美國專利5，552，157 ；美國專利5，565，213 ；美國專利5，738，868和美國專利5，795，587，每一篇特別地在此全文引入作為參考)。脂質體已成功地用于一系列通常耐受其它方法轉染(包括T細胞懸浮液、原代肝細胞培養物和PC 12細胞)的細胞類型(Renneisen等人，1990 ;Muller等人，1990)。此外，脂質體不受到DNA長度限制，而基于病毒的傳遞系統受到這種限制。脂質體已被用于有效地將基因、藥物(Heath & Martin, 1986 ；Heath 等人，1986 ；Balazsovits 等人，1989 ； Fresta & Puglisi，1996)、放射性治療劑(Pikul 等人，1987)、酶(Imaizumi 等人，1990a ； Imaizumi 等人，1990b)、病毒(Faller & Baltimore，1984)、轉錄因子和別構劑(Nicolau & Gersonde, 1979)引入各種培養的細胞系和動物中。此外，多個成功的臨床試驗已考察了脂質體介導的藥物傳遞的效力(Lopez-Berestein 等人，1985a ；1985b ；Coune, 1988 ；Sculier 等人，1988)。進一步地，多個研究顯示脂質體的使用與全身傳遞后的自身免疫應答、毒性或性腺局部化不相關(Mori&Fukatsu，1992)。脂質體是由分散在水性介質中并自發地形成多層同心雙層囊泡(也稱為多層囊泡(MLVs))的磷脂形成的。MLVs通常具有25nm至4μπι的直徑。對MLVs進行超聲可形成
在核內包含水溶液的直徑在200-500人范圍內的小單層囊泡(SUVs)。脂質體與細胞膜具有相似性，且預期在本發明中被用作肽組合物的載體。它們可被廣泛適用，因為水溶性和脂溶性物質均可被包埋在內，即，分別包埋在水性空間內和其自身雙層內。該攜帶藥物的脂質體甚至有可能通過選擇性調整該脂質體制劑而被用于活性藥
46劑的定點傳遞。除Couvreur等人(1977 ；1988)的教導外，如下信息可被用于生成脂質體制劑。根據脂質和水的摩爾比，當分散在水中時，磷脂可形成多種脂質體以外的結構。在較低的比例下，脂質體是優選的結構。脂質體的物理特征取決于PH、離子強度以及二價陽離子的存在。 脂質體可對離子和極性物質顯示較低的穿透性，但在升高的溫度下則會經歷相變，從而顯著改變它們的穿透性。該相變包括由緊密堆積的有序的結構(稱為凝膠態)轉變為松散堆積的、較為無序的結構(稱為液態)。這發生在特征相變溫度下，并導致對離子、糖和藥物的穿透性的提高。除溫度外，暴露至蛋白可改變脂質體的穿透性。一些可溶性蛋白，例如細胞色素C， 結合、變形和穿透該雙層，從而引起穿透性的變化。膽固醇顯然通過使磷脂更為緊密堆積而抑制蛋白的穿透。預期用于抗生素和抑制劑傳遞的最有用的脂質體形式將包含膽固醇。不同類型的脂質體具有不同的包埋溶解物的能力。例如，MLVs對于包埋溶解物較為有效，而SUVs則極為無效。SUVs可提供在粒度分布上的均勻性和重現性的優勢，然而，大的單層囊泡(LUVs)提供了粒度和包埋效率之間的折中。這些大單層囊泡通過醚蒸發制備， 且比MLVs具有高三至四倍的溶解物包埋效率。除脂質體特征外，在包埋化合物中的一個重要的決定因素在于該化合物本身的理化特性。極性化合物被包埋在水性空間內，而非極性化合物結合至囊泡的脂質雙層。極性化合物通過穿透或在雙層破裂時被釋放，而非極性化合物則會保持與雙層連接，直至其被溫度或暴露至脂蛋白破壞。兩種類型均在相變溫度下顯示最大流出速率。脂質體通過四種不同的機制與細胞相互作用通過網狀內皮組織系統的吞噬細胞如巨噬細胞和中性粒細胞的胞吞作用；通過非特異性弱疏水或靜電力或通過與細胞表面成分的特異性相互作用吸附至細胞表面；通過脂質體的脂質雙層插入質膜與漿細胞膜融合， 同時將脂質體內容釋放進入細胞質；以及通過將脂質體的脂質轉移至細胞或亞細胞膜或者反向轉移，而不與脂質體內容關聯。通常難以確定哪種機制在運作，且可能有一種以上的機制同時運作。靜脈注射的脂質體的去向和處理取決于它們的物理特性，例如大小、流動性和表面電荷。它們可在組織中存在數小時或數天，這取決于它們的組成，而在血液中的半衰期可有數分鐘至數小時。更大的脂質體，例如MLVs和LUVs，迅速被網狀內皮組織系統的吞噬細胞攝取，但循環系統的生理學在多數部位保留了該種大脂質體。它們僅存在于毛細血管內皮中具有大開口或孔隙處，例如肝或脾的竇狀隙排出。因此，這些器官成為主要的攝取部位。另一方面，SUVs顯示了更廣的組織分布，但仍然在肝臟和脾臟高度集中。一般而言，這種體內表現將脂質體限制為僅潛在靶向它們的大尺寸可到達的器官和組織。其包括血液、 肝、脾、骨髓和淋巴器官。就本發明而言，靶向通常不是限制。然而，當需要特異性靶向時，可存在實現這一點的方法。抗體可用于結合至脂質體表面，并將抗體及其藥物成分引導至位于特定細胞類型表面上的特異性抗原受體。碳水化合物決定簇(在細胞-細胞識別、相互作用和吸附中具有作用的糖蛋白或糖脂類細胞-表面成分)也可被用作識別位點，因為它們有潛力將脂質體引導至特定的細胞類型。通常預期采用脂質體制劑的靜脈注射，但也可采用其它給藥途徑。
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替代性地，本發明提供了本發明的組合物的藥學上可接受的納米膠囊制劑。 納米膠囊通常可以穩定和可重現的方式包埋化合物(Henry-Michelland等人，1987 ； Quintanar-Guerrero等人，1998 ；Douglas等人，1987)。為了避免由于胞內聚合過載的副作用，應采用能夠體內降解的聚合物設計超細顆粒(尺寸約為0. 1 μ m)。滿足這些需求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒預期用于本發明。該種顆粒可根據描述容易地制備(Couvreur 等人，1980 ； 1988 ；zur Muhlen 等人，1998 ；Zambaux 等 1998 ；Pinto-Alphandry 等人，1995以及美國專利5，145，684，特別全文引入作為參考)。皮膚貼劑也可用于經皮傳遞。免疫原性組合物在本發明某些優選的實施方式中提供了免疫原性組合物。該免疫原性組合物通常包含一種或多種多肽或多核苷酸(例如上述多肽和多核苷酸)，并聯合免疫刺激劑。免疫刺激劑可以是增強或加強對外源性抗原的免疫應答(抗體和/或細胞介導)的任意物質。免疫刺激劑的實例包括佐劑、可生物降解的微球體(例如，polylactic galactide)和脂質體 (化合物合并入其中；參見，例如，Fullerton，美國專利4，235，877)。免疫原性組合物的制備總體描述于，例如，Powe 1 l&Newman，編輯，Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach) (1995)。在本發明范圍內的藥物組合物禾口免疫原性組合物還可包含其它化合物，其可具有生物活性或不具活性。