專利名稱：：嵌合呼吸道合胞病毒多肽抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開內(nèi)容關(guān)注免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本公開內(nèi)容涉及用于引發(fā)對呼吸道合胞病毒(RSV)特異性的免疫應(yīng)答的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：人呼吸道合胞病毒(RSV)是小于6個(gè)月齡的嬰兒和懷孕期小于或等于35周的早產(chǎn)兒中下呼吸道感染(LRI)的最常見的全球性原因。RSV疾病譜包括從鼻炎(rhinitis)和耳炎(otitis)至肺炎(pneumonia)和細(xì)支氣管炎(bronchiolitis)的一大批呼吸癥狀，后兩種疾病與相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率有關(guān)。人是RSV唯一已知的貯主。自受污染的鼻分泌物擴(kuò)散病毒經(jīng)由大的呼吸飛沫發(fā)生，因此傳播需要與受感染個(gè)體或受污染表面緊密接觸。RSV能在玩具或其它物體上持續(xù)數(shù)小時(shí)，這解釋了醫(yī)院RSV感染的高比率，特別是在兒科病房中。估計(jì)全球每年的RSV感染和死亡數(shù)字分別是6400萬和16萬。僅在美國，估計(jì)RSV每年造成18，000至75，000例住院和90至1900例死亡。在溫帶氣候，RSV被較好地證明為急性LRI(包括細(xì)支氣管炎和肺炎)的每年冬季流行病的一個(gè)原因。在美國，幾乎所有兒童到兩歲時(shí)都感染過RSV。RSV相關(guān)LRI在其它方面健康的兒童中的發(fā)生率計(jì)算為生命前兩年中37/1000名兒童-年(小于6個(gè)月齡的嬰兒中45/1000名兒童-年)，而住院風(fēng)險(xiǎn)為6/1000名兒童-年(生命前6個(gè)月中11/1000名兒童-年)。發(fā)生率在患有心肺疾病的兒童和早產(chǎn)兒中較高，在美國這些兒童構(gòu)成幾乎半數(shù)的RSV相關(guān)醫(yī)院收治。經(jīng)受由RSV引起的更嚴(yán)重的LRI的兒童以后具有升高的兒童哮喘發(fā)生率?；加袊?yán)重LRI及其后遺癥的兒童的護(hù)理花費(fèi)巨大，而且RSV還日益被公認(rèn)為老年人中流感樣病的發(fā)病率的一個(gè)重要原因，這突顯了需要能夠針對RSV誘導(dǎo)的疾病提供保護(hù)的安全且有效的疫苗。發(fā)明概述本公開內(nèi)容關(guān)注嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。嵌合RSV抗原以N端至C端方向包含第一氨基酸序列，其包含與呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白多肽的Fl域不可切割地連接的F2域；和第二氨基酸序列，其包含RSV附著(G)蛋白多肽中包含免疫學(xué)優(yōu)勢表位的部分。所公開的抗原在對受試者施用時(shí)引發(fā)免疫應(yīng)答，而且可以用于治療和/或預(yù)防RSV感染的癥狀。還公開了編碼嵌合抗原的核酸、含有嵌合抗原的免疫原性組合物、及用于生成和使用嵌合抗原的方法。附圖簡述圖1是相對于原型Rix)進(jìn)行的修飾以生成reνι-ι和reV2-1的圖示。數(shù)字1和2分別指明引入的接頭和G蛋白片段的位置。圖2是序列比對，其提供了re-Rix與稱作reVi-I和reV2-1的兩種例示性的新型改良re嵌合物的比較。圖3A和圖;3B是柱狀圖，其顯示了TOVl-I和TOV2-1對人血清的中和抑制。發(fā)明詳述導(dǎo)言由于宿主免疫應(yīng)答表現(xiàn)出在疾病的發(fā)病機(jī)制中起作用的實(shí)情而使開發(fā)針對由RSV感染引起的癥狀和后遺癥提供保護(hù)的疫苗變得復(fù)雜。二十世紀(jì)60年代的早期研究顯示了，與未接種疫苗的對照受試者相比，接種用福爾馬林滅活的RSV疫苗的兒童在隨后暴露于病毒后遭受更嚴(yán)重的疾病。這些早期試驗(yàn)導(dǎo)致80%的接種疫苗者住院和2例死亡。增強(qiáng)的疾病嚴(yán)重性已經(jīng)在動(dòng)物模型中得到再現(xiàn)，而且認(rèn)為其源自血清中和性抗體的水平不足、缺乏局部免疫、和2型輔助T細(xì)胞樣(TM)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)過量，其伴有肺嗜酸粒細(xì)胞增多及IL-4和IL-5細(xì)胞因子的生成增加。比較而言，針對RSV感染提供保護(hù)的成功疫苗誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答，其特點(diǎn)在于IL-2和Y-干擾素(IFN-γ)的生成。已經(jīng)嘗試了多種辦法(包括殺死的或滅活的病毒、減毒的活病毒和純化的亞基辦法)來努力產(chǎn)生安全且有效的RSV疫苗，其在健康的和有風(fēng)險(xiǎn)的群體中產(chǎn)生持久的且保護(hù)性的免疫應(yīng)答。然而，迄今所評估的候選物無一導(dǎo)致為了預(yù)防RSV感染和/或減輕或預(yù)防RSV疾病的疫苗的銷售。一種辦法已經(jīng)牽涉生成重組嵌合抗原，其包含RSV融合(F)和附著(G)糖蛋白兩者的構(gòu)件。例示性的嵌合RSV抗原披露于美國專利號(hào)5，194，595中。這些嵌合構(gòu)建體包含RSVF和G蛋白的整個(gè)胞外域(即RSVF的氨基酸殘基1-5和RSVG的69-298)。雖然此嵌合抗原在動(dòng)物模型(例如小鼠、棉鼠)中引發(fā)免疫應(yīng)答，但是它由于生產(chǎn)和穩(wěn)定性困難而不能進(jìn)行銷售。本公開內(nèi)容關(guān)注具有卓越的免疫原性和上佳的工藝特征的新型嵌合re多肽。這些新型嵌合RSV抗原克服先前嘗試中遇到的數(shù)項(xiàng)重大缺點(diǎn)以生成適合于作為預(yù)防性和治療性疫苗施用的安全且有效的嵌合RSV抗原。一方面，公開內(nèi)容涉及包含嵌合多肽的呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，所述嵌合多肽以N端至C端方向包含(i)第一氨基酸序列，其包含與F蛋白多肽的Fl域不可切割地連接的F2域；和(ii)第二氨基酸序列，其包含G蛋白多肽中含有免疫學(xué)優(yōu)勢表位的部分。典型地，RSVF蛋白多肽的Fl域和F2域經(jīng)由氨基酸接頭不可切割地連接?？梢酝ㄟ^消除弗林蛋白酶切割識(shí)別序列和/或位點(diǎn)來以不可切割的方式連接F2和Fl域，所述弗林蛋白酶切割識(shí)別序列和/或位點(diǎn)使F2和Fl域可分開，而且導(dǎo)致天然F蛋白的成熟和裝配過程中釋放ρ印27肽。例如，嵌合RSV多肽可以包括至少一處氨基酸刪除或替代，其除去弗林蛋白酶切割位點(diǎn)，由此使嵌合多肽不可切割。例如，可以刪除或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如第106位和第133位)以生成不可切割的F蛋白。在某些例示性的實(shí)施方案中，可以刪除或替代兩個(gè)氨基酸(包括至少一個(gè)精氨酸，例如第106位和第107位的精氨酸和丙氨酸，和第133位和第134位的精氨酸和賴氨酸)。任選地，為了便于表達(dá)和回收，嵌合RSV多肽包括N端的信號(hào)肽。信號(hào)肽可以選自本領(lǐng)域中已知的多種信號(hào)肽，而且通常進(jìn)行選擇以便于(增強(qiáng)或最大化)在選擇用于重組表達(dá)嵌合多肽的系統(tǒng)中的生成和加工。一般地，信號(hào)肽在18-25個(gè)氨基酸的長度范圍中。在某些實(shí)施方案中，信號(hào)肽來自RSVF蛋白，例如SEQIDNO:2的氨基酸殘基1_23。F2域可以包含天然F蛋白多肽的氨基酸殘基M-105。會(huì)顯而易見的是，信號(hào)肽與F2域之間的精確的氨基酸界限可以變化一個(gè)或多個(gè)氨基酸(實(shí)際上，在選自RSVF蛋白的信號(hào)肽的情況中，此類界限是任意的)。在例示性的實(shí)施方案中，F(xiàn)l域包含F(xiàn)l域的基本上整個(gè)胞外部分，例如天然F蛋白多肽的殘基137至殘基528。如上文所指明的，F(xiàn)2和Fl域可以通過氨基酸接頭序列不可切割地連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在本文中所公開的嵌合re多肽的背景中合適的許多氨基酸接頭。在例示性的實(shí)施方案中，接頭選自下列序列SEQIDNO5,SEQIDNO:6、SEQIDNO7禾口SEQIDNO:8。以符合讀碼框的方式將F多肽序列與RSVG蛋白多肽的一部分連接。選擇G蛋白的一部分以改善生成特征(例如與全長G蛋白多肽相比)。選擇G蛋白的一部分以保留免疫學(xué)優(yōu)勢表位，特別是氨基酸殘基183和203之間的免疫學(xué)優(yōu)勢表位。例如，RSVG蛋白的一部分包含氨基酸152-229。在某些例示性的實(shí)施方案中，RSVG蛋白的一部分包含G蛋白的氨基酸殘基149-229。F和G構(gòu)件的序列可以選自天然存在的F和G蛋白序列，而且可以選擇為在序列上對應(yīng)于單種毒株或超過一種毒株。例如，F(xiàn)和G部分可以來自同一毒株，或者F和G部分可以各自來自不同毒株，或者F部分和/或G部分可以是與來自超過一種毒株的氨基酸對應(yīng)的雜合物。任選地，嵌合RSV多肽相對于天然存在的RSV多肽可以包含一處或超過一處氨基酸替代。例如，可以將氨基酸替代引入G蛋白部分中，諸如與減輕或預(yù)防模式系統(tǒng)中的疫苗增強(qiáng)性病毒疾病有關(guān)的氨基酸替代，例如嵌合多肽可以包含G蛋白的殘基191處用丙氨酸對天冬酰胺的替代(N191A)。任選地，如本文中所公開的嵌合RSV多肽可以包含多組氨酸標(biāo)簽或另一種此類序列，其設(shè)計(jì)用于便于或提高重組表達(dá)的蛋白質(zhì)的回收和/或純化。在某些例示性的實(shí)施方案中，嵌合RSV多肽具有選自SEQIDNO11或13的氨基酸序列或其亞序列(例如缺乏氨基酸1-23的信號(hào)序列或具有不同信號(hào)序列替代和/或缺乏C端組氨酸標(biāo)簽的亞序列)。有利地，嵌合RSV多肽包含RSVF蛋白和RSVG蛋白兩者的至少一個(gè)免疫優(yōu)勢表位。表達(dá)(例如和純化或分離)后，嵌合RSV多肽裝配成多聚體，其擁有免疫學(xué)上類似天然F蛋白的構(gòu)象。例如，嵌合RSV多肽可以有利地裝配成三聚體。本公開內(nèi)容還涵蓋免疫原性組合物，其包含與載體或賦形劑一起配制的上文所描述的任何嵌合RSV多肽。典型地，載體或賦形劑是藥學(xué)可接受載體或賦形劑，諸如緩沖劑。任選地，載體或賦形劑可以包括提高嵌合RSV多肽的穩(wěn)定性、溶解度或穩(wěn)定性和溶解度兩者的別的成分。任選地，免疫原性組合物進(jìn)一步包含適合于施用入受試者群體中的佐劑，對于所述受試者群體，意圖施用所述組合物例如以預(yù)防、減輕或改善RSV誘導(dǎo)性疾病或癥狀。因而，可以選擇佐劑以對新生兒、嬰兒或成人諸如年齡為至少65歲的成人施用。有利地，佐劑是Thl偏愛性佐劑。在某些實(shí)施方案中，佐劑是TLR-4配體諸如3D-MPL，或脂質(zhì)A的任何其它合成衍生物。任選地，免疫原性組合物還可以包含顆粒載體諸如明礬。在某些實(shí)施方案中，佐劑可以包括脂質(zhì)體或乳劑，例如水包油乳劑。有利地，配制免疫原性組合物以在人中作為藥物使用，例如以預(yù)防或減輕對人受試者施用后受RSV感染，或者以預(yù)防或減輕對人受試者施用后由受RSV感染引起的病理學(xué)應(yīng)答。任選地，免疫原性組合物還包含與RSV不同的病原性生物體的至少一種別的抗原。例如，病原性生物體可以是與RSV不同的病毒，諸如副流感病毒(PIV)、流感病毒、乙肝病毒、和/或脊髓灰質(zhì)炎病毒?；蛘?，病原性生物體可以是細(xì)菌，諸如白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血菌(Hemophilusinfluenza)、禾口/或月市炎球菌(Pneumococcus)。本公開內(nèi)容的另一方面關(guān)注編碼本文中所提供的任何嵌合多肽的重組核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸包括已經(jīng)進(jìn)行過密碼子優(yōu)化以在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)(例如進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞等中表達(dá))的多核苷酸序列。在一些情況中，核酸包含在載體諸如原核或真核表達(dá)載體內(nèi)。此類核酸或載體所導(dǎo)入的細(xì)胞(即宿主細(xì)胞)也是本公開內(nèi)容的特征。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，但是更通常會(huì)是真核細(xì)胞，諸如酵母細(xì)胞(例如畢赤酵母(Picchia))、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)。嵌合多肽和核酸在制備用于處理(例如預(yù)防性)RSV感染的藥物中是有用的。因而，本公開內(nèi)容還提供了用于引發(fā)針對RSV的免疫應(yīng)答的方法，其通過施用免疫學(xué)有效量的含有本文中所公開的任何嵌合RSV多肽的組合物來進(jìn)行。有利地，在對人受試者(諸如為新生兒、嬰兒或兒童或?qū)夏晔茉囌?施用時(shí)，組合物引發(fā)對RSV特異性的免疫應(yīng)答而不在與RSV接觸后增強(qiáng)病毒疾病。有利地，組合物引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，其減輕或預(yù)防受RSV感染和/或減輕或預(yù)防受RSV感染后的病理學(xué)應(yīng)答。典型地，免疫應(yīng)答引發(fā)以生成Thl型細(xì)胞因子為特征的免疫應(yīng)答，例如Thl型免疫應(yīng)答。術(shù)語除非另有解釋，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同含義。分子生物學(xué)中的常見術(shù)語的定義可以參見BenjaminLewin,GenesV,由OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(編)，TheEncyclopediaofMolecularBiology,由BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；及RobertA.Meyers(編)，MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)。除非上下文另有明確指明，單數(shù)術(shù)語“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)所指物。類似地，除非上下文另有明確指明，詞語“或”意圖包括“和”。術(shù)語“多個(gè)/種”指兩個(gè)/種或更多個(gè)/種。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，對核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子質(zhì)量值是近似的，并且為了描述而提供。另外，關(guān)于物質(zhì)諸如抗原的濃度或水平給出的數(shù)值限制意圖為近似的。如此，若指明濃度是至少(例如)200pg，則意圖該濃度被理解為至少約(或“大約”或“”)200pg。雖然與本文中所描述的方法和材料類似或等同的方法和材料可以在本公開內(nèi)容的實(shí)踐或測試中使用，下文描述了合適的方法和材料。術(shù)語“包含”意味著“包括”。如此，除非上下文另有要求，詞語“包含”及其變化形式應(yīng)當(dāng)理解為暗示包括規(guī)定的化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或步驟，或者化合物或步驟的組，但是不排除任何其它化合物、組合物、步驟，或其組?？s寫“例如”(e.g.)衍生自拉丁語exemplifygratia，并且在本文中用于指明非限制性例子。如此，縮寫“例如”(e.g.)與術(shù)語“例如”(forexample)是同義的。為了便于審閱本公開內(nèi)容的各個(gè)實(shí)施方案，提供了術(shù)語的下列解釋。可以在本公開內(nèi)容的語境中提供別的術(shù)語和解釋。呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒亞科(Pneumovirinae)、肺病毒屬(Pneumovirus)的一種病原性病毒。RSV的基因組是長15，222個(gè)核苷酸、單鏈、負(fù)義RNA分子，其編碼11種蛋白質(zhì)。RNA基因組與病毒N蛋白的緊密聯(lián)合形成包在病毒包膜內(nèi)部的核殼?；贕糖蛋白的抗原性差異，已經(jīng)描述了兩組人RSV株，即A和B組。迄今已經(jīng)分離出多種RSV株。在圖4和圖5中通過GenBank和/或EMBL登錄號(hào)指明例示性毒株。別的RSV株可能會(huì)得到分離，并且涵蓋在RSV屬內(nèi)。類似地，RSV屬涵蓋通過遺傳漂變、或人工合成和/或重組，源于天然存在的變體(例如以前或以后鑒定的毒株)。術(shù)語“F蛋白”或“融合蛋白”或“F蛋白多肽”或“融合蛋白多肽”指具有RSV融合蛋白多肽的整個(gè)或部分氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語“G蛋白”或“G蛋白多肽”指具有RSV附著蛋白多肽的整個(gè)或部分氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。已經(jīng)描述了許多RSV融合和附著蛋白，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。為了便于理解本公開內(nèi)容，在提及RSVF和/或G蛋白的氨基酸殘基位置時(shí)，所有氨基酸殘基位置相對于(即氨基酸殘基位置對應(yīng)于)例示性F蛋白SEQIDNO2的氨基酸位置和例示性G蛋白SEQIDNO:4的氨基酸位置給出。然而，可以使用來自任何RSVA或B株的可比氨基酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過使用容易地可獲得且公知的比對算法(諸如BLAST，例如使用缺省參數(shù))來比對選定RSV株的氨基酸序列與SEQIDNO2的氨基酸序列，從而容易地確定任何其它RSVA或B株的可比氨基酸位置。