專利名稱：用于遞送光敏蛋白的載體和使用方法
用于遞送光敏蛋白的載體和使用方法交叉引用本申請要求以下美國臨時申請的權益2008年5月20日提交的第61/0 , 571號、 2008年11月14日提交的第61/199，241號，2008年11月洸日提交的第61/200，430號， 通過引用將上述申請全部并入本文。
背景技術：
用來治療疾病或障礙的基因遞送療法，其不依賴于治療潛在的突變，可能具有潛在的價值。能夠控制、調節和/或驅動特異性神經回路從而介導自然神經響應和高分辨率感知以及控制的方法也可能具有巨大的潛在治療價值。神經元是使用通過去極化形成的電流以產生通信信號(例如神經脈沖)的細胞類型的實例。其他可電興奮的細胞包括骨骼肌細胞、心肌細胞和內分泌細胞。神經元利用快速去極化來在全身傳輸信號，并且用于各種目的，例如運動控制(例如肌肉收縮)、感官反應(例如觸覺、聽覺和其他感覺)以及計算功能 (例如腦功能)。通過促進或抑制陽離子或陰離子流經細胞膜，細胞可被暫時去極化、去極化且維持此狀態或者超極化。因而，細胞的去極化控制對于許多不同的目的可能是有益的， 所述細胞的去極化控制包括視覺控制、肌肉控制和感官控制。光敏蛋白通道、泵和受體可以允許細胞的毫秒精確的光學控制。雖然光敏蛋白與光結合可以用于控制離子經由細胞膜的流動，但對于特定的疾病、障礙和回路，靶向和遞送仍然尚待解決。
發明內容
一方面，本發明提供重組核酸，其包含可操作地連接至代謝型谷氨酸受體 6(mGluR6)調控序列或其片段的編碼光敏蛋白的核酸。在一種實施方式中，所述光敏蛋白可以選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2CU8A、ChR2 C128S,ChR2 CU8T、ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥服、6恥服、黑視蛋白(melanopsin)以及它們的變體。在另一實施方式中，所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、至少約80%、至少約90% 或至少約95%相同的光敏蛋白。在另一實施方式中，所述mGluR6調控序列片段包含少于約1000個、少于約750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。在相關的實施方式中，所述mGluR6調控序列或其片段為mGluR6啟動子或者增強子。在特別相關的實施方式中，所述核酸還包含綠色熒光蛋白。在另一實施方式中，所述核酸被包裹在重組腺相關病毒(AAV)的衣殼中。在一些實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15或更多個血清型或者它們的突變體的組合雜合體。在一些實施方式中，所述重組腺相關病毒的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、 AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它們的雜合體。在相關的實施方式中，所述核酸衣被包裹在選自以下的重組病毒的衣殼中重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。另一方面，本發明提供包含編碼光敏蛋白的核酸的載體，所述核酸可操作地連接至代謝型谷氨酸受體6(mGluR6)調控序列或其片段。在一種實施方式中，所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2C128A、ChR2C128S、ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、 ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。在相關的實施方式中，所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95% 相同的光敏蛋白。在另一實施方式中，所述mGluR6調控序列片段少于約1000個、少于約 750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。在相關的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示的序列。在另一實施方式中，所述載體包含重組腺相關病毒(AAV)。在相關的實施方式中，所述載體包括選自以下的重組病毒重組腺相關病毒 (AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。在具體的實施方式中，所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 以及它們的雜合體。在其他具體的實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15或更多個血清型或它們的突變體的組合雜合體。在相關的實施方式中，所述AAV包含突變的衣殼蛋白。在一種具體的實施方式中，所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。所述突變的酪氨酸殘基可以選自Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、 Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在具體的實施方式中，所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。另一方面，本發明提供治療患有眼部疾病或障礙的受試者的方法，所述方法包括向感染的眼部引入包含可操作地連接至代謝型谷氨酸受體6調控序列(mGluR6)或其片段的光敏蛋白的重組腺相關病毒(AAV)。在一種實施方式中，所述眼部疾病或障礙由光感受器細胞的退化導致。在另一實施方式中，所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A、 ChR2 C128S、ChR2C128T、ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、 黑視蛋白以及它們的變體。在相關的實施方式中，所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70 %、至少約80 %、至少約90 %或至少約95 %相同的光敏蛋白。在另一實施方式中， 所述mGluR6啟動子片段少于約1000個、少于約750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。在相關的實施方式中，所述mGluR6啟動子片段為圖6中所示的序列。在另一實施方式中，所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12以及它們的雜合體。在其他實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個血清型或者它們的突變體的組合雜合體。在相關的實施方式中，所述AAV包含突變的衣殼蛋白。在另一相關的實施方式中，所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。在具體的實施方式中，所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、 Y673F和Y720F。在相關的實施方式中，所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。在另一實施方式中，所述AAV使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/或ILM剝除引入。 在具體的實施方式中，所述AAV被引入至視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞； 視桿和視錐雙極細胞)。在另一實施方式中，所述方法還包括在眼部外部使用光發生裝置。另一方面，本發明提供在視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)中表達外源核酸的方法，所述方法包括向視網膜引入包含可操作地連接至視網膜雙極(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)細胞特異性調控序列的外源核酸的載體，其中所述方法導致至少約25 %至30 %的轉導效率。在其他實施方式中，這種方法導致至少約10%的轉導效率。在一種實施方式中，所述方法導致至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的轉導效率。在相關的實施方式中，所述轉導效率通過定量被感染的視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)的總數來測定。在另一實施方式中，所述外源核酸包含光敏蛋白。在相關的實施方式中，所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, ChRl-ChR2雜合體/嵌合體、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。 在具體的實施方式中，所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。在另一實施方式中，所述調控序列包含代謝型谷氨酸受體6調控序列(mGluR6)或其片段。在相關的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段少于約1000個、少于約750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。 在具體的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示的序列。在另一實施方式中，所述外源核酸使用重組腺相關病毒載體(AAV)被引入。在相關的實施方式中，所述AAV 包含突變的衣殼蛋白。在具體的實施方式中，所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。在相關的實施方式中，所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、Y444F, Y500F, Y700F、Y704F、 Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。