例如，在藥物或免疫原性組合物中可存在其它結核分枝桿菌抗原的一個或多個免疫原性部分，其或者結合在融合多肽內，或者作為單獨的化合物。示范性的免疫原性組合物可包含編碼一種或多種本文所述多肽的多核苷酸(例如，DNA)，從而原位生成該多肽(以誘發免疫應答)。如上文指出，DNA可存在于本領域普通技術人員已知的各種傳遞系統(包括核酸表達系統、細菌和病毒表達系統)的任意一種內。各種基因傳遞技術已在本領域公知，例如描述于Rolland，Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15 :143-198 (1998)(在此引用)。合適的核酸表達系統包含了在患者體內表達的必需DNA序列(例如合適的啟動子和終止信號)。細菌傳遞系統包括施用表達該多肽(例如，在細胞表面或分泌該多肽)的細菌宿主細胞(例如，分枝桿菌、桿菌或乳酸菌菌株，包括Calmette-Guerrin桿菌或乳酸乳球菌)(參見，例如，Ferreira,等人，An Acad Bras Cienc (2005) 77 :113-124 ；和 Raha，等人，Appl Microbiol Biotechnol (2005) PubMedID 15635459) 0在優選的實施方式中，該DNA可利用病毒表達系統(例如，牛痘或其它水痘病毒、逆轉錄病毒或腺病毒)引入，其可包括采用非病原性(缺陷型)、可復制病毒。合適的系統披露于，例如，Fisher-Hoch等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321 (1989) ；Flexner 等人，Ann. N. Y. Acad. Sci. 569 :86-103 (1989) ；Flexner 等人， Vaccine 8 :17-21 (1990)；美國專利 4，603，112,4, 769，330 和 5，017，487 ；WO 89/01973 ；美國專利 4，777，127 ；GB 2，200，651 ；EP 0，345，242 ；WO 91/02805 ；Berkner, Biotechniques 6 :616-627(1988) ；Rosenfeld 等人，Science 252 :431-434(1991) ；Kolls 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219(1994) ；Kass-Eisler 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :11498-11502(1993) ；Guzman 等人，Circulation 88:2838-2848(1993)；以及 Guzman 等人，Cir. Res. 73 :1202-1207(1993)。將DNA結合進入該種表達系統的技術為本領域普通技術人員公知。該DNA可以是“裸”DNA，例如，如Ulmer等人，Science 259 :1745-1749(1993)所述和CohenJcience 259 :1691-1692(1993)綜述。可通過將該DNA涂覆在可被有效運輸進入細胞的可生物降解的珠子上提高裸DNA的攝入。顯而易見地，免疫原性組合物可同時包含多核苷酸和多肽成分。該種免疫原性組合物可提供增強的免疫應答。顯而易見地，免疫原性組合物可包含本文提供的多核苷酸和多肽的藥學上可接受的鹽。該種鹽可由藥學上可接受的無毒性堿制備，該無毒性堿包括有機堿(例如，伯、仲和叔胺和堿性氨基酸的鹽)和無機堿(例如，鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽)。盡管本領域普通技術人員已知的任意合適的載體可被用于本發明的免疫原性組合物，載體的類型將取決于給藥的模式。本發明的組合物可配制為用于任意合適的給藥方式，包括，例如，局部、口服、鼻內、靜脈內、顱內、腹腔內、皮下或肌肉內給藥。對于腸胃外給藥，如皮下注射，該載體優選包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給藥，可采用任意上述載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、 蔗糖以及碳酸鎂。可生物降解的微球體(例如，聚乳酸聚乙二醇)也可被用作本發明的藥物組合物的載體。合適的可生物降解微球體披露于，例如，美國專利4，897，268 ；5, 075，109 ； 5，928，647 ；5，811，128 ；5，820，883 ；5，853，763 ；5，814，344 和 5，942，252。還可采用包含美國專利5，928，647中所述的微粒-蛋白復合物的載體，其能在宿主中誘導I類限制性細胞毒性T淋巴細胞應答。該種組合物還可包含緩沖液(例如，中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(例如，氫氧化鋁)、使得該制劑與接受考血液等張、低滲或弱高滲的溶解物、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑。替代性地，本發明的組合物可配制為凍干制品。化合物還可利用公知技術被包封在脂質體內。各種免疫刺激劑的任意一種可用于本發明的免疫原性組合物。例如，可以包含佐劑。大部分佐劑包含經設計用于防止抗原快速分解的物質，例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應答的刺激劑，例如脂質A、百日咳桿菌或分枝桿菌種類或分枝桿菌衍生的蛋白。例如，可使用去脂化、去糖脂化的牝牛分枝桿菌(“pVac”)。合適的佐劑已有市售，例如，弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco Laboratories, Detroit, MI) ；Merck 佐劑 65 (Merck and Company, Inc.，Rahway, NJ) ；AS01B、AS02A、AS15、AS-2 及其衍生物(GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA) ；CWS(來自結核桿菌的細胞壁骨架)，TDM (海藻糖二白喉菌酸 (dicorynomycolate))，Leif (利什曼原蟲延長起始因子)，鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(明礬) 或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；酰化酪氨酸的不溶性懸浮液；酰化糖；陽離子或陰離子衍生化的多糖；聚膦腈；可生物降解的微球體；單磷酰脂質A(MPL )；以及quil A(例如，QS-21)。 細胞因子如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可用作佐劑。佐劑指疫苗或治療性組合物中提高針對抗原的特異性免疫應答的成分(參見， 例如 Edelman，AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411(1992))。佐劑誘導 Thl-型和 Th2-型免疫應答。Thl-型細胞因子(例如，IFN-Y、IL-2和IL-12)易于誘導針對施用抗原的細胞介導的免疫應答，而 ι2-型細胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL_6、IL-10)易于誘導體液免疫應答。優選能刺激 ι-1細胞介導的免疫應答的佐劑描述于WO 94/00153和WO 95/17209。在本文提供的免疫原性組合物中，該佐劑組合物優選設計為主要誘導Thl型免疫
