適用于hpv和乙型肝炎感染的疫苗組合物以及其制備方法

專利名稱：適用于hpv和乙型肝炎感染的疫苗組合物以及其制備方法
技術領域：
本發明涉及包含單獨或組合使用的人乳頭瘤病毒(HPV)抗原和來源于所述抗原 的多肽并作為與細菌或病毒抗原的嵌合融合物形式的組合物，其可用于預防性和/或治療 性治療哺乳動物、尤其是人類的HPV以及乙型肝炎感染。本發明涉及一種藥物制劑，其能夠引發針對人乳頭瘤病毒感染(HPV)的保護性抗 體應答和細胞毒性T細胞應答。免疫原性制劑包含純化的重組HPV抗原于穩定制劑中。本 發明還論述了使用單價、二價和多價嵌合疫苗引發保護性抗體應答和細胞毒性T細胞應答 的方法。配制的免疫原性組合物適于在體內投予人類。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(HPV)是感染鱗狀上皮細胞和粘膜上皮細胞的雙鏈DNA病毒。由 “高風險”或致癌的HPV類型引起的惡性上皮腫瘤可能進展成惡性子宮頸癌(博斯(Bosch) 和德圣荷西(de Sanjose)，2003)。HPV的持續感染與進展到侵襲性癌顯著相關。“高風險” 基因型可在低級別鱗狀上皮內病變(low grade squamous intra印itheliallesion，LSIL) 到惡性腫瘤間有差別地進展(斯奇利特(Schlecht)等人，2003)。HPV是子宮頸癌的主要 病因，據悉，約99. 7%的子宮頸癌病例都具有持續的HPV感染(沃布梅斯(Walboomers)等 人，1999)。HPV感染常發生于性活躍的年輕女性中間，并且超過95%的易發感染似乎都會 在一段時間內自發消退。不到5%感染HPV16的女性發展成侵襲性子宮頸癌(斯奇利特 (Schlecht)等人，2003)。截至目前，已經借助分子方法鑒別出近100類HPV，并且超過35類HPV是在生 殖道中鑒別出來的，在大多數國家，50%到60%的子宮頸癌病例是由HPV16引起，其次為 HPV18(10%到20% )以及HPV 31和45 (各4%到5% )。因此，在所有地理區域，HPV16是 最常見的類型，HPV18緊隨其后，特別是在東南亞更為普遍。雖然在世界范圍內，此種模式
(squamous cell carcinoma, SCC),{MX^TI/I^ (adenocarcinoma, ADC) 來說，HPV18是最主要的，其次為HPV16(卡利福德(Clifford)等人，2003)。流行病學研究 顯示，存在數種HPV基因型的混合感染。其它研究也證實，與其它高風險HPV基因型相比較，HPV 16的持續性更強(理查 德森(Richardson)等人，2003 ；朗德斯博(Londesborough)等人，1996)，并且進展成CIN3 的可能性更大。因此，在基于HPV的子宮頸篩查程序中，基因分型可在分開需要密切監督的 HPV16(也可能是HPV18和其它基因型)陽性LSIL病例與感染其它高風險基因型的LSIL病 例時起到診斷作用(卡利福德(Clifford)等人，2005)。基于有關年齡和類型特異性HPV感染分布的可用流行病學數據的疫苗接種策略 可形成開發有效疫苗以控制和根治人乳頭瘤病毒感染的基礎。賦予針對多種基因型的廣 泛保護性功效的候選疫苗應成為進行有效疫苗接種的策略。使用Ll衣殼蛋白的可用疫苗 對于HPV16、HPV18、HPV6和HPVll具有類型特異性，但不能充分保護由例如HPV31、HPV35、 HPV52、HPV58等也與進展成子宮頸癌相關的其它基因型所引起的感染。目前，還沒有能夠提供針對多種HPV基因型的交叉保護的HPV疫苗。包含重組HPV Ll病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)的兩種預防性疫苗已 經獲得批準。這兩種疫苗僅靶向約15種已知致癌性HPV類型中的兩種。盡管約70%的子 宮頸癌病例是由這兩種類型引起，而且有證據顯示，對其它密切相關的類型存在某種程度 的交叉保護，但當前這些疫苗的成本阻礙了持續的全球傳遞，尤其是在HPV感染發生率很 高的第三世界國家。

發明內容
因此，本發明提供一種適用于乙型肝炎病毒以及人乳頭瘤病毒(HPV)感染的疫苗 組合物，其包含HPV抗原與賦予較強免疫原性的病毒或細菌蛋白的嵌合融合物。HPV抗原可選自包含(但不限于)以下各項的群組HPV16、HPV18、HPV6、HPVlU HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。包含HPV抗原的完整/部分序列/突變體/變異體的抗原性組合物可選自包含以 下各項的清單L1、L2、E2、E5、E6和E7抗原，或者所述抗原的特異性T細胞或B細胞表位， 這些可以是單一序列，或者是與細菌/病毒蛋白的在投予宿主時能夠誘發強抗體應答的嵌 合融合物中的串聯重復序列。所述病毒和細菌蛋白可選自包括(但不限于)以下各項的清單中的一種或者組合 或者來源于清單中蛋白質的表位乙型肝炎抗原(例如乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎小抗 原)、失活的破傷風類毒素(tetanus toxoid)、白喉類毒素(diphtheria toxoid)、大腸桿菌 不而才熱毒素、霍舌L毒素(cholera toxin)、綠月農桿菌夕卜毒素A (Pseudomonas exotoxinA)、志 賀毒素(Shiga toxin)、李斯特菌素(Iisterolysin)。抗原性組合物是由HPV抗原與乙型肝炎小抗原(HbsAg)的嵌合融合物組成。HPV抗原包含例如Ll和L2等衣殼蛋白的完整或部分序列/表位，或者來源于其 Ll和/或L2的多肽，且與HbsAg融合，如SEQ ID N0. 3到SEQ ID N0. 13中所示。HPV抗原包含單獨或組合形式的HPV早期蛋白(例如E2、E5、E6和E7)的完整/ 部分序列/突變體/變異體/表位，如SEQ ID No. 1和2所示。HPV抗原與乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者開放閱讀框內的任何區域融合， 其中在這兩個序列之間添加有或不添加連接子序列。根據本發明另一方面，提供一種表達上述技術方案1的HPV和HPV-HBsAg嵌合抗 原的方法，其包含培養經技術方案1的抗原/融合抗原轉化的宿主細胞，從所述宿主細胞中 分離出重組蛋白并純化。上述HPV抗原可在宿主中重組表達為細胞內蛋白或分泌蛋白，所述宿主可以是原 核或真核表達系統，優選酵母。一種藥物組合物，其包含有效量的可用作疫苗的如上文所揭示的抗原性組合物， 以及藥學上可接受的載劑。抗原的用量在每劑IOyg至IJ IOOOyg蛋白質的范圍內，優選介于10 μ g至IJ 200 μ g 之間，最優選介于IOyg到IOOyg之間。所述藥物組合物另外包含適合的佐劑，所述佐劑選自以下各項中的至少一種氫 氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰脂A、其它有機親脂性化合物、含有CpG和非CpG的低聚核苷酸、細胞因子。一種引發對于根據前述技術方案中任一技術方案所述的抗原性組合物的保護性 抗體應答和/或細胞毒性T細胞應答的方法，其包含借助例如經口、粘膜或腸胃外投藥途徑 等途徑中的至少一種途徑，將所述組合物投予需要所述治療的個體。上述抗原性組合物是以藥學上可接受的生物可降解聚合物實現。一種上述抗原制劑的用途，其可用于預防性或治療性治療哺乳動物、尤其是人類 的乳頭瘤病毒感染和相關的癌癥風險。