在另一實施方式中，所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。在另一實施方式中，所述外源核酸使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/或ILM剝除引入。在另一實施方式中，所述AAV為的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO, AAVlU AAV12 以及它們的雜合體。在又一實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15或更多個血清型或者它們的突變體的組合雜合體。 又一方面，本發明提供將外源核酸引入至視網膜細胞核的方法，所述方法包括將包含可操作地連接至視網膜細胞特異性調控序列的外源核酸的載體引入至視網膜細胞，其中所述載體專門設計用來避免泛素介導的蛋白質降解。在一種實施方式中，所述降解是蛋白酶體介導的。在另一實施方式中，所述外源核酸包含光敏蛋白。在相關的實施方式中，所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體/嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。在另一相關的實施方式中，所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、至少約80%、至少約 90%或至少約95%相同的光敏蛋白。在另一實施方式中，所述視網膜細胞為視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。在相關的實施方式中，所述調控序列包含代謝型谷氨酸受體6啟動子(mGluR6啟動子)或其片段。在另一實施方式中， 所述mGluR6片段小于1000個、750個、500個、250個或100個堿基對。在另一實施方式中， 所述mGluR6啟動子片段為圖6中所示的序列。在另一實施方式中，所述載體選自重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。在相關的實施方式中，所述載體為重組腺相關病毒載體(AAV)。在另一實施方式中，所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 以及它們的雜合體。在其他實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個血清型或者它們的突變體的組合雜合體。在另一實施方式中，所述AAV包含突變的衣殼蛋白。 在另一實施方式中，所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。在另一實施方式中，所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、 TO76F、Y612G、Y673F和Y720F。在另一實施方式中，所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突
8變成苯丙氨酸。在另一實施方式中，所述載體使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/或ILM 剝除引入。 另一方面，本發明提供轉導視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)的方法，所述方法包括向視網膜引入包含可操作地連接至調控序列的外源核酸的載體。在一種實施方式中，所述調控序列為非細胞類型特異性啟動子。在另一實施方式中，所述調控序列為鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α激活活性多肽O(GNAOl)啟動子或者巨細胞病毒(CMV)即時早期增強子與牛肌動蛋白啟動子加上內含子1-外顯子1銜接點的融合(CBA、smCBA)。在另一實施方式中，所述外源核酸包含光敏蛋白。在相關的實施方式中，所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2C 128A、ChR2 C128S、ChR2C 128T、 ChRl-ChR2雜合體/嵌合體、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。 在另一相關的實施方式中，所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、至少約80%、 至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。在另一實施方式中，所述載體選自重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。在相關的實施方式中，所述載體為重組腺相關病毒載體(AAV)。在另一實施方式中，所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO, AAVlU AAV12 以及它們的雜合體。在一些實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個血清型或者它們的突變體的組合雜合體。在相關的實施方式中，所述AAV包含突變的衣殼蛋白。在另一實施方式中，所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。在另一實施方式中，所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、 Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。在另一實施方式中，所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。在另一實施方式中，所述載體使用玻璃體內注射、視網膜下注射和 /或ILM剝除引入。通過引用合并在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請在此通過引用并入本文，其引用程度就如同特定且單獨地指明通過引用合并各個單獨的出版物、專利或專利申請。
本發明新的特征在所附權利要求書中具體闡明。通過參考以下闡明示例性實施方式(利用了本發明的原理)的詳細說明以及附圖將獲得對本發明特征和優點的更好的理解，其中圖1圖示ChRl核酸序列。圖2圖示ChR2核酸序列。圖3圖示NpHR核酸序列。圖4圖示黑視蛋白核酸序列。圖5圖示ChR2核酸序列，所述序列為哺乳動物密碼子優化了的序列，并且其編碼與綠色熒光蛋白(GFP)融合的ChR2。圖6圖示能夠以雙極細胞特異性方式調控表達的GRM6(代謝型谷氨酸受體6)調控核酸序列的片段。圖7圖示smCBA調控核酸序列。
圖8圖示神經元表達ChR2和發放。(A)用光刺激神經元表達ChR2 ； (B)神經元發放響應藍光快速脈沖群。圖9圖示-MN遞送至視網膜雙極細胞。第1列顯示在用AAV7-CBA-GFP載體視網膜下注射8周之后，GFP在視網膜雙極細胞中的表達。第2列顯示PKCa染色(雙極細胞特異性抗體)，第3列顯示對細胞核的DAPI染色，以及第4列顯示GFP表達、PKC α染色和 DAPI染色的合并圖像。第一行為20Χ放大，第二行為40Χ放大。圖10圖示ChR2-GFP融合蛋白在rdl、rho-/-和rdl6視網膜雙極細胞中的表達。 在各個圖像中，記錄了視網膜色素上皮細胞(RPE)、雙極細胞或內核層(INL)、內網層(IPL) 以及神經節細胞層(GCL)。亮白區域顯示GFP表達。在INL的雙極細胞中有表達的小環 (ringlet)(除了 AAV5玻璃體內注射外)。圖11圖示用酪氨酸突變AAV載體視網膜下注射后1個月時，通過免疫組 織化學分析冷凍視網膜切片中EGFP的表達。示例性切片圖示出用血清型2Y444(a)或血清型 8Y733(b)轉導之后，EGFP熒光在視網膜中的分布和強度。圖像方向為玻璃體面向底部和光感受器層面向頂部。來自用血清型2Y444視網膜下注射小鼠眼部的光感受器、RPE細胞和神經節細胞中的EGFP熒光。(c)在遞送血清型8Y733之后，光感受器、RPE細胞和米勒 (Muller)細胞中的EGFP熒光。(d)通過使用谷氨酰胺合成酶(GS)抗體的免疫染色檢測米勒細胞突起(process)(紅色)。(e)合并圖像顯示來自用血清型8Y733治療的眼部的視網膜切片中EGFP熒光(綠色)和GS染色(紅色)的共定位。(f)校準線ΙΟΟμΜ。gcl，神經節細胞層；ipl，內網層；inl，內核層；onl，外核層；os，外段；rpe，視網膜色素上皮細胞。圖12圖示水迷宮任務訓練小鼠。㈧用于測量暗視閾值的水迷宮示意圖(Hayes 和Balkema，1993)。(B)各小鼠組(視網膜退化-治療、視網膜退化-未治療和野生型)發現目標(黑色平臺+LED陣列)所花費的時間與訓練時間的函數關系。(C)各小鼠組(治療rdl、治療rdl6、治療rho-/-、未治療視網膜變性和野生型)發現目標(黑色平臺+LED陣列)所花費的時間與不同光強度的函數關系。圖13圖示聯合有可觸發光敏蛋白表達的光發生/產生元件(LED陣列/激光系統)的護目鏡(goggle)樣裝置。
具體實施例方式光敏蛋白本發明提供編碼光敏蛋白的重組核酸，用于遞送編碼光敏蛋白的重組核酸的病毒載體和非病毒載體，以及用于遞送光敏蛋白的方法。光敏蛋白屬于視蛋白家族，包括脊椎動物(動物)和無脊椎動物視紫紅質。動物視蛋白、視紫紅質是具有7個跨膜螺旋的G-蛋白偶聯受體(GPCR)，其可以調控離子通道的活性。無脊椎動物視紫紅質通常不是GPCR，但為光敏性或光激活的離子泵或離子通道。由于去極化陽離子通量穿過光門控孔(light-gated pore)，來自萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)的海藻視蛋白(如視紫紅質通道蛋白(ChR2))允許在細胞內以毫秒精確觸發藍光誘導的動作電位。古細菌視蛋白(如氯視紫紅質法老(嗜)鹽堿單孢菌(Natronomonas pharaonis))允許光激活的氯泵作用；當暴露于黃光時，所述泵可以被超極化，并可被抑制觸發動作電位。這種光敏視蛋白的應用允許神經元發放活動的時空CN 102159713 A
說明書