49應答。在應用本文提供的免疫原性組合物后，患者通常支持包括Thl-型和Th2_型應答的免疫應答。在應答主要是Thl-型的優選實施方式中，Thl-型細胞因子的水平將增加至遠遠大于Th2_型細胞因子的水平。這些細胞因子的水平可通過標準測定容易地評估。該族細胞因子的綜述可參見Janeway，等人，Immunobiology，第5版，2001。該Rv2386c組合物通常可在脂質體制劑中包含一種或多種佐劑，例如，ASOlB(3-去-0-酰化單磷酰脂質A(3D-MPL )和QS21 ；參見，美國專利公布 2003/0143240) ；AS02A (3D-MPL 和 QS21 以及水包油乳液；參見，Bojang,等人， Lancet (2001) 358 :1927) ；，ENHANZYN (Detox) ；3D-MPL ;皂試，包括 Quil A 及其成分， 例如QS21和皂甙類似物；CWS (來自結核桿菌的細胞壁骨架)；TDM(海藻糖二白喉菌酸)； 氨基烷基葡糖苷4-磷酸酯(AGPs)；免疫刺激性寡核肽，例如CPG ;Leif (利什曼原蟲延長起始因子)；及其衍生物。在優選的實施方式中，Rv2386c多肽與一種或多種佐劑一起給藥， 所述佐劑選自在脂質體制劑例如ASOlB中的3D-MPL 和QS21以及3D-MPL⑧和QS21和水包油乳液(例如AS02A)。佐劑系統ASOlB和AS02A進一步描述于Pichyangkul，等人， Vaccine(2004) 22 :3831_40。在作為核酸傳遞Rv2386c抗原時，其可在病毒載體(S卩，腺病毒載體)或突變細菌宿主細胞(即，突變體，無毒性分枝桿菌，乳酸桿菌或桿菌宿主細胞，包括卡介桿菌(BCG)和乳酸乳球菌)中傳遞。用于誘發主要的Thl-型應答的優選佐劑包括，例如，單磷酰脂質A(MPL )、優選 3-0-去酰化單磷酰脂質A (3D-MPL )任選地與鋁鹽的組合(參見，例如Ribi，等人，1986， Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp.， NY, pp 407-419 ；GB 2122204B ；GB 2220211;以及 US 4,912,094)。優選的 3D-MPL 形式為具有直徑小于0.2mm的小顆粒尺寸的乳液形式，其生產方法披露于WO 94/212920包含單磷酰脂質A和表面活性劑的水性制劑披露于WO 98/43670。示范性的優選佐劑包括可從GlaxoSmithKline獲得的AS01B (含于脂質體制劑的MPL③和QS21)、在脂質體制劑內的 3D-MPL⑧和QS21、AS02A(MPL⑧和QS21和水包油乳液)、3D_MPL⑧和QS21和水包油乳液以及 AS15。MPL 佐劑可從 GlaxoSmithKline 獲得(參見美國專利 4，436，727 ；4，877，611 ； 4，866,034 和 4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG 二核苷酸是未甲基化的)也誘導主要的Thl應答。 CpG是存在于DNA中的胞苷-鳥苷二核苷酸基序的縮寫。該種寡核苷酸眾所周知，并描述于， 例如，WO 96/02555、WO 99/33488 和美國專利 6，008, 200 和 5，856，462。免疫刺激 DNA 序列還描述于，例如，Sato等人，Science 273 :352(1996)。在配制進入免疫原性組合物中時， CpG通常在自由溶液中與游離抗原(W0 96/02555 ；McCluskie和Davis，見上文)一起給藥， 或者與抗原共價綴合(W0 98/16247)，或者與氫氧化鋁等載體配制((肝炎表面抗原)Davis 等人見上；Brazolot-MiIlan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA, 1998,95(26)，15553-8)。在本領域中已知CpG是能通過全身和粘膜途徑給藥的佐劑(W0 96/02555，EP 468520，Davis 等人，J. Immunol, 1998,160(2) :870-876 ；McCluskie 和 Davis，J. Immunol.，1998，161 (9) 4463-6)。另一優選的佐劑是皂苷或皂苷類似物或衍生物，例如，Quil A，優選QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham, MA)，其可單獨使用或與其它佐劑組合使用。例如，強化的系統包括了單磷酰脂質A(MPL )和皂苷衍生物的組合，例如WO 94/00153所述的QS21和3D-MPL 的組合，或者反應原性更低的組合物，其中QS21用膽固醇淬火，如WO 96/33739所述。其它優選的制劑包含水包油乳液和生育酚。一種特別有效的佐劑制劑包含了含于水包油乳液的QS21、3D-MPL 和生育酚，其描述于WO 95/17210。本發明使用的其它皂苷佐劑包括QS7(描述于WO 96/33739和WO 96/11711)和QS17 (描述于美國專利 5，057，540 和 EPO 362 279 Bi)。替代性地，該皂苷制劑可與疫苗載體合并，所述疫苗由殼聚糖或其它聚陽離子聚合物、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯顆粒、聚-N-乙酰基葡糖胺基聚合物基質、由多糖或化學修飾的多糖構成的顆粒、基于脂質體和脂質的顆粒、由甘油單酯組成的顆粒等組成。該皂苷還可在膽固醇存在下配制形成微粒結構，例如脂質體或ISCOM 。此外，該皂苷可與聚氧乙烯醚或酯一起配制于非微粒溶液或懸浮液中，或配制在微粒結構如paucilamelar脂質體或ISCOM 中。皂苷還可與賦形劑如CARB0P0L 配制以提高粘度，或者與粉狀賦形劑如乳糖配制為干粉形式。