激活素-actrii的拮抗劑及在提高紅細胞水平中的用途的制作方法

專利名稱：激活素-actrii的拮抗劑及在提高紅細胞水平中的用途的制作方法
激活素-ACTRI I的拮抗劑及在提高紅細胞水平中的用途相關申請
本申請要求2008年6月沈日提交的美國臨時申請號61/133，368的權益，該申請的說 明書在此通過全文引用并入本文。
背景技術：
成熟的紅細胞(或紅血球)負責脊椎動物循環系統中的氧運輸。紅細胞攜帶高濃度的血 紅蛋白，血紅蛋白是一種蛋白，其在相對高的氧分壓(PO2)下在肺中與氧結合，并將氧送遞 至具有相對低PA的身體區域。成熟的紅細胞在稱為紅細胞生成的過程中由多能造血干細胞產生。在出生后的個 體中，紅細胞生成主要在骨髓和脾的紅髓中進行。各種信號轉導途徑的協同作用控制細胞 增殖、分化、存活和死亡的平衡。在正常條件下，紅細胞以可維持體內恒定的紅細胞量的速 率產生，且反應于各種刺激(包括上升或下降的氧壓力或組織需求)可增加或減少其生成。 紅細胞生成的過程開始于譜系定型的前體細胞的形成，并通過一系列的不同前體細胞類型 進行。紅細胞生成的最終階段出現為網織紅細胞，其釋放進入血流，并失去它們的線粒體和 核糖體，同時呈現成熟紅細胞的形態。在血液中網織紅細胞水平的上升或者網織紅細胞紅 細胞比例的上升標志著紅細胞產生速率的上升。促紅細胞生成素(Epo)被廣泛認為是出生后脊椎動物中最重要的紅細胞生成的 正調節劑。Epo調節對減少的組織氧壓力(低氧)和低紅細胞水平或低血紅蛋白水平的補償 性紅細胞生成反應。在人體內，上升的Epo水平可通過刺激骨髓和脾中祖紅細胞的生成而 促進紅細胞的形成。在小鼠中，Epo主要增加脾中的紅細胞生成。醫生們采用了各種形式的重組Epo來增加各種臨床設置中的紅細胞水平，特別用 于貧血的治療。貧血是一種具有較寬定義的狀況，其特征在于血液中的血紅蛋白或紅細胞 低于正常水平。在一些情況下中，貧血是由紅細胞的生成或存活中的原發性病癥所引起的。 更常見情況下，貧血繼發于其它系統的疾病(Weatherall & ftx)van (2000) Lancet 355， 1169-117 。貧血可由紅細胞生成速率下降或破壞速率上升所導致，或者由因出血引起的 紅細胞丟失所導致。貧血可由多種病癥引起，所述病癥包括，例如，慢性腎功能衰竭、骨髓異 常增生綜合征、類風濕關節炎以及骨髓移植。以Epo進行治療通常可導致健康人在一周中血紅蛋白上升約1-3 g/dL。當施用 至貧血個體時，該治療方案通常可提供血紅蛋白和紅細胞水平的實質上升，并使得生活質 量改善和存活時間延長。Epo并非一律有效，許多個體甚至在高劑量下仍然是難治的(Horl 等人 Q000) Nephrol Dial Transplant 15，43-50)。50% 以上的癌癥患者對 Epo 的反應 不足，大約10%的末期腎疾病患者具有低反應性(Glaspy等人(1997) J Clin Oncol 15， 1218-1234 ;Demetri 等人(1998) J Clin Oncol 16，3412-3425)，以及不到 10% 的骨髓異 常增生綜合征患者能夠有利地反應(Estey (2003) Curr Opin Hematol 10，60-67)。一些 因素，包括炎癥、鐵和維生素缺乏、透析不充分、鋁毒性以及甲狀旁腺功能亢進可預測較差 的治療反應，對Epo耐受的分子機制仍然不清楚。因此，本公開內容的一個目的是提供提高患者紅細胞水平的替代性組合物和方法。發明概述
本公開內容部分證明激活素拮抗劑以及ActRIIa拮抗劑(統稱為“激活素-ActRIIa拮 抗劑”)可以用于提高紅細胞和血紅蛋白水平。本公開內容部分證明了激活素-ActRIIa拮 抗劑可以提高紅細胞和血紅蛋白水平并且也增加骨密度。這種雙重作用在具有貧血和骨丟 失這兩者的患者，例如很多癌患者(其中貧血和骨丟失可以是腫瘤的后果或放療或化療的 后果)、骨質疏松患者和腎功能衰竭患者中特別有利。具體地，本公開內容證明了 ActRIIa的 可溶形式充當激活素的抑制劑，并且當體內施用時，提高紅細胞水平。盡管可溶性ActRIIa 可以通過除激活素拮抗作用之外的機制影響紅細胞水平，但本公開內容證明了可以基于 激活素拮抗作用或ActRIIa拮抗作用或這兩者選擇期望的治療劑。所述藥劑統稱為激活 素-ActRIIa拮抗劑。因此，在某些實施方式中，本公開內容提供了使用激活素-ActRIIa 拮抗劑來提高患者中的紅細胞和血紅蛋白水平并在有需要的患者中治療與低紅細胞或血 紅蛋白水平相關的病癥，或對骨和紅細胞產生聯合作用的方法，該激活素-ActRII拮抗劑 包括，例如，結合激活素的ActRIIa多肽，抗激活素抗體，抗ActRIIa抗體，靶向激活素或 ActRIIa的小分子和適體以及減少激活素或ActRIIa的表達的核酸。