6/27 頁 調控。本文所提及的“光敏”蛋白包括視紫紅質通道蛋白(ChRl、ChR2)、氯視紫紅質 (NpHR)、黑視蛋白、松果體視蛋白、細菌視紫紅質以及它們的變體。本發明的光敏蛋白可以天然存在于植物、動物、古細菌、海藻或細菌細胞中，或者可選擇地，通過實驗室技術制備。視紫紅質通道蛋白ChRl(GenBank登錄號AB058890/AF385748 ；圖1)和 ChR2 (GenBank登錄號AB058891/AF461397 ；圖幻是來自綠藻萊茵衣藻的兩種視紫紅質 (Nagel，2002 ；Nagel, 2003)。二者都是光敏通道，在神經組織中表達和激活時，允許細胞在被光刺激時去極化(Boyden，2005)。在一些實施方式中，可以通過結合ChRl和ChR2蛋白的不同部分而形成和使用雜合或嵌合視紫紅質通道蛋白。在一種實施方式中，可以通過用ChRl的同源配對物取代ChR2的N-末端片段而制備和使用雜合或嵌合視紫紅質通道蛋白(反之亦然)。在一些實施方式中，所述雜合視紫紅質通道蛋白導致敏感性以可以忽略的減敏現象和減慢的開啟(turning-on)和關閉 (turning-off)動力學移動至不同的波長譜(例如至紅光波長譜)。在另一實施方式中，可以制備和使用ChRl (氨基酸1-345)和ChR2 (氨基酸1_315) 雜合體/嵌合體。在又一實施方式中，可以制備和使用保留ChRl的N-末端部分，并且用相應的ChR2 片段取代C-末端部分的ChRl-ChR2雜合體/嵌合體。在具體的實施方式中，可以構建和利用包括在嵌合體的視網膜結合袋(pockets)周圍的突變殘基的ChRl和ChR2雜合體/嵌合體。在示例性實施方式中，可以制備和使用以下嵌合體a. ChD =ChRl的N-末端部分和ChR2的C-末端部分的雜合體位置位于兩種視紫紅質通道蛋白的螺旋D的同源位點。b. ChEF =ChRl的N-末端部分和ChR2的C-末端部分的雜合體位置位于兩種視紫紅質通道蛋白的螺旋E和F之間的環。c. ChIEF 異亮氨酸170突變成纈氨酸的ChEF嵌合體的變體。d. ChF =ChRl的N-末端部分和ChR2的C-末端部分的雜合體位置位于兩種視紫紅質通道蛋白的螺旋F的末端。在一些實施方式中，在持久性光存在下，所述嵌合體保留ChRl的減少失活，但是除質子外，可以允許鈉和鉀離子滲透。在其他實施方式中，所述嵌合體可以通過刺激后增強通道關閉的比率而改進通道的動力學。在一些實施方式中，可以改造其他ChRl和ChR2變體。在具體的實施方式中，ChR2 蛋白的單個或多個點突變可以得到ChR2變體。在示例性實施方式中，ChR2在CU8位點的突變可以得到改變的通道特性。在相關的實施方式中，C128A、C128S和CU8T ChR2突變可以得到更多的總平均開放次數(Berndt，2009)。在其他相關的實施方式中，ChR2變體可以導致改變的動力學。在另一實施方式中，可以使用VChRl (GenBank登錄號EU622855)。在具體的實施方式中，利用ChR2的哺乳動物密碼子優化型(圖5)。NpHR (氯視紫紅質)(GenBank登錄號EF474018 ；圖3)來自嗜(耐)鹽堿古菌法老 (嗜)鹽堿單孢菌。在一些實施方式中，可以制備NpHR的變體。在具體的實施方式中，NpHR
/嵌合體，其中交叉 /嵌合體，其中交叉
/嵌合體，其中交叉
11蛋白的單個或多個點突變可以得到NpHR變體。在具體的實施方式中，可以利用NpHR的哺乳動物密碼子優化型。在一種實施方式中，利用NpHR變體。在一種具體實施方式
中，利用eNpHR(增強的 NpHR)。將氨基酸FCYENEV增加至NpHR的C-末端，同時將來自煙堿型乙酰膽堿受體β亞基的信號肽增加至NpHR的N-末端，實現eNpHR的構建。黑視蛋白(GenBank登錄號6693702 ； 圖4)是發現于視網膜特化光敏神經節細胞中的光色素，其涉及生理節律的調控、瞳孔對光反射和其他對光的非可視響應。在結構上，黑視蛋白為視蛋白，它是G-蛋白偶聯受體的亞視黃基蛋白變體。黑視蛋白在許多方面類似無脊椎動物視蛋白，包括它的氨基酸序列和下游信號級聯放大。如同無脊椎動物視蛋白，黑視蛋白似乎是雙穩態光色素，具有內在的光異構酶活性。在一些實施方式中， 可以制備黑視蛋白變體。在具體的實施方式中，黑視蛋白蛋白質的單個或多個點突變可以得到黑視蛋白變體。光敏蛋白還可以包括與光敏蛋白ChRl、ChR2、NpHR和黑視蛋白至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、 至少約55%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、或至少約 99%相同的蛋白質。例如，ChR2蛋白可以包括與ChR2至少約60%、至少約70%、至少約 80%、至少約90%或至少約95%相同的蛋白質。此外，這些蛋白質可以包括光敏且可以由高強度光的特定波長激活的ChR2。在一些實施方式中，光敏蛋白可以調節神經回路中的信號傳導，并且在單神經元水平雙向控制離子電導行為。在一些實施方式中，所述神經元為視網膜神經元、視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)、視網膜神經節細胞、光感受器細胞或視網膜無長突細胞。腺相關病毒載體如本文所描述，本發明提供包含編碼光敏蛋白的核酸的病毒載體及其使用方法。腺相關病毒(AAV)是小的(25-nm)無包膜病毒，其包裝4. 7Kb的線性單鏈DNA基因組。AAV基因組的小尺寸以及關于R印對細胞基因表達的潛在作用的顧慮，致使構建的AAV 載體不編碼R印，并且缺失對于頻繁的位點特異性整合所需要的順式活性(cis-active) IEE0保留ITR，因為它們是包裝所需要的順式信號。因此，當前的重組AAV(rAAV)載體主要作為染色體外元件繼續存在。可以使用各種重組腺相關病毒載體(rAAV)來遞送感興趣的基因至細胞，并且實現感興趣的基因的表達，例如編碼光敏蛋白的基因。例如，可以使用rAAV在靶細胞中表達光敏蛋白，例如 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體/嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChlEF、NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體，或者本文描述的任何一種光敏蛋白。本文有時使用的“轉基因”是指編碼感興趣的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸被包裹在病毒載體(例如rAAV)的衣殼中。腺相關病毒是小的單鏈DNA病毒，其需要輔助病毒來促進有效的復制。AAV的 4. 7kb基因組以兩個反向末端重復序列(ITR)和分別編碼R印蛋白和Cap蛋白的兩個開放閱讀框為特征。R印閱讀框編碼分子量為78kD、68kD、52kD和40kD的四種蛋白質。這些蛋白質的功能主要是調控AAV復制和拯救，以及整合AAV至宿主細胞的染色體。Cap閱讀框編碼分子量為85kD(VP 1)、72kD(VP2)和6IkD(VP3)的三種結構蛋白(Berns,以上引用)，這些結構蛋白形成病毒粒衣殼。AAV病毒粒中多于80%的總蛋白質包含VP3。rAAV的基因組通常包含(1)5'腺相關病毒ITR，⑵用于所期望的基因產物(例如光敏蛋白)的編碼序列(例如轉基因)，其可操作地連接至在細胞中調控該編碼序列表達的序列(例如啟動子序列，如mGluR6或其片段)，以及(3)3'腺相關病毒反向末端重復序列。此外，rAAV載體優選地可包含多聚腺苷酸化序列。通常，為了允許復制、包裝和有效整合至細胞染色體，rAAV載體在感興趣的轉基因或基因的各個末端具有一個AAV ITR拷貝。所述ITR由位于AAV的DNA基因組5'末端的 1至145位核苷酸和位于AAV的DNA基因組3'末端的4681至4536位核苷酸(即相同的序列)組成。所述rAAV載體還可以包含在所述ITR的末端之后的至少10個核苷酸(即“D 區域”的一部分)。所述轉基因序列(例如編碼光敏蛋白的多核苷酸)的長度可以為約2至51Λ (或可選擇地，轉基因可以額外包含“充填”或“填充”序列，以使兩個ITR之間的核酸序列的總大小為2至51Λ)。可選擇地，所述轉基因序列可以由相同或相似異源序列多次的重復拷貝 (例如編碼由核糖體通讀隔離，或可選擇地，由內部核糖體進入位點或“IRES”隔離的一種或一種以上光敏蛋白的兩種核酸分子)組成，或者由幾種不同的異源序列(例如由核糖體通讀隔離或IRES隔離的ChR2和NpHR ；或任何兩種或多種本文所描述的光敏蛋白，它們包括但不限于 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體)組成。本發明的重組AAV載體可以產生自各種腺相關病毒，包括例如本文所描述的血清型1至12的任何一種。例如，來自任何一種AAV血清型的ITR預期具有在復制、整合、剪切和轉錄機制方面相似的結構和功能。在一些實施方式中，利用細胞類型特異性啟動子(或其他調控序列，如增強子)來驅動感興趣的基因在一種或一種以上特定的細胞類型中的表達，例如光敏蛋白、ChR2等。在其他情況下，在本發明的一些實施方式中，光敏轉基因的表達可以通過獨立的啟動子(例如病毒啟動子、真核啟動子或其他在真核細胞、尤其是哺乳動物細胞中促進被可操作地連接的序列的表達的啟動子)來完成。在這點上，適當的啟動子的代表性實例包括mGluR6啟動子、GNAOl啟動子、CBA/smCBA(CMV即時早期增強子與牛β _肌動蛋白啟動子加上內含子 1-外顯子1銜接點的融合)啟動子、CBA啟動子(雞β -肌動蛋白)、CMV啟動子、RSV啟動子、SV40啟動子、MoMLV啟動子或它們的衍生物、突變體和/或片段。啟動子和其他調控序列將在本文進一步描述。在本發明中同樣可以利用其他啟動子，包括細胞或組織特異性啟動子(例如視桿、視錐或神經節衍生的啟動子)或誘導型啟動子。適當的誘導型啟動子的代表性實例包括對抗生素敏感的誘導型啟動子，例如四環素-響應啟動子，如“tet-on”和/或“tet-off” 啟動子。誘導型啟動子還可以包括對除抗生素外的化學物質敏感的啟動子。rAAV載體還包含額外的序列，例如來自腺病毒的序列，用于輔助實現載體的期望的功能。這種序列包括例如輔助將rAAV載體包裝至病毒顆粒的序列。適于生產腺相關病毒載體的包裝細胞系可以用已知可利用的技術完成(參見如美國專利第5，872，005號)。用于構建和包裝rAA7I載體的方法描述于例如WO 00/54813 中。