圖1 描述乙型肝炎小抗原OfepBsAg)基因的PCR擴增。泳道1 約700bp的HbsAg 基因；泳道2 IOObp的DNA梯狀條帶。圖2 描述用于構建嵌合HbsAg-HPV嵌合體的E6和E7合成基因片段的多表位序 列的PCR擴增。泳道1 約150bp的多表位基因片段，由129bp的多表位序列組成；泳道2 IOObp的DNA梯狀條帶。圖3 描述用于產生嵌合HbsAg-HPV序列的HPV16L2的PCR擴增；約530bp的基因 片段，由510bp的HPV16L2基因組成；泳道2 IOObp的DNA梯狀條帶。圖4 描述對應于L2基因的氨基酸100-220的HPV16L2片段的PCR擴增，獲得含 有360bp特定序列的約380bp的PCR片段。圖5 說明99bp HPV16L1基因片段的PCR擴增，通過PCR擴增得到約120bp的片 段。對應于L2基因的氨基酸100-220，獲得含有360bp特定序列的約380bp的PCR片段。圖6 說明HPV18L1基因的PCR擴增，得到由117bp HPV18L1序列組成的約140bp 的片段。圖7 描述HPV18L1基因的PCR擴增，得到由480bp HPV18L1片段組成的約500bp 的片段。圖8 顯示嵌合HbsAg-HPV蛋白的表達水平，是在畢赤酵母(Pichia pastoris)的 誘導培養物中借助ELISA法針對HbsAg含量所檢測，并視為嵌合蛋白的表達的量度。圖9 涉及嵌合HbsAg-HPV蛋白的表達水平，是在畢赤酵母的誘導培養物中借助 ELISA法針對HPV抗原含量所檢測。圖10 使用HPV特異性ELISA法，使用針對市售的四價疫苗而產生的初級抗體和 對于HPV16L2，針對純化蛋白質而產生的兔抗血清檢測的嵌合蛋白的免疫原性。圖11 使用HbsAg特異性ELISA法，使用市售的試劑盒檢測的嵌合蛋白的免疫原 性。使用針對純化的L2蛋白而產生的兔抗血清來估計針對含有HPV16L2蛋白的構建體的 抗體滴度。
具體實施例方式本發明涵蓋用于人類的人乳頭瘤病毒感染的預防性和治療性疫苗候選物的開發。 現有技術已知，當在體外表達成重組蛋白時，HPV的主要衣殼蛋白Ll蛋白可單獨或與次要 衣殼蛋白L2組合組裝成病毒樣顆粒(VLP)。這些病毒樣顆粒具有免疫原性，并且已被用 作預防人類HPV感染的疫苗。子宮頸癌是由數種“致癌性” HPV類型引起，這些HPV類型包括 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、 HPV68等。包含Ll衣殼蛋白的VLP是良好的疫苗候選物，但識別VLP上的特定結構表位的 抗體具有基因型特異性，而且針對一種VLP類型的抗體對于其它HPV基因型具有極少或沒 有交叉反應性。然而，數種HPV基因型的混合感染是很常見的。本發明的范圍是開發一種廣譜疫苗，其可提供針對與子宮頸癌風險有關的主要 HPV類型的保護性免疫。鑒于次要的HPV衣殼蛋白L2中存在較高的序列保守性，故L2蛋白 可潛在地提供針對數種病毒基因型的廣泛中和活性。然而，與Ll的結構表位具有較高抗原 性不同，L2蛋白的免疫原性相對較弱。L2蛋白在天然衣殼蛋白中的低豐度，即每360個Ll 拷貝約12到72個分子，限制了其免疫原性(皮埃拉(Pereira)等人，2009)。一種以較低成 本擴大免疫性的可能方法是考慮針對L2進行疫苗接種。L2疫苗的制造相對便宜，并且也有 望賦予比利用LlVLP免疫所觀察到的免疫范圍廣得多的交叉型保護性免疫(坎達(Kanda) 和肯度(Kondo) 2009)。HPV的次要衣殼蛋白L2在病毒進入細胞、病毒組分定位于細胞核、 DNA結合、衣殼形成和穩定性方面起到重要作用，它所引出的抗體在各類HPV之間的交叉反 應性高于主要衣殼蛋白Li，這些使得其成為針對HPV感染的新一代更廣泛保護性亞單位疫 苗的引人注目的潛在目標。本發明一個目的在于，通過利用與病毒和細菌蛋白的嵌合融合而提供抗原表位的 多個拷貝來增強免疫原性，由此增加候選疫苗的免疫原性。截至目前，市面上還沒有針對 HPV感染的多表位疫苗。由于在病毒的不同基因型間衣殼蛋白與早期蛋白的抗原表位存在 高序列保守性，故使得多表位疫苗有利于提供廣泛的保護活性。由乙型肝炎小抗原(HbsAg)形成的病毒樣顆粒是一種多聚體(multimeric)結構， 當作為針對乙型肝炎病毒感染的疫苗投予時，其具有高免疫原性。VLP的結構允許將來自其 它蛋白質的異源序列插入其開放閱讀框中的個別位置，從而可使用蛋白質與HbsAg的嵌合 融合物用作潛在疫苗候選物。HPV抗原包括衣殼蛋白Ll和L2，以及早期蛋白，例如E1、E2、 E5、E6和E7。這些蛋白質可由單獨或組合形式的HPV L1、L2、E1、E2、E5、E6和E7蛋白的完 整/部分序列/突變體/變異體/表位組成。這些候選蛋白質的T細胞或B細胞表位可單 獨使用或以串聯重復序列的形式使用，并且與HbsAg融合，用作供HPV疫苗接種的疫苗候選 物。HPV抗原與乙型肝炎小抗原的N末端或C末端或者開放閱讀框內的任何區域融合，其中 在這兩個抗原之間添加有或不添加連接子序列。迄今為止，尚無有關HPV衣殼蛋白與HbsAg的嵌合融合物的報導。次要HPV衣殼 蛋白L2與HbsAg的嵌合體是一種引人注目的疫苗候選物，因為盡管L2蛋白可賦予針對多 種病毒基因型的廣泛中和活性，但它由于是線性多肽而本身為弱抗原。負責針對多種HPV 病毒基因型的廣泛中和活性的L2區是以多聚體拷貝的形式呈現于HbsAg的VLP上，鑒于在 VLP上多個拷貝的呈現，故相比于以單一拷貝存在時，增加了免疫原性。所選用于與HbsAg 形成嵌合構建體的HPV16和HPV18L1蛋白的區域也為對其它基因型具有廣泛中和活性并且 能潛在地提供交叉保護的區域。我們已經利用了 HbsAg在自組裝成病毒樣顆粒后，仍允許 利用其它蛋白質與異源序列進行嵌合融合的柔性。還制備出HbsAg與HPV E6和E7蛋白的 B細胞和T細胞表位(以串聯形式存在以增加免疫原潛力)以及與HPV16和HPV18的Ll和 L2蛋白的嵌合體。已經報導過HPV E7的個別區域與HbsAg蛋白的嵌合構建體。我們使用 了來源于HPV的E6和E7蛋白的多個T細胞和B細胞表位，因為這些序列以串聯形式存在時所引發的免疫原性高于以單一拷貝形式存在的情形。它們在HbsAg的多聚體VLP上的存 在又會增加呈現于VLP上的拷貝數，這進一步增加其免疫原性，并代表一種優良的疫苗候 選物。已知B細胞和T細胞表位可引發強細胞毒性T細胞應答，從而有望成為針對HPV感 染的優良治療性疫苗。所屬領域的技術人員將確定，以下候選物也可用于與利用HPV抗原的嵌合序列類 似的策略中，以便增加其疫苗潛力。候選物的清單包括(但不限于)乙型肝炎核心抗原、 失活的破傷風類毒素、白喉類毒素、大腸桿菌不耐熱毒素、霍亂毒素、綠膿桿菌外毒素A、志 賀毒素、李斯特菌素、熱激蛋白、鈣網蛋白，或來源于上述蛋白質的表位。上述蛋白質可在原核或真核表達系統中表達為細胞內或分泌蛋白。在工業規模 上，畢赤酵母宜作為表達系統，因為其可節省成本，并且由畢赤酵母表達和純化得到的幾種 蛋白質由于能夠安全用于人類而已經成功商業化。此系統適用于任一種屬的酵母。HPV抗原 與HAS(人血清白蛋白)的分泌信號的嵌合融合使培養基中所述蛋白質的合成和分泌增加， 這使得不僅能夠進行高水平表達，而且還易于在工業發酵規模上純化出所述蛋白質。HSA的 N末端序列可與畢赤酵母中的高水平合成和高效率分泌相適應。使用專有的Himax 技術 純化病毒抗原，便于以節省成本的方法分離出HbsAg-HPV嵌合抗原，尤其是VLP，所述節省 成本的方法能安全用于人類，而且在工業規模上，比在氯化銫上的常規密度梯度超速離心 法更經濟。這將能夠制造出低成本疫苗，并且環保，避免了如氯化銫等重金屬的使用。所述蛋白質被表達為VLP、殼粒(capsomere)、多肽或包含HPV和細菌/病毒抗原 的嵌合多肽。