如美國專利申請系列 號11/603，485和公開的專利申請WO 2008/100384和W0/2007/062188 (在此通過引用并 入本文)所述，激活素-ActRIIa拮抗劑可用于促進骨生長和提高骨密度。如本文所述，激活 素-ActRIIa拮抗劑對紅細胞水平的作用相對該種拮抗劑對骨的作用更為快速并在更低劑 量下發生。因此，在某些實施方式中，本公開內容提供使用激活素-ActRIIa拮抗劑來提高 紅細胞或血紅蛋白水平，而不引起骨密度顯著升高的方法。例如，一種方法可引起小于3%、 5%、10%或15%的骨密度增加。這種選擇性作用可通過使用例如較低劑量的激活素-ActRIIa 拮抗劑、較低給藥頻率而達到，或通過使用經計算可提供較低血清濃度的劑量和頻率下的 具有較短血清半衰期的激活素-ActRIIa拮抗劑而達到。此外，考慮到激活素-ActRIIa拮抗 劑促進骨生長和提高紅細胞水平，本公開內容提高了用于促進骨生長和提高紅細胞水平， 特別是在患有特征在于貧血和骨丟失的病癥的患者中促進骨生長和提高紅細胞水平的方 法，所述病癥例如炎性腸病、類風濕關節炎、多發性骨髓瘤、癌和癌治療相關的骨丟失和很 多形式的腎功能衰竭，包括末期腎疾病。在某些方面，本公開內容提供多肽，包括與激活素結合的可溶性、結合激活素的 ActRIIa多肽。可將ActRIIa多肽配制成包含該結合激活素的ActRIIa多肽和藥學可接受 的載體的藥物制劑。該結合激活素的ActRIIa多肽可以小于1微摩爾或小于100、10或1 納摩爾的Kd與激活素結合。任選地，相對于⑶Fll和/或⑶F8，該結合激活素的ActRIIa 多肽選擇性地結合激活素，并任選地以比結合⑶Fll和/或⑶F8的Kd至少低10倍、20倍 或50倍的Kd結合激活素。盡管不希望受到特定作用機制的束縛，預期ActRIIa-Fc中這種 激活素抑制相對于GDF11/GDF8抑制的選擇性程度解釋了對骨或紅細胞生成的作用，而對 肌肉沒有一致可測的作用。在許多實施方案中，將選擇ActRIIa多肽，從而在達到對紅細胞 水平的理想作用的劑量下，引起肌肉中小于15%、小于10%或小于5%的增長。在其它實施 方案中，對肌肉的作用是可接受的，并且不需要針對其進行選擇。如通過大小排阻層析所 評估的，該組合物相對于其它多肽成分可具有至少95%的純度，任選地，該組合物具有至少 98%的純度。用于此類制劑的結合激活素的ActRIIa多肽可以是本文公開的那些多肽的任意種，例如具有(即，包含)選自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列的多肽，或具有 (即，包含)與選自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、 97%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。結合激活素的ActRIIa多肽可包含天然ActRIIa 多肽的功能性片段，例如包含選自SEQ ID NOs: 1-3的序列或SEQ ID NO: 2的序列的至少 10,20或30個氨基酸，缺乏C-末端10至15個氨基酸(“尾”)的功能性片段。可溶性、結合激活素的ActRIIa多肽可包括相對天然存在的ActRIIa多肽在氨基 酸序列(例如，在配體結合域)中的一個或多個改變。分別在WO 2006/0U627的第59-60頁 和55-58頁(通過引用并入本文)和美國專利序列號12/012,652 (通過引用并入本文)中提 供了改變的ActRIIa多肽的實例。氨基酸序列中的改變可以例如，當在哺乳動物、昆蟲或其 它真核細胞中產生時改變多肽的糖基化，或者相對于天然存在的ActRIIa多肽改變多肽的 蛋白酶剪切。結合激活素的ActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有作為一個結構域的ActRIIa 多肽(例如，ActRIIa的配體結合部分)和提供理想特性(例如改善的藥代動力學、更容易的 純化、對特定組織的靶向等)的一個或多個其它結構域。例如，融合蛋白的結構域可增強 以下一項或多項體內穩定性、體內半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形 成、融合蛋白的多聚化和/或純化。結合激活素的ActRIIa融合蛋白可包含提供理想特性 (例如改善的藥代動力學、改善的溶解度或改善的穩定性)的免疫球蛋白Fc結構域(野生型 或突變體)或血清白蛋白或其它多肽部分。