在r印和cap開放閱讀框的5'末端一側和3'末端一側為I^bp的反向末端重復序列(ITR)，其前能夠形成Y-形或T-形雙螺旋結構。所述兩個ITR是用于AAV 復制、拯救、包裝和AAV基因組整合的唯一的必要順式元件。AAV ITR有兩種構象，被稱為“翻(flip)”和“轉(flop)”。構象上的這些區別源自腺相關病毒使用ITR來啟動和再啟動復制的復制模式(R. 0. Snyder 等，1993，J. Virol. ,67 :6096-6104(1993) ；K. I. Berns, 1990Microbiological Reviews, 54 :316-329)。完整的 rep 和 cap 結構域可以被切除并且可用治療或報告轉基因取代。在一些實施方式中，使用自身互補型AAV載體。自身互補型載體已被開發用來在單鏈AAV載體基因組中防止限速第二鏈合成，并且促進以最小劑量進行的強烈的轉基因表達。在具體的實施方式中，任何一種血清型或雜合血清型或突變血清型或突變雜合血清型的自身互補型AAV，與相同血清型的非自身互補型rAAV相比，光敏蛋白的表達增加至少 10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200%或大于200%， 所述光敏蛋白如 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2 C128S,ChR2 CU8T、ChRl_ChR2 雜合體/嵌合體、ChD, ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。腺相關病毒血清型在一種實施方式中，所述載體包含天然存在或改造的特定血清型的重組AAV。已在許多動物種類中發現AAV，包括靈長類、犬類、禽類和人類。病毒血清型是具有一組共同可識別抗原的微生物菌株。有幾種已知的AAV血清型，并且在視網膜中的轉染或轉導效力可能隨著特定的血清型和靶細胞的性質而變化。 rAAV或者rAAV或AAV的特定血清型能提供用于基因遞送至視網膜雙極細胞(例如ON或 OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)的組織-特異性或細胞-類型特異性嗜性。雖然rAAV和/或AAV可能是遞送轉基因至靶組織的相對安全的方法，但遞送的效力(以及可能的情況下，遞送的安全性)可能依賴于AVV的外殼蛋白。蛋白外殼或衣殼決定哪種細胞可以吸收病毒有效載荷。不同的AAV血清型，即蛋白外殼或衣殼不同的病毒，可能在它們的組織嗜性和轉導靶細胞的能力上不同。轉基因可被包裝于具有許多功能不同的外殼蛋白或衣殼的AAV顆粒中。這些不同的衣殼定義了血清型，并且可能(全部或部分)有助于其轉導特定細胞類型的能力。病毒載體的進入開始于衣殼與靶細胞表面蛋白的交互作用。不希望受理論束縛，正是在轉導通路這一點上，不同的血清型可能顯著影響轉基因遞送的效率。在一些實施方式中，所述AAV載體的血清型或其變體/突變體包括但不限于AAV1 (GenBank 登錄號 AY724675)、AAV2 (GenBank 登錄號 AF043303)、AAV3、AAV4、 AAV5 (GenBank 登錄號 M61166)、AAV6、AAV7 (GenBank 登錄號 AF513851)、AAV8 (GenBank 登錄號 AF513852)、AAV9 (GenBank 登錄號 AX753250)、AAVlO, AAVll (GenBank 登錄號 AY631966) 或AAV12 (GenBank登錄號DQ813647)或者它們的突變體、雜合體或片段。在一些實施方式中，所述AAV載體包含一種或一種以上、兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、 或者五種或更多種以下的血清型AAV1 (GenBank登錄號AY724675)、AAV2 (GenBank登錄號 AF043303)、AAV3、AAV4、AAV5 (GenBank 登錄號 M61166)、AAV6、AAV7 (GenBank 登錄號 AF513851)、AAV8 (GenBank 登錄號 AF513852)、AAV9 (GenBank 登錄號 AX753250)、AAVlO,AAVll (GenBank登錄號AY631966)或AAV12 (GenBank登錄號DQ813647)或者它們的突變體、 雜合體或片段。在其他實施方式中，所述AAV載體為迄今仍然未被發現和未被表征的天然血清型或它們的變體/突變體。在一些實施方式中，所述重組AAV的血清型為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15或更多種血清型或者它們的突變體的組合雜合體。在一些實施方式中，所述AAV載體可被用于特異性轉導特定的細胞類型，例如視網膜細胞或視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。在一些情況中，特定的血清型(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)在轉導特定的細胞類型(例如視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)，神經元)或組織時，可能比其他血清型更佳。例如，特定的AAV血清型(如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)，可以與不同的AAV血清型相比增加至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少 175%、至少200%或大于200%的轉導效率轉導特定的細胞類型，例如視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。在一些情況中，特定的血清型(例如 AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)可以允許特定細胞類型的細胞(例如視網膜雙極細胞(例如ON 或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞))或者在特定組織(例如視網膜組織)中的細胞至少 2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90% 的轉導。本領域內需要能有效地轉導視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞； 視桿和視錐雙極細胞)的AAV血清型，尤其是當這種轉導能夠遞送和表達光敏蛋白，例如 ChR2。治療眼部障礙或疾病(例如視覺受損、失明)的重要療法，可包括使用特定的AAV血清型在視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)中表達光敏蛋白，如ChR2。例如，在優選的實施方式中，在視網膜細胞例如視網膜雙極細胞(例如 ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)中，使用AAV5或AAV7血清型來靶向感興趣的基因(例如光敏蛋白、ChR2等)的表達。在一些情況中，AAV5和/或AAV7比其他 AAV血清型能更有效地轉導視網膜細胞，例如視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。例如，在一些實施方式中，使用AAV5和/或AAV7血清型(而非AAVl血清型)來轉導視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。在其他情況中，使用AAV2和/或AAV8血清型來轉導視網膜雙極細胞(例如ON 或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。在一些情況中，特定的血清型(例如AAV2、 AAV5、AAV7或AAV8)可被籠統地應用于組織(例如視網膜組織)，但隨后特定的血清型優先于其他細胞類型轉導特定的細胞類型。在一些情況中，引入至視網膜的AAV(例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)能優先轉導視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)，以致與其他視網膜細胞相比，轉基因在視網膜雙極細胞中更高地表達。在一些情況中，AVV的特定血清型 (例如AAV2、AAV5、AAV7或AAV8)可能是導致或有助于導致這種優先轉導的原因。在一些情況中，僅有雙極細胞小的亞群被轉導。在一些實施方式中，包含非細胞類型特異性啟動子的AAV的特定血清型，例如 AAV5和/或AAV7 (或本文所描述的任何一種其他AAV血清型或突變體)，被用于驅動光敏蛋白在特定細胞類型中的表達。在一些情況中，已被證明優先轉導特定細胞類型的AAV的特定血清型，與細胞-類型特異性啟動子一起使用來驅動感興趣的蛋白質(例如光敏蛋白) 在特定細胞類型中的表達。在產生小基因、載體和衣殼中使用的AAV ITR序列和其他AAV序列，以及在一些實施方式中使用的其他構建體可以獲自各種來源。例如，所述序列可以由目前鑒別的人AAV 類型和有待鑒別的AAV血清型提供。類似地，已知感染其他動物的AAV也可以提供在本發明的分子或構建體中使用的這些ITR。類似地，來自各種AAV血清型的衣殼可以與其他載體成分“混合和匹配”。參見，例如于2001年11月8日公開的國際專利公開號第W001/83692號 (通過引用并入本文)。各種這些病毒血清型和株系可獲自美國模式培養物藏所(American Type Culture Collection, Manassas, Va.)或者可獲自各種學術或商業來源。可選擇地， 使用已知的技術合成在制備本發明的載體和病毒中使用的序列可能是合乎需要的，這可能利用公開的和/或可獲自各種數據庫的AAV序列。腺相關病毒和表面暴露殘基的突變重組腺相關病毒載體正用在幾個臨床試驗中，但是為達到療效需要相對大的載體劑量。大的載體劑量還可能觸發免疫響應，因為相當大的一部分載體可能未能有效地被運輸至核中，并且可能通過宿主細胞蛋白酶體機制被靶向而降解。已報道，通過減少載體的核轉運，表皮生長因子受體蛋白質酪氨酸激酶(EGFR-PTK)信號傳導負面影響AAV血清型2載體的轉導(Zhong 2007)。酪氨酸磷酸化的AAV2載體進入但未有效轉導，部分地是因為AAV 衣殼的泛素化( 接著是蛋白酶體介導的降解)。AAV2中酪氨酸的點突變可能導致在較低病毒滴度下的高效率轉導(Zhong 2008)。在一種實施方式中，為了提高視網膜細胞(例如視網膜雙極細胞)轉導的效率，使用酪氨酸突變的AAV，例如AAV2或AAV8 (圖9至圖12)。在一種實施方式中，rAAV衣殼的表面暴露酪氨酸殘基的突變允許載體避免磷酸化和隨后的泛素化，從而防止蛋白酶體介導的降解，導致更多的轉導和隨后的光敏蛋白的基因表達。在相關的實施方式中，除酪氨酸外，可以突變任何一種或一種以上表面暴露殘基， 以提高轉導效率、組織/細胞類型嗜性、表達特性和有效感染所需的滴度。如本文所描述的，對野生型rAAV載體的多核苷酸和多肽的結構的修飾和變化可能得到具有期望特性的改良rAAV病毒粒。例如，突變的rAAV載體可以改善光敏基因構建體向經選擇的哺乳動物細胞、組織和器官的遞送，用于各種疾病和障礙的治療、阻止和預防。