W02008114149中提供了來自許多毒株的例示性F和G蛋白序列，其中任一種可以在本文中所公開的嵌合re蛋白的背景中采用。為了公開適合于在嵌合G蛋白中使用的RSVF和G蛋白的序列，通過提及而將W02008114149收入本文?！扒逗蟫e多肽”或“re抗原”或“re多肽抗原”是摻入多肽構(gòu)件(通常包括rsvF蛋白和RSVG蛋白兩者的抗原決定簇或表位)的嵌合多肽。在本公開內(nèi)容的背景中，嵌合FG多肽以N端至C端取向包含包含與Fl域不可切割地連接的F2域的第一氨基酸序列和包含RSVG蛋白中含有免疫學(xué)優(yōu)勢表位的部分的第二氨基酸序列。術(shù)語亞基和域在提及F蛋白和/或FO多肽的結(jié)構(gòu)域時(shí)可互換使用。此背景中的術(shù)語嵌合的包括F和G蛋白構(gòu)件都來自同一血清型或毒株的多肽及單獨(dú)的F和G蛋白構(gòu)件來自不同血清型或毒株的多肽?！白凅w”在提及核酸或蛋白質(zhì)(例如RSVF或G蛋白或蛋白質(zhì)域，或TO嵌合多肽)時(shí)指與參照核酸或蛋白質(zhì)不同的核酸或多肽。通常，變體與參照核酸或蛋白質(zhì)之間的差異構(gòu)成與參照物相比小比例數(shù)目的差異。此類差異可以是氨基酸添加、刪除或替代。如此，變體通常相差不超過約、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%的核苷酸或氨基酸殘基。如此，RSVF或G蛋白，或嵌合TO多肽背景中的變體通常與參照蛋白(例如SEQIDN0:2和4中顯示的參照序列，或本文中所公開的任何例示性TO多肽)共享至少80%、或85%，更常見地，至少約90%或更多，諸如95%，或甚至98%或99%序列同一性。作為本公開內(nèi)容特征包括的別的變體是如下的嵌合TO多肽，其摻入來自例如W02008114149(同一或不同毒株)中提供的任何例示性序列的F2(例如包含所有或部分的氨基酸M-105，其通過與SEQIDNO2比對用數(shù)字指明)和/或Fl構(gòu)件(例如包含所有或部分的氨基酸137-528，其通過與SEQIDNO2比對用數(shù)字指明)和選自例如W02008114149中提供的任何例示性序列的G蛋白構(gòu)件(例如所有或部分的氨基酸149-229，其通過與SEQIDNO4比對用數(shù)字指明)。變體可以經(jīng)由遺傳漂變生成，或者可以使用定點(diǎn)或隨機(jī)誘變，或者通過重組兩種或更多種先前存在的變體來人工生成。例如，與SEQIDNO11和13的例示性TO嵌合物相比，變體TO多肽可以包含1、或2、或5或10、或15、或50處氨基酸差異，或者與例如SEQIDNO:10和12的例示性re嵌合核酸相比包含多至約100處核苷酸差異。多肽或蛋白質(zhì)的“域”或“結(jié)構(gòu)域”指多肽或蛋白質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)限定的元件。在本公開內(nèi)容的背景中，“弗林蛋白酶切割域”是通過弗林蛋白酶蛋白酶切割前體多肽限定的域。例如，F(xiàn)蛋白合成為稱作FO的單條多肽。隨后，通過弗林蛋白酶蛋白酶在兩個(gè)共有弗林蛋白酶識(shí)別基序處切割FO多肽以生成稱作F2和Fl的兩個(gè)結(jié)構(gòu)獨(dú)立的多肽單元。F2從氨基酸24(信號(hào)肽后)延伸至第一(以N至C端方向)弗林蛋白酶切割識(shí)別位點(diǎn)。Fl從第二弗林蛋白酶切割位點(diǎn)延伸至FO多肽的C端末端。在本公開內(nèi)容的背景中，也使用術(shù)語Fl來指FO多肽中包含F(xiàn)l域的胞外部分(例如氨基酸137-528)的部分。術(shù)語“天然的”和“天然存在的”指以與其在自然界中相同狀態(tài)存在的元件，諸如蛋白質(zhì)、多肽或核酸。也就是說，該元件沒有進(jìn)行過人工修飾。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本公開內(nèi)容的語境中，RSV蛋白或多肽有許多天然的/天然存在的變體，例如自不同的天然存在的RSV株或隔離群獲得的。術(shù)語“多肽”指其中單體是經(jīng)由酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。如本文中所使用的，術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”意圖涵蓋任何氨基酸序列，而且包括經(jīng)修飾的序列諸如糖蛋白。術(shù)語“多肽”明確意圖涵蓋天然存在蛋白質(zhì)，以及重組或合成生成的蛋白質(zhì)。術(shù)語“片段”提到多肽時(shí)指多肽的一部分(即亞序列)。術(shù)語“免疫原性片段”指多肽的保留全長參照蛋白質(zhì)或多肽的至少一個(gè)優(yōu)勢免疫原性表位的所有片段。多肽內(nèi)的取向一般以N端至C端方向敘述，由各個(gè)氨基酸的氨基和羧基模塊的取向限定。多肽從N或氨基端朝向C或羧基端翻譯?！靶盘?hào)肽”是一種短的氨基酸序列(例如長度為約18-25個(gè)氨基酸)，其將新合成的分泌性蛋白質(zhì)或膜蛋白引導(dǎo)至膜及穿過膜，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的。信號(hào)肽常常但不普遍位于多肽的N端，并且常常在蛋白質(zhì)穿過膜后被信號(hào)肽酶切去。信號(hào)序列通常含有三種常見的結(jié)構(gòu)特征N端極性堿性區(qū)(η區(qū))、疏水性核心、和親水性c區(qū)。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸序列”指長度為至少10個(gè)堿基的核苷酸聚合形式。核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或任一核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語包括單一和雙重形式DNA。“分離的多核苷酸”指與衍生它的生物體的天然存在基因組中與它緊密相鄰的兩條編碼序列(一個(gè)在5’端上，而一個(gè)在3’端上)均不緊密相鄰的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼多肽。核酸的5’和3’方向通過參照各個(gè)核苷酸單元的連接性來限定，并依照脫氧核糖(或核糖)糖環(huán)的碳位置來指派。以5’至3’方向閱讀多核苷酸序列的信息(編碼)內(nèi)容。“重組”核酸指具有非天然存在序列或者具有通過人工組合兩個(gè)在其它情況中分開的序列區(qū)段生成的序列的核酸?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成或者，更常見地，通過人工操作分離的核酸區(qū)段，例如通過遺傳工程技術(shù)來實(shí)現(xiàn)此人工組合?！爸亟M”蛋白指由已經(jīng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞諸如細(xì)菌或真核細(xì)胞中的異源(例如重組)核酸編碼的蛋白質(zhì)。可以在具有能夠表達(dá)由所導(dǎo)入核酸編碼的蛋白質(zhì)的信號(hào)的表達(dá)載體上導(dǎo)入核酸，或者可以將核酸整合入宿主細(xì)胞染色體中。術(shù)語“純化”(例如就病原體或含有病原體的組合物而言)指自組合物除去其存在不是想要的成分的方法。純化是一個(gè)相對術(shù)語，并且不要求從組合物除去不想要的成分的所有痕跡。在疫苗生產(chǎn)的語境中，純化包括諸如離心、透析、離子交換層析、和大小排阻層析、親和純化或沉淀等工藝。如此，術(shù)語“純化的”并不要求絕對純度；相反，其意圖為一個(gè)相對術(shù)語。如此，例如純化的核酸制備物是指定蛋白質(zhì)比該核酸在其生成環(huán)境中(例如在細(xì)胞內(nèi)或在生化反應(yīng)室中)得到更多富集的核酸制備物?？梢约兓旧霞兊暮怂峄虻鞍踪|(zhì)的制備物，使得想要的核酸占制備物總核酸含量的至少50%。在某些實(shí)施方案中，基本上純的核酸會(huì)占制備物總核酸或蛋白質(zhì)含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多?！胺蛛x的”生物學(xué)成分(諸如核酸分子、蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)已經(jīng)與該成分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其它生物學(xué)成分，諸如其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器基本上分開或已經(jīng)基本上純化除去與該成分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其它生物學(xué)成分，諸如其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。已經(jīng)“分離的”核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸和蛋白質(zhì)。“抗原”指能在動(dòng)物中刺激抗體生成和/或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物、或物質(zhì)，包括注射、吸附、或別的方式導(dǎo)入動(dòng)物中的組合物。術(shù)語“抗原”包括所有相關(guān)抗原性表位。術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”指抗原上由B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的位點(diǎn)?！懊庖邔W(xué)優(yōu)勢”表位指針對其產(chǎn)生功能上顯著的宿主免疫應(yīng)答(例如抗體應(yīng)答或T細(xì)胞應(yīng)答)的那些表位。如此，關(guān)于針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，免疫學(xué)優(yōu)勢表位指在被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別時(shí)產(chǎn)生保護(hù)免于由該病原體引起的疾病的那些抗原性模塊。術(shù)語“T細(xì)胞表位”指在與合適的MHC分子結(jié)合時(shí)被T細(xì)胞特異性結(jié)合(經(jīng)由T細(xì)胞受體)的表位。“B細(xì)胞表位”指被抗體(或B細(xì)胞受體分子)特異性結(jié)合的表位?！白魟敝敢苑翘禺愋苑绞皆鰪?qiáng)免疫應(yīng)答產(chǎn)生的藥劑。常見的佐劑包括將抗原吸附至其上的礦物(明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁)的懸液液；乳劑，包括油包水、和水包油(及其變體，包括雙重乳劑和可逆乳劑)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(諸如CpG寡核苷酸)、脂質(zhì)體、Toll受體激動(dòng)劑(特別是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激動(dòng)劑)，和此類成分的各種組合?！懊庖咴越M合物”指適合于對人或動(dòng)物受試者施用的物質(zhì)組合物，其能夠引發(fā)特異性免疫應(yīng)答，例如針對病原體諸如RSV。因此，免疫原性組合物包含一種或多種抗原(例如多肽抗原)或抗原性表位。免疫原性組合物還可以包含一種或多種能夠引發(fā)或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的別的成分，諸如賦形劑、載體、和/或佐劑。在某些例子中，施用免疫原性組合物來引發(fā)保護(hù)受試者免于由病原體誘導(dǎo)的癥狀或狀況的免疫應(yīng)答。在一些情況中，在受試者被暴露于病原體后通過抑制病原體(例如RSV)的復(fù)制來預(yù)防(或減輕或改善)由病原體引起的癥狀或疾病。在本公開內(nèi)容的語境中，術(shù)語免疫原性組合物應(yīng)當(dāng)理解成涵蓋意圖用于對受試者或受試者群體施用以引發(fā)針對RSV的保護(hù)性或姑息性免疫應(yīng)答的組合物(即疫苗組合物或疫苗)?！懊庖邞?yīng)答”指免疫系統(tǒng)細(xì)胞諸如B細(xì)胞、T細(xì)胞、或單核細(xì)胞對刺激的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以是B細(xì)胞應(yīng)答，其導(dǎo)致特異性抗體諸如抗原特異性中和性抗體的生成。免疫應(yīng)答也可以是T細(xì)胞應(yīng)答，諸如⑶4+應(yīng)答或⑶8+應(yīng)答。在一些情況中，應(yīng)答對特定抗原是特異性的(即“抗原特異性應(yīng)答”)。若抗原衍生自病原體，則抗原特異性應(yīng)答是“病原體特異性應(yīng)答”。“保護(hù)性免疫應(yīng)答”指抑制病原體的有害功能或活性、減輕病原體感染、或減輕源于病原體感染的癥狀(包括死亡)的免疫應(yīng)答。可以例如通過在噬斑減少測定法或ELISA中和測定法中抑制病毒復(fù)制或噬斑形成，或者通過在體內(nèi)測量對病原體攻擊的抗性來測量保護(hù)性免疫應(yīng)答?！癟hl”型免疫應(yīng)答的特征在于生成IL-2和IFN-γ的⑶4+Τ輔助細(xì)胞。比較而言，“Th2”型免疫應(yīng)答的特征在于生成IL-4、IL-5、和IL-13的CD4+輔助細(xì)胞?！懊庖邔W(xué)有效量”是用于引發(fā)受試者中的免疫應(yīng)答的組合物(典型地，免疫原性組合物)數(shù)量。通常，想要的結(jié)果是產(chǎn)生抗原(例如病原體)特異性免疫應(yīng)答，其能夠或促成針對病原體保護(hù)受試者。然而，為了獲得針對病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，可需要免疫原性組合物的多次施用。如此，在本公開內(nèi)容的語境中，術(shù)語免疫學(xué)有效量涵蓋與先前或隨后施用聯(lián)合促成獲得保護(hù)性免疫應(yīng)答的分?jǐn)?shù)劑量。形容詞“藥學(xué)可接受的”指明主題物適合于對受試者(例如人或動(dòng)物受試者)施用。Remington’sPharmaceuticalSciences,Ε.W.MartiniMackPublishingCo.，Easton，PA，第15版(1975)描述了適合于治療性和/或預(yù)防性組合物(包括免疫原性組合物)的藥學(xué)投遞的組合物和配制劑(包括稀釋劑)。術(shù)語“調(diào)控”提到應(yīng)答諸如免疫應(yīng)答時(shí)指改變或變更應(yīng)答的開始、幅度、持續(xù)時(shí)間或特征。調(diào)控免疫應(yīng)答的藥劑在其施用后改變免疫應(yīng)答的開始、幅度、持續(xù)時(shí)間或特征中至少一項(xiàng)，或者與參照藥劑相比改變開始、幅度、持續(xù)時(shí)間或特征中至少一項(xiàng)。術(shù)語“減輕”是一個(gè)相對術(shù)語，從而若應(yīng)答或狀況在施用藥劑后得到定量減弱，或者若與參照藥劑相比，它在施用藥劑后得到減弱，則所述藥劑減輕應(yīng)答或狀況。類似地，術(shù)語“預(yù)防”不必然意味著藥劑完全消除應(yīng)答或狀況，只要應(yīng)答或狀況的至少一項(xiàng)特征得到消除。如此，減輕或預(yù)防感染或應(yīng)答諸如病理學(xué)應(yīng)答(例如疫苗增強(qiáng)性病毒疾病)的免疫原性組合物可以但不必然完全消除此類感染或應(yīng)答，只要所述感染或應(yīng)答可測量地減弱例如至少約50%，諸如至少約70%，或約80%，或甚至約90%(即減弱至10%或更小)的感染或應(yīng)答(在沒有藥劑的情況中，或者與參照藥劑相比)。“受試者”指活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體。在本公開內(nèi)容的語境中，受試者可以是實(shí)驗(yàn)受試者，諸如非人動(dòng)物，例如小鼠、棉鼠、或非人靈長類?；蛘?，受試者可以是人受試者。FG嵌合RSV抗原RSV的病毒包膜包括病毒編碼的F、G和SH糖蛋白。F和G糖蛋白是RSV病毒體的僅有的兩種已知誘導(dǎo)Rsv特異性中和性抗體的成分。設(shè)計(jì)本文中所公開的嵌合re多肽以摻入天然F蛋白的結(jié)構(gòu)特征，而同時(shí)展現(xiàn)出RSVG蛋白的重要免疫優(yōu)勢表位。RSV的天然F蛋白被翻譯為單條多肽前體，稱作F0。FO折疊，并受到蛋白水解和其它翻譯后修飾。首先，信號(hào)肽(Sp)將新生多肽的翻譯靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，隨后被信號(hào)肽酶切割。然后初生多肽在RE中在3個(gè)位點(diǎn)處，即在例示性F多肽序列SEQIDNO2的氨基酸位置27、70和500處進(jìn)行N-糖基化。通過弗林蛋白酶切割來生成F2和Fl，并將它們一起折疊為異二聚體的三聚體(3xF2-F1)。弗林蛋白酶是一種鈣依賴性絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，其能在配對的堿性氨基酸加工位點(diǎn)處有效地切割前體蛋白質(zhì)。典型地，此類加工位點(diǎn)包括堿性氨基酸靶序列(規(guī)范地，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg，)。RSVF蛋白在位置106-109和133-136處包含兩個(gè)弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。弗林蛋白酶蛋白酶在兩個(gè)保守的弗林蛋白酶共有序列，即RAR/KR1Q9(FCS-2)和KKRKRR136(FCS-I)處對天然存在的成熟FO多肽的蛋白水解切割導(dǎo)致生成三個(gè)蛋白水解片段。在其N端具有疏水性融合肽的大的膜錨定亞基Fl(對應(yīng)于氨基酸137-574)經(jīng)由二硫化物橋連接至小亞基F2(對應(yīng)于氨基酸M-105)，并釋放最初位于兩個(gè)切割位點(diǎn)之間的由27個(gè)氨基酸構(gòu)成的小肽(pep27)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，縮寫F0、F1和F2在科學(xué)文獻(xiàn)中通常稱作FtlUPF2。