以單一序列并入或以串聯重復序列形式呈與細菌/病毒蛋白的嵌合融合物 并入的所述抗原在投予宿主時，能誘導強的抗體應答或細胞毒性T細胞應答。含有串聯的 T細胞和B細胞表位拷貝的亞單位免疫原的免疫原性可能高于這些細胞表位以單一拷貝出 現的情形。如借助ELISA法所測定，與E6和E7表位以及與L2和Ll蛋白形成的嵌合構建 體針對HbsAg和HPV表位都引發了強抗體應答。這提供了疫苗的雙重用途，即針對乙型肝 炎以及多種HPV病毒基因型。上述蛋白質的抗原性組合物以藥學上可接受的載劑配制，以便用于人類免疫。所 述抗原制劑可單獨投予，或與選自包括(但不限于)以下各項的清單的佐劑一起投予氫氧 化鋁、磷酸鋁、單磷酰脂A、其它有機親脂性化合物、含有CpG和非CpG的低聚核苷酸、細胞因 子等。或者，抗原制劑可包含兩種或兩種以上純化的抗原，這些抗原在體外混合于適合的制 劑中，并用作疫苗。抗原制劑可借助數種方法中的一種，通過經口、粘膜或腸胃外途徑遞送 給哺乳動物，優選人類個體，以便引發保護性抗體應答和/或細胞毒性T細胞應答。抗原也 可以藥學上可接受的生物可降解聚合物遞送。上述制劑可用于預防性或治療性治療哺乳動 物的乳頭瘤病毒感染和相關的癌癥風險。HPV透過粘膜細胞進入體內，并且不會全身擴散。因此，HPV疫苗有可能在生殖器 粘膜誘發強烈而且持續的免疫應答。在這點上，動物中的鼻和口腔免疫研究顯示，VLP可誘 導生殖器粘膜中的抗體。賦予針對HPV抗原的粘膜免疫性的疫苗有利于預防HPV感染。將 對適于疫苗的粘膜遞送的制劑進行測試。市面上還沒此類供粘膜應用的HPV疫苗。本發明 將利用以下實例進一步予以說明。然而，這些實例只出于說明的目的，并且不應解釋保護范 圍。實例
1.實例1 克隆策略a) mi 來源干早期蛋白的多表擬與HbsAg的嵌合融合本序列是由乙型肝炎小抗原與來源于HPV16和HPV18E7蛋白的串聯的多表位融 合，隨后所述多表位與HbsAg蛋白的C末端和N末端嵌合融合而組成。(HbsAg蛋白序列MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYI) ·以下來源于E7和/或E6蛋白的表位串聯排列，得到5 ‘ EYMLDLQPETTEEDEID GPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL 3'，即43個氨基酸(129個核苷酸)。這個主要表位是 以下各項的組合，并選自T細胞和B細胞表位清單HPV16E7T細胞表位氨基酸20-29 TDLYCYEQLN ；氨基酸 45-54AEPDRAHYNI ；B 細胞表位氨基酸 10-20 :EYMLDLQPETT ；氨基酸 35-49EEDEIDGPAGQAEPDR ；與 HPV18E7B 細胞表位 DEIDGVNHQHL 融合，所述 HPV18E7B 細胞表 位是HPV18E7的免疫優勢(immunodominant)表位，由此獲得下述指定為SEQ ID No. 1的嵌 合融合物。類似地，所述多表位與HbsAg的N末端融合得到的嵌合融合物為SEQ ID No. 2 中提供的序列。在所述多表位的5'端引入翻譯起始子甲硫氨酸來用于起始翻譯。SEQ ID No. 1MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL-SEQ ID NO. 2 MEYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHLGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTR ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQ GMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSL LVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI-b)策略2 次要衣殼蛋白L2與HbsAg的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區域與HbsAg的C末端融合。擴增的L2區域為下述 在HbsAg的C末端融合的具有171個氨基酸的序列(引入起始子甲硫氨酸以促進翻譯)MSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFID AGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHN YEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRSEQ ID No. 3 MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAG APTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEE IPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR-
SEQ ID No. 4 將包含下述具有171個氨基酸的序列的次要衣殼蛋白序列L2在其C末端與HbsAg 的N末端融合，得到SEQ ID No. 4。添加起始子甲硫氨酸以便翻譯。5 ‘MSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDA GAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYE EIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPG QNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTC TMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYff GPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI 3'c)策略3 :L2片段的嵌套缺失體與HbsAg的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區域與HbsAg的C末端融合。擴增的L2區域是下述 具有約120個氨基酸(360bp)的序列SDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVL QPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR將其連接至HbsAg的C末端，得到SEQ ID No. 5。SEQ ID No. 5 5 ‘MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVL QPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR 3‘SEQ ID No. 6 將包含下述具有120個氨基酸的序列的次要衣殼蛋白序列L2 SDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVL QPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSR在其C末端與HbsAg的N末端嵌合融合，得到SEQ ID NO. 6。添加起始子甲硫氨酸 以便翻譯。MSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSV LQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTR ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQ GMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSffAFARFLffEffASVRFSffLSL LVPFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI 3‘d)策略4 :HPV16的Ll區與HbsAg的嵌合融合由以下來源于HPV16蛋白Ll區的33個氨基酸(99bp)的序列組成的HPV16蛋白 的 Ll 區在 HbsAg 的 C 末端發生嵌合融合NTVIQD⑶MVDTGFGAMDFITLQANKSEVPLDISEQ ID No. 75 ‘