這種方法還可以提供用于這些疾病的癥狀改善的手段，并且通過rAAV載體介導的基因療法，促進感興趣的外源治療多肽和/或預防多肽的表達。所述突變的rAAV載體可以編碼一種或一種以上蛋白質，例如本文所描述的光敏蛋白，如ChR2。在本文中，在編碼一種或一種以上由公開的rAAV構建體編碼的光敏蛋白的特定多核苷酸序列中形成(或插入)一個或一個以上突變。在某些情況下，通過這些突變改變所得的光敏多肽序列，或者在其他情況下，多肽的序列未因在編碼多核苷酸中的一個或一個以上突變而被改變，以產生具有改良特性的修飾載體，用于在哺乳動物系統中實現基因治療。如本文所描述，編碼光敏蛋白的多核苷酸的密碼子優化也可能提高轉導效率。泛素-蛋白酶體通路在AAV細胞內運輸中發揮作用。在例如AAV2或AAV8衣殼上的表面暴露酪氨酸殘基的取代，允許載體具有有限的泛素化，或者完全避開泛素化。泛素化的降低或缺失可有助于防止衣殼遭受蛋白酶體介導的降解。在體外磷酸化分析中，AAV或rAAV衣殼可通過EGFR-PTK在酪氨酸殘基處被磷酸化，并且所述磷酸化的AAV衣殼保持它們的結構完整性。雖然磷酸化的AAV載體可能與它們的未磷酸化的對應物(counterpart) — 樣有效地進入細胞，但是它們的轉導效率可能顯著減少。在一些 情況中，重組腺相關病毒(rAAV)載體包含具有突變的酪氨酸殘基的衣殼蛋白，其能夠使載體具有提高的靶細胞(例如視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞))轉導效率。在一些情況中，所述rAAV進一步包含能夠驅動感興趣的蛋白質表達于靶細胞中的啟動子(例如mGluR6或其片段)。在一些情況中，在特定細胞類型中的表達還通過將本文描述的細胞類型特異性啟動子包括在rAAV載體中而實現。在一種實施方式中，重組腺相關病毒(rAAV)載體至少包含第一衣殼蛋白，所述第一衣殼蛋白至少包含第一磷酸化的酪氨酸氨基酸殘基，并且其中所述載體還至少包含可操作地連接至啟動子的編碼光敏蛋白的第一核酸片段，所述啟動子能夠在宿主細胞中表達所述片段。在一種實施方式中，可以在AAV 1-12或雜合AAV的衣殼蛋白的任何一個或一個以上酪氨酸殘基中進行突變。在具體的實施方式中，這些是表面暴露的酪氨酸殘基。在相關的實施方式中，所述酪氨酸殘基是VPl、VP2或VP3衣殼蛋白的一部分。在示例性實施方式中， 可以在AAV-VP3衣殼蛋白的一個或一個以上以下氨基酸殘基中進行突變Tyr252、Tyr272、 Tyr444、Tyr500、Tyr700、Tyr704、Tyr730 ；Tyr275、Tyr281、Tyr508 > Tyr576 > Tyr612 > Tyr673 或Tyr720。示例性突變為酪氨酸至苯丙氨酸的突變，包括但不限于Y252F、Y272F、Y444F、 Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。在具體的實施方式中，這些突變在AAV2血清型中進行。在一些情況中，AAV2血清型包含Y444F突變和/或AAV8血清型包含Y733F突變，其中444和733表示病毒衣殼的酪氨酸點突變的位點。在進一步的實施方式中，這種突變的AAV2和AAV8血清型編碼光敏蛋白(例如ChR2)， 并且還可能包含調控序列(例如mGluR6)來驅動這種光敏蛋白的表達。在相關的實施方式中，對AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或雜合血清型的酪氨酸殘基進行1、2、3、4、5、6或7個突變。在一個示例性實施方式中，3個酪氨酸突變形成由 Y444F、Y500F和Y730F組成的具有三重突變的AAV血清型。本發明的rAAV載體可以包含于腺相關病毒顆粒或感染性rAAV病毒粒中，包括例如選自以下的病毒粒AAV血清型1、AAV血清型2、AAV血清型3、AAV血清型4、AAV血清型5 和AAV血清型6、AAV血清型7、AAV血清型8、AAV血清型9、AAV血清型10、AAV血清型11、 AAV血清型12或雜合AAV血清型。本發明的rAAV載體還可以包含于分離的哺乳動物宿主細胞中，包括例如人類、靈長類、鼠科、貓科，犬科、豬科、綿羊科、牛科、馬科、印ine、山羊和狼宿主細胞。所述rAAV載體可以包含于分離的哺乳動物宿主細胞中，如人內皮、上皮、血管、肝臟、肺臟、心臟、胰臟、 腸、腎、肌肉、骨骼、神經、血液或腦細胞。在一些實施方式中，與表達光敏蛋白的野生型AAV相比時，表達光敏蛋白且包含突變的衣殼蛋白(例如本文所描述的酪氨酸殘基的突變)的AAV的轉導效率增加了至少 10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%、至少125%、至少150%、至少175%、至少200%或大于200%， 所述光敏蛋白例如是 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2 C128S,ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體/嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。本發明還提供了能夠轉導雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)的至少 2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90% 的突變的 rAAV 載體(例如AAV2 Y444F載體或AAV8 Y733F載體)。由突變的衣殼造成的轉導的提高可以允許通過玻璃體內注射轉導雙極細胞。例如，在一些實施方式中，通過玻璃體內注射，將突變的rAAV 載體或rAAV組合血清型雜合載體或突變的組合血清型雜合rAAV載體引入至視網膜，所述載體可能能夠轉導至少 2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90% 的視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)。在具體的實施方式中，僅轉導視網膜雙極細胞的亞群。在其他具體的實施方式中，僅轉導高度敏感的雙極細胞。在一些實施方式中，與表達光敏蛋白的野生型AAV相比時，包含具有突變的衣殼蛋白且表達光敏蛋白的AAV的泛素或蛋白酶體介導的降解減少了至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%或至少90%，所述光敏蛋白例如是 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。其他基因遞送載體適用于在眼部細胞，特別是視網膜細胞，更特別的是非光感受器細胞(例如無長突細胞、視網膜神經節細胞、視網膜雙極細胞(ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞))中表達 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2 C128S,ChR2 C128T、ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體或者任何光敏蛋白的多種其他載體中的任何一種都在本發明的范圍之內。基因遞送載體可以是病毒載體 (例如衍生自或包含病毒DNA或RNA序列，優選包裝于病毒顆粒中)或非病毒載體(例如并未包裝于病毒顆粒中，包括“裸”多核苷酸，與諸如脂質體或靶分子的載體顆粒聯合的核酸等)。以下描述其他示例性基因遞送載體。重組腺病毒載體(Ad)在其他實施方式中，所述基因遞送載體為重組腺病毒載體。美國專利第6，245, 330號描述的重組腺病毒可適合用于本發明中。Ad載體并不整合至宿主細胞基因組，當需要短期基因表達(一般約14日)時特別優選。因而，Ad載體的應用可能要求重復眼內注射來治療在一般患者中持續幾十年的視網膜疾病。Ad和AAV在視網膜內的病毒嗜性可能不同。由載體轉導的細胞亞群通常是受體介導的事件。已證明，注射后Ad載體主要轉導視網膜米勒細胞和視網膜色素上皮細胞。當注射至眼部時，AAV載體非常有效地轉移它們的基因有效荷載至視網膜光感受器細胞和非光感受器細胞。逆轉錄病毒基因遞送載體本發明的基因遞送載體可以是適合表達經選擇的感興趣的基因或序列(例如 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2C128S,ChR2 C128T,ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體)的逆轉錄病毒基因遞送載體。本發明的逆轉錄病毒基因遞送載體可易于從各種各樣的逆轉錄病毒(包括例如B、C和D型逆轉錄病毒以及泡沫病毒和慢病毒)構建。例如，在一些情況中， 將諸如慢病毒的逆轉錄病毒用包膜蛋白或其他病毒蛋白假型化，以促進進入靶細胞。在一些情況中，將慢病毒用水皰性口炎病毒g蛋白假型化(參見RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory，1985)。這些逆轉錄病毒可易于從保藏機構或保藏所如美國模式培養物保藏所(“ATCC”;R0Ckville，Maryland)獲得，或者由本文提供的已知禾口標準重組技術(例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual 2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Kunke 1, PNAS 52 :488,1985)分離。此外，在本發明的一些實施方式中，部分逆轉錄病毒基因遞送載體可以源自不同的逆轉錄病毒。例如，在本發明的一種實施方式中，逆轉錄病毒LTR可以源自鼠科肉瘤病毒、來自勞氏(Rous)肉瘤病毒的tRNA結合位點、來自鼠科白血病病毒的包裝信號、以及來自禽白血病病毒的第二鏈合成起始位點。在本發明的一個方面，提供的逆轉錄病毒載體構建體包含5' LTR、tRNA結合位點、包裝信號、一種或一種以上異源序列、第二鏈DNA合成起始位點和3' LTR，其中所述載體構建體缺失gag、pol或env編碼序列。其他逆轉錄病毒基因遞送載體同樣可以用在本發明中，并且是本領域所熟知的。適合用于上述逆轉錄病毒載體構建體的包裝細胞系可以根據本領域熟知的方法容易地制備，并且可被用來形成用于重組載體顆粒生產的生產細胞系。甲病毒遞送載體適合在本發明中應用的基因遞送載體還可以基于甲病毒載體。 例如，辛德畢斯(Sindbis)病毒是披膜病毒科甲病毒屬的原型成員。辛德畢斯病毒不分節段的基因組RNAG9S RNA)長度大約為11，703個核苷酸，包含5'帽和3'多聚腺苷酸尾巴， 并且顯示正極性。傳染性的包膜辛德畢斯病毒通過在細胞質中裝配病毒核衣殼蛋白于病毒基因組RNA上并且出芽穿過嵌入了病毒編碼的糖蛋白的細胞膜而形成。病毒進入細胞是通過經由被膜小窩的細胞內吞作用、病毒膜和內涵體的融合、核衣殼的釋放以及病毒基因組的脫殼而實現的。在病毒復制期間，基因組49S RNA作為用于合成互補負鏈的模板。這種負鏈又作為用于基因組RNA和內在啟動(internally initiated)的26S亞基因組RNA的模板。所述辛德畢斯病毒非結構蛋白是從基因組RNA翻譯的，而結構蛋白是從亞基因組 26S RNA翻譯的。全部病毒基因表達為多聚蛋白，并且通過翻譯后蛋白裂解加工成單個蛋白。包裝序列位于非結構編碼區，因此僅有基因組49SRNA被包裝進病毒粒中。在本發明中，可以構建和利用幾種不同的辛德畢斯載體系統。這種系統的代表性實例包括在美國專利第5，091，309號和第5，217，879號以及PCT公開第WO 95/07994號中描述的那些。其他病毒基因遞送載體。除了逆轉錄病毒載體和甲病毒載體，許多其他病毒載體系統也可用作基因遞送載體。這種基因遞送載體的代表性實例包括諸如痘病毒之類的病毒，諸如金絲雀痘病毒或牛痘病毒之類的病毒。非病毒基因遞送載體除了以上基于病毒的載體外，在本發明中，同樣可以利用許多非病毒基因遞送載體。這些基因遞送載體的代表性實例包括直接遞送核酸表達載體、裸 DNA(例如未包含于病毒載體的DNA) (W0 90/11092)、連接或未連接至滅活腺病毒的聚陽離