對RSVF蛋白的弗林蛋白酶加工的描述以及本領(lǐng)域公認(rèn)的術(shù)語的定義可參見Zimmer等"ProteolyticactivationofRespiratiorySyncyticalVirusfusionprotein.”J.Biol.Chem.276:31642-31650,2001，及Zimmer等，"CleavageatthefurinconsensussequenceRAR/KR109andpresenceoftheinterveningpeptideoftheRespiratiorySyncyticalVirusfusionproteinaredispensableforvirusr印licationincellculture.”J.Virol.76:9218-9224,2002。蛋白質(zhì)使用在C端區(qū)中由白色菱形標(biāo)示的其跨膜螺旋(TM)錨定至膜。另外，RSVF蛋白特征為15個(gè)半胱氨酸殘基、4個(gè)已表征的中和性表位、2個(gè)卷曲螺旋區(qū)和1個(gè)脂質(zhì)化基序。天然G蛋白是通過其跨膜疏水區(qū)(氨基酸41-6錨定至病毒體膜的298個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。氨基酸65-298包括G蛋白中在RSV的表面上暴露的部分。高度0-糖基化的粘蛋白樣區(qū)存在于每個(gè)末端。5個(gè)N-糖基化基序也存在于這兩個(gè)區(qū)域中。未糖基化的中部包括數(shù)種重要的結(jié)構(gòu)基序，包括1)半胱氨酸套索(aal73-190)，其是唯一可獲得結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的G部分⑵在aal83-203處的免疫優(yōu)勢MHCII類表位；和幻趨化因子Fractalkine受體(C3)(CR)和糖胺聚糖(GAG)結(jié)合基序，其牽涉宿主細(xì)胞表面上病毒附著的過程。本公開內(nèi)容關(guān)注嵌合RSV多肽，其以N端至C端取向包含⑴第一氨基酸序列，其包含與RSVF蛋白的Fl域連接的F2域和(ii)第二氨基酸序列，其包含RSVG蛋白的一部分。為了便于生成過程中的折疊和裝配，修飾天然F蛋白序列以消除內(nèi)部弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，并阻止弗林蛋白酶切割?？梢酝ㄟ^在氨基酸殘基106-109和/或133-136的區(qū)域中添加、刪除或替代一個(gè)或多個(gè)氨基酸來破壞弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。例如，可以通過刪除一個(gè)或兩個(gè)氨基酸(例如第106位和第107位的精氨酸和丙氨酸，和第133位和第134位的精氨酸和賴氨酸)破壞弗林蛋白酶切割位點(diǎn)來消除弗林蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。如此，表達(dá)并裝配后，嵌合多肽的F2和Fl部分在單一不可切割的多肽單元中保留。在選擇F蛋白的F2和Fl域時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，包含整個(gè)F2和/或Fl域不是嚴(yán)格必要的。典型地，構(gòu)象考慮在選擇F2域的亞序列(或片段)時(shí)是重要的。如此，F(xiàn)2域通常包含F(xiàn)2域中促進(jìn)嵌合多肽裝配和穩(wěn)定性的部分。在某些例示性的變體中，F(xiàn)2域包含氨基酸M-105。任選地，F(xiàn)2域可以包含天然FO多肽的信號(hào)肽(例如氨基酸1-23)。典型地，至少選擇Fl域的亞序列(或片段)，并將其設(shè)計(jì)成維持包含F(xiàn)蛋白的免疫優(yōu)勢表位的穩(wěn)定構(gòu)象。例如，一般想要選擇Fl多肽域中包含氨基酸沈2-275(帕利珠單抗(palivizumab)中和)和423-436(Centocor的chlOlF單抗)的區(qū)域中由中和性抗體識(shí)別的表位的亞序列。另外，想要包含T細(xì)胞表位，例如在氨基酸328-355的區(qū)域中。最常見地，作為Fl亞基的單一連續(xù)部分(例如跨越氨基酸沈2_436)，但是表位可以在包含作為以穩(wěn)定構(gòu)象裝配的不連續(xù)元件的這些免疫優(yōu)勢表位的合成序列中得到保留。如此，F(xiàn)l域多肽至少包含RSVF蛋白多肽的約氨基酸沈2-436。在本文提供的一個(gè)非限制性例子中，F(xiàn)l域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137至5(雖然可以采用稍微小些的片段，例如開始于氨基酸殘基151或氨基酸161，或終止于第5M位的片段)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可，別的更短的亞序列可以任憑從業(yè)人員使用。為了便于折疊和裝配，并使構(gòu)象性表位的保留最大化，在兩個(gè)F蛋白域之間引入氨基酸接頭。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道具有不同長度和結(jié)構(gòu)屬性的多種接頭。在本文中所公開的嵌合RSV多肽的背景中，可以采用許多此類接頭。例如，有利地采用簡單富含甘氨酸的重復(fù)序列作為接頭，如稱作Vi-I和V1-2的實(shí)施方案中所顯示的。在reVi-I中，采用簡單甘氨酸和絲氨酸重復(fù)序列作為接頭。變體reV1-2包含甘氨酸/絲氨酸接頭，其進(jìn)行改編以包含糖基化位點(diǎn)。分別在SEQIDNO:5和6中提供了具體的例示性甘氨酸/絲氨酸接頭序列?；蛘?，可以采用具有更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)屬性的接頭。在某些實(shí)施方案中，接頭選自天然F蛋白。例如，在某些有利的實(shí)施方案中，接頭在序列上對應(yīng)于整個(gè)或部分的pep27序列，如由稱作V2-1和V2-2的實(shí)施方案所顯示的。在采用此類接頭的情況中，它在長度上可以有所變化，例如以修飾結(jié)構(gòu)或功能特征諸如糖基化。SEQIDNO:7和8中提供了基于ρ印27的接頭的兩種例示性型式。選擇G蛋白多肽構(gòu)件以包含G蛋白中保留免疫學(xué)優(yōu)勢或免疫優(yōu)勢T細(xì)胞表位(例如在氨基酸183-197的區(qū)域中)的部分(或亞序列或片段)。例示性變體包括例如G蛋白中包含氨基酸152、151、150、149、148等至氨基酸226、227、228、229、230等的亞序列或片段。任選地，可以用天然G蛋白的較大的片段(諸如包含氨基酸殘基128-2或130-230的片段)替換。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地領(lǐng)會(huì)，也可以使用更長或更短的G蛋白部分，只要選定的部分不在構(gòu)象上使嵌合re多肽不穩(wěn)定或破壞嵌合re多肽的表達(dá)、折疊或加工。任選地，G蛋白域包含第191位的氨基酸替代，先前已經(jīng)將其與減輕和/或預(yù)防以與福爾馬林滅活的RSV疫苗有關(guān)的嗜酸粒細(xì)胞增多為特征的增強(qiáng)性疾病聯(lián)系起來。天然存在的和替代的(N191A)G蛋白的屬性的全面描述可以參見例如美國專利公開文本No.2005/0042230，通過提及而將其收入本文用于所有目的。若如此需要的話，可以使用本領(lǐng)域中已知的錨基序或其它方法諸如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或多項(xiàng)式確定來鑒定別的T細(xì)胞表位，參見例如RANKPEP(在萬維網(wǎng)上于mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html可獲得)；ProPredI(在萬維網(wǎng)上于:imtech.res.in/raghava/propredl/index,html可獲得)；Bimas(在萬維網(wǎng)上于:www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html可獲得)；和SYFPEITH(在萬維網(wǎng)上于syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm可獲得)。例如，使用算法來測定肽的“結(jié)合閾”，并選擇那些具有給予它們MHC或抗體以某種親和力結(jié)合的高概率的得分的。算法或是基于對MHC結(jié)合特定位置處的特定氨基酸的影響、對抗體結(jié)合特定位置處的特定氨基酸的影響、或是對結(jié)合含有基序的肽中的特定替代的影響。在免疫原性肽的背景內(nèi)，“保守殘基”指在肽中特定位置處以比通過隨機(jī)分布會(huì)預(yù)期的頻率顯著更高的頻率出現(xiàn)的殘基。錨殘基是保守殘基，其提供與MHC分子的接觸點(diǎn)。由此類預(yù)測方法鑒定出的T細(xì)胞表位可以通過測量它們對特定MHC蛋白的結(jié)合及通過其在MHC蛋白的背景中呈遞時(shí)刺激T細(xì)胞的能力來確認(rèn)。雖然SEQIDNO:11和13中列出了例示性的實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需過度實(shí)驗(yàn)就可以產(chǎn)生許多其它實(shí)施方案。對本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)顯而易見的是，可以在重組嵌合RSVre多肽的構(gòu)建中采用任何RSVF和/或G蛋白序列。F蛋白(其負(fù)責(zé)融合病毒包膜與靶細(xì)胞膜)的序列在RSV隔離群間是高度保守的。比較而言，G蛋白(其負(fù)責(zé)病毒附著)的序列是相對可變的。W02008114149中提供了RSVF和G蛋白序列的比對，其顯示了不同蛋白質(zhì)之間的同一性和變異。從這些比對看，保守的和可變的區(qū)域是容易顯而易見的。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)2域(例如對應(yīng)于參照F蛋白序列的氨基酸M-105)通過選自SEQIDNO:5、6、7、或8之任一項(xiàng)的接頭與Fl域(例如對應(yīng)于參照F蛋白序列的氨基酸137-528)不可切割地連接，并以符合讀碼框的方式與包含由G蛋白的氨基酸183-203提供的免疫優(yōu)勢表位的G蛋白域(例如大致與第149位對應(yīng)的氨基酸至大致與參照F蛋白序列的第2位對應(yīng)的氨基酸，例如第148位、第149位、第150位、第151位或第152位至第2位、第227位、第2位、第2位或第230位)連接。F2和Fl域可以選自同一F蛋白多肽，諸如選自天然存在的F蛋白諸如SEQIDNO:2的天然存在F蛋白的F蛋白多肽，或其它例示性F蛋白多肽(例如那些披露于W02008114149中的)之任一種?；蛘?，F(xiàn)2和Fl域可以選自不同天然存在的F蛋白多肽。或者，可以修飾F2和Fl域之一或兩者，如本文中關(guān)于變體的討論中更為詳細(xì)地指明的。類似地，G蛋白域可以選自SEQIDN0:4或W02008114149中所披露的任何變體。其它例示性的實(shí)施方案是具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的刪除的變體。在想要較短片段的情況中，仍然選擇如下的部分，其保留嵌合多肽的構(gòu)件的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)上重要的特征，如本文中所描述的?；蛘?，變體可以包含額外的氨基酸。例如，變體可以包含便于純化的額外的氨基酸(例如多組氨酸標(biāo)簽)。另外/或者，可以對任何所公開的嵌合re多肽進(jìn)行修飾以在選定的表達(dá)系統(tǒng)中生成時(shí)提高嵌合多肽的表達(dá)和穩(wěn)定性。例如，真核構(gòu)建體通常設(shè)計(jì)為包含與表達(dá)系統(tǒng)對應(yīng)的信號(hào)肽，例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)嵌合多肽時(shí)，有利地選擇哺乳動(dòng)物或病毒信號(hào)肽諸如RSVFO天然信號(hào)序列?；蛘?，可以用信號(hào)肽(諸如桿狀病毒信號(hào)肽，或蜂毒肽信號(hào)肽)替代以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。合適的植物信號(hào)肽是本領(lǐng)域中已知的，若植物表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選的話。適合于在本文中所公開的嵌合re多肽的背景中使用的例示性信號(hào)肽包括下列各項(xiàng)的信號(hào)肽組織纖溶酶原激活物(tPA)、單純皰疹病毒(HSV)gD蛋白、人內(nèi)皮抑制素、HIVgpl20、CD33、巨細(xì)胞病毒gB蛋白、人Her2Neu、埃巴病毒(EBV)gp350、禾口Tan等，ProteinEng.15337-45的SS0在某些實(shí)施方案中，修飾嵌合re多肽以改變糖基化樣式或狀態(tài)(例如通過提高或降低天然F蛋白多肽中存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)處糖基化的分子的比例)。例如，預(yù)測SEQIDNO:2的天然F蛋白多肽在氨基酸位置27、70和500處被糖基化。在一個(gè)實(shí)施方案中，在氨基酸位置500處的糖基化位點(diǎn)附近引入修飾。例如，可以通過用諸如谷氨酰胺(Q)的氨基酸替換與參照F蛋白序列(SEQIDNO2)的第500位對應(yīng)的位置處的天冬酰胺來除去糖基化位點(diǎn)。有利地，引入提高此糖基化位點(diǎn)處的糖基化效率的修飾。合適的修飾的例CN102131830A說明書12/30頁子包括第500位-第502位的下列氨基酸序列NGS；NKS；NGT；NKT0導(dǎo)致糖基化升高的對此糖基化位點(diǎn)的修飾還可以導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性升高的蛋白質(zhì)生成。編碼嵌合FG多肽抗原的核酸本公開內(nèi)容的另一方面關(guān)注重組核酸，其編碼上文所描述的嵌合re多肽。重組核酸以5’至3’方向包含⑴至少編碼RSVF蛋白多肽弗林蛋白酶切割域2(F2域)的一部分或片段的多核苷酸序列；(編碼氨基酸接頭的多核苷酸序列；C3)至少編碼RSVF蛋白多肽弗林蛋白酶切割域1(Fl域)的一部分或片段的多核苷酸序列；和(4)至少編碼RSVG蛋白多肽的一部分或片段的多核苷酸序列。連接構(gòu)件多核苷酸序列以使編碼的多肽區(qū)段在如上文所公開的單條連續(xù)嵌合多肽中生成。在某些實(shí)施方案中，重組核酸編碼嵌合re多肽，其中F2域(例如對應(yīng)于參照F蛋白序列的氨基酸M-105)通過選自SEQIDNO:5、6、7、或8之任一項(xiàng)的接頭與Fl域(例如對應(yīng)于參照F蛋白序列的氨基酸137-528)不可切割地連接，并以符合讀碼框的方式與包含由G蛋白的氨基酸183-203提供的免疫優(yōu)勢表位的G蛋白域(例如大致與第149位對應(yīng)的氨基酸至大致與參照F蛋白序列的第2位對應(yīng)的氨基酸，例如第148位、第149位、第150位、第151位或第152位至第2位、第227位、第2位、第2位或第230位)連接。編碼F2和Fl域的多核苷酸可以選自同一F蛋白多肽，諸如選自天然存在的F蛋白諸如SEQIDNO:2的天然存在的F蛋白(例如SEQIDNO=D的F蛋白多肽，或編碼其它例示性F蛋白多肽(例如那些披露于W02008114149中的)之任一種的?；蛘撸梢赃x擇F2和Fl域以編碼不同天然存在的F蛋白多肽。或者，編碼F2和Fl域之一或兩者的多核苷酸可以包含一處或多處突變(例如核苷酸添加、刪除或替代)以修飾多肽，如本文中關(guān)于變體的討論中更為詳細(xì)地指明的(例如以修飾第27位、第70位和/或第500位的糖基化位點(diǎn))。類似地，編碼G蛋白域的多核苷酸可以選自SEQIDNO:4或W02008114149中所披露的任何變體。在某些實(shí)施方案中，對重組核酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在選定的原核或真核宿主細(xì)胞諸如哺乳動(dòng)物、植物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。為了便于復(fù)制和表達(dá)，可以將核酸摻入載體諸如原核或真核表達(dá)載體中。雖然本文所公開的核酸可以包含在許多載體(包括例如細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；自質(zhì)粒和噬菌體DNA、病毒DNA諸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病、腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等的組合衍生的載體)之任一種中，但是最常見地，載體會(huì)是適合于生成多肽表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體。在表達(dá)載體中，編碼re嵌合物的核酸通常以對于合適的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動(dòng)子，和任選地，一種或多種增強(qiáng)子)的接近和取向排列以指導(dǎo)mRNA合成。也就是說，感興趣的多核苷酸序列可操作連接至合適的轉(zhuǎn)錄控制序列。此類啟動(dòng)子的例子包括CMV的立即早期啟動(dòng)子、LTR或SV40啟動(dòng)子、桿狀病毒的多角體啟動(dòng)子、大腸桿菌Iac或trp啟動(dòng)子、噬菌體T7和λPl啟動(dòng)子、和已知在原核或真核細(xì)胞或其病毒中控制基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。表達(dá)載體通常還含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。任選地，載體包含適合于擴(kuò)增表達(dá)的序列。另外，任選地，表達(dá)載體包含一種或多種選擇標(biāo)志基因以提供供選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞用的表型性狀，諸如供真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者諸如大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。