在一個實施方式中，該佐劑系統包括了單磷酰脂質A和皂苷衍生物的組合，例如 WO 94/00153所述的QS21和3D-MPL 的組合，或者反應原性更低的組合物，其中QS21用含膽固醇的脂質體淬火，如WO 96/33739所述。其它合適的制劑包含水包油乳液和生育酚。另一合適的佐劑制劑采用WO 95/17210中所述的含于水包油乳液的QS21、3D-MPL 佐劑和生育酚。另一強化佐劑系統包含含有CpG寡核苷酸和皂苷衍生物的組合，特別是WO 00/09159中所述的CpG和QS21的組合。該制劑適當地另外包含水包油乳液和生育酚。其它合適的佐劑包括MONTANIDE ISA 720 (Seppic, France)、SAF (Chiron, California, United States)，ISCOMS (CSL)、MF_59 (Chiron)、SBAS系列佐劑(SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)、Detox (Corixa)、RC-529 (Corixa)以及其它氨基烷基葡糖苷4-磷酸酯類(AGPs)，例如在待審美國專利申請08/853，擬6和09/074, 720中披露的那些，其披露在此全文引入作為參考，以及如WO 99/52549A1中所述的聚氧乙烯醚佐劑。 SmithKline Beecham 禾口 Corixa Corporation 現在屬于 GlaxoSmithKline 的一部分。其它合適的佐劑包括通式⑴的佐劑分子HO (CH2CH2O)n-A-R其中，η為1-50，A是鍵或-C(O)_，R是CV5tl烷基或苯基C1^烷基。其它感興趣的佐劑是志賀毒素b鏈，其使用例如，如W02005/112991所述。本發明的一個實施方式由免疫原性組合物組成，該免疫原性組合物包含通式(I) 的聚氧乙烯醚，其中η介于1和50之間，優選4- ，最優選9 ；R成分為(；_5(1，優選C4-C2tl烷基，最優選C12烷基，且A為鍵。聚氧乙烯醚的濃度應當在0. 1-20%范圍內，優選在0. 1-10% 范圍內，最優選在0. 1-1%范圍內。優選的聚氧乙烯醚選自如下聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-9-steoryl醚、聚氧乙烯-8-steoryl醚、聚氧乙烯_4_月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚以及聚氧乙烯-23-月桂醚。聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂醚描述于Merck目錄(第12 版entry 7717)。這些佐劑分子描述于WO 99/525490本文提供的任何免疫原性組合物可通過公知的獲得抗原、免疫應答增強劑和合適載體或賦形劑的組合的方法進行制備。本文所述的組合物可作為緩釋制劑(即，可使
51化合物在給藥后緩慢釋放的制劑，例如膠囊、海綿體或凝膠(例如，由多糖組成))的一部分進行給藥。該種制劑通常可采用公知技術(參見，例如，Coombes等人，Vaccine 14: 1429-1438(1996))制備，并通過，例如，口服、直腸或皮下灌輸或者通過在所需的靶點灌輸進行給藥。緩釋制劑可包含分散在載體基質和/或包含在被控速膜圍繞的儲器內的多肽、 多核苷酸或抗體。用于該種制劑內的載體是生物相容的，并且也是可生物降解的；優選地，該制劑提供相對恒定的活性成分釋放水平。該種載體包括聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚丙烯酸酯、乳膠、淀粉、纖維素、葡聚糖等的微粒。其它的緩釋載體包括超分子生物載體，其包含非液體親水核(例如，交聯多糖或寡糖)，以及，可選地，包含兩親化合物如磷脂的外層(參見， 例如，美國專利 5，151，254 和 PCT 申請 WO 94/20078,W0/94/23701 和 WO 96/06638)。在緩釋制劑內包含的活性化合物的量取決于灌輸的部位、釋放的速率和預期時間。多種傳遞載體中的任意一種可用于藥物組合物和免疫原性組合物中以促進生成抗原特異性免疫應答。傳遞載體包括抗原呈遞細胞(APCs)，例如樹突細胞、巨噬細胞、B細胞、單核細胞以及可被工程改造為有效APCs的其它細胞。該種細胞可以(但非必須)被工程改造以提高呈遞抗原的能力，以改善T細胞應答的激活和/或維持，和/或與接受者免疫原性相容(即，匹配的HLA單元型)。APCs通常可從各種生物液體和器官的任意一種分離， 并可以是自體的、同種異體的、同基因的或異種細胞。本發明的某些優選的實施方式采用樹突細胞或其祖細胞作為抗原呈遞細胞。樹突細胞是高度有效的 APCs (Banchereau& Meinman，Nature 392 :245-251 (1998))，且顯示為誘發預防性或治療性免疫性的有效的生理學佐劑(參見Timmerman & Levy，Arm. Rev. Med. 50 :507-529(1999)).總體而言，樹突細胞可基于其典型的形狀(原位星形、在體外有可見的顯著胞質突(樹突))、它們高效攝取、處理和呈遞抗原的能力以及激活幼稚T細胞應答的能力進行鑒定。樹突細胞當然可以被工程改造以表達在體內或離體樹突細胞上不常見的特異性細胞表面受體或配體，且該種改造的樹突細胞在本發明的預期之中。作為樹突細胞的替代，分泌囊泡抗原負載樹突細胞(稱為外染色體)可用于免疫原性組合物(參見 Zitvogel 等人，Nature Med. 4 :594-600 (1998))。樹突細胞和祖細胞可從外周血、骨髓、淋巴結、脾、皮膚、臍帶血或任意其它合適的組織或液體獲得。例如，樹突細胞可通過將細胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFa 的組合添加至從外周血收獲的單核細胞的培養物以離體分化。替代性地，從外周血、臍帶血或骨髓收獲的CDM陽性細胞可通過向培養基中添加GM-CSF、IL-3、TNFa、⑶40配體、LPS、 flt3配體和/或誘導樹突細胞分化、成熟和增殖的其它化合物的組合以分化成為樹突細胞。樹突細胞可方便地分類為“不成熟”和“成熟”細胞，這允許在兩種充分鑒定的表型之間以簡單方式進行區分。然而，這種命名法不應解釋為排除所有可能的分化中間階段。 不成熟的樹突細胞表征為具有高抗原攝取和處理能力的APC，其與Fc γ受體和甘露糖受體的高表達相關。成熟表型通常通過這些標記物的低表達，負責T細胞激活的細胞表面分子如I類和II類MHC、吸附分子(例如，CD54和⑶11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86 和4-1BB)的高表達進行表征。APCs通常可用編碼蛋白(或其部分或其它變體)的多核苷酸轉染，從而使多肽在細胞表面表達。該種轉染可離體進行，且包含該種轉染細胞的藥物組合物或免疫原性組合物可按照本文所述使用。替代性地，靶向樹突或其它抗原呈遞細胞的基因傳遞載體可被給藥至患者，從而形成體內轉染。