在優選的實施方式中，ActRIIa-Fc融合體包含 位于Fc結構域和胞外ActRIIa結構域之間的相對非結構化的接頭。該非結構化的接頭可以 是相對不含二級結構的、1、2、3、4或5個氨基酸的人工序列或長度在5到15、20、30、50或更 多氨基酸之間的人工序列，或者兩者的混合物。接頭可富含甘氨酸和脯氨酸殘基，并可以例 如，含有蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的單序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復序列(例如， TG4(SEQ ID NO: 15) ^ SG4(SEQ ID NO: 16)單序列或重復序列)。融合蛋白可包含純化子 序列(subsequence)，例如表位標記、FLAG標記、聚組氨酸序列和GST融合體。任選地，可溶 性ActRIIa多肽包含選自如下的一種或多種修飾的氨基酸殘基糖基化氨基酸、聚乙二醇 化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、與脂質部分綴合的氨基酸以 及與有機衍生劑綴合的氨基酸。藥物制劑還可包含一種或多種額外化合物，例如用于治療 骨病癥的化合物或用于治療貧血的化合物。優選地，藥物制劑基本不含熱原。一般而言，優 選在哺乳動物細胞系中表達ActRIIa蛋白，該細胞系合適地介導ActRIIa蛋白的天然糖基 化，從而減少患者中的不利免疫應答的可能性。人和CHO細胞系已被成功使用，預期其它常 見的哺乳動物表達系統將是有用的。如本文所述的，ActRIIa蛋白是指具有理想特性的ActRIIa-Fc，所述特性包括在 動物模型和人患者中相對GDF8和/或GDF11，對激活素的選擇性結合、高親和力配體結合和 大于兩周的血清半衰期。在某些實施方式中，本發明提供ActRIIa-Fc多肽和包含此類多肽 和藥學可接受的賦形劑的藥物制劑。在某些方面，本公開內容提供編碼可溶性的結合激活素的ActRIIa多肽的核 酸。分離的多核苷酸可包含例如上文所述的可溶性、結合激活素的ActRIIa多肽的編碼序 列。例如，分離的核酸可包含編碼ActRIIa的胞外域(例如，配體結合域)的序列以及編碼 ActRIIa的部分或全部跨膜結構域和/或胞質域的序列(除定位在該跨膜結構域或胞質域中或定位在該胞外域與該跨膜結構域或胞質域之間的終止密碼子)。例如，分離的多核苷酸 可包含全長ActRIIa多核苷酸序列，例如，SEQ ID NO: 4，或ActRIIa的部分截短的形式， 例如包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的核酸，其對應于ActRIIa的胞外域。所述分離的多核 苷酸可以進一步包含在3’-末端之前至少六百個核苷酸處或其它位置的轉錄終止密碼子， 從而使該多核苷酸的翻譯產生任選地融合至全長ActRIIa的截短部分的胞外域。優選的 ActRIIa的核酸序列為SEQ ID NO: 14。本文公開的核酸可以可操作地連接至啟動子從而 進行表達，且本公開內容提供用此類重組多核苷酸轉化的細胞。所述細胞優選為哺乳動物 細胞，例如CHO細胞。在某些方面，本公開內容提供制備可溶性、結合激活素的ActRIIa多肽的方法。所 述方法可包括在合適的細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人細胞中表達本文公開的任 意核酸(例如，SEQ ID NO: 4、5或14)。此類方法可包括a)在適于表達所述可溶性ActRIIa 多肽的條件下培養細胞，其中用可溶性ActRIIa表達構建體轉化所述細胞；和b)回收如此 表達的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可作為粗制的、部分純化的或高度純化 的級分回收。可通過一系列純化步驟實現純化，所述純化步驟包括例如，任意順序的如下步 驟中的一個、兩個或三個或更多個蛋白A層析、陰離子交換層析(例如Q瓊脂糖)、疏水作用 層析(例如苯基瓊脂糖)、大小排阻層析以及陽離子交換層析。可溶性ActRIIa可以配制為 液體或固體(如凍干的)形式。在某些方面，本文公開的激活素-ActRII拮抗劑可用于在受試者中促進紅細胞產 生或提高紅細胞水平的方法中。在某些實施方式中，本公開內容提供了在有需要的患者中 治療與低紅細胞計數或低血紅蛋白水平相關的病癥(例如，貧血)的方法。方法可包括給有 需要的受試者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗劑。在某些實施方案中，本公開內容提供 了在有需要的患者中提高紅細胞水平和骨形成的方法。