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLffAYIGS NTVIQD⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI 3'由以下來源于HPV16L1區的33個氨基酸的序列組成的HPV16蛋白Ll區N1VIQD ⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI與HbsAg的N末端嵌合融合，得到嵌合序列SEQ ID No. 8。 添加起始子甲硫氨酸以便翻譯。SEQ ID No. 8 5 ‘ MNTVIQD⑶MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDIGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQ SLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVC PPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPFVQ WFVGLSPTVWLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYI3'e)策略5 :HPV18的Ll區與HbsAg的嵌合融合具有以下序列的HPV18L1蛋白的區域(39個氨基酸；117bp)5' PPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 3'與HbsAg序列的C末端嵌合融合，由此得到以下嵌合序列SEQ ID NO. 9 5 ‘MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSPPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 3‘將其與HbsAg蛋白的N末端融合，得到SEQ ID NO. 10，其中添加起始子甲硫氨酸以 便翻譯。SEQ ID NO. 10 5 ‘MPPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDIGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTI PQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLP VCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPF VQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYNILSPFLPLLPISCCLffAYIf)策略6 :HPV18L1區的較大多肽與HbsAg的嵌合融合由以下序列組成的較大HPV18片段ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶MVD TGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPY⑶SMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM⑶TVPQSLYIK GTGMRAS PGSCVYSPS在其N末端與HbsAg的C末端嵌合融合，由此得到嵌合序列SEQ ID NO. 11 5'MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFPSCCCTKPS DGNCTCIPIPSSWAFARFLWEffASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPISC CLWAYIGSATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶MVDT GYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGT GMRASPGSCVYSPS 3'由以下序列組成的較大HPV18片段5'ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVD TGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPY⑶SMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM⑶TVPQSLYIK GTGMRASPGSCVYSPS 3'在其C末端與HbsAg的N末端嵌合融合，由此得到嵌合序列SEQ ID 12 SEQ ID No. 12 MATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQ⑶CPPLELKNTVLEDGDMVD TGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM⑶TVPQSLYIKG TGMRASPGSCVYSPSGSENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPACPGQNSQSPTSNHS PTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLISLLVLLDYQGMLPVCPPLLGKSNTTTTSTGPCKTCTMPAQGTSMFP SCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLffEWASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIffMMWYffGPSLYNILSPF LPLLPISCCLWAYI策略7 全長HPV16L1蛋白序列在其N末端與用于在畢赤酵母中進行分泌表達的人血清白 蛋白的具有24個氨基酸的信號序列嵌合融合，得到SEQ ID NO. 13。