19子濃縮的DNA(Curiel等，Hum. Gene Ther. 3 147-154，1992)、連接至具有或不具有上述高親和性配對物之一的配體的DNA配體(Wu等，R of Biol. Chem(264 16985-16987，1989)、包含脂質體的核酸(例如WO 95/249 和WO 95/12387)以及某些真核細胞。調控序列在一些實施方式中，利用調控序列或元件以允許ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥!11 、6恥! 、 黑視蛋白以及它們的變體的細胞類型或組織類型特異性靶定。在相關的實施方式中，將調控元件用于特異性靶向視網膜神經元、或視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)、或視網膜神經節細胞、或光感受器細胞、或無長突細胞。調控序列或元件的實例包括但不限于啟動子、沉默子、增強子和絕緣子序列。在一些實施方式中，適用于本發明的調控序列(如啟動子)包括組成型啟動子、強啟動子(例如CMV啟動子)、誘導型啟動子和組織特異性或細胞特異性啟動子(例如優先促進在少數組織或細胞類型中(例如眼部組織、視網膜、視網膜細胞、光感受器細胞等)表達的啟動子)。可以在本發明的基因遞送載體中使用任何一種調控序列，以用于感興趣的光敏蛋白的合適水平或模式的表達。所述調控序列通常源自真核調控序列。在一些實施方式中，使用非細胞特異性調控元件。在一種實施方式中，所述啟動子包含(從5'至3')病毒增強子(CMV即時早期增強子)和β-肌動蛋白啟動子(牛或雞 β -肌動蛋白啟動子-外顯子1-內含子1元件)。在具體的實施方式中，所述啟動子包含 (從5'至3' )CMV即時早期增強子(381bp)/牛或雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子外顯子 1-內含子l(1352bp)元件，本文統稱為“CBA啟動子”(圖7)。在一些實施方式中，使用病毒載體(如AAV)將編碼光敏蛋白的核酸遞送至細胞，所述AAV攜帶由非細胞特異性啟動子和/或其他調控序列調控的表達DNA產物的經選擇的光敏轉基因編碼DNA。在一些相關的實施方式中，所述非細胞特異性啟動子為通用啟動子，如基于泛素的啟動子，例如泛素C啟動子。在其他實施方式中，使用病毒載體(如AAV)將光敏蛋白遞送至感興趣的細胞類型或組織類型，所述AVV攜帶由非細胞特異性啟動子和/或其他調控序列調控的經選擇的光敏轉基因編碼DNA，該DNA在受試者的經選擇的視網膜細胞中表達DNA產物。在具體的實施方式中，通過使用被設計到載體中的特異性啟動子核苷酸序列和/或其他調控區(如沉默子、增強子或絕緣子序列)，將表達靶定至視網膜中特定類型的細胞。在一些實施方式中，在不同的細胞群中使用不同的調控序列來驅動不同改造基因的表達。在其他實施方式中，使用視網膜雙極細胞特異性調控序列，如啟動子、增強子、沉默子和絕緣子序列。在具體的實施方式中，靶定ON雙極細胞。在其他實施方式中，靶定OFF 雙極細胞。在其他實施方式中，靶定視桿雙極細胞。在其他實施方式中，靶定視錐雙極細胞。在一種實施方式中，使用可操作地連接至GRM6 (代謝型谷氨酸受體6，mGluR6)調控序列或其片段的光敏蛋白來靶向光敏蛋白在ON雙極細胞中的特異性表達，所述光敏蛋白如 ChRU ChR2、VChRU ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。在一種實施方式中，利用全長mGluR6調控序列。
在另一實施方式中，使用可操作地連接至mGluR6調控序列片段的光敏蛋白來靶向光敏蛋白在ON雙極細胞中的特異性表達，所述光敏蛋白如ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體 / 嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥! 、 eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體。在具體的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段為圖6 中所示的序列。在相關的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段基本上與圖6中所示的序列相同，或者與圖6中所示的序列約60%相同或約70%相同或約80%相同或約90%相同或約95%相同。許多已知啟動子太大而不能裝配到AAV的基因組中。事實上，mGluR6的原始細胞特異性調控序列(Dhingra、2008)太大(大約10.5Kb)而不能在AVV中使用。在本發明優選的實施方式中，使用mGluR6調控序列片段，它小得足以在AAV介導的遞送中使用。在相關的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段長度為少于約2000個堿基對、少于約1000個堿基對、少于約750個堿基對、少于約500個堿基對、少于約250堿基對或少于約100個堿基對。在另一相關的實施方式中，所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示序列的變體。在另一實施方式中，使用可操作地連接至GNAOl (鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白質)，α激活活性多肽0)調控序列的光敏蛋白來靶向光敏蛋白在ON雙極細胞中的特異性表達，所述光敏蛋白如 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2 C128S,ChR2 C128T,ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01記？、恥冊、州 冊、黑視蛋白以及它們的變體。在相關的實施方式中，所述調控序列基本上與GNAOl序列相同，或者與GNAOl序列約60%相同或約 70%相同或約80%相同或約90%相同或約95%相同。視網膜雙極細胞和靶定雖然僅是人視覺系統的一小部分，但視網膜是在視覺信號發送至其余視覺系統之前，過濾、放大和調節視覺信號的復雜系統(Wassle 2004)。這個過程大部分發生于內網層 (IPL)中，其中雙極和無長突細胞系統提煉視覺信號成為其主要成分(例如運動、對比度、 分辨率)(Mills 1999 ；Roska 2001)。一些小組當前將ChR2靶定至神經節細胞層，其繞開了所述IPL和無長突細胞系統的處理能力(Bi 2006 ；Greenberg 2007 ；Tomita 2007)。這些小組極少報道行為的變化。大多數視網膜細胞是ON中心型(由于感受野中心內對比度的逐步增加(step increase)而具有增加的發放率)或OFF中心型(由于感受野中心內對比度的逐步減小 (step decrease)而具有增加的發放率)，以一種推挽式抑制模式運行(Wassle 2004)。為了維持所述兩種路徑之間的這種關系，這兩種路徑可以被獨立地驅動。從雙極細胞至神經節細胞的信息傳送的ON和OFF通道通過在內核層中的抑制性無長突細胞的網絡被部分地調控(Roska 2001)。這種雙極-無長突網絡形成信息的臨時區別平行通道例如，持續活性神經元在整個光步驟(light step)中維持活性，而短暫活性神經元僅在開啟或關閉時具有活性。這些響應的不同模式決定了視覺信息亮度、形狀、邊緣和運動(Wassle 2004)。在一些實施方式中，視網膜神經節細胞的突觸前細胞被遺傳性地靶向，以維持這些通道的本能和引起自然的神經節細胞發放。在一些實施方式中，視網膜雙極細胞(例如ON或OFF視網膜雙極細胞；視桿和視錐雙極細胞)被遺傳性地靶向。靶向視網膜雙極細胞可允許視網膜響應外部光，并且更重要地，甚至是在缺乏天然的光感受器時，傳送有意義的圖像信息至大腦。