表達(dá)載體還可以包含別的表達(dá)元件，例如以改善翻譯的效率。這些信號(hào)可以包含例如ATG起始密碼子和相鄰序列。在一些情況中，例如與感興趣的多核苷酸序列(例如天然的起始密碼子)同時(shí)將翻譯起始密碼子和相關(guān)序列元件插入合適的表達(dá)載體中。在此類情況中，不需要?jiǎng)e的翻譯控制信號(hào)。然而，在僅插入多肽編碼序列或其部分的情況中，提供外源翻譯控制信號(hào)(包括ATG起始密碼子)來表達(dá)嵌合re序列。以正確讀碼框的方式放置起始密碼子以確保翻譯感興趣的多核苷酸序列。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是多種起源的(天然的和合成的兩者)。若想要的話，可以通過包含適合于使用中的細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來進(jìn)一步提高表達(dá)效率(Scharf等(1994)ResultsProblCellDiffer20:125-62；Bitter等(1987)MethodsinEnzymol153:516-544)。在一些例子中，編碼!7G多肽的核酸(諸如載體)包含為了在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)提高和/或優(yōu)化re編碼核酸的表達(dá)而選擇的一種或多種別的序列元件。一類表達(dá)增強(qiáng)序列包括外遺傳元件諸如基質(zhì)附著區(qū)(或MAR)，或類似的外遺傳元件，例如STAR元件(例如諸如Otte等，Biotechnol.Prog.23=801-807,2007中披露的那些STAR元件)。不限于理論，認(rèn)為MAR介導(dǎo)靶DNA序列錨定至細(xì)胞核基質(zhì)，產(chǎn)生染色質(zhì)環(huán)域，其自異染色質(zhì)核心向外延伸。雖然MAR不含任何明顯的共有或可識(shí)別序列，但是它們最一致的特征表現(xiàn)為總體上高的A/T含量，和另一條鏈上占優(yōu)勢的C堿基。這些區(qū)域表現(xiàn)為形成彎曲的二級結(jié)構(gòu)，其可能傾向于鏈分開，而且可以包含能充當(dāng)鏈分開的成核點(diǎn)的核心解旋元件(CUE)。已經(jīng)將數(shù)個(gè)簡單的富含AT的序列基序與MAR序列聯(lián)系起來例如A框(AATAAAYAAA)、T框(TTWTWTTWTT)、DNA解鏈基序(AATATATT，AATATT)、SATBl結(jié)合位點(diǎn)(H框，A/T/C25)和脊椎動(dòng)物(RNYNNCNNGYNGKTNYNY)或果蠅屬(Drosophila)(GTNWAYATTNATNNR)的共有拓?fù)洚悩?gòu)酶II位點(diǎn)。例示性MAR序列記載于已公布的美國專利申請No.20070178469和國際專利申請No.W002/074969(通過提及而將其收入本文)。可以用于增強(qiáng)編碼TO多肽的核酸表達(dá)的別的MAR序列包括雞溶菌酶MAR、MARp1-42,MARp1-6,MARp1-68、禾口MARpx-29,其記載于Girod等，NatureMethods,4747-753，2007(分別以GenBank登錄號(hào)EA423306、DI107030、DI106196、DI107561、和DI106512披露)。技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，可以通過選擇產(chǎn)生中間水平增強(qiáng)的MAR(如關(guān)于MAR1-9報(bào)告的)來進(jìn)一步調(diào)控表達(dá)。若想要的話，可以通過搜索序列數(shù)據(jù)庫，例如使用諸如MAR-Finder(在網(wǎng)絡(luò)上于futuresoft.org/MarFinder^ImM)、SMARTest(^genomatix.de^ImM)、$SMARScanI(Levitsky等，Bioinformatics15:582-592,1999)等軟件來鑒定用于提高FG多肽表達(dá)的備選MAR序列。在某些實(shí)施方案中，在與re多肽編碼序列相同的核酸(例如載體)上將MAR導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞中。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，在不同的核酸上(例如反式)將MAR導(dǎo)入，并且任選地，它可以與re核酸共整合。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成重組re核酸生成的例示性規(guī)程可以參見Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第2片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989;Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3片反，ColdSpringHarborPress，2001；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates，1992(和至2OO3年的增補(bǔ))；及Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology，第4片反，Wiley&Sons，1999。編碼嵌合FG多肽的例示性核酸以SEQIDN0:10和12表示。可以通過裝配選自任何已知的(或隨后)發(fā)現(xiàn)的RSV株的類似的F2、Fl和G蛋白多肽序列來生成別的變體，例如如圖4和圖5中所顯示的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以生成與例示性變體共享序列同一性的別的序列變體。典型地，核酸變體會(huì)編碼相差不超過1<%、或2%、或5(%、或10(%、或15(%、或20%的核苷酸或氨基酸殘基的多肽。也就是說，編碼的多肽共享至少80%、或85%、更常見地，至少約90%或更多，諸如95%，或者甚至98%或99%序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)立即理解的是，編碼re多肽的多核苷酸序列本身可以由于遺傳密碼冗余而共享較少的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，嵌合re多肽和多核苷酸序列間的相似性一般就多肽和多核苷酸序列而言可以按照序列間的相似性(在其它情況中稱為序列同一性)表示。序列同一性常常按照百分比同一性(或相似性)測量；百分比越高，兩種序列的一級結(jié)構(gòu)越相似。一般而言，兩種氨基酸(或多核苷酸)序列的一級結(jié)構(gòu)越相似，源于折疊和裝配的更高級結(jié)構(gòu)越相似。嵌合re多肽和多核苷酸序列的變體可以具有一處或少量氨基酸刪除、添加或替代，但是仍然會(huì)共享非常高百分比的其氨基酸，和一般地其多核苷酸序列。測定序列同一性的方法是本領(lǐng)域中公知的。多種程序和比對算法記載于Smith和Waterman,Adv.App1.Math.2:482,1981；Needleman禾口Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970；Higgins和Sharp，Gene73:237,1988；Higgins和Sharp，CABIOS5:151，1989；Corpet等，NucleicAcidsResearch16:10881,1988；及Pearson禾口Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444，1988。Altschul等，NatureGenet.6:119，1994呈現(xiàn)了序列比對方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考慮。NCBI基本的局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool,BLAST)仏1仏(^111等，工101.8丨01.215:403,1990)可獲自數(shù)個(gè)來源，包括(美國)國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI,Bethesda,MD)及在因特網(wǎng)上，用于與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx組合使用。如何使用此程序來測定序列同一性的描述在因特網(wǎng)上NCBI網(wǎng)站上可獲得。兩種核酸間的序列相似性的另一項(xiàng)指示是雜交能力。兩種核酸的序列越相似，它們會(huì)雜交的條件越嚴(yán)格。雜交條件的嚴(yán)格性是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。如此，產(chǎn)生特定程度的嚴(yán)格性的雜交條件會(huì)隨選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長度而變化。一般而言，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(尤其是Na+和/或Mg++濃度)會(huì)決定雜交的嚴(yán)格性，雖然清洗時(shí)間也影響嚴(yán)格性。一般而言，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在規(guī)定離子強(qiáng)度和PH的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C至20°C。、是日。^的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下)。用于核酸雜交的條件和嚴(yán)格性的計(jì)算可以參見例如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001；Tijssen,HybridizationWithNucleicAcidProbes,PartITheoryandNucleicAcidPreparation,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierScienceLtd.,NY,NY,1993；及Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology,%4版，JohnWiley&Sons,Inc.,1999。出于本公開內(nèi)容的目的，“嚴(yán)格條件”涵蓋雜交僅會(huì)在雜交分子與靶序列之間有小于25%的錯(cuò)配時(shí)發(fā)生的條件。為了更精確的定義，“嚴(yán)格條件”可以分成特定的嚴(yán)格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等嚴(yán)格性”條件指具有超過25%序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件；“中度嚴(yán)格性”條件指錯(cuò)配超過15%的分子不會(huì)雜交的條件，而“高嚴(yán)格性”條件指錯(cuò)配超過10%的序列不會(huì)雜交的條件?！胺浅８叩膰?yán)格性”條件指錯(cuò)配超過6%的序列不會(huì)雜交的條件。比較而言，在“低嚴(yán)格性條件”下雜交的核酸包括具有少得多的序列同一性，或僅在核酸的短的亞序列里具有序列同一性的核酸。因此，應(yīng)當(dāng)理解，由本公開內(nèi)容所涵蓋的核酸的各種變體能夠在基本上其整個(gè)長度里與SEQIDNO:5、7、9、11、13、15、17、19、67或69的至少一項(xiàng)雜交。牛成嵌合RSV抗原件多肽的方法使用用于表達(dá)和純化重組蛋白的完善建立的規(guī)程來生成本文中所公開的嵌合re多肽。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的規(guī)程可以參見例如上文所引用的Sambrook和Ausubel參考文獻(xiàn)。下文提供了另外的和具體的詳情。通過許多公知的規(guī)程之任一種，諸如電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、感染、轉(zhuǎn)染等(這取決于載體和宿主細(xì)胞的選擇)來將編碼上文所描述的任何嵌合reRsv抗原的重組核酸諸如(但不限于)以SEQIDNO10和12表示的例示性核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。如此，包含重組嵌合re多肽編碼核酸的宿主細(xì)胞也是本公開內(nèi)容的特征。有利的宿主細(xì)胞包括原核(即細(xì)菌)宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌，以及許多真核宿主細(xì)胞，包括真菌(例如酵母諸如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Picchiapastoris))細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如CHO細(xì)胞)。將重組TO核酸導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞中，例如經(jīng)由載體諸如表達(dá)載體。如上文所描述的，載體最通常是質(zhì)粒，但是此類載體也可以是例如病毒顆粒、噬菌體等。合適的表達(dá)宿主的例子包括細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)；真菌細(xì)胞，諸如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)；昆蟲細(xì)胞諸如果蠅屬和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞諸如3T3、C0S、CH0、BHK、HEK293或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞，包括藻類細(xì)胞等?？梢栽跒榱思せ顔?dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體、或者擴(kuò)增所插入的多核苷酸序列而酌情修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件諸如溫度、PH等通常是那些先前與選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞一起使用的條件，而且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的，并且在本文所引用的參考文獻(xiàn)中，包括例如Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasic^Technique，第三版，Wiley-Liss，New^rk及其中所引用的參考文獻(xiàn)。也可以在非動(dòng)物細(xì)胞諸如植物、酵母、真菌、細(xì)菌等中生成與本發(fā)明的核酸對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物。在Sambrook,Berger和Ausubel外，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的詳情可以參見Payne等(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg禾口Phillips(編)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture；FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)及Atlas禾口Parks(編)TheHandbookofMicrobioloRicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL。在細(xì)菌系統(tǒng)中，可以根據(jù)所表達(dá)產(chǎn)物預(yù)期的用途來選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)需要大量多肽或其片段來生成抗體時(shí)，有利地采用指導(dǎo)容易純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。此類載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體諸如BLUESCRIPTGtratagene)，其中可以將感興趣的編碼序列(例如如上文所描述的本發(fā)明的多核苷酸)連接入載體中，符合氨基端翻譯起始甲硫氨酸和隨后β-半乳糖苷酶的7個(gè)殘基的序列的讀碼框，生成有催化活性的半乳糖苷酶融合蛋白；PlN載體(VanHeeke和Schuster(1989)JBiolChem264:5503-5509)；pET載體(Novagen,MadisonWI)，其中將氨基端甲硫氨酸以符合讀碼框方式與組氨酸標(biāo)簽連接；等。類似地，在酵母諸如釀酒酵母中，可以使用許多含有組成性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如α因子、醇氧化酶和PGH的載體來生成想要的表達(dá)產(chǎn)物。關(guān)于綜述，參見Berger、Ausubel、和例如Grant等(1987;MethodsinEnzymologyl53:516-544)。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以利用許多表達(dá)系統(tǒng)，包括質(zhì)粒和基于病毒的系統(tǒng)兩者。任選地，對宿主細(xì)胞選擇其調(diào)控插入序列的表達(dá)或以想要的方式加工所表達(dá)的蛋白質(zhì)的能力。對蛋白質(zhì)的此類修飾包括但不限于糖基化(以及例如乙?；?、羧基化、磷酸化、脂質(zhì)化和酰化)。任選地，在宿主細(xì)胞的背景中實(shí)施翻譯后加工，例如其將前體形式切割成蛋白質(zhì)的成熟形式(例如通過弗林蛋白酶蛋白酶進(jìn)行)。