SEQ ID NO. 13 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLIA VGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHP LLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNP⑶CPPLELINTVIQDG DMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPY⑶SLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDL YIKGSGSTANIASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTWDTTRST匪SLCAAISTSE TTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQ KHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKLSEQ ID NO. 14 全長HPV16L2蛋白序列在其N末端與用于在畢赤酵母中進行分泌表達的人血清白 蛋白的具有24個氨基酸的信號序列嵌合融合，得到SEQ ID NO. 14。MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSRHKRSAKRTKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQ ILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPT PVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPM DTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKVVDPAFVTTPTKLITYDNPAYEGIDVDNTLYFSSNDNSI NIAPDPDFLDIVALHRPALTSRRTGIRYSRIGNKQTLRTRSGKSIGAKVHYYYDFSTIDPAEEIELQTITPSTYTTT SHAASPTSINNGLYDIYADDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPLVSGPDIPINITDQAPSLIP IVPGSPQYTIIADAGDFYLHPSYYMLRKRRKRLPYFFSDVSLAA
12
SEQ ID NO. 15 全長HPV18L1蛋白序列在其N末端與用于在畢赤酵母中進行分泌表達的人血清白 蛋白的具有24個氨基酸的信號序列嵌合融合，得到SEQ ID NO. 15 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRGSLWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTV GNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPF YNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶ MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYOTSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLY IKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVP GQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAITCQ KDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTSSKPAKRVRVRARK2.實例2 基因克隆和HbsAg-HPV抗原嵌合體的構建a)利用分別含有EcoRl和BamHl限制性位點的N末端和C末端引物，借助PCR擴 增編碼全長HbsAg蛋白的乙型肝炎基因，得到約700bp的PCR片段(參看圖1)。HbsAg基 因的PCR擴增使用的引物為HB N 末端(HBNTERM)5’ CACGAATTCACCATGGAGAACACAACATCAGG 3’HB C 末端(HBCTERM)5’ TCAGGATCCAATGTATGCCCAAAGACAACAGG 3’PCR擴增的條件為在94°C下變性45秒，在65°C下退火40秒并在72°C下延伸1. 5 分鐘，持續30個循環，隨后在72°C下進行最后一次延伸，持續10分鐘。IOng將HbsAg基因 克隆到pBluescript SKII+中得到的質粒DNA用作PCR反應的模板。反應物由Ix TaqDNA 聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、20皮摩爾各引物和1.5U Taq DNA聚合酶組成。所有試劑都 來自班加羅爾_吉奈公司(Bangalore Genei)。對PCR片段進行凝膠純化，并用BamHl消 化。使用經BamHl消化的HbsAg PCR片段來與各種HPV抗原連接，得到嵌合構建體。為了 構建在C末端帶有HbsAg基因且在N末端帶有HPV抗原的嵌合構建體，利用含有Notl位 點的C末端引物和含有BamHl位點的N末端引物，借助PCR擴增HbsAg。在用于PCR擴增 的構建體(其中HPV抗原在N末端且HbsAg在C末端)中，針對HPV抗原的PCR弓丨物在其 N末端含有EcoRl位點，且在其C末端含有BamHl位點。在兩種情況下，通過連接兩個序列 的BamHl端，來使HbsAg基因片段與HPV基因片段發生嵌合融合。BamHl位點在HbsAg-HPV 序列的接點處引入兩個氨基酸“GS” (甘氨酸-絲氨酸)。本發明中描述的所有嵌合融合物 (SEQ IDNo. 1到SEQ IDNo. 15)都是在核苷酸水平上使用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)以及連接PCR擴增基因得到。借助PCR法擴增以下HPV基因片段以便連接多表位序列的克降EYMLDLQPETTEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIDEIDGVNHQHL,即 43 個氨基酸(129 個核苷 酸)。在金斯瑞公司(GenScript Corporation)合成編碼上述序列的合成基因片段。利用 以下引物擴增所述基因片段，這些引物在N末端引入BamHl位點且在C末端引入Notl位 點。使PCR反應物在94°C下變性45秒，在62°C下退火45秒，并在72°C下延伸30秒，持續 33個循環，由此得到含有129bp表位序列的約140bp的PCR片段。