可被治療的病癥在一些實施方式中，本發明提供了治療患疾病或障礙的受試者的方法。可以利用本文所描述的組合物和方法來治療中樞和外周神經系統疾病和障礙。一方面，利用本發明的組合物和方法來治療光感受器疾病。光感受器疾病(如色素性視網膜炎(RP)和年齡相關性黃斑變性(ARMD))導致全世界1500萬人失明(Congdon 2004 ；Chader 2002)，數量隨著人口年齡增長而增加。曾有嘗試通過基因替代療法或細胞移植來恢復基本視覺功能(Acland 2001, Acland 2005, Batten 2005, Pawlyk 2005, Aguirre 2007, MacLaren 2006)。然而，當前的方法基本上限于潛在影響的范圍和程度，因為他們試圖以一次一種(one-at-a-time)為基礎機械地糾正不同的遺傳通路(Pimzo 2007)。光感受器疾病在遺傳上是多種多樣的，具有超過160種不同的突變導致退化(Pimzo 2007)。 還有利用植入于人類受試者中的急性、半急性和長期視網膜假體來進行電刺激的努力(de Balthasar, 2008 ；Horsager，2009)。他們已顯示出初步的進展，但是為基因非特異性的；電刺激僅提供總的特異性并且不加選擇地驅動由獨特的細胞類型介導的視覺信息通道。激活視網膜神經元需要大的圓盤電極(至少是視網膜神經節細胞直徑的20倍)，導致以非選擇的方式刺激視網膜廣闊區域，極大限制了可達到的視覺分辨率(Winter 2007)。在這方面， 本發明的組合物和方法由以下組成引入編碼光敏蛋白的基因以在二級神經元(例如雙極細胞)中誘導光敏性，所述光敏蛋白例如是ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體，所述基因是在調控元件(例如GRM6)的控制下，使用具有單個酪氨酸突變成苯丙氨酸的病毒載體(如AAV8)來遞送的。這些光敏蛋白的活化可以由環境光或通過光遞送裝置(如圖13所描述的護目鏡)控制。本發明的方法可以用于治療(例如在癥狀發作之前或之后)易感性受試者或診斷為具有各種眼部疾病的受試者。所述眼部疾病可能是由環境因素(例如化學物質損傷、熱損傷等)、機械損傷(例如由于事故或手術的損傷)或者遺傳因素導致的結果。患有病癥的受試者可能單眼或雙眼感染，并且可根據本發明對感染的眼部或者由于這種病癥在受試者另一感染的眼部存在而處于光感受器變性危險的眼部給予治療。本發明提供的方法通常包括眼內給予(例如通過視網膜下注射或通過玻璃體內注射)基因遞送載體的步驟，所述基因遞送載體將光敏蛋白的表達導引至眼部，從而治療、 預防或抑制眼部疾病的發作或發展。如本文所使用，應當理解術語“治療、預防或抑制”是指以統計學上顯著的方式改變疾病發作、過程或發展。可根據本發明治療的另一種病癥為年齡相關性黃斑變性(AMD)。所述黃斑為包含中央凹的視網膜中心附近的結構。視網膜的此特化部分負責高分辨率視覺，允許諸如閱讀的行為。AMD中的中央視覺損失是破壞性的。黃斑的變性變化(黃斑病變)幾乎可發生在一生中的任何時間，但是年老階段更普遍。由于復發性脈絡膜新生血管形成，常規治療是短效的。AMD有兩種主要的病理過程，脈絡膜新生血管形成(CNV)和黃斑性光感受器細胞死亡。可根據本發明的方法治療的特別感興趣的示例性病癥包括但不必須限于視網膜色素變性(RP)、糖尿病視網膜病變和青光眼，青光眼包括開角型青光眼(例如原發性開角型青光眼)、閉角型青光眼和繼發性青光眼(例如色素性青光眼、假性剝脫性青光眼以及由外傷和炎癥性疾病導致的青光眼)。可根據本發明治療的進一步示例性病癥包括但不必須限于視網膜剝離、年齡相關或其他黃斑病變、光視網膜病變、手術引發的視網膜病變、中毒性視網膜病變、早產兒視網膜病變、由眼部外傷或穿透性損傷引起的視網膜病變、遺傳性視網膜變性、手術引發的視網膜病變、中毒性視網膜病變、由眼部外傷或穿透性損傷引起的視網膜病變。根據本發明治療的感興趣的具體示例性遺傳病癥包括但不必須限于 Bardet-Biedl綜合征(常染色體隱性)；先天性黑朦(常染色體隱性)；視錐細胞或視錐-視桿細胞變性(常染色體顯性和χ-連鎖形式)；先天性靜止性夜盲癥(常染色體顯性、 常染色體隱性和X-連鎖形式)；黃斑變性(常染色體顯性和常染色體隱性形式)；視神經萎縮(常染色體顯性和χ-連鎖形式)；視網膜色素變性(常染色體顯性、常染色體隱性和 X-連鎖形式)；綜合征性或系統性視網膜病變(常染色體顯性、常染色體隱性和χ-連鎖形式)；以及Usher綜合征(常染色體隱性)。另一方面，利用本發明的組合物和方法來治療外周損傷、疼痛感或慢性疼痛。長時間的疼痛感(疼痛)可能引起慢性疼痛，并且可能由身體中的內臟、肉體或神經結構的損傷或疾病而引起。雖然用于神經性疼痛的藥物治療范圍在過去十年已增加，但許多患者并沒有得到有效鎮痛，甚至有效的藥物經常產生不期望的副作用。P物質(SP)與疼痛感有關，它將關于組織損傷的信息從外周受體傳輸到中樞神經系統以轉變為痛覺。已有理論表明，它與纖維肌痛有關。對由NKl和NK2拮抗劑中心給藥引起的有害刺激的響應閾值的降低表明了 P物質在疼痛感中的作用。在缺失SP/NKA的突變小鼠中，由機械、熱和化學物質刺激肉體和內臟組織引起的疼痛行為減少。在一種實施方式中，使用NpHR或eNpHR，光敏蛋白能抑制由于外周損傷或慢性疼痛而過度活躍的神經元(即P物質表達外周神經元)的活性。使用P物質啟動子序列，NpHR/eNpHR可被遺傳性地靶定至P物質表達細胞。在另一實施方式中，光敏蛋白增強由于外周損傷或慢性疼痛而失活的神經元的活性。在另一方面，利用本發明的組合物和方法來治療脊髓損傷和/或運動神經元病。 脊髓損失可導致脊髓病或白質和有髓纖維束損傷，有髓纖維束將感覺和運動信號傳送到和傳送出腦。它也可能損傷脊柱中央部分的灰質，導致中間神經元和運動神經元的節段損失 (segmental loss)。脊髓損傷可能發生自許多原因，包括但不限于外傷、腫瘤、缺血、發育異常、神經發育性疾病、神經退行性障礙或血管畸形。在一種實施方式中，光敏蛋白激活受損的神經回路以恢復運動或感覺功能。在一種具體的實施方式中，所述元件發揮作用以允許自主和內臟功能的控制。在其他實施方式中，所述元件發揮作用以允許肉體骨骼功能的控制。尿的儲存和排泄的神經控制是復雜的，并且功能失常可能難以治療。對于患難治性癥狀的人的一種治療是使用植入電極和植入脈沖發生器對骶神經根進行持續的電神經刺激。 然而，這種神經根的刺激可能導致許多不同的并發癥或副作用。通過基因靶向工具能夠直接控制骶神經將非常有益。在一種實施方式中，ChR2和NpHR都可以表達于這種神經中來控制膀胱的存儲和排泄。在另一方面，利用本發明的組合物和方法來治帕金森(Parkinson' s)病。帕金森病屬于被稱為運動障礙的一類病癥。它們的特征是肌肉僵化、顫動、身體運動慢化(運動遲緩)以及在極端情況下，身體運動喪失(運動不能)。主要癥狀是由基底神經節對運動皮質的刺激降低導致的，這通常由多巴胺的形成和作用不足引起，多巴胺產生于腦的多巴胺能神經元中。帕金森病既是慢性又是進行性的。與諸如丘腦切開術和/或蒼白球切開術的損傷性技術相比，深部腦刺激(DBQ是用于晚期帕金森病(PD)的有效手術治療法，在發病率-死亡率和生命質量方面具有顯著的優勢。具有嚴重靜止性震顫、對常規藥物治療無響應或者具有運動并發癥的患者需要該治療方法。最常見報道的在手術中和手術后期的并發癥是程序中止、錯放導線(misplaced leads)、顱內出血、突然發作和硬件并發癥(hardware complication)，而長期看來，癥狀可能包括高度認知功能障礙、精神病和輕微語言問題。事實上，這種治療的方法將通過能夠在給定區域內靶向特異性細胞類型來避免這些副作用而改進。在一種實施方式中，光敏蛋白特異性激活多巴胺能回路。在另一特定方面，利用本發明的組合物和方法來治療癲癇癥和突然發作。癲癇癥是經常以突然發作為特征的神經病癥。這些突然發作是由于腦中異常、過量或異時的神經元活動導致的短暫征兆和/或癥狀。即使有最好的可利用的藥物，患癲癇癥的人超過30% 不能控制突然發作。癲癇癥并不是單一的障礙，而是相當于具有許多不同癥狀的一組綜合病癥，但是全部涉及腦中短暫的異常電活動。最近在小規模的初步研究中已證明，在不同的丘腦核和內側顳葉結構中的急性深部腦刺激(DBQ是有效的。關于合理靶標和刺激參數的循證信息很少。在長期隨訪期間，扁桃體海馬DBS已導致突然發作次數和間歇EEG異常的顯著降低。來自初步研究的數據表明，用于癲癇癥的慢性DBS可能是可行、有效和安全的過程。此外，能夠遺傳學上靶向激活細胞的特異性亞群將提高治療質量并使整體副作用最小化。在具體實施方式
中，利用所述光敏蛋白改變在這些腦區域深處的、導致突然發作的異時電活動。在另一方面，利用本發明的組合物和方法來實現用于疾病預防、治療和改善的植入藥物或疫苗存儲的光刺激釋放。在另一方面，利用本發明的組合物和方法來治療神經退行性疾病，所述神經退行性疾病選自但不限于酒精中毒、亞歷山大(Alexander' s)病、阿爾珀斯(Alper' s) 病、阿爾茨海默(Alzheimer' s)病、肌萎縮性側索硬化癥、共濟失調毛細血管擴張癥、 巴滕(Batten)病(又被稱為Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、牛腦海綿狀病 (BSE)、慢性疼痛、卡那文(Canavan)病、科凱恩(Cockayne)綜合征、皮質基底核退化癥、克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病、亨廷頓(Huntington ‘ s)病、HIV-相關癡呆、肯尼迪(Kennedy' s)病、克拉伯(Krabbe' s)病、路易(Lewy)體癡呆、馬查多-約瑟夫 (Machado-Joseph)病(脊髓小腦共濟失調3型)、多發性硬化、多系統萎縮、發作性睡病、 神經疏螺旋體病(Neuroborreliosis)、中白金森病、佩一梅(Pelizaeus-Merzbacher)疾病、皮克(Pick' s)病、原發性側索硬化、朊病毒O^ion)病、雷夫蘇姆(Refsum' s)病、 桑德霍夫(Sandhoff' s)病、希爾德(Schilder' s)病、脊髓亞急性聯合變性合并急性貧血(Subacute combined degeneration of spinal cord secondary to Pernicious Anaemia)、精神分裂癥、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten 病(又被稱為巴滕(Batten) 病)、脊髓小腦共濟失調(具有不同特征的多種類型)、脊髓性肌萎縮、進行性核上性癱瘓 (Steele-Richardson-Olszewski 病)以及脊髓瘦(Tables dorsalis)。在另一方面，利用本發明的組合物和方法來治療神經發育疾病，所述神經發育疾病選自但不限于注意缺陷多動障礙(ADHD)、注意缺陷障礙(ADD)、精神分裂癥、強迫癥 (OCD)、精神發育遲滯、自閉癥譜系障礙(ASD)、腦性麻痹、脆性X綜合征、唐氏(Downs)綜合