方法可以包括給有需要的受試者施 用有效量的激活素-ActRIIa拮抗劑。在某些實施方案中，本公開內容證明了，在嚙齒動物 中，激活素-ActRIIa拮抗劑主要通過對脾的作用提高祖紅細胞水平。因此，本公開內容提 供了增加從脾釋放紅細胞的方法，該方法包括給患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗 劑。在某些方面，所述公開內容提供了激活素-ActRI Ia拮抗劑在制備用于治療本文描述的 病癥或狀況的藥物中的用途。在某些方面，所述公開內容提供了鑒定刺激紅細胞產生的藥劑的方法。所述方法 包括a)鑒定結合激活素或ActRIIa多肽的配體結合域的測試藥劑；以及b)評估所述藥 劑對紅細胞、血紅蛋白水平和/或紅細胞前體水平(例如，網織紅細胞水平)的作用。附圖簡述


圖1顯示了在CHO細胞中表達的ActRIIa-hFc的純化。所述蛋白純化為單一的、充分 確定的峰，其通過大小區分柱(sizing column)(左圖)和考馬斯染色的SDS-PAGE (右圖) 顯現(左泳道分子量標準；右泳道ACtRIIa-hFC)。圖2顯示了通過BiaCore 測定而測量的ActRIIa-hFc與激活素及⑶F-11的結
口 O圖3顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長類動物的紅細胞計數的作用。在第0天、 第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kgU0 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治 療雌性獼猴(四組，每組五只猴)。圖3A顯示紅細胞(RBC)計數。圖:3B顯示血紅蛋白水平。統計學顯著性是相對于每個治療組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖4顯示了 ActRIIa-hFc對雄性非人靈長類動物的紅細胞計數的作用。在第0天、 第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kgUO mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治 療雄性獼猴(四組，每組五只猴)。圖4A顯示紅細胞(RBC)計數。圖4B顯示血紅蛋白水平。 統計學顯著性是相對于每個治療組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖5顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長類動物的網織紅細胞計數的作用。在第 O天、第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc 治療獼猴(四組，每組五只猴)。圖5A顯示絕對網織紅細胞計數。圖5B顯示網織紅細胞相對 于RBC的百分比。統計學顯著性是相對于每個組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖6顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長類動物的網織紅細胞計數的作用。在第 O天、第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc 治療獼猴(四組，每組五只猴)。圖6A顯示絕對網織紅細胞計數。圖6B顯示網織紅細胞相對 于RBC的百分比。統計學顯著性是相對于每個組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖7顯示了實施例5中描述的人類臨床試驗所得的結果，其中曲線下面積(AUC) 和ActRIIa-hFc的施用劑量具有線性關系，而與ActRIIa-hFc是通過靜脈內(IV)施用還是 皮下(SC)施用無關。圖8顯示了 IV或SC施用的患者中的ActRIIa-hFc血清水平的比較。圖9顯示了反應于不同劑量水平的ActRIIa-hFc的骨堿性磷酸酶(BAP)水平。BAP 是合成代謝骨生長的標志。