ME N 末端(MENTERM)引物5' ATAGGATCCGAGTACATGTTGGATTTG 3'ME C 末端(MECTERM)引物5' ATCGCGGCCGCTTATCACAAATGTTGGTGGTTG 3'對使用上述引物得到的129bp PCR片段(參看圖2)進行凝膠純化，并用BamHl消 化。使用T4DNA連接酶將經BamHl消化的PCR片段連接至經BamHl消化的HbsAg基因過夜， 由此得到約840bp的嵌合片段，其翻譯序列指定為SEQ ID NO. 1。對恰當尺寸(約840bp) 的連接片段進行凝膠純化，用EcoRl和Notl消化，以便克隆到酵母載體pPIC3. 5K中。為了 產生SEQ ID NO. 2(其中多表位序列連接于HbsA基因的5'端)，制備出具有類似序列的引 物，但C末端引物帶有BamHl位點而非Notl位點，并且在N末端引物中，利用EcoRl代替 BamHl位點。用BamHl消化約140bp的PCR產物，并用T4DNA連接酶將其與經BamHl消化的 HbsAg連接過夜。對連接得到的約840bp的片段(指定為SEQ ID NO. 2)進行凝膠純化，用 EcoRl和Notl消化，以便克隆到酵母表達載體pPIC3. 5K中。HPV16L2片段在HbsAg的C末端的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區域與HbsAg的C末端融合。在金斯瑞公司合成 HPV16L2基因。擴增的L2區域對應于氨基酸50-220 (510bp)，并將其連接于HbsAg的C末 端，產生SEQ ID NO. 3。為了將L2基因片段連接至HbsAg基因的C末端，利用含有BamHl位 點的類似N末端引物和含有Notl位點的C末端引物，借助PCR擴增編碼L2蛋白的基因。用 BamHl消化PCR擴增得到的約530bp的片段，并與經BamHl消化的在C末端帶有BamHl位點 的HbsAg連接。對連接得到的約1230bp片段進行凝膠純化，并用EcoRl和Notl消化，以便 克隆到酵母載體PPIC3. 5K中。為了產生HPV-HbsAg嵌合構建體，利用具有類似序列的引物擴增L2基因(氨基酸 位置50-220bp)，但N末端引物帶有EcoRl位點而非BamHl，且C末端引物含有BamHl位點 而非Notl。如上文所述進行PCR擴增、消化，得到SEQ ID NO. 4。HPV16L2片段的嵌套缺失體在HbsAg的C末端的嵌合融合。將次要衣殼蛋白L2的N末端區域與HbsAg的C末端融合。擴增的L2區域為100 到220位的氨基酸(120個氨基酸；360bp)。L2基因片段的PCR擴增使用的引物為6P2CF N 末端(6P2CFNTERM)5' ACCGGATCCGATCCATCTATCGTTTC 3'6P2CF C 末端(6P2CFCTERM)5' ATCGCGGCCGCTTATCATCTTGAACCTGGAATTG 3'PCR反應在含有Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP以及20皮摩爾各引物和 1. 5U Taq DNA聚合酶的50 μ L體積中進行。PCR條件是在94°C下變性45秒，在64°C下40 秒和在72°C下延伸1分鐘，持續30個循環。對含有360bp L2序列的約380bp的PCR片段進行凝膠純化，用BamHl消化，并連接 到經BamHl消化的HbsAg基因，產生約1060bp的HbsAg-HPV嵌合體，指定為SEQ ID No. 5。 為了產生L2基因片段連接到HbsAg基因的N末端的HPV-HbsAg嵌合序列，用于L2的N末端 和C末端引物含有EcoRl和BamHl限制性位點。使經BamHl消化的L2基因片段與經BamHl 消化的HbsAg連接，產生1060bp的嵌合序列，指定為SEQ ID N0. 6。
具有HPV16的Ll區和HbsAg的嵌合序列的產牛產生的嵌合序列由來源于HPV16蛋白Ll區的33個氨基酸的序列(99bp) NTVIQD⑶ MVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDI與HbsAg基因組成。使用以下PCR引物，借助PCR擴增HPV16L1 基因(在金斯瑞公司合成的基因)的指定區域，得到含有99bp上述序列的約120bp的PCR 片段6P1CF N 末端(6P1CFNTERM)5' ATCGGATCCAACACCGTTATCCAAGACGG 3'6P1CF C 末端(6P1CFCTERM)5' ACTGCGGCCGCTTATCAAATATCCAATGGAACTTC 3'PCR反應在含有Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、20皮摩爾各引物和1. 5U Taq DNA聚合酶的50 μ L反應體積中進行(所有試劑都從班加羅爾_吉奈公司獲得)。PCR 循環由在94°C下變性45秒、在65°C下退火40秒和在72°C下延伸45秒持續30個循環組成。 對約120bp的PCR片段進行凝膠純化，用BamHl消化，并利用T4DNA連接酶連接到經BamHl 消化的HbsAg過夜，產生約SlObp的嵌合序列G^gSSEQ ID No. 7)，其中HPV16L1片段為 HbsAg基因的C末端。為了產生上述片段連接于HbsAg基因的N末端的HPV-HbsAg，利用具 有類似序列的引物，借助PCR擴增HPV16L1片段，其中N末端引物中含有EcoRl位點，且C 末端引物中含有BamHl序列而非Notl。用BamHl消化類似尺寸的PCR片段，并如上文所述 連接到經BamHl消化的HbsAg，產生指定為SEQ ID No. 8的序列。具有HPV18的Ll區和HbsAg的嵌合序列的產生借助PCR，將具有序列 PPLELKNTVLED⑶MVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDI 的 HPV18L1 蛋 白(39個氨基酸；117bp)連接到HbsAg序列的C末端，產生嵌合序列。針對在畢赤酵母中表 達來對合成性HPV18L1基因進行密碼子優化，并在金斯瑞公司進行合成。利用以下PCR引 物，借助PCR擴增上文指定的HPV18L1序列8PICF N 末端(SPICFNTERM)5' GATGGATCCCCTCCTTTGGAATTGAAG 3'8Picf c 末端(8Picfcterm)5' AGTGCGGCCGCTTATCAGTAATCTGGATATTTGC 3'PCR反應以50 μ L體積進行，并含有Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、20 皮摩爾各引物和1.5U Taq DNA聚合酶。PCR反應由在94°C下變性45秒、在65°C下退火30 秒和在72°C下延伸40秒持續30個循環組成。對約135bp的PCR片段進行凝膠純化，用 BamHl消化，并連接到經BamHl消化的HbsAg，得到HPV18L1序列連接到HbsAg的C末端的 HbsAg-HPV嵌合序列，得到SEQ ID No. 9。為了產生HPV-HbsAg嵌合序列，對于PCR引物，在 N末端引物中含有EcoRl位點，且在C末端引物中含有BamHl位點。在用BamHl消化后，將 片段連接到在N末端含有BamHl的HbsAg，產生SEQ ID No. 10。用EcoRl和Notl消化所述 兩個連接得到的PCR片段，以便克隆到酵母表達載體pPIC3. 5K中。較大HPV18L1片段與HbsAg的嵌合序列的產生借助PCR，將由以下序列組成的較大HPV18L1片段5 ‘ ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLED⑶ mvdtgygamdfstlqdtkcevpldicqsickypdylqmsadpygdsmffclrreqlfarhfwnragtmgdtvpqslyIKGTGMRASPGSCVYSPS 3'連接到HbsAg的C末端，得到嵌合序列。利用以下PCR引物，借助PCR擴增Ll片 段8P1CFLF N 末端(SP1CFLFNTERM)5' TCTGGATCCGCTACATCTAATGTCTC 3'8P icFLF c 末端(8Picflfcterm)5' ATTGCGGCCGCTTATCAGGATGGACTGTAAACG 3'50 μ L的PCR反應物由Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、0. 