例如，樹突細胞的體內和離體轉染通常可利用本領域已知的任何方法(例如描述于WO 97/24447中的那些)進行，或者通過Mahvi等人，Immunology and Cell Biology 75 :456-460(1997)所述的基因槍方法進行。樹突細胞的抗原負載可通過用多肽、DNA(裸DNA或在質粒載體內)或RNA孵育樹突細胞或祖細胞實現，或者通過抗原表達重組細菌或病毒(例如，痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒載體)實現。在負載之前，多肽可被共價綴合至提供T細胞輔助的免疫原性伙伴(例如，載體分子)。替代性地，樹突細胞可單獨的或在多肽存在下用非綴合免疫原性伙伴進行脈沖。免疫原性組合物和藥物組合物可存在于單位劑量或多劑量容器內，例如密封的安瓿或小瓶。該種容器優選嚴密密封，以將制劑保持無菌至使用。總體而言，制劑可作為懸浮液、溶液或含于油性或水性溶媒中的乳液儲存。替代性地，免疫原性組合物或藥物組合物可儲存在冷凍干燥條件下，僅需要在使用前添加無菌液體載體。在一些實施方式中，“引發”或第一次施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸，然后進行一次或多次“促進”或后續施用 Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸(“引發和促進”法)。例如，第一次施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸，然后一次或多次后續施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸。在一個實施方式中，首次施用Rv2386c多肽或多核苷酸，然后一次或多次后續施用Rv2386c多肽。在一個實施方式中，首次施用Rv2386c多肽或多核苷酸，然后一次或多次后續施用Rv2386c多核苷酸。通常該首次或“引發”施用和該第二次或“促進”施用的間隔約2-12周，或長達4-6月。后續的“促進”施用可相隔約6個月，或者相隔長達1、2、3、4或 5年。傳統的促進治療(例如，蛋白引發施用，然后進行蛋白促進施用)也可用于預防或治療結核病(例如，預防或治療潛伏結核病，特別是預防或延緩結核病再活化)。抗體“抗體”指包含來自免疫球蛋白基因或其片段的框架區的多肽，其特異性結合和識別抗原。該識別的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、印silon和 mu恒定區基因，以及眾多免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為kappa或lambda。重鏈被分類為gamma、mu、alpha、delta或印silon，其分別依次定義了免疫球蛋白類別IgG、IgM、 IgA, IgD 和 IgE0示范性的免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚物。每個四聚物由兩個相同的多肽鏈對組成，每個對具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的 N-末端定義了約100至110或更多氨基酸的可變區，其主要負責抗原識別。術語可變輕鏈 (Vl)和可變重鏈(Vh)分別指輕鏈和重鏈。抗體作為例如完整免疫球蛋白或多個充分鑒定的以各種肽酶消化生成的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化鉸鏈區中的二硫鍵下的抗體以生成Fab的二聚物F(ab)’ 2， 其自身是通過二硫鍵連接至Vh-ChI的輕鏈。該F(ab) ’2可在溫和條件下還原以打斷鉸鏈區中的二硫鍵，從而將F(ab)，2 二聚物轉化為Fab’單體。該Fab’單體基本是具有鉸鏈區部
53分的Fab (參見Fundamental Immunology (Paul編輯，第3版，199 。盡管各種抗體片段可從完整抗體的消化進行定義，本領域技術人員將理解，該種片段可通過化學方法或重組DNA 方法從頭合成。因此，本文所用的術語抗體還包括通過全抗體修飾、或采用重組DNA方法從頭合成(例如，單鏈Fv)、或采用噬菌體展示庫鑒定的抗體片段(參見，例如，McCafferty等人，Nature 348 :552-554 (1990)) 為制備單克隆或多克隆抗體，可采用本領域已知的任意技術(參見，例如，Kohler & Milstein， Nature 256 :495-497(1975) ；Kozbor ^A, Immunology Today 4 :72(1983)； Cole 等人，pp 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985))。用于生成單鏈抗體的技術(美國專利4，946，778)可適用于生成針對本發明多肽的抗體。此外，轉基因小鼠，或其它生物如其它哺乳動物，可用于表達人源化抗體。替代性地，噬菌體展示技術可用于鑒定特異性結合所選抗原的抗體和異聚Fab片段(參見，例如，McCafferty等人， Nature 348:552-554(1990) ；Marks 等人，Biotechnology 10:779-783(1992))。對于蛋白或肽，短語與抗體的“特異性(或選擇性)結合”或“特異性(或選擇性) 免疫反應”指在蛋白和其它生物質的異種群體中確定該蛋白存在的結合反應。因此，在指定的免疫測定條件下，該特異性抗體與特定蛋白的結合是背景的至少兩倍，且基本不會與樣本中存在的其它蛋白大量結合。在該種條件下特異性結合至抗體可能需要選擇對特定蛋白具有特異性的抗體。例如，可選擇針對融合蛋白的多克隆抗體，從而僅獲得與融合蛋白特異性免疫反應且不與該融合蛋白的單獨成分特異性免疫反應的多克隆抗體。這種選擇可通過減去與單個抗原交叉反應的抗體實現。多種免疫測定形式可用于選擇能與特定蛋白進行特異性免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫測定可常規用于選擇與蛋白特異性免疫反應的抗體(可用于確定特異性免疫反應性的免疫測定形式和條件的描述可參見，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual (1988)以及 Using Antibodies :A Laboratory Manual (1998))。典型地，特異性或選擇性反應將是背景信號或噪聲的至少兩倍，更典型地， 是背景(例如，結合至其它分枝桿菌蛋白，例如其它結核分枝桿菌蛋白)的10、20或100倍以上。診斷在另一方面，本發明提供了用一種或多種上述多肽診斷結核病的方法(例如采用常規形式的基于T細胞應答的測定或基于抗體的測定)。