圖10描繪了從實施例5所述人臨床試驗的血細胞比容水平基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖11描繪了從實施例5所述人臨床試驗的血紅蛋白水平基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖12描繪了從實施例5所述人臨床試驗的RBC (紅細胞)計數基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖13描繪了從實施例5所述人臨床試驗的網織紅細胞計數基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖14顯示了具有本文推測的殘基的人ActRIIA和ActRIIB的比對，所述推測是基 于用方框表示的、直接接觸配體的多個ActRIIB和ActRIIA晶體結構(配體結合袋)的復合 分析。圖15顯示化療誘導的貧血的小鼠模型中ActRIIA-mFc對血細胞比容的作用。數 據是平均值士 SEM。*，在同一時間點與載體相比P < 0.05。在化療前單劑ActRIIA-mFc 防止了原本會在施用化療劑紫杉醇后觀察到的血細胞比容水平的下降。圖16顯示化療誘導的貧血的小鼠模型中ActRIIA-mFc對血細胞比容的劑量依賴 性作用。數據是平均值士 SEM。#，在同一時間點與載體相比P < 0.01; *#，在同一時 間點與載體相比P < 0.001。在施用紫杉醇2周后，ActRIIA-mFc治療提高了血細胞比容水 平，該提高是劑數的函數。圖17顯示慢性腎疾病的部分腎切除的(NEPHX)小鼠模型中ActRIIA-mFc對血細 胞比容的作用。數據是平均值士 SEM。*，在同一時間點與載體相比P < 0.05。ActRIIA-mFc治療防止了原本會在4周時觀察到的血細胞比容水平的下降，并且在8周時產生了血細胞 比容的有益趨勢。發明詳述 1. ■
轉化生長因子-β (TGF-β)超家族包含多種生長因子，它們具有共同的序列元件和 結構基序。已知這些蛋白在脊椎動物和無脊椎動物中對多種細胞類型施加生物作用。該超 家族的成員在胚胎發育過程中在模式形成和組織特化方面行使重要功能，并且能夠影響多 種分化過程，包括脂肪生成、肌發生、軟骨發生、心臟生成、血細胞生成、神經發生和上皮細 胞分化。該家族分成兩大分支BMP/GDF和TGF- β /激活素/BMPlO分支，其成員具有多樣 的，通常互補的作用。通過操縱TGF-β家族成員的活性，通常可以導致生物中的顯著生理 學改變。例如，皮埃蒙特和比利時藍牛品種攜帶GDF8 (也稱作肌肉抑制素)基因中的功能 喪失突變，其導致肌肉量的顯著增加。Grobet等人，NatGenet. 1997，17(1):71_4。此 外，在人類中，GDF8的無活性等位基因與增加的肌肉量相關，并且，據報道，與優越的強度相 關。Schuelke 等人，N Engl J Med 2004，350:2682-8。激活素是二聚多肽生長因子，其屬于TGF-β超家族。存在三種主要的激活素 形式(Α，B和ΑΒ)，其為兩種密切相關的β亞基的同/異二聚體(分別為βΑβΑ，βΒβΒ和 βΑβΒ)。人基因組還編碼激活素C和激活素Ε，它們主要在肝中表達，同樣已知包括i3c 或β e的異二聚體形式。在TGF-β超家族中，激活素是獨特的和多功能的因子，它能刺激 卵巢和胎盤細胞中的激素生成，支持神經元細胞存活，根據細胞類型正面或負面影響細胞 周期進程，并至少在兩棲動物胚胎中誘導中胚層的分化(DePaolo等人，1991，Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512 ;Dyson等人，1997，Curr Biol. 7:81-84 ；Woodruff, 1998,Biochem Pharmacol. 55:953-963)。此外，業已發現從刺激后的人單核細胞白血病細胞中分離的紅 細胞分化因子(EDF)與激活素A相同(Murata等人，1988，PNAS，85 2434)。業已表明激活 素A促進骨髓中的紅細胞生成。在一些組織中，激活素信號傳導被它的相關異二聚體，即抑 制素所拮抗。例如，在從腦垂體釋放促卵泡激素(FSH)的過程中，激活素促進FSH分泌和合 成，而抑制素阻止FSH的分泌和合成。其它可調節激活素生物活性和/或結合激活素的蛋 白包括促濾泡素抑制素(FS)、促濾泡素抑制素相關蛋白(FSRP)和α 2-巨球蛋白。TGF-β信號由I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復合物介導，該復合 物在受到配體刺激時磷酸化和激活下游Smad蛋白(Massagu6，2000，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 :169-178)。這些I型和II型受體為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的區域的結 合配體的胞外域、跨膜結構域、具有預測的絲氨酸/蘇氨酸特異性的胞質域所組成。