不同宿主細(xì)胞諸如3T3、C0S、CH0、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等具有用于此類翻譯后活性的特定細(xì)胞機(jī)器和特征性機(jī)制，而且可以選擇為確保對所引入的外來蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為了長期、高產(chǎn)量生成由本文中所公開的核酸編碼的重組嵌合re多肽，通常使用穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)。例如，使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)或內(nèi)源表達(dá)元件和選擇標(biāo)志基因的表達(dá)載體來將穩(wěn)定表達(dá)嵌合re多肽的細(xì)胞系引入宿主細(xì)胞中。導(dǎo)入載體后，容許細(xì)胞在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，之后將其轉(zhuǎn)換至選擇培養(yǎng)基。選擇標(biāo)志的目的是賦予對選擇的抗性，并且其存在容許成功表達(dá)所導(dǎo)入序列的細(xì)胞的生長和回收。例如，可以使用適合于細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)來增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性組或集落。任選地，在適合于自細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)和回收所編碼蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)用編碼嵌合re多肽的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞系并將宿主細(xì)胞培養(yǎng)至合適的細(xì)胞密度后，通過合適的手段(例如溫度變動(dòng)或化學(xué)誘導(dǎo))來誘導(dǎo)選定的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。然后自培養(yǎng)液回收所分泌的多肽產(chǎn)物。或者，可以通過離心來收獲細(xì)胞，通過物理或化學(xué)手段來破壞細(xì)胞，并保留所得的粗制提取物用于進(jìn)一步純化?？梢酝ㄟ^任何便利的方法來破壞蛋白質(zhì)表達(dá)中所采用的真核或微生物細(xì)胞，包括冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、機(jī)械破壞、或者使用細(xì)胞裂解劑、或者其它方法，其對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的許多方法來從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收和純化所表達(dá)的嵌合re多肽，包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析(例如使用本文所記錄的任何加標(biāo)簽系統(tǒng))、羥磷灰石層析、和凝集素層析。根據(jù)需要，可以在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)造中使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可以在最終的純化步驟中采用高效液相層析(HPLC)。在上文所記錄的參考文獻(xiàn)外，多種純化方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如下列文獻(xiàn)列出的Sandana(1997)BioseparationofProteins,AcademicPress,Inc.；及Bollag等(1996)ProteinMethods,第2版ffiley-Liss,NY；ffalker(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ,Harris禾口Angal(1990)ProteinPurificationApplications:APracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,U.K.；Scopes(1993)ProteinPurification-PrinciplesandPractice第3版SpringerVerlag,NY；Janson禾口Ryden(1998)ProteinPurificationPrinciples,HighResolutionMethodsandApplications,二版ffiIey-VCH,NY；及Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ0在某些例子中，將核酸導(dǎo)入適合于在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)中導(dǎo)入和表達(dá)的載體中。例如，可以將包含編碼TO嵌合RSV抗原的多核苷酸序列的核酸導(dǎo)入多種商品化或?qū)Ｓ休d體諸如PET表達(dá)載體系列(例如pET19b和pET21d)之任一種中。IPTG可誘導(dǎo)編碼序列的表達(dá)，產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)。在噬菌體T7啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)錄編碼嵌合RSV抗原的多核苷酸序列。備選的載體諸如包含熱誘導(dǎo)型XpL啟動(dòng)子的pURV22也是合適的。將表達(dá)載體導(dǎo)入(例如通過電穿孔)合適的細(xì)菌宿主中。許多合適的大腸桿菌菌株是可用的，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇(例如，已經(jīng)證明了Rosetta和BL21(DE3)菌株對于表達(dá)含有編碼TO嵌合RSV抗原的多核苷酸序列的重組載體是有利的)。在另一個(gè)例子中，將編碼嵌合re多肽的多核苷酸克隆入適合于導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中的載體中。在此例示性的實(shí)施方案中，將編碼嵌合RSV抗原的多核苷酸序列導(dǎo)入由LonzaBiologicals公司開發(fā)的pEE14載體中。在組成性啟動(dòng)子，即立即早期CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子下表達(dá)嵌合多肽?；诮?jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在沒有谷氨酰胺來源的情況中生長的能力來進(jìn)行對表達(dá)嵌合物的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的選擇。已經(jīng)成功整合PEE14的細(xì)胞能夠在沒有外源谷氨酰胺的情況中生長，因?yàn)镻EE14載體表達(dá)GS(谷氨酰胺合成酶)酶。可以對選定的細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)充，并表征嵌合多肽的表達(dá)。在另一個(gè)例子中，使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVQ來將編碼re嵌合RSV抗原的多核苷酸序列導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞中?？梢允褂蒙唐坊d體、試劑盒和/或系統(tǒng)，諸如來自BDBioscience的BDBaculoGold系統(tǒng)來生成能夠感染昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒。簡言之，將編碼TO嵌合RSV抗原的多核苷酸序列插入pAcSG2轉(zhuǎn)移載體中。然后，通過pAcSG2嵌合物質(zhì)粒和BDBaculoGold(含有桿狀病毒苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的線性化基因組DNA)共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞SF9(草地夜蛾)。轉(zhuǎn)染后，pACSG2質(zhì)粒與桿狀病毒基因組之間發(fā)生同源重組以生成重組病毒。在一個(gè)例子中，在多角體蛋白啟動(dòng)子(PH)的調(diào)節(jié)控制下表達(dá)嵌合RSV抗原?？梢允褂闷渌鼏?dòng)子諸如基本的(Ba)和PlO啟動(dòng)子來生成類似的轉(zhuǎn)移載體。類似地，可以采用備選的昆蟲細(xì)胞，諸如與Sf9緊密相關(guān)的SF21，和自甘藍(lán)尺蠖，即粉紋夜蛾(Trichoplusiani)衍生的HighFive(Hi5)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)表達(dá)(依照選定的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或其它調(diào)節(jié)元件)后，將所表達(dá)的嵌合多肽回收(例如純化或富集)，并復(fù)性以確保折疊成抗原性活性構(gòu)象。典型地，抗原性活性構(gòu)象是嵌合re多肽的多聚體。有利的是，多聚體是三聚體。免疫原性組合物和方法還提供了免疫原性組合物，其包含嵌合re多肽和藥學(xué)可接受稀釋劑、載體或賦形劑。許多藥學(xué)可接受稀釋劑和載體和/或藥學(xué)可接受賦形劑是本領(lǐng)域已知的，并且記載于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,Ε.W.Martin,MackPublishingCo.,Easton,PA,M15版(1975)。一般而言，稀釋劑、載體和/或賦形劑的性質(zhì)會(huì)取決于所采用的具體施用模式。例如，胃腸外配制劑通常包含可注射流體，其包含藥學(xué)和生理學(xué)可接受流體，諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、水性右旋糖、甘油等作為媒介物。在某些配制劑(例如固體組合物，諸如粉末形式)中，不采用液體稀釋劑。在此類配制劑中，可以使用無毒性固體載體，包括例如藥用級的海藻糖、甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的賦形劑和載體以產(chǎn)生適合于通過選定的施用路徑向受試者投遞的配制劑。上文在表1中給出了具體的例子。別的賦形劑包括但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、玻璃形成多元醇(諸如山梨糖醇、海藻糖)、N-月桂酰肌氨酸(例如鈉鹽)、L-脯氨酸、非去污劑磺基甜菜堿、鹽酸胍、脲、三甲胺氧化物、KCl,Ca2\Mg2+、Mn2+、&ι2+(和其它二價(jià)陽離子相關(guān)鹽)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(Dithioerytrol)、β-巰基乙醇、去污劑(包括例如Tween80、Tween20、TritonX-100、NP-40、EmpigenBB、辛基葡糖苷、月桂酰麥芽糖苷、Zwittergent3_08、Zwittergent3_10、Zwittergent3_12、Zwittergent3_14、Zwittergent3-16,CHAPS、去氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、和溴化十六烷基三甲銨)。[οο]在某些有利的例子中，免疫原性組合物還包含佐劑。適合于在含有嵌合re多肽的免疫原性組合物中使用的佐劑是與本文中所公開的re抗原組合在對受試者施用時(shí)是安全且最小反應(yīng)原性的佐劑。一種適合于與re嵌合抗原組合使用的佐劑是非毒性細(xì)菌脂多糖衍生物。合適的脂質(zhì)A無毒性衍生物的例子是單磷酰脂質(zhì)A或者更具體的是，3-脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)ο3D-MPL由GlaxoSmithKlineBiologicalsN.A.以名稱MPL出售，并且貫穿整個(gè)文件稱為MPL或3D-MPL。參見例如，美國專利No.4，436，727；4，877，611；4,866，034和4，912，094。3D-MPL主要促進(jìn)具有IFN-Y(Thl)表型的⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答?？梢砸勒誈B2220211A中所披露的方法來生成3D-MPL。在化學(xué)上，它是具有3、4、5或6條酰化鏈的3-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，可以使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有如下顆粒大小，使得其可以無菌過濾流過0.22μm濾器。此類制備物記載于W09V2U92?？梢砸悦總€(gè)人劑量的免疫原性組合物1和50μg之間的量使用所述脂多糖諸如3D-MPL?？梢砸约s25μg，例如20-30μg之間，合適地2149μg之間或22和^μg之間或23和27μg之間或M和沈μg之間，或25μg的水平使用所述3D-MPL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約10μg，例如5禾Π15μg之間，合適地6禾Π14μg之間，例如7禾口13μg之間或8禾口12μg之間或9禾口11μg之間，或10μg的水平的3D-MPL。在又一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約5μg，例如1和9μg之間，或2和8μg之間或者合適地3和7μg之間或4和6μg之間，或5μg的水平的3D_MPL。在其它實(shí)施方案中，脂多糖可以是β(1-6)葡糖胺二糖，如記載于美國專利No.6，005，099和歐洲專利No.O729473Bi?；谶@些參考文獻(xiàn)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地能夠生成各種脂多糖，諸如3D-MPL。盡管如此，通過提及而將每篇這些參考文獻(xiàn)收入本文。在前述免疫刺激物(其在結(jié)構(gòu)上與LPS或MPL或3D-MPL類似)外，作為上述MPL結(jié)構(gòu)的亞部分的?；瘑翁呛投茄苌镆彩呛线m的佐劑。在其它實(shí)施方案中，佐劑是脂質(zhì)A的合成衍生物，其中一些被描述為TLR-4激動(dòng)劑，并且包括但不限于OMl74(2-脫氧-6_o-[2-脫氧_2_[(R)_3_十二烷?；趸?癸?；被鵠-4-0-膦?；?β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠-α-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫酯)(W095/14026)OM294DP(3S,9R)-3—[(R)-十二烷酰基氧基四癸酰基氨基]-4-氧-5-氮-9(R)-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-1，10-二醇，1，10-二(磷酸二氫酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S_，9R)_3_[(R)-十二烷?；趸墓秕；被鵠-4-氧-5-氮-9-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-1，10-二醇，1-磷酸二氫酯10-(6-氨基己酸酯)(W001/46127)?？梢允褂玫钠渌黅LR4配體是烴基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)諸如那些在WO98/50399或美國專利No.6，303，347(還披露了用于制備AGP的方法)中披露的，合適地，RC527或或AGP的藥學(xué)可接受鹽，如美國專利No.6，764，840中所披露的。一些AGP是TLR4激動(dòng)劑，而一些是TLR4拮抗劑。認(rèn)為兩者作為佐劑都是有用的。能夠經(jīng)由TLR-4引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的其它合適的TLR-4配體(Sabroe等，JI2003pl630-5)是例如來自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，特別是LPS的無毒性衍生物(諸如3D-MPL)。其它合適的TLR激動(dòng)劑是熱休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性劑蛋白A、乙酰透明質(zhì)酸寡糖、硫酸乙酰肝素片段、纖連蛋白片段、血纖蛋白原肽和b-防衛(wèi)素-2、和胞壁酰二肽(MDP)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是HSP60、70或90。其它合適的TLR-4配體如記載于WO2003/011223和WO2003/099195，諸如W02003/011223的第4頁-第5頁上或W02003/099195的第3頁-第4頁上披露的化合物I、化合物II和化合物III和特別是W02003/011223中披露為ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680、和ER804764的那些化合物。例如，一種合適的TLR-4配體是ER804057。別的TLR激動(dòng)劑作為佐劑也是有用的。術(shù)語“TLR激動(dòng)劑”指能夠經(jīng)由TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答(或是作為直接的配體或是間接地經(jīng)由生成內(nèi)源或外源配體)的藥劑。可以使用此類天然的或合成的TLR激動(dòng)劑作為備選的或別的佐劑。Kaisho和Akira，BiochimicaetBiophysicaActal589:1_13，2002中提供了TLR作為佐劑受體的作用的簡短綜述。這些潛在佐劑包括但不限于1112、11^3、11^7、11^8和11^9的激動(dòng)劑。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑和免疫原性組合物進(jìn)一步包含選自下組的佐劑=TLR-I激動(dòng)劑、TLR-2激動(dòng)劑、TLR-3激動(dòng)劑、TLR-4激動(dòng)劑、TLR-5激動(dòng)劑、TLR-6激動(dòng)劑、TLR-7激動(dòng)劑、TLR-8激動(dòng)劑、TLR-9激動(dòng)劑、或其組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-I引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-I引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑選自三?