例如，提供了一種測定個體中先前的結核分枝桿菌感染的方法，該方法包括(a)從該個體獲得樣本；(b)用分離多肽接觸所述樣本，該分離多肽包括(i)Rv2386c 蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；(c)對樣本的應答進行定量。該樣本可以是例如全血或純化細胞。適當地，該樣本將包含外周血單核細胞 (PBMC)。在本發明的一個實施方式中，該個體血清反應呈陽性。在本發明的第二個實施方式中，該個體血清反應呈陰性。合適地，該個體之前未針對結核分枝桿菌感染進行接種(例如，合適地，該個體之前未用BCG接種)。該樣本的應答可通過本領域技術人員已知的一系列手段進行定量，包括監測淋巴細胞增殖或特異性細胞因子或抗體的生成。例如，T-細胞ELISP0T可用于監測細胞因子例如干擾素gamma (IFN Y )、白介素2 (IL2)和白介素5 (IL5)。B-細胞ELLISP0T可用于監測結核分枝桿菌特異性抗原的刺激。細胞應答還可通過使用胞內和胞外染色并通過流式細胞儀分析來進行表征。對樣本增殖應答的定量方法包括(i)用放射性標記(例如，氚化胸腺嘧啶)對培養細胞進行脈沖，并監測氚的攝取 (例如，氣體閃爍)。(ii) 二醋酸羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記并用流式細胞儀對細胞分裂進行熒光監測。對樣本細胞因子應答的定量具體包括對干擾素gamma生成的監測。在使用該種定量方法時，對抗原的陽性應答可通過至少2 1(例如，至少3 1 或至少5 1)的信噪比(S/N比)進行定義。在本發明進一步的方面提供了采用皮試診斷結核分枝桿菌感染的方法。本文所用的“皮試”是直接對患者進行的任意測定，其中在皮內注射上述Rvl53c多肽(或其變體、免疫原性片段或編碼它們的核苷酸)后測量延緩型超敏(DTH)反應(例如腫脹、發紅或皮膚炎)。該種注射可用足以將抗原組合與患者真皮細胞接觸的任意裝置實現，例如結核菌素注射器或ImL注射器。該反應在一定時間后測量，例如在注射后至少48小時，特別是48-72 小時。DTH反應是一種細胞介導的免疫應答，這種應答在之前曾暴露至受試抗原的患者中更大。該應答可采用尺子肉眼測量。總體而言，直徑大于約0.5cm，特別是直徑大于約 1. Ocm的應答為陽性應答，是之前有結核分枝桿菌感染的指征，其可能顯示或不顯示為活動性疾病。為用于皮試，該Rv2386c成分合適地被配制為包含生理可接受載體的藥物組合物。合適地，在該種藥物組合物中使用的載體是具有合適防腐劑(例如苯酚和/或Tween 80 )的鹽水溶液。本發明進一步提供了用于任意上述診斷方法的試劑盒。該種試劑盒通常包含進行診斷測定所必需的兩種或更多種成分。該成分可以是化合物、試劑、容器和/或裝置。例如，試劑盒內的一個容器可包含特異性結合蛋白的單克隆抗體或其片段。該種抗體或片段可連接至上述支持材料。一個或多個另外的容器可包含用于該測定的元素，如試劑或緩沖液。該種試劑盒還可以(或者替代性地)包含上述檢測試劑，該檢測試劑包含適用于直接或間接檢測抗體結合的報告基團。替代性地，試劑盒可被設計為檢測生物樣本中編碼蛋白的mRNA的水平。該種試劑盒通常包含至少一種與編碼蛋白的多核苷酸雜交的上述寡核苷酸探針或引物。該種寡核苷酸可用于，例如，PCR或雜交測定中。可存在于該種試劑盒內的其它成分包括用于促進編碼本發明蛋白的多核苷酸檢測的第二寡核苷酸和/或診斷試劑或容器。其它的診斷試劑盒包括設計用于檢測細胞介導的應答(其可以，例如，用于本發明的診斷方法)的試劑盒。該種試劑盒通常包含
(i)從對象獲得合適細胞樣本的設備；(ii)用Rv2386c多肽(或其變體、其免疫原性片段或編碼該多肽的DNA)刺激所述細胞樣本的裝置；(iii)對刺激的細胞應答進行檢測和定量的裝置。用于定量細胞應答的合適裝置包括B-細胞ELISP0T試劑盒或替代性地T-細胞 ELISP0T試劑盒，其為本領域技術人員已知。一種可能的試劑盒包含(a)本發明的多肽；和(b)適于直接或間接檢測抗體結合的檢測試劑。特別感興趣的是對T細胞應答的定量所定制的診斷試劑盒診斷試劑盒，其包含(a)本發明的多肽；和(b)使所述多肽與個體的真皮細胞充分接觸的設備。診斷試劑盒，其包含(a)本發明的多肽；(b)使所述多肽與來自個體的樣本(例如，全血或更合適的PBMC)充分接觸的設備；和(c)對T細胞應答(例如，增殖或IFN-生成)定量的裝置。 實施例以下的實施例僅為闡述目的提供，并非對本發明構成限制。本領域技術人員將容易地理解，可改變或調整多種非關鍵參數以獲得基本類似的結果。實施例1-作為潛伏TB疫苗靶標的Rv2386c的鑒別基因Rv2386c也稱為MbtI，其編碼參與含羥苯噁唑啉鐵載體分枝桿菌素的生物起源的蛋白，其中它將分支酸鹽轉化為水楊酸鹽(分枝菌鐵載體合成的起始單元)。Rv2386c 可基于與如 Murphy 和 Brown BMC. Infect. Dis. 2007 7 :84-99 中的休眠期維持和傳染性相關的結核分枝桿菌基因的全基因組分析進行選擇。結核分枝桿菌中的潛在休眠期基因靶標通過在模擬休眠條件下細菌基因表達的公開的全基因組DNA微陣列數據組的生物信息學meta分析中是優先的(prioritised)。然后在整個基因組進行由基因編碼的結核分枝桿菌蛋白的亞細胞定位以鑒別疫苗靶標。簡言之，休眠模型中的實驗條件變化很大，因此開發了零至五的評分系統，以根據兩個標準歸一化這些數據1)實驗條件與休眠狀態的相關性和幻表達的排位順序。特定實驗數據組中的最大評分可基于與休眠期結核分枝桿菌感染的臨床發生率潛在關聯性進行調整。表1顯示了為步驟1采集的數據組以及對每個數據組調整的最大評分。對于生長必需的基因的附加數據組可采用基于轉座子的敲除實驗(TraSH)從公開研究獲得。對于生長沒有作用的基因的評分為零。表1-結核分枝桿菌DNA微陣列基因表達和全基因組敲除(生長期必需)的來源、
實驗模型和評分標準
5權利要求
1.分離多肽，其包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
2.如權利要求1所述的多肽，其用作藥劑。
3.如權利要求1或2所述的多肽，其包含Rv2386c蛋白序列。
4.如權利要求3所述的多肽，其由Rv2386c蛋白序列組成。
5.如權利要求1或2所述的多肽，其包含Rv2386c蛋白序列的變體。
6.如權利要求5所述的多肽，其包含與Rv2386c蛋白序列具有至少70%的一致性的 Rv2386c蛋白序列的變體。
7.如權利要求6所述的多肽，其包含與Rv2386c蛋白序列具有至少90%的一致性的 Rv2386c蛋白序列的變體。
8.如權利要求7所述的多肽，其包含與Rv2386c蛋白序列具有至少95%的一致性的 Rv2386c蛋白序列的變體。
9.如權利要求5所述的多肽，其由Rv2386c蛋白序列的變體組成。
10.如權利要求9所述的多肽，其由與Rv2386c蛋白序列具有至少70%的一致性的 Rv2386c蛋白序列的變體組成。