I型受 體為信號傳導所必需；在結合配體和I型受體的表達中需要II型受體。I和II型激活素 受體在配體結合后形成穩定的復合物，導致I型受體被II型受體磷酸化。兩種相關的II型受體(ActRlDJPActRIlE^PActRnb已被鑒定為激活素的 II 型受體(Mathews 和 Vale，1991，Cell 65973-982 ;Attisano 等人，1992，Cell 68: 97-108)。除了激活素外，ActRIIa和ActRnb能夠與一些其它的TGF-β家族蛋白(包括 BMP7、Nodal、GDF8 和 GDF11)進行生物化學相互作用(Yamashita 等人，1995，J. Cell Biol. 130:217-226 ;Lee 和 McPherron，2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311 ；Yeo 和 Whitman, 2001 ,Mol. Cell 7: 949-957 ;0h 等人，2002，Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4 是激活素(特別是激活素A)的主要的I型受體，而ALK-7也可作為激活素(特別是激活素B) 的受體。如本文所證實，相對其它TGF-b家族成員(例如⑶F8或⑶Fl 1)顯示與激活素A的 結合的實質優先性的可溶性ActRIIa多肽(sActRIIa)能夠有效提高體內紅細胞水平。盡 管不希望受限于任何具體機理，考慮到在這些研究中所用的具體sActRIIa構建體所顯示 的極強激活素結合(皮摩爾解離常數)，預期sActRIIa的作用主要由激活素拮抗劑作用所引 起。不考慮機理，從本公開內容可顯而易見地看出=ActRIIa-激活素拮抗劑提高了嚙齒動 物、猴和人的紅細胞水平。應指出血細胞生成是一種復雜的過程，它受到多種因素的調節， 包括促紅細胞生成素、G-CSF和鐵的體內穩態。術語“提高紅細胞水平”和“促進紅細胞形 成”指臨床可觀察的度量，例如血細胞比容、紅細胞計數和血紅蛋白測量值，其意在對于發 生該種改變的機理是中立的。本文報道的關于非人類靈長類動物的數據也可在小鼠、大鼠和人中重復，因此， 本公開內容提供了采用ActRII多肽和其它激活素-ActRII拮抗劑在從嚙齒動物到人的 哺乳動物中促進紅細胞生成和提高紅細胞水平的方法。激活素-ActRIIa拮抗劑包括，例 如，結合激活素的可溶性ActRIIa多肽、結合激活素(特別是激活素A和B亞基，也稱為β A 和βΒ)并破壞ActRIIa結合的抗體、結合ActRIIa并破壞激活素結合的抗體、選擇用于 激活素或ActRIIa結合的非抗體蛋白(此類蛋白及其設計和選擇的方法的實例參見例如 W0/2002/08817UW0/2006/055689 和 W0/2002/03^25)、選擇用于激活素或 ActRIIa 結合的 隨機化的肽，其通常附著在Fc結構域上。具有激活素或ActRIIa結合活性的兩種不同蛋白 (或其它部分)，特別是分別阻斷I型(例如可溶性I型激活素受體)和II型(例如可溶性II 型激活素受體)結合位點的激活素結合劑，可連接在一起建立雙功能結合分子。抑制該激活 素-ActRIIa信號傳導軸的核酸適體、小分子和其它試劑也包括為激活素-ActRIIa拮抗劑。 多種蛋白具有激活素-ActRIIa拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素α亞基)(盡管抑制素 并不在所有的組織中普遍拮抗激活素)、促濾泡素抑制素(例如促濾泡素抑制素-288和促濾 泡素抑制素_315)、FSRP、FLRG、激活素C、α⑵-巨球蛋白、以及Μ108Α (在位置108處由甲 硫氨酸改變為丙氨酸)突變激活素Α。一般而言，激活素的替代形式(特別是在I型受體結 合域中具有改變的那些形式)能夠結合II型受體且不能形成活性三元復合物，因此充當拮 抗劑。此外，抑制激活素Α、B、C或E或者特別是抑制ActRIIa表達的核酸，例如反義分子、 siRNA或核酶可被用作激活素-ActRII拮抗劑。相對于其它TGF_b家族成員，特別是相對于 GDF8和GDFl 1，待使用的激活素-ActRIIa拮抗劑可對抑制激活素介導的信號傳導顯示選擇 性。在本發明的上下文中以及在使用每個術語的特定的上下文中，在本說明書中所用 的術語通常具有其在本領域中的普通含義。在下文以及說明書的其它部分討論了某些術 語，以在描述本發明的組合物和方法以及如何制造和使用它們的方面為從業者提供額外的 指導。