；?LP)；酚可溶性調(diào)控蛋白；結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)LP；三鹽酸S-O，3-二(棕櫚?；趸?-(2-RS)-丙基)-N-棕櫚酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH(Pam3Cys)LP(其模擬細(xì)菌脂蛋白的乙酰化氨基端)和來自布氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的OspALP。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-2引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-2引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是下列一項(xiàng)或多項(xiàng)來自結(jié)核分枝桿菌、布氏疏螺旋體或蒼白密螺旋體(Tpallidum)的脂蛋白、肽聚糖、細(xì)菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌Gtaphylococcusaureus)的物種的肽聚糖；脂磷壁酸類、甘露糖醛酸類、奈瑟氏球菌(Neisseria)孔蛋白、細(xì)菌菌毛、耶爾森氏菌Wersina)毒力因子、CMV病毒體、麻疹血細(xì)胞凝集素、和來自酵母的酵母聚糖。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-3引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-3引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是雙鏈RNA(dsRNA)、或聚肌苷酸-聚胞苷酸(PolyIC)，一種與病毒感染有關(guān)的分子核酸樣式。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-5引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-5引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是細(xì)菌鞭毛蛋白。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-6引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-6引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是分枝桿菌脂蛋白、二?；疞P、和酚可溶性調(diào)控蛋白。別的TLR6激動(dòng)劑記載于WO2003/043572。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-7引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-7引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是單鏈RNA(ssRNA)、洛索立賓(Ioxoribine)、在位置N7和C8的鳥苷類似物、或咪唑喹啉化合物、或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是咪喹莫特(imiquimod)。別的TLR7激動(dòng)劑記載于WO2002/085905。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-8引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。合適地，能夠經(jīng)由TLR-8引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是單鏈RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如瑞喹莫德(reSiquimod，R848)；瑞喹莫德也能夠被TLR-7識(shí)別。可以使用的其它TLR-8激動(dòng)劑包括記載于WO2004/071459的。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，使用能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是HSP90。或者，能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)應(yīng)答的TLR激動(dòng)劑是細(xì)菌或病毒DNA、含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，特別是稱為CpG基序的序列背景。含有CpG的寡核苷酸主要誘導(dǎo)Thl應(yīng)答。此類寡核苷酸是公知的，并且記載于例如WO96/02555、WO99/33488和美國專利No.6，008，200和5，856，462。合適地，CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用的合適的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任選地，其含有由至少三個(gè)，合適地，至少六個(gè)或更多個(gè)核苷酸分開的兩個(gè)或更多個(gè)二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后面跟著鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵是二硫代磷酸酯，或者合適的是硫代磷酸酯鍵，雖然磷酸二酯和其它核苷酸間鍵在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間連接的寡核苷酸。用于產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法記載于美國專利No.5，666，153,5,278，302和WO95/26204。可以在具有嵌合re多肽的免疫原性組合物中使用(例如單獨(dú)地或者與3D-MPL或本文所描述的其它佐劑組合地)的其它佐劑是皂苷類，諸如QS21。皂苷類參見Lacaille-Dubois，M和WagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicine^l2^^1363頁-第386頁)。皂苷類是植物和海洋動(dòng)物王國中廣泛分布的類固醇或三萜糖苷。皂苷類記錄用于在水中形成膠體溶液(其在搖動(dòng)時(shí)起泡沫)及用于沉淀膽固醇。當(dāng)皂苷類接近細(xì)胞膜時(shí)，它們在膜上產(chǎn)生引起膜爆裂的孔樣結(jié)構(gòu)。紅細(xì)胞溶血是此現(xiàn)象的一個(gè)例子，其是某些但不是所有皂苷類的特性。已知皂苷類為供系統(tǒng)施用的疫苗中的佐劑。本領(lǐng)域中已經(jīng)廣泛研究了各種皂苷的佐劑和溶血活性(Lacaille-Dubois和Wagner，見上文)。例如，QuilA(衍生自南美喬木皂皮樹(QuillajaSaponariaMolina)的樹皮)及其級分記載于US5，057，540和"Saponinsasvaccineadjuvants，，，Kensil,C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996,12(1-2):1-55;及EP0362279Bi。包含QuilA級分的顆粒結(jié)構(gòu)(稱作免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS))是溶血的，并且已經(jīng)在疫苗的制造中使用(Morein,Β·，EP0109942Bl；WO96/11711；WO96/33739)。溶血性皂苷類QS21和QS17(HPLC純化的QuilA級分)已經(jīng)被描述為有力的系統(tǒng)佐劑，并且其生產(chǎn)方法披露于美國專利No.5，057，540和EP0362279Bi，通過提及而將其收入本文。已經(jīng)在系統(tǒng)疫苗接種研究中使用的其它皂苷類包括衍生自其它植物物種諸如絲石竹(Gypsophila)和肥皂草(Saponaria)的(Bomford等，Vaccine,10(9):572-577,1992)QS21是自皂皮樹樹皮衍生的Hplc純化的非毒性級分。美國專利No.5，057，540中披露了用于生成QS21的方法。含有QS21的非反應(yīng)原性佐劑配制劑記載于WO96/33739。通過提及而將前述參考文獻(xiàn)收入本文?？梢砸悦總€(gè)人劑量的免疫原性組合物1和50μg之間的量使用所述免疫學(xué)活性皂苷諸如QS21。有利地，以約25μg，例如20-30μg之間，合適地，21-29μg之間或22-μg之間或23-27μg之間或M46μg之間，或25μg的水平使用QS21。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約10μg，例如5和15μg之間，合適地6-14μg之間，例如7-1348之間或8-1248之間或9-1148之間，或1(^8的水平的QS21。在又一個(gè)實(shí)施方案中，人劑量的免疫原性組合物包含在約5μg，例如1-9μg之間，或2-8μg之間或者合適地3-7μg之間或4-6μg之間，或5μg的水平的QS21。已經(jīng)顯示了包含QS21和膽固醇的此類配制劑在與抗原一起配制時(shí)是成功的Thl刺激性佐劑。如此，例如，可以在具有佐劑的免疫原性組合物中有利地采用嵌合re多肽，所述佐劑包含QS21和膽固醇的組合。任選地，佐劑還可以包括礦物鹽諸如鋁或鈣鹽，特別是氫氧化鋁、磷酸鋁和磷酸鈣。例如，含有與鋁鹽(例如氫氧化鋁或“明礬”)組合的3D-MPL的佐劑適合于在含有嵌合FG多肽的免疫原性組合物中配制用于對人受試者施用。另一類適合于在具有嵌合re多肽的配制劑中使用的Thl偏愛性佐劑包括基于OMP的免疫刺激性組合物?；贠MP的免疫刺激性組合物作為粘膜佐劑例如用于鼻內(nèi)施用是特別合適的?；贠MP的免疫刺激性組合物是一類來自革蘭氏陰性細(xì)菌諸如但不限于奈瑟氏球菌物種的外膜蛋白(0ΜΡ，包括一些孔蛋白)的制備物(參見例如Lowell等，J.Exp.Med.167:658,1988；Lowell等，Science240:800,1988；Lynch等，Biophys.J.45:104,1984;Lowell,于"NewGenerationVaccines，，第2版，MarcelDekker,Inc.,NewYork,Basil,HongKong，第193頁，1997；美國專利No.5，726，292；美國專利No.4，707,M3)，其作為載體或者在免疫原諸如細(xì)菌或病毒抗原的組合物中是有用的。一些基于OMP的免疫刺激性組合物可以稱為“蛋白體”，其是疏水性的，并且供人使用是安全的。蛋白體具有自裝配成約20nm至約SOOnm的小囊泡或小囊泡樣OMP簇的能力，及非共價(jià)地與蛋白質(zhì)抗原(Ag)，特別是具有疏水性模塊的抗原合并、配合、結(jié)合(例如靜電地或疏水地)、或以其它方式協(xié)作的能力。產(chǎn)生小囊泡或小囊泡樣形式(包括一種或多種OMP的多分子膜性結(jié)構(gòu)或熔球樣OMP組合物)中的外膜蛋白成分的任何制備方法包括在蛋白體的定義內(nèi)?？梢灾苽涞鞍左w，例如如本領(lǐng)域中所描述的(參見例如美國專利No.5，726，292或美國專利No.5，985，284)。蛋白體還可以含有源于用于生成OMP孔蛋白的細(xì)菌(例如奈瑟氏球菌物種)的內(nèi)源脂多糖或脂寡糖(分別為LPS或L0S)，其一般會(huì)小于2%的總OMP制備物。蛋白體主要由來自腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriamenigitidis)的化學(xué)提取外膜蛋白(OMP)(主要為孔蛋白A和B以及4類0ΜΡ)構(gòu)成，通過去污劑維持在溶液中(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal，Oral，orInjectabIeVaccines.于LevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS編，NewGenerationVaccines.NewYork:MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。蛋白體可以與多種抗原諸如自病毒來源衍生的純化的或重組的蛋白質(zhì)(包括本文所公開的嵌合re多肽)一起配制，例如通過滲濾或傳統(tǒng)的透析方法。逐漸除去去污劑容許直徑約100_200nm的顆粒疏水性復(fù)合物的形成(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.于LevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS編，NewGenerationVaccines.NewYork:MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。如本文中所使用的，“蛋白體LPS或Protollin”指與至少一類脂多糖混合(例如通過外源添加)以提供OMP-LPS組合物(其能發(fā)揮免疫刺激性組合物的功能)的蛋白體制備物。如此，OMP-LPS組合物可以由ftOtollin基本成分之兩種構(gòu)成，其包括(1)自革蘭氏陰性細(xì)菌諸如腦膜炎奈瑟氏球菌制備的蛋白體(例如ftOjimmt)的外膜蛋白制備物，和(2)一種或多種脂糖的制備物。脂寡糖可以是內(nèi)源的(例如與OMP蛋白體制備物天然包含在一起)，可以與來自外源制備的脂寡糖(例如自與OMP制備物不同的培養(yǎng)物或微生物制備)的OMP制備物混合或組合，或者可以是其組合。此類外源添加的LPS可以來自制備OMP制備物的相同革蘭氏陰性細(xì)菌或者來自不同革蘭氏陰性細(xì)菌。還應(yīng)當(dāng)理解，任選地，Protollin包含脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、小分子等，及其組合?？梢灾苽銲^rotollin，例如如記載于美國專利申請公開文本No.2003/0044425的。也可以在具有嵌合re多肽的組合物中使用不同佐劑諸如上文所提及的佐劑的組合。例如，如已經(jīng)記錄的，可以將QS21與3D-MPL配制在一起。QS213D-MPL的比率通常會(huì)是大約110至101;諸如15至51，和經(jīng)常基本上為11的量級。典型地，比率在2.51至113D-MPLQS21的范圍中。另一種組合佐劑配制劑包含3D-MPL和鋁鹽，諸如氫氧化鋁。在組合配制時(shí)，此組合能增強(qiáng)抗原特異性Thl免疫應(yīng)答。在一些例子中，佐劑配制劑包含脂質(zhì)體、水包油乳劑、或礦物鹽諸如鈣或鋁鹽，例如磷酸鈣、磷酸鋁或氫氧化鋁。水包油乳劑的一個(gè)例子在水性載體中包含可代謝油，諸如鯊烯、母育酚諸如例如α-生育酚、和表面活性劑諸如聚山梨酯80或Tween80，并且不含任何別的免疫刺激物，特別是它不含非毒性脂質(zhì)A衍生物(諸如3D-MPL)或皂苷(諸如QS21)。水性載體可以是例如磷酸鹽緩沖鹽水。另外，水包油乳劑可以含有Span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種疫苗組合物，其包含抗原或抗原組合物和佐劑組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳劑和任選地，一種或多種別的免疫刺激物，其中所述水包油乳劑包含0.5-10mg可代謝油(合適的是鯊烯)、0.5-llmg母育酚(合適的是α-生育酚)和0.4-4mg乳化劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，佐劑配制劑包含以乳劑諸如水包油乳劑形式制備的3D-MPL。在一些情況中，乳劑具有直徑小于0.2μm的小顆粒大小，如WO94/21292中所披露的。例如，3D-MPL顆?？梢孕〉米阋詿o菌過濾流過0.22微米膜(如記載于歐洲專利號(hào)O689妨4的)?；蛘?，可以在脂質(zhì)體配制劑中制備3D-MPL。任選地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐劑還包含別的免疫刺激性成分。例如，在將具有嵌合re多肽抗原的免疫原性組合物配制用于對嬰兒施用時(shí)，佐劑的劑量確定為在嬰兒受試者中是有效且相對非反應(yīng)原性的。一般而言，嬰兒配制劑中的佐劑劑量低于設(shè)計(jì)用于對成人(例如年齡為65歲或更年長的成人)施用的配制劑中使用的劑量。例如，3D-MPL的量通常在每劑1μg-200μg,諸如10-100μg，或10μg-50μg的范圍中。嬰兒劑量通常在此范圍的下端，例如約1μg至約50μg，諸如約2μg、或約5μg、或約10μg至約25μg、或約50μg。典型地，在配制劑中使用QS21的情況中，范圍是相當(dāng)?shù)?并且依照上文所指明的比率)。對于成人和老年人群體，配制劑通常包含比嬰兒配制劑中通常找到的佐劑成分更多的佐劑成分。在使用水包油乳劑的特定配制劑中，此類乳劑可以包含別的成分，例如諸如膽固醇、鯊烯、α-生育酚、和/或去污劑，諸如Tween80或Span85。在例示性配制劑中，此類成分可以以下列量存在約l_50mg膽固醇、2至10%鯊烯、2至10%α-生育酚和0.3至3%Tween80。典型地，鯊烯α-生育酚的比率等于或小于1，因?yàn)檫@提供更穩(wěn)定的乳劑。在一些情況中，配制劑還可以含有穩(wěn)定劑。在存在明礬(例如與3D-MPL組合)的情況中，量通常在每劑約100μg和Img之間，諸如約100μg或約200μg至約750μg，諸如約500μg。免疫原性組合物通常含有免疫保護(hù)數(shù)量(或其分?jǐn)?shù)劑量)的抗原，并且可以通過常規(guī)技術(shù)來制備。免疫原性組合物(包括用于對人受試者施用的免疫原性組合物)的制備一般記載于PharmaceuticalBiotechnology,第61卷VaccineDesign-thesubunitandadjuvantapproach,Powell禾口Newman編，PlenurnPress,1995.NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,Voller等編，UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。