24征、雷特(Rett's)綜合征、阿斯伯格(Asperger's)綜合征、威廉斯(Williams-Beuren)綜合征、兒童崩解癥、分節發音障礙、學習障礙(即閱讀或計算)、閱讀障礙、表達性語言障礙以及混合性感受-表達性語言障礙、言語或表演能力。由異常的神經發育過程導致的疾病還可以包括但不限于雙極障礙、厭食癥、普遍抑郁、癲癇發作、強迫癥(OCD)、焦慮、磨牙癥 (bruixism)、快樂木偶(Angleman’s)綜合征、攻擊性、爆發性發作(explosive outburst)、 自傷、創傷后壓力、品行障礙、妥瑞(Tourette’s)癥、制式行為疾患(stereotypic movement disorder)、情緒病、睡眠呼吸暫停、不安腿綜合征、睡眠障礙(dysomnias)、妄想型人格障礙、分裂樣(schizoid)人格障礙、分裂型(schizotypal)人格障礙、反社會型人格障礙、邊緣型人格障礙、表演型人格障礙、自戀型人格障礙、逃避型人格障礙、依賴型人格障礙、反應性依戀障礙；分離性焦慮障礙；對立違抗性障礙；性交疼痛、縱火癖、盜竊癖、拔毛發癖、賭博癖、異食癖、精神官能癥、酒精相關障礙、安非他明相關障礙、可卡因相關障礙、大麻濫用、 阿片相關性障礙、苯環利啶(phencyclidine)濫用、煙草使用障礙、神經性暴食癥、妄想癥、 性障礙(sexual disorder)、恐懼癥、身體化癥、遺尿、大便失禁、文字表達障礙、表達性語言障礙、精神發育遲滯、數學障礙、短暫性抽動障礙、口吃、選擇性緘默癥、克羅恩(Crohn' s) 病、潰瘍性結腸炎、細菌過度生長綜合征、碳水化合物不耐癥、乳糜瀉、傳染病和感染癥、腸內引流式胰腺移植、短腸綜合征、熱帶性口炎性腹瀉、惠普爾(Whipple' s)病、阿爾茨海默病、帕金森病、ALS、脊髓性肌萎縮和亨延頓病。關于神經發育障礙的進一步實例、討論和信息可以例如通過國家精神衛生研究所(National Institute of Mental Health)神經發育障礙分部(萬維網網址nihm.nih.gov/dptr/b2-nd.cfm)找到。關于神經發育疾病的其他信息還可以例如在 Developmental Disabilities in Infancy and Childhood Neurodevelopmental Diagnosis and Treatment, Capute and Accardo, eds. 1996,Paul H Brookes Pub Co. ；Hagerman,Neurodevelopmental Disorder :Diagnosis and Treatment, 1999, Oxford Univ Press ；Handbook of Neurodevelopmental and Genetic Disorders in Children, Goldstein and Reynolds, eds. , 1999, Guilford Press ；Handbook of Neurodevelopmental and Genetic Disorders in Adults, Reynolds and Goldstein, eds. , 2005, Guilford Press ；以及Neurodevelopmental Disorders, Tager-Flusberg, ed., 1999，MIT Press 中找到。治療的評估如本文所描述，本發明的治療效果可使用本領域內已知的方法，以各種方式評估。 例如，可以根據常規方法測試受試者的視力。這些常規方法包括但不必須限于視網膜電流圖(ERG)、聚焦ERG、用于視野的測試、用于視敏度的測試、光學相干斷層掃描(OCT)、眼底照相、視覺誘發電位(VEP)以及瞳孔測量法。在其他實施方式中，可以從行為上評估所述受試者。總體來說，本發明用于受試者視力的維持(例如預防或抑制由于光感受器變性而引起進一步的視力減退)、減慢視力減退發作或進程，或者在一些實施方式中，用于治療之前相對于受試者視力的改良視力。給藥的方法本發明的基因遞送載體可以通過各種途徑遞送至眼部。它們可通過局部施用至眼部或通過眼內注射至例如玻璃體(玻璃體內注射)或視網膜下(視網膜下注射)光感受器之間的(inter-photorec印tor)空間而被眼內遞送。可選擇地，它們可通過插入或注射至
25眼部周圍的組織而被局部遞送。它們可通過口服途徑或通過皮下、靜脈內或肌肉注射而被全身遞送。可選擇地，它們可通過導管或通過植入物而被遞送，其中這種植入物由多孔、無孔或凝膠材料制成，包括膜(如硅橡膠膜或纖維)、可生物降解聚合物或蛋白質的材料。所述基因遞送載體可以在病癥發作之前被遞送以預防其出現，例如在眼部手術期間，或者緊接在病理病癥發作之后，或者急性或長期病癥出現期間。在另一實施方式中，所述內界膜(ILM)被分解以實現遞送。ILM是視網膜和玻璃體之間的邊界，由星形膠質細胞和米勒細胞腳板形成。在非人靈長類和人類中，ILM厚且提供視網膜的基本屏障。事實上，使用玻璃體內注射，大部分病毒顆粒不能轉導視網膜細胞。在一種實施方式中，為提高轉導效率，進行ILM剝除，包括實施包括剝除一小部分ILM的手術程序。在另一實施方式中，為提高轉導效率，ILM屏障可以部分或全部分解，包括使用酶技術和一種或一種以上酶。在一種實施方式中，ILM被保留以限制光敏蛋白對黃斑的治療效果。在另一實施方式中，使用本文所描述的ILM剝除方法和/或ILM酶消化方法以實現光敏蛋白更廣泛的分布。可以修飾所述基因遞送載體以增強血-視網膜屏障的滲透。這種修飾可以包括增加含有基因遞送載體的藥物制劑的親脂性。所述基因遞送載體可以單獨或聯合遞送，并且可以與藥學上可接受的載體一起遞送。理想地，這種載體將增強穩定性和/或遞送特性。本發明還提供了包含活性因子或其片段或其衍生物的藥物組合物，其可以使用合適的載體(如脂質體、微粒或微膠囊)給藥。 在本發明的各種實施方式中，使用這種組合物以實現活性組分的持續釋放可能是有用的。在治療特定障礙或病癥中有效的基因遞送載體量(例如病毒顆粒的數量)和表達的光敏蛋白量可能依賴于所述障礙或病癥的性質和各種患者特異性因素，并且可以通過標準臨床技術確定。在一種實施方式中，所述基因遞送載體被施用于眼部，并根據要治療、預防或抑制的疾病類型以及疾病的程度眼內施用于眼內的各種位置。合適的位置實例包括視網膜(例如對于視網膜疾病)、玻璃體或者視網膜內或附近的其他位置、眼內或附近的其他位置。人視網膜被安排于相當精確的鑲嵌結構(mosaic)中。在中央凹內，所述鑲嵌結構為視錐細胞的六邊形聚集(packing)。在中央凹外，視桿細胞打破視錐細胞的緊密的六邊形聚集，但是仍然允許視錐細胞更加均勻隔開的、有組織的結構被多圈視桿細胞環繞。因此，在人視網膜中不同的光感受器群的密度方面，很明顯視錐細胞密度在中央凹小凹處最大，而在中央凹外部至外周視網膜迅速降低至相當均勻的密度(參見0Sterberg，G. (1935) Topography of the layer of rods and cones in the human retin. Acta Ophthal. (suppl. )6,1-103 ；同樣參見 Curcio, C. Α. , Sloan, K. R. , Packer, 0. , Hendrickson, Α. Ε. and Kalina, R. Ε. (1987)Distribution of cones in human and monkey retina individual variability and radial asymmetry. Science 236，579—582)。本領域技術人員可以易于接近期望的視網膜部分或眼的其他部分(參見 Generally Medical and Surgical Retina :Advances，Controversies and Management， Hilel Lewis, Stephen J. Ryan, Eds.，medical- “ illustrator，Timothy C. Hengst. St. Louis :Mosby，cl994.xix,534 ；同樣參見 Retina，Stephen J. Ryan, editor inchief, .2nd ed. , St. Louis, Mo. :Mosby、cl994.3v. (xxix,2559)。在一種實施方式中，應用于視網膜的特異性病毒載體的量一律相當小，因為眼部為相對包含的結構，并且試劑直接注入其中。需要注射的載體的量由所選的用于治療的靶向細胞的眼內位置來確定。要轉導的細胞類型可以由要治療的具體疾病實體來確定。例如，單獨20微升體積(例如包含約IO13個物理顆粒滴度/ml rAAV)可以用于視網膜下注射來治療人眼部的黃斑和中央凹。可以使用50 100微升的更大注射來遞送 rAAV至視網膜區域的實質性部分，或許是全部視網膜，這取決于所述顆粒橫向擴散的程度。100微升注射可以提供幾百萬活性rAAV顆粒至視網膜下空間。這種計算基于IO13 個物理顆粒/毫升的滴度。這種滴度下，估計1/1000至1/10,000的AAV顆粒是感染性的。 視網膜解剖學限制了在視網膜下空間(SRQ中可能的注射體積。假設最大注射量100微升， 這可在SRS中提供IO5個至IO9個rAAV的感染滴度。這將具有用單次注射感染在整個人視網膜中全部大約150 X IO6個光感受器的潛力。在黃斑變性或其他局部視網膜病變的情況下，集中應用于中央凹或黃斑的更小注射體積可以充分轉染受疾病感染的整個區域。根據具體的應用，可以遞送至少IO3、IO4、105、IO6、107、IO8、IO9、IO10、IOllUO12,1013、 IO14個或更多的顆粒至感興趣的組織。可選擇地，基因遞送載體可以通過眼內注射至玻璃體而被遞送至眼部，例如來治療由于細胞凋亡導致的與青光眼有關的視網膜神經節細胞損失。在青光眼的治療中，要轉導的主要靶細胞是主要受感染的視網膜神經節細胞和視網膜細胞。在這種實施方式中，所述基因遞送載體的注射體積可以實質性地更大，因為體積并不受視網膜下空間的解剖學的限制。在這種情況下，可接受的劑量范圍可以為約25微升至1000微升。藥物組合物基因遞送載體可以制備成適合用于給藥的藥學上可接受的組合物。一般地，這種藥物組合物包含一定量的基因遞送載體并結合了藥學上可接受的載體或賦形劑，基因遞送載體的量適合將編碼光敏蛋白的多核苷酸遞送至眼部細胞，用于表達治療有效量的光敏蛋白。優選地，所述藥學上可接受的載體適合用于眼內給藥。示例性的藥學上可接受的載體包括但不必須限于鹽水或緩沖鹽水溶液(例如磷酸鹽緩沖液)。本領域內熟知各種藥學上可接受的賦形劑。本文所使用的“藥學上可接受的賦形劑”包括任何一種與組合物的活性成分結合時，允許該成分保留生物活性的材料，優選不會導致與受試者的免疫系統產生破壞性反應或者不利地影響給藥位置(例如眼內)周圍的組
幺口
/Ν ο示例性的藥物載體包括非水溶液、懸浮液和乳劑的無菌液。實例包括但不限于任何一種標準的藥物賦形劑，如鹽水、緩沖鹽水(例如磷酸緩沖鹽水)、水、乳劑(如油/水乳劑)以及各種類型的潤濕劑。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、透明質酸、植物油(如橄欖油)以及可注射的有機酯(如油酸乙酯)。水載體包括水、乙醇/水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer' s)葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化林格氏油或固定油。靜脈內載體可以包括流體和營養補充劑、電解質補充劑(如基于林格氏葡萄糖的電解質補充劑)等。本發明的基因遞送載體組合物還以使用本領域內熟知的手段凍干，用于根據本發明的后續復原和應用。當要遞送的載體沒有被封裝于病毒顆粒中(例如作為“裸”多核苷酸)時，用于脂質體遞送的制劑以及包含微囊化的多核苷酸的制劑，也可能是令人感興趣的。包含賦形劑的組合物通過熟知的常規方法配制(參見，例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Chapter 43,14th Ed. , Mack Publishing Col, Easton PA 18042，