11.如權利要求10所述的多肽，其由與Rv2386c蛋白序列具有至少90%的一致性的 Rv2386c蛋白序列的變體組成。
12.如權利要求11所述的多肽，其由與Rv2386c蛋白序列具有至少95%的一致性的 Rv2386c蛋白序列的變體組成。
13.如權利要求1或2所述的多肽，其包含Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
14.如權利要求13所述的多肽，其包含來自Rv2386c蛋白序列的最少10個氨基酸殘基的免疫原性片段。
15.如權利要求14所述的多肽，其包含來自Rv2386c蛋白序列的最少20個氨基酸殘基的免疫原性片段。
16.如權利要求15所述的多肽，其包含來自Rv2386c蛋白序列的最少50個氨基酸殘基的免疫原性片段。
17.如權利要求13所述的多肽，其由Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段組成。
18.如權利要求17所述的多肽，其由來自Rv2386c蛋白序列的最少10個氨基酸殘基的免疫原性片段組成。
19.如權利要求18所述的多肽，其由來自Rv2386c蛋白序列的最少20個氨基酸殘基的免疫原性片段組成。
20.如權利要求19所述的多肽，其由來自Rv2386c蛋白序列的最少50個氨基酸殘基的免疫原性片段組成。
21.如權利要求1-20中任意一項所述的多肽，其中該Rv2386c蛋白序列來自結核分枝桿菌。
22.如權利要求21所述的多肽，其中該Rv2386c蛋白具有SEQID NO 1的序列。
23.如權利要求1-22中任意一項所述的多肽，其用于治療或預防結核病。
24.如權利要求23所述的多肽，其用于治療結核病。
25.如權利要求23所述的多肽，其用于預防結核病。
26.如權利要求23所述的多肽，其用于治療潛伏結核病。
27.如權利要求23所述的多肽，其用于預防潛伏結核病。
28.如權利要求23所述的多肽，其用于預防結核病的再活化。
29.如權利要求23所述的多肽，其用于延緩結核病的再活化。
30.如權利要求23-29中任意一項所述的多肽，其中該結核病與結核分枝桿菌感染相關。
31.包含編碼多肽的核酸序列的分離多核苷酸，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
32.如權利要求31所述的多核苷酸，其用作藥劑。
33.如權利要求31或32所述的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含 Rv2386c蛋白序列。
34.如權利要求31或32所述的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含 Rv2386c蛋白序列的變體。
35.如權利要求34所述的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含與 Rv2386c蛋白序列具有至少70%的一致性的Rv2386c蛋白序列的變體。
36.如權利要求31或32所述的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含 Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
37.如權利要求36所述的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含來自 Rv2386c蛋白序列的至少10個氨基酸殘基的免疫原性片段。
38.如權利要求31-37中任意一項所述的多核苷酸，其包含編碼多肽的核酸序列，該多肽由以下組成(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
39.如權利要求38所述的多核苷酸，其由編碼多肽的核酸序列組成，該多肽由以下組成(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
40.如權利要求31-39中任意一項所述的多核苷酸，其中該Rv2386c蛋白序列來自結核分枝桿菌。
41.如權利要求40所述的多核苷酸，其中該Rv2386c蛋白具有SEQID NO 1的序列。
42.如權利要求41所述的多核苷酸，其包含SEQID NO :2的序列或其片段。
43.如權利要求31-42中任意一項所述的多核苷酸，其用于治療或預防結核病。
44.如權利要求43所述的多核苷酸，其用于治療結核病。
45.如權利要求43所述的多核苷酸，其用于預防結核病。
46.如權利要求43所述的多核苷酸，其用于治療潛伏結核病。
47.如權利要求43所述的多核苷酸，其用于預防潛伏結核病。
48.如權利要求43所述的多核苷酸，其用于預防結核病的再活化。
49.如權利要求43所述的多核苷酸，其用于延緩結核病的再活化。
50.如權利要求43-49中任意一項所述的多核苷酸，其中該結核病與結核分枝桿菌感染相關。
51.藥物組合物，其包含(a)多肽，其包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含編碼(a)的多肽的核酸序列的多核苷酸； 以及(c)藥學上可接受的載體或賦形劑。
52.免疫原性組合物，其包含(a)多肽，其包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含編碼(a)的多肽的核酸序列的多核苷酸； 以及(c)非特異性免疫應答增強劑。
53.如權利要求52所述的免疫原性組合物，其中該非特異性免疫應答增強劑為佐劑。
54.包含編碼多肽的核酸序列的表達載體，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
55.以權利要求M所述的表達載體轉化的分離宿主細胞。
56.重組表達多肽的分離宿主細胞，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
57.如權利要求56所述的分離宿主細胞，其選自大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞。
58.如權利要求56所述的分離宿主細胞，其為卡介桿菌。
59.生產多肽的方法，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；所述方法包括在宿主細胞內重組表達所述多肽的步驟。
60.治療或預防結核病的方法，其包括向有此需要的對象施用安全和有效量的多肽，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段； 其中所述多肽誘導免疫應答。
61.治療或預防結核病的方法，其包括向有此需要的對象施用安全和有效量的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段； 其中所述多核苷酸誘導免疫應答。