例如，F(xiàn)ullerton，美國專利4,235,877描述了脂質(zhì)體內(nèi)的包囊。例如，LiWiite，美國專利4，372，945和Armor等，美國專利4，474，757披露了蛋白質(zhì)與大分子的偶聯(lián)。典型地，每劑免疫原性組合物中的蛋白質(zhì)量選擇為在典型的受試者中誘導(dǎo)免疫保護(hù)性應(yīng)答而沒有顯著的、不利的副作用的量。在此語境中的免疫保護(hù)性的并不必然意味著針對感染的完全保護(hù)的；它意味著提供保護(hù)免于癥狀或疾病，尤其是與病毒有關(guān)的嚴(yán)重疾病?？乖靠梢噪S哪種特定的免疫原被采用而變化。一般而言，預(yù)期每個(gè)人劑量會(huì)包含1-1000μg的蛋白質(zhì)，諸如約1μg至約100μg，例如約1μg至約50μg，諸如約1μg、約2μg、約5μg、約10μg、約15μg、約20μg、約25μg、約30μg、約40μg、或約50μg0基于受試者群體(例如嬰兒或老年人)來選擇免疫原性組合物中利用的量?？梢酝ㄟ^牽涉在受試者中觀察抗體滴度和其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究來確定特定組合物的最佳量。初始疫苗接種后，受試者可以在約4周中接受加強(qiáng)免疫。實(shí)施例實(shí)施例1例示性嵌合RSV多肽抗原例示性真核FG多肽。依照本公開內(nèi)容生成例示性真核嵌合reVl-I和reV2-1。SEQIDN0:10和ll中提供了此類例示性re嵌合物的序列。嵌合FG多肽包含F(xiàn)O天然信號(hào)序列。信號(hào)序列的摻入增強(qiáng)翻譯后修飾，諸如糖基化。在這些例示性的實(shí)施方案中，兩個(gè)弗林蛋白酶識(shí)別基序都除去，并將接頭插入F2和Fl域之間。SEQIDNO:5和6中分別提供了TOVl-I和TOV2-1中存在的接頭的序列。使用GS表達(dá)系統(tǒng)將此例示性重組蛋白設(shè)計(jì)成在哺乳動(dòng)物中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)。在無谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細(xì)胞需要外源谷氨酰胺來實(shí)現(xiàn)最佳生長。用包含編碼嵌合TO多肽的多核苷酸序列的PEE14載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，此系統(tǒng)經(jīng)由代謝剝奪實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定克隆的選擇，這是由于PEE14載體表達(dá)谷氨酰胺合酶。雖然生成本文所描述的構(gòu)建體以在CHO細(xì)胞中表達(dá)，但是可以使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVQ同等地生成這些構(gòu)建體來表達(dá)。實(shí)施例2由嵌合RSV多肽講行的人血清中的中和抑制通過ELISA對自志愿者獲得的人血清篩選針對RSVA的反應(yīng)性，并基于先前對RSV中和潛力的滴定以相關(guān)稀釋度在中和抑制(Ni)測定法中使用。將血清與25yg/ml濃度的抑制劑蛋白質(zhì)混合，并于37°C溫育1.5至2小時(shí)。在圓底96孔板中，將血清和蛋白質(zhì)與固定濃度的RSVA混合，并于33°C溫育20分鐘。然后將血清-抑制劑-病毒混合物放入先前用Vero細(xì)胞接種的平底96孔板中，并在5%CO2的情況中于33°C再溫育5_6天，直至進(jìn)行免疫熒光測定法來檢測NI滴度。使用Reed-Muench法來計(jì)算滴度，并如下計(jì)算NI百分比[(25μg/ml抑制劑的NI滴度-Oμg/ml抑制劑的NI滴度)/0μg/ml抑制劑的NI滴度]X100。序列表SEQIDNO1編碼RSV參照融合蛋白的核苷酸序列毒株A2GenBank登錄號(hào)U50362atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaaaacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaaCtggttggtataccagtgttataactatagattaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcacccagcSLSLCSLSLSLCSLatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgccaaaaaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttgctgtatctaaggtcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcag￡Ι0￡1￡1￡1tggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaagcaaagctgcagcatatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaagcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactatatggtgttatagatacaccctgttggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaagaactgacagaggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtattttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatgattgtaaaattatgacttcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaacaaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaacgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaatccaccataaatatcatgataactactataattatagtgattatagtaatattgttatcttaattgctgttggactgctcttatactgtaaggccagaagcacaccagtcacactaagaaagatcaactgagtggtataaataatattgcatttagtaactaaSEQIDNO:2RSV參照F蛋白前體FO的氨基酸序列毒株A2GenBank登錄號(hào)AAB86664MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIATVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTINIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNSEQIDNO3編碼RSV參照G蛋白的核苷酸序列毒株LongAtgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttattattcatatcatcgggcttatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatgataatctcaacttcacttataattacagccatcatattcatagcctcggcaaaccacaaagtcacactaacaactgcaatcatacaagatgcaacaagccagatcaagaacacaaccccaacatacctcactcaggatcctcagcttggaatcagcttctccaatctgtctgaaattacatcacaaaccaccaccatactagcttcaacaacaccaggagtcaagtcaaacctgcaacccacaacagtcaagactaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccactacaaaacaacgccccaccaaacaaacccaataatgattttcacttcgaagtgtttaactttgtaccctgcagcatatgcagcaacaatccaacctgctgggctatctgcaaaagaataccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagcctac3.3.3.3.3.3.3.CcaaccttcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaaccactaaaccaaaggaagtacccaccaccaagcccacagaagagccaaccatcaacaccaccaaaacaaacatcacaactacactgctcaccaacaacaccacaggaaatccaaaactcacaagtcaaatggaaaccttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacatccgagcacccatcacaaccctcatctccacccaacacaacacgccagtagSEQIDNO4RSV參照G蛋白的氨基酸序列MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQSEQIDNO5合成接頭1SGGSGGSGGSGGSGSEQIDNO6合成接頭2SGGSGGSGTNVTLSSEQIDNO7合成接頭3ELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSSEQIDNO8合成接頭4QYTLNNTKNTNVTLSSEQIDNO9FG-Rixensart原女臺(tái)(wo1atggagttgccaatcctcaaagcaaatgca3.3.CC3.C3.3.tcctcgctgcagtcacattt61tgctttgcttctagtcaaaacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtt121agcaaaggctatcttagtgctctaagaactggttggtatactagtgttataactatagaa181ttaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgatgaaa241caagaattag3.3.3.3.3.3.3.aaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcaca301ccagcagcaaacaatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaac361clcltclCCclclclclaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttt421ttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcattgctgtatctaaggtcctgcactta481gaaggagaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggccgtagtcagc541ttatcaaatggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagat601aaacaattgttacctattgtgaataagcaaagctgcagaatatcaaatatagaaactgtg661atagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaat721gcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcatta781atcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaata841gttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgta901gtacaattaccactatatggtgtgatagatacaccttgttggaaattacacacatcccct961ctatgtacaaCC3.3.C3.C3.3.3.agaagggtcaaacatctgtttaacaagaactgacagagga1021tggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtt1081caatcgaatcgagtattttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaat1141ctctgcaatgttgacatattcaatcccaaatatgattgtaaaattatgacttcaaaaaca1201gatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaact1261aaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgtgat1321tatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaat1381aagcaagaaggcaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaa3.3.3.3.3.ctatgaccca1441ttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaatgagaagattaac1501cagagtttagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaaa1561tC￡l￡lCC￡lC￡l￡latatcctggtcacactaacaactgcaatcatacaagatgcaacaagccag1621atcaagaacacaaccccaacatacctcacccagaatccccagcttggaatcagcttctcc1681aatctgtctgaaactacatc3.C3.3.3.CC3.CCaccatactagcttcaacaacaccaagtgtc1741aagtcaaccctgcaatccacaacagtcaag3.CC3.3.3.3.3.C3.C3.3.C3.3.C3.3.CC3.3.3.3.3.C3.3.1801cccagcaagcCC3.CC3.C3.3.3.acaacgccaa3.3.C3.3.3.CC3.CC3.3.3.C3.3.3.CCcaataatgat1861tttcactttgaagtgttcaactttgtaccttgcagcatatgcagcaacaatccaacctgc1921tgggctatctgtaaaagaatQ.CCQ.Q.Q.CQ.Q.Q.aaacctggaaagaaaaccaccaccaagccc1981SLCSLSLSLSLSLSLSLCcaaccatcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaacC3.C3.3.3.3.CC3.2041aaggaagtacctaccaccaagcccacagaaaagccaaccatcaacaccacC3.3.3.3.C3.3.3.C2101atcagaactacactgctcaccaacaataccacaggaaatccagaacacacaagtcaaaag2161ggaaccctccactcaacctcctccgatggcaatccaagcccttcacaagtctatacaaca2221tccgagtacctatcacaacctccatctccatccaacacaacaaaccagSEQIDNO10FGVl-I(CHO)1aagcttgccaccatggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggcc61gccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttttaccagtccacc121tgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtg181atcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtc241aagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgacagaactccagctcctg301atgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtccggcggcagcggcggctctggcggc361tccggcggatctggcaagaagttcctgggcttcctgctgggcgctggctccgccatcgcc421tccggcaccgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagc481gccctgctgtCC3.CC3.3.C3.3.ggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacc541tccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaag601cagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccgg661ctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacc721tacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgac781caaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatg841agcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatc901gacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggaaggc961tccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtg1021tccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacacc1081atgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaacccc1141aagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctcc1201ctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccgg1261ggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacacc1321gtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtg1381aagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgac1441gcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtcc1501gacgagctgctgcacaacgtgaacgctggcaagtctaccaccaacatcatggtgaccaag1561cagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaac1621ttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatc1681cccaacaagaagccaggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaag1741accaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaag1801caccaccaccatcaccactgataatctaSEQIDNO11FGVl-IMELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKSGGSGGSGGSGGSGKKFLGFLLGAGSAIASGTAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMVTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKHHHHHHSEQIDNO12FGV2-11aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggcc61gccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacc121tgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtg181atcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtc241aagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctg301atgcagtccacccctgccaccaacaacaagaaagaactgcctcggttcatgaactacacc361ctgaacaacaccaagaacaccaacgtgaccctgagcaagaagttcctgggcttcctgctg421ggcgctggctccgccatcgcctccggcaccgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggc481gaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtcc541aacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcag601ctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgag661ttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggc721gtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaac781gacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcgg841cagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtcctggcctacgtggtgcag901ctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgc9613.CC3.CC3.3.C3.ccaaggaaggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtac1021tgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtcc1081aaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgc1141aacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtg1201tcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgc1261accgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtg1321tccaataagggcgtggacacCgtgtCCgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcag1381gaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtg1441ttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtcc1501ctggccttcatccggaagtccgacgagctgctgcacaacgtgaacgctggcaagtctacc1561accaacatcatggtgaccaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgac1621ttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgc1681tgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcct1741accaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcct1801aaggaagtgcC3.3.CC3.CC3.3.gcaccaccaccatcaccactgataatctaSEQIDNO:13FGV2-1MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKELPRFMNYTLNNTKNTNVTLSKKFLGFLLGAGSAIASGTAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCffKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDOaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMVTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKHHHHHH權(quán)利要求1.一種嵌合RSV多肽，其以N端至C端方向包含(i)第一氨基酸序列，其包含與呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白多肽的Fl域不可切割地連接的F2域；和()第二氨基酸序列，其包含RSV附著(G)蛋白多肽中包含免疫學(xué)優(yōu)勢表位的部分。2.權(quán)利要求1的嵌合RSV多肽，其中所述RSVF蛋白多肽的Fl域和F2域是經(jīng)由氨基酸接頭不可切割地連接的。3.權(quán)利要求2的嵌合RSV多肽，其中所述氨基酸接頭選自下組SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO7禾口SEQIDNO:8。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述第一氨基酸序列包含至少一處除去弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸刪除或替代。5.權(quán)利要求4的嵌合RSV多肽，其中所述第一氨基酸序列包含所述RSVF蛋白多肽的第106位和第133位的氨基酸刪除。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其進(jìn)一步包含信號(hào)肽。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述F2域包含天然F蛋白多肽的殘基24至殘基105的氨基酸序列。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述Fl域包含天然F蛋白多肽的殘基137至殘基528的氨基酸序列。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述RSVG蛋白多肽的部分包含天然G蛋白多肽的氨基酸殘基183至殘基203。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述RSVG蛋白多肽的部分包含天然G蛋白多肽的氨基酸殘基152至殘基229。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述RSVG蛋白多肽的部分包含天然G蛋白多肽的氨基酸殘基149至殘基229。12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽相對于天然存在的RSV多肽包含至少一處氨基酸替代，其中所述氨基酸替代與疫苗增強(qiáng)性病毒疾病的減輕或預(yù)防有關(guān)。13.權(quán)利要求12的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽包含G蛋白的殘基191處用丙氨酸對天冬酰胺的替代(N191A)。14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述G蛋白多肽和所述F蛋白多肽的至少一部分在序列上對應(yīng)于RSVALong株或RSVA2株。15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽進(jìn)一步包含多組氨酸標(biāo)簽。16.權(quán)利要求1的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合多肽包含選自SEQIDNO11和13的氨基酸序列或其亞序列。17.權(quán)利要求16的嵌合RSV多肽，其中所述亞序列省略選定序列的氨基酸殘基1-23。18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽，其中所述嵌合RSV多肽包含RSVF蛋白和RSVG蛋白兩者的至少一個(gè)免疫優(yōu)勢表位。19.一種重組RSV抗原，其包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽的多聚體。20.權(quán)利要求19的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含嵌合多肽的三聚體。21.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽和載體或賦形劑。22.權(quán)利要求21的免疫原性組合物，其中所述載體或賦形劑是藥學(xué)可接受載體或賦形劑。23.權(quán)利要求21或22的免疫原性組合物，其中所述載體或賦形劑包含緩沖劑。24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述載體或賦形劑包含至少一種使溶解度、穩(wěn)定性或溶解度和穩(wěn)定性兩者穩(wěn)定化的成分。25.權(quán)利要求21-M中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。26.權(quán)利要求25的免疫原性組合物，其中所述佐劑適合于對新生兒施用。27.權(quán)利要求25的免疫原性組合物，其中所述佐劑能夠增強(qiáng)年齡為至少65歲的人中的免疫應(yīng)答。28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述佐劑是Thl偏愛性佐劑。29.權(quán)利要求觀的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TLR-4配體。30.權(quán)利要求四的免疫原性組合物，其中所述脂質(zhì)A衍生物選自3D-MPL和脂質(zhì)A的任何合成衍生物。31.權(quán)利要求觀-30中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含顆粒載體。32.權(quán)利要求31的免疫原性組合物，其中所述載體是明礬。33.權(quán)利要求25-30中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含水包油乳劑.34.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其用于在藥物中使用。35.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其用于在預(yù)防或減輕對人受試者施用后受RSV感染中使用。36.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其用于在預(yù)防或減輕對人受試者施用后由受RSV感染引起的病理學(xué)應(yīng)答中使用。37.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物減輕或預(yù)防對人受試者施用后受RSV感染。38.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物減輕或預(yù)防對人受試者施用后由受RSV感染引起的病理學(xué)應(yīng)答。39.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其進(jìn)一步包含與RSV不同的病原性生物體的至少一種別的抗原。40.權(quán)利要求39的免疫原性組合物，其中所述病原性生物體是與RSV不同的病毒。41.權(quán)利要求40的免疫原性組合物，其中所述免疫原性病毒是副流感病毒(PIV)。42.權(quán)利要求39的免疫原性組合物，其中所述病原性生物體選自乙肝、流感、白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血菌、脊髓灰質(zhì)炎病毒、和肺炎球菌。43.一種重組核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的嵌合多肽的多核苷酸序列。44.權(quán)利要求43的重組核酸，其中所述編碼嵌合多肽的多核苷酸序列包含至少一個(gè)為在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子。45.一種載體，其包含權(quán)利要求43或權(quán)利要求44的重組核酸。46.權(quán)利要求45的載體，其中所述載體包含原核或真核表達(dá)載體。47.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求43或權(quán)利要求44的核酸或權(quán)利要求46的表達(dá)載體。48.權(quán)利要求47的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自下組細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。49.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽或權(quán)利要求43-46中任一項(xiàng)的核酸在制備用于治療RSV感染的藥物中的用途。50.權(quán)利要求49的嵌合RSV多肽或核酸的用途，其中所述藥物是為了預(yù)防性處理RSV感染而施用的。51.一種用于引發(fā)針對呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟對受試者施用免疫原性有效量的包含權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的嵌合RSV多肽的組合物。52.權(quán)利要求51的方法，其中施用所述包含嵌合RSV多肽的組合物引發(fā)對RSV特異性的免疫應(yīng)答而在與RSV接觸后不增強(qiáng)病毒疾病。53.權(quán)利要求52的方法，其中所述免疫應(yīng)答包含Thl型免疫應(yīng)答。54.權(quán)利要求52或53的方法，其中所述免疫應(yīng)答包含保護(hù)性免疫應(yīng)答，其減輕或預(yù)防受RSV感染和/或減輕或預(yù)防受RSV感染后的病理學(xué)應(yīng)答。55.權(quán)利要求51的方法，其中所述受試者是人受試者。56.權(quán)利要求51的方法，包括施用所述包含嵌合RSV多肽的組合物，包括通過鼻內(nèi)路徑施用。57.權(quán)利要求51的方法，包括施用所述包含嵌合RSV多肽的組合物，包括通過肌肉內(nèi)路徑施用。全文摘要提供了嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)多肽抗原。所公開的多肽包含第一氨基酸序列，其包含與呼吸道合胞病毒(RSV)融合(F)蛋白多肽的F1域不可切割地連接的F2域；和第二氨基酸序列，其包含RSV附著(G)蛋白多肽中包含免疫學(xué)優(yōu)勢表位的部分。公開內(nèi)容還提供了編碼嵌合RSV多肽的核酸和含有嵌合RSV多肽的藥物組合物以及用于其生產(chǎn)和使用的方法。文檔編號(hào)A61P31/14GK102131830SQ200980133274公開日2011年7月20日申請日期2009年7月17日優(yōu)先權(quán)日2008年7月18日發(fā)明者帕特里克.雷奧爾特,諾曼德.布萊斯申請人:魁北克益得生物醫(yī)學(xué)公司