25mM dNTP、N末端和C末端 引物各20皮摩爾和1.5U Taq DNA聚合酶組成。PCR反應物由Ix Taq DNA聚合酶緩沖液、 0. 25mM dNTP、20皮摩爾各引物和1. 5U Taq DNA聚合酶組成。PCR循環由在94°C下變性30 秒、在64°C下退火40秒和在72°C下延伸1分鐘持續30個循環組成。對PCR片段進行凝膠 純化，用BamHl消化，并連接到經BamHl消化的HbsAg的C末端，得到具有SEQ ID No. 11的 嵌合片段。為了將上述HPV18L1片段連接到HbsAg序列的N末端，對于引物來說，N末端引 物帶有EcoRl位點，且C末端引物帶有BamHl位點。將經BamHl消化的片段連接到經BamHl 消化的HbsAg，得到HPV18L1片段處在HbsAg基因的N末端的嵌合序列，得到SEQ ID No. 12。 用EcoRl和Notl消化上述兩個嵌合序列，并連接到經EcoRl和Notl消化的酵母表達載體 PPIC3. 5K，以便克隆到畢赤酵母中。HPV抗假與用于在畢,未酵母Φ^Η必+牛表達HPV抗JC的人血清白g白基因白射言號序 列的嵌合序列的產生利用以下引物，借助PCR擴增人血清白蛋白基因的具有24個氨基酸的信號序列HASS N 末端(HASSNTERM)5' CCTGAATTCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTC 3'HASS C 末端(HASSCTERM)5' ATTGGATCCTCGACGAAACACACCCCTG 3'由此得到72bp的片段，對其進行凝膠純化，用BamHl消化并連接到在5'端帶有 BamHl位點的HPV16L1、HPV16L2和HPV18L1全長基因的5'端，分別得到序列SEQID No. 13、 SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID No. 15。實例3 在畢赤酵母中的克隆和表達通過對所有嵌合序列的兩條DNA鏈進行測序來驗證嵌合序列和閱讀框的 正確性，隨后進行酵母轉化。用EcoRl和Notl消化前幾章節中提到的所有嵌合序 列，隨后進行凝膠純化，并將其與經EcoRl和Not 1消化的pPIC3. 5K載體(英杰公司 (InvitrogenCorporation)，美國卡爾斯巴德(Carlsbad，USA))連接，并用T4DNA連接酶連 接過夜。用連接混合物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，并涂于含有100 μ g/mL氨必西林 (ampicillin)的LB瓊脂板中。從轉化的克隆中大規模分離出每一所述構建體的質粒DNA， 純化并用Bgl II消化，使質粒線性化以用于酵母轉化。遵照制造商(英杰公司)的方案以及其手冊中略述的，將編碼嵌合序列SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 15的基本上線性化的質粒DNA轉化到畢赤酵母GS115中。將所有嵌 合序列都克隆到AOXl基因座中，并借助甲醇的誘導，在AOXl啟動子下進行表達。重組畢 赤酵母屬菌株的克隆、篩選、分離以及甲醇對克隆基因的誘導均遵照畢赤酵母屬表達試劑盒(Pichia Expression Kit，目錄號K1710-01 ；英杰公司，美國卡爾斯巴德)中的用戶手 冊“在畢赤酵母中表達重組蛋白的方法手冊(A Manual of Methods for Expressionof Recombinant Proteins in Pichia pastoris)，，(第]\1版，2002 年 1 月)進行。實例4 嵌合HbsAg-HPV抗原的純化用甲醇誘導后，采集細胞，并借助超聲波和/或利用玻璃珠進行溶解。用PEG6000 處理溶解產物，達到7. 5%的濃度，并用NaCl處理，使濃度達到3%。以8000 χ g離心細胞 懸浮液10分鐘。借助鹽處理(專用混合物)來使上清液沉淀，并進行沉淀。利用Tris-HCl 緩沖液(pH 8. 5)，從鹽沉淀中洗脫出蛋白質。濃縮洗脫液，并用50mM Tris-HCl (pH 8. 5)透 濾(diafiltered)，并裝載到經同一緩沖液平衡的陽離子柱上。對于不同抗原蛋白，用不同 濃度的NaCl洗脫蛋白質。在12% SDS-PAGE上借助銀染色檢查制劑的純度。隨后借助蛋白 質免疫印跡(Western blot)確定各種嵌合蛋白的正確分子尺寸。實例5 =HPV-HbsAg 嵌合蛋白的 ELISA 借助ELISA法，利用M0N0LISA Anti_Hbs3. O試劑盒(產品編號72400 ；伯樂公司 (Bio-Rad))，嚴格遵照試劑盒手冊中略述的方案，針對乙型肝炎小抗原的含量來檢測嵌合 蛋白的表達，并以ng/mL表示。使用誘導后的100 μ L細胞溶解產物來估算HbsAg的含量。 還借助ELISA法估計誘導后細胞溶解產物中嵌合蛋白中的HPV抗原。在涂布緩沖液(碳酸 鹽緩沖液，PH 9.6)存在下，將含Iyg純化蛋白質的200yL涂布于96孔微量滴定板上，并 在4°C下培育過夜。在紙巾上輕敲所述板以去除孔中殘留的緩沖液，隨后排出孔中的內含 物。用每孔225 μ L阻斷溶液(含有0. 5% BSA的Ix PBST)阻斷各孔，并在37°C下培育1 小時。用洗滌緩沖液洗滌各孔3次(每孔200 μ L，每次洗滌30秒)。在每次洗滌后，在紙 巾上輕敲所述板至干，以去除各孔中殘留的緩沖液。以Ix PBST (含有0. 5%吐溫20(tween 20)的磷酸鹽緩沖液)洗滌各孔5次，以去除未結合的蛋白質。在兔中產生的針對全長 HPV6L1、HPV16L2和HPV18L1的抗體用作初級抗體。添加以1 1000稀釋的初級抗體后， 在室溫下，振蕩培育所述板1小時。排出孔中內含物，并用含有Ix PBST的洗滌緩沖液洗滌 5次。添加在IOmM磷酸鹽緩沖生理鹽水中以1 2000稀釋的二級抗體抗兔IgG-HRP結合 物，并在室溫下振蕩培育1小時。排出孔中的內含物，并在干紙巾上輕敲所述板，以去除孔 中殘留的緩沖液。每孔添加20 μ L新制的底物溶液OPD (鄰苯二胺二鹽酸鹽)和過氧化氫， 并在室溫下培育30分鐘。通過添加75 μ L終止溶液(stopping solution)來終止反應，并 在ELISA讀取器中讀取在490nm下的吸光度。實例6:蛋白質免疫印跡在12 % SDS-PAGE凝膠上分離前幾章節所述的嵌合蛋白，在PVDF膜(Hybond-Ρ轉 印膜，GE醫療集團(GE Healthcare))上進行電印跡，并在含有IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. 4， 含有3%脫脂奶粉)的溶液中阻斷。用阻斷溶液阻斷過夜后，排出阻斷溶液，并以PBST沖 洗3次，每次5分鐘。在37°C下，將印跡與利用市售四價疫苗而產生的初級兔抗血清的 1 500稀釋液一起培育。與初級抗體培育1小時后，洗滌印跡5次，并與二級抗體(即，抗 兔IgGHRPO結合物)的1 2000的PBST稀釋液一起培育，在室溫下振蕩培育1小時。添 加底物二氨基聯苯胺(diaminobenzidene，DAB)和過氧化氫，并顯色，直到得到所需的顏色 強度。通過排出底物溶液并用WFI沖洗，來終止反應。利用針對市售四價HPV疫苗而產生的抗血清，借助蛋白質免疫印跡檢測嵌合序列中的HPV16L1和HPV18L1。實例7 :嵌合蛋白的免疫原性利用50 μ g吸收于氫氧化鋁凝膠中并經肌肉內投予的每一嵌合抗原的純化蛋白 質使每一測試組中的10只BALB/C小鼠(15-20g)免疫。