62.如權利要求60或61所述的方法，其中該多肽或多核苷酸作為藥物組合物施用。
63.如權利要求60或61所述的方法，其中該多肽或多核苷酸作為免疫原性組合物施用。
64.如權利要求60-63中任意一項所述的方法，其中該對象為哺乳動物。
65.如權利要求64所述的方法，其中該對象為人。
66.如權利要求60-65中任意一項所述的方法，其中該對象患有活動性結核病。
67.如權利要求60-65中任意一項所述的方法，其中該對象患有潛伏結核病。
68.如權利要求60-65中任意一項所述的方法，其中該對象未患有結核病。
69.如權利要求60-68中任意一項所述的方法，其中該對象之前用卡介桿菌(BCG)免疫。
70.如權利要求60-69中任意一項所述的方法，其中該Rv2386c蛋白序列來自結核分枝桿菌。
71.如權利要求70所述的方法，其中該Rv2386c蛋白具有SEQID NO :1的序列。
72.如權利要求60-71中任意一項所述的方法，其進一步包括施用一種或多種可有效治療結核病的化療劑。
73.如權利要求72所述的方法，其中該一種或多種化療劑選自異煙胼和利福平。
74.如權利要求60-73中任意一項所述的方法，進一步包括施用至少一種另外的結核分枝桿菌抗原。
75.如權利要求74所述的方法，其中該另外的結核分枝桿菌抗原以多肽形式提供。
76.如權利要求75所述的方法，其中該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；且該另外的結核分枝桿菌抗原以融合蛋白的形式提供。
77.如權利要求74所述的方法，其中該另外的結核分枝桿菌抗原以多核苷酸形式提
78.如權利要求77所述的方法，其中該多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；且該另外的結核分枝桿菌抗原以單個多核苷酸序列的形式提供。
79.如權利要求78所述的方法，其中所述單個多核苷酸序列編碼融合蛋白，該融合蛋白包含該Rv2386c抗原和該另外的結核分枝桿菌抗原。
80.如權利要求74所述的方法，其中該另外的結核分枝桿菌抗原以卡介桿菌(BCG)形式提供。
81.如權利要求60-80中任意一項所述的方法，其中結核病的治療或預防指結核病的治療。
82.如權利要求60-80中任意一項所述的方法，其中結核病的治療或預防指結核病的預防。
83.如權利要求60-80中任意一項所述的方法，其中結核病的治療或預防指潛伏結核病的治療。
84.如權利要求60-80中任意一項所述的方法，其中結核病的治療或預防指潛伏結核病的預防。
85.如權利要求60-80中任意一項所述的方法，其中結核病的治療或預防指結核病再活化的預防。
86.如權利要求60-80中任意一項所述的方法，其中結核病的治療或預防指結核病再活化的延緩。
87.如權利要求60-86中任意一項所述的方法，其中該結核病與結核分枝桿菌感染相關。
88.如權利要求87所述的方法，其中該結核分枝桿菌感染與結核分枝桿菌的多重耐藥菌株有關。
89.如權利要求60-88中任意一項所述的方法，其誘導針對結核分枝桿菌感染的免疫應答。
90.多肽在用于治療或預防結核病的藥劑生產中的用途，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
91.包含編碼多肽的核酸序列的多核苷酸在用于治療或預防結核病的藥劑生產中的用途，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
92.包含多肽的融合蛋白，該多肽包含 (i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
93.包含編碼含有多肽的融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
94.包含第一核苷酸序列的多核苷酸，該第一核苷酸序列在適度嚴格條件下與編碼多肽的第二核苷酸序列的補體選擇性雜交，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
95.如權利要求94所述的多核苷酸，其包含在高度嚴格條件下與編碼多肽的第二核苷酸序列的補體選擇性雜交的第一核苷酸序列，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
96.如權利要求94或95所述的多核苷酸，其包含與SEQID NO 2的補體選擇性雜交的第一核苷酸序列。
97.與多肽特異性結合的抗體或其片段，該多肽包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。
98.診斷試劑盒，其包含(a)如權利要求1所述的多肽；(b)使所述多肽與來自個體的樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)充分接觸的設備；和(c)對樣本的T細胞應答進行定量的裝置。
99.如權利要求98所述的診斷試劑盒，其包含(a)如權利要求1所述的多肽；(b)使所述多肽與來自個體的樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)充分接觸的設備；和(c)對樣本的T細胞應答進行定量和表征的裝置。
100.診斷試劑盒，其包含(a)如權利要求1所述的多肽；(b)使所述多肽與來自個體的樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)充分接觸的設備；和(c)對樣本的B細胞應答進行定量的裝置。
101.診斷試劑盒，其包含(a)如權利要求1所述的多肽；和(b)使所述多肽與患者的真皮細胞充分接觸的設備。
102.診斷試劑盒，其包含(a)如權利要求1所述的多肽；和(c)對來自個體樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)的T細胞應答進行定量的裝置。
103.診斷試劑盒，其包含(a)如權利要求1所述的多肽；和(c)對來自個體樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)的B細胞應答進行定量的裝置。
全文摘要
本發明涉及多肽，其包含(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。本發明的其它方面涉及相關的多核苷酸、融合蛋白以及治療或預防結核病的方法。
文檔編號A61K38/51GK102165064SQ200980138405
公開日2011年8月24日 申請日期2009年7月24日 優先權日2008年7月25日
發明者D·墨菲, J·布朗, P·梅滕斯 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司, 葛蘭素集團有限公司