術語的任何使用范圍或含義將從使用該術語的特定上下文顯而易見。“約”和“大約”一般應表示考慮到測量法的性質和精確性，測得的量的可接受誤差 程度。典型地，示例性誤差程度為在給定的數值或數值范圍的20%以內，優選在10%以內， 更優選在5%以內。或者，特別是在生物系統中，術語“約”和“大約”可表示在一定數量級內，優選在給定值的5倍以內，更優選在2倍以內的值。除非另有說明，本文給出的數量為近似值，表 示在未明確指出時，可推出術語“約”或“大約”。本發明的方法可包括對序列彼此比較的步驟，包括將野生型序列與一種或多種突 變體(序列變體)進行比較。此類比較通常包括聚合物序列的比對，例如，采用本領域熟知的 序列比對程序和/或算法(例如，稍加舉例，BLAST、FASTA和MEGALIGN)進行。本領域技術 人員可容易地理解在此類比對中，當突變包含殘基插入或缺失時，該序列比對將在不包含 該插入或缺失的殘基的聚合物序列中引入“空位”(通常由破折號或“A”表示)。以及其所有的語法形式和拼寫變化表示的“同源性”均指具有“共同進化起源”的 兩種蛋白(包括來自相同生物物種的超家族的蛋白，以及來自不同生物物種的同源性蛋白) 之間的關系。此類蛋白(及其編碼核酸)具有序列同源性，這反映在它們的序列相似性，不管 是在同一性百分比方面還是在特定殘基或基序以及保守位置的存在方面。以其所有的語法形式表示的術語“序列相似性”指可共有或可不共有共同進化起 源的核酸或氨基酸序列之間的同一性或對應性程度。然而，在通常的使用以及在本申請中，當術語“同源性”被副詞例如“高度”修飾時， 可表示序列相似性，并可涉及或可不涉及共同進化起源。2. ActRIIa 多肽
在某些方面，本發明涉及ActRIIa多肽。本文所用的術語“ActRIIa”指來自任意物種的 IIa型激活素受體(ActRIIa)蛋白以及通過誘變或其它修飾從所述ActRIIa蛋白衍生的變 體的家族。本文提及ActRIIa時，應理解為提及目前鑒定的形式中的任意一種。該ActRIIa 家族的成員通常為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的區域的配體結合胞外域、跨膜結構域 以及具有預測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的胞質域組成。術語“ActRIIa多肽”包括包含ActRIIa家族成員的任何天然存在的多肽及其保留 了有用活性的任意變體(包括突變體、片段、融合物以及肽模擬(P^tidomimetic)形式)的 多肽。參見，例如W0/2006/0U627。例如，ActRIIa多肽包括由任意已知ActRIIa的序列所 衍生的、具有與ActRIIa多肽的序列有至少約80%同一性、任選至少85%、90%、95%、97%、99% 或更高同一性的序列的多肽。例如，本發明的ActRIIa多肽可結合ActRIIa蛋白和/或激活 素并抑制其功能。可針對在體內促進紅細胞形成的活性選擇ActRIIa多肽。ActRIIa多肽 的實例包括人ActRIIa前體多肽(SEQ ID NO: 1)和可溶性人ActRIIa多肽(例如，SEQ ID NOs: 2、3、7 和 12)。人ActRIIa前體蛋白序列如下信號肽以單下劃線表示；胞外域以粗體表示，而潛在的N-連接的糖基化位點以雙下劃 線表示。 人ActRIIa可溶性(細胞外)、加工的多肽序列如下
編碼人ActRIIa前體蛋白的核酸序列如下所示(Genbank條目NM_001616的核苷酸 164-1705)
權利要求
1.提高有需要的患者中的紅細胞水平的方法，該方法包括以每周一次到每90天一次 的給藥間隔，給患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮抗劑。
2.權利要求1的方法，其中給藥間隔是每周一次到每60天一次。
3.提高有需要的患者中的紅細胞水平和骨形成的方法，該方法包括給患者施用有效 量的激活素-ActRIIa拮抗劑。
4.治療有需要的患者中的貧血的方法，該方法包括給患者施用有效量的激活 素-ActRIIa拮抗劑。
5.增加從脾釋放紅細胞的方法，該方法包括給患者施用有效量的激活素-ActRIIa拮 抗劑。
6.權利要求5的方法，其中所述患者患有骨髓的病癥。
7.提高患者中的紅細胞水平的方法，該方法包括施用有效量的激活素拮抗劑和促紅 細胞生成素激動劑。
8.權利要求1-7的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是與選自激活素 和ActRIIa的靶蛋白結合的抗體。