第1劑后21天，給予加強劑量， 并在第1劑后45天后投予第2劑。借助間接ELISA測量對于前一章節略述的含有SEQID No. 3-12的所有克隆的抗體滴度。估算經嵌合抗原免疫的小鼠中針對HbsAg和HPV抗原的 抗體滴度。用于估算HPV16L1和HPV18L1的初級抗體為針對市售四價疫苗產生的兔抗血清， 但對于表達HPV16L2蛋白的克隆，利用針對純化的HPV16L2蛋白而產生的HPV16L2兔抗血 清來測量。借助間接ELISA，測量從每一組小鼠匯集的血清中針對HPV抗原的抗體滴度。二 級抗體為兔抗IgG HRPO結合物。重復本實驗，其中將含等量抗原的氫氧化鋁凝膠(algel) 與每劑50 μ gCpG低聚核苷酸一起投予。在投予抗原的初始劑量后60到65天，估算所有小 鼠的抗體滴度。為了估算免疫小鼠中針對HbsAg的抗體滴度，利用來自伯樂公司實驗室的 Monolisa Anti HBs 3. O試劑盒，嚴格遵照制造商的說明進行估算。在490nm下記錄值，并 作圖。參考文獻克雷斯特森N. (ChristensenN.)，瑞德 C. (Reed C.)，克拉德爾 N. (CladelN.)， 韓R(Han R)和柯瑞德J. (Kreider J.) (1996)利用病毒樣顆粒免疫將誘導針對白尾棕 色兔乳頭瘤病毒激發的長期兔防護(Immunization with viruslike particles induces long-termprotection of rabbits against challenge with cottontail rabbit papillomavirus).《病毒學雜志》(Journal of Virology) 70，960-965。科恩鮑爾R.(Kirnbauer R.)，查德庫德L. (Chandrachud L.)，奧尼爾B. (0' Neill B.)，瓦格納 E. (Wagner Ε.)，格林德萊 G. (Grindlay G.)，阿姆斯特朗 A. (Armstrong A.)，麥克格韋 G. (McGarvie G.)，斯奇爾 J. (Schiller J.)，羅瑞 D. (Lowry D.)和坎 普M. (Camp Μ.) (1996):牛乳頭瘤病毒4型的病毒樣顆粒用于預防性和治療性免疫 (Virus-like particles of bovine papillomavirus type-4 in prophylactic and therapeuticimmunization).《病毒學》(Virology) 219，37-44。露絲R. (Rose R.)，懷特 W. (White W.),馬琳 L. (MaoIin L.)，蘇黎世 J. (SuzichJ.)，萊恩 C. (Lane C.)和格瑞克 R. 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權利要求
1.一種疫苗組合物，其包含人乳頭瘤病毒(HPV)抗原與賦予較強免疫原性的病毒或細 菌蛋白的嵌合融合物，所述疫苗組合物適用于乙型肝炎病毒以及HPV感染。
2.根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原選自包含但不限于 HPV16、HPV18、HPV6、HPVl 1、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59、HPV68 的群組。
3.根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其中包含所述HPV抗原的完整/部分序列 /突變體/變異體的所述抗原性組合物選自包含以下各項的清單L1、L2、E2、E5、E6和E7 抗原，或者所述抗原的特異性T細胞或B細胞表位，這些是單一序列，或者是與細菌/病毒 蛋白的在投予宿主時能夠誘導強抗體應答的嵌合融合物中的串聯重復序列。
4.根據權利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述病毒和細菌蛋白選自包括但不限 于以下各項的清單中的一種或者組合或者來源于清單中蛋白質的表位乙型肝炎抗原，例 如乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎小抗原；失活的破傷風類毒素；白喉類毒素；大腸桿菌不耐 熱毒素；霍亂毒素；綠膿桿菌外毒素A ；志賀毒素；李斯特菌素。
5.根據權利要求4所述的免疫原性組合物，其中所述抗原性組合物由HPV抗原與乙型 肝炎小抗原(HbsAg)的嵌合融合物組成。
6.根據權利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原包含例如Ll和L2等衣 殼蛋白的完整或部分序列/表位，或者來源于其Ll和/或L2的多肽，且與所述HbsAg融合， 例如 SEQ ID NO. 3 到 SEQ ID NO. 13 中所示。
7.根據權利要求3所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原包含單獨或組合形式的 例如E2、E5、E6和E7等HPV早期蛋白的完整/部分序列/突變體/變異體/表位，例如SEQ ID No. 1和2中所示。
8.根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其中所述HPV抗原與所述乙型肝炎小抗原 的N末端或C末端或者開放閱讀框內的任何區域融合，其中在所述兩個序列之間添加有或 不添加連接子序列。
9.一種表達上述根據權利要求1所述的HPV和HPV-HBsAg嵌合抗原的方法，其包含培 養經根據權利要求1所述的抗原/融合抗原轉化的宿主細胞，從所述宿主細胞中分離出所 述重組蛋白并純化。
10.根據權利要求9所述的方法，其中上述HPV抗原在所述宿主中重組表達為細胞內蛋 白或分泌蛋白，所述宿主是原核或真核表達系統，優選酵母。
11.一種藥物組合物，其包含有效量的適用作疫苗的根據權利要求1至10所述的抗原 性組合物，以及藥學上可接受的載劑。
12.根據權利要求11所述的藥物組合物，其中所述抗原的用量在每劑IOyg到 1000 μ g所述蛋白質的范圍內，優選介于IOyg到200 μ g之間，最優選介于IOyg到100 μ g 之間。
13.根據權利要求11和12所述的藥物組合物，其另外包含適合的佐劑，所述佐劑選自 以下各項中的至少一種氫氧化鋁、磷酸鋁、單磷酰脂A、其它有機親脂性化合物、含有CpG 和非CpG的低聚核苷酸、細胞因子。
14.一種引發對于根據前述權利要求中任一權利要求所述的抗原性組合物的保護性抗 體應答和/或細胞毒性T細胞應答的方法，其包含借助例如經口、粘膜或腸胃外投藥途徑等途徑中的至少一種途徑，將所述組合物投予需要所述治療的個體。
15.根據權利要求14所述的方法，其中上述抗原性組合物的遞送是以藥學上可接受的 生物可降解聚合物實現。
16.一種上述抗原制劑的用途，其是用于預防性或治療性治療哺乳動物、尤其是人類的 乳頭瘤病毒感染和相關的癌癥風險。
全文摘要
本發明描述一種適用于乙型肝炎病毒以及人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染的疫苗組合物，其包含HPV抗原與賦予較強免疫原性的病毒或細菌蛋白的嵌合融合物。
文檔編號A61K39/285GK102112152SQ200980130450
公開日2011年6月29日 申請日期2009年6月9日 優先權日2008年6月9日
發明者克里希納·默斯·艾拉, 坎達斯瓦彌·蘇瑪斯 申請人:巴拉特生物技術國際有限公司