9.權利要求1-7的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是抑制素或抑制 素的保守變體。
10.權利要求1-7的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是包含結合并拮 抗激活素的促濾泡素抑制素結構域的蛋白。
11.權利要求1-7的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是選自下組的蛋 白促濾泡素抑制素、FLRG和前述物質的保守變體。
12.權利要求1-7的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是選自下組的 ActRIIa 多肽a)包含與SEQID NO: 2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQID NO: 3具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；c)包含選自SEQID NO: 2的至少50個連續氨基酸的多肽；d)包含與SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；和e)包含由在嚴格條件下與SEQID NO: 5的互補序列雜交的核酸編碼的氨基酸序列的 蛋白。
13.權利要求12的方法，其中所述多肽具有一種或多種以下特征i)以至少10" M的Kd結合ActRIIa配體；禾口 )抑制細胞中的ActRIIa信號傳導。
14.權利要求12的方法，其中所述多肽是融合蛋白，其除了包含ActRIIa多肽結構域 外，還包含一種或多種多肽部分，所述多肽部分增強以下一種或多種體內穩定性、體內半 衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形成和/或純化。
15.權利要求12的方法，其中所述融合蛋白包括選自免疫球蛋白Fc結構域和血清白 蛋白的多肽部分。
16.權利要求12的方法，其中所述多肽包括一個或多個選自下組的修飾的氨基酸殘基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、 與脂質部分綴合的氨基酸和與有機衍生劑綴合的氨基酸。
17.權利要求12的方法，其中ActRIIa-Fc融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列a)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，b)SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，c)SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。
18.權利要求4的方法，其中所述患者患有低增殖性貧血。
19.權利要求18的方法，其中所述患者患有腎疾病。
20.權利要求18的方法，其中所述患者患有癌。
21.權利要求20的方法，其中所述癌選自多發性骨髓瘤和乳腺癌。
22.權利要求18的方法，其中所述患者是缺鐵的。
23.權利要求18的方法，其中所述患者患有骨髓的病癥。
24.權利要求4的方法，其中所述患者患有小紅細胞性貧血。
25.權利要求4的方法，其中所述患者已經用骨髓抑制療法進行過治療。
26.權利要求25的方法，其中所述骨髓抑制療法選自放療和化療。
27.權利要求25的方法，其中所述骨髓移植療法選自烷化劑、抗代謝藥、細胞毒性抗 生素、激酶抑制劑、有絲分裂抑制劑和拓撲異構酶抑制劑。
28.權利要求25的方法，其中患者已經用紫杉烷進行過治療。
29.權利要求觀的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇。
30.權利要求3的方法，其中所述患者患有貧血和骨丟失。
31.權利要求3的方法，其中所述患者患有選自下組的病癥炎性腸病、類風濕關節 炎、多發性骨髓瘤、實體瘤和腎病癥。
32.權利要求3的方法，其中所述患者患有末期腎疾病。
全文摘要
在某些方面，本發明提供了用于提高脊椎動物中的紅細胞和/或血紅蛋白水平的組合物和方法，所述脊椎動物包括嚙齒動物和靈長類動物，特別是人。
文檔編號A61K38/00GK102131515SQ200980133280
公開日2011年7月20日 申請日期2009年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者J·西拉, M·L·謝爾曼, N·伯爾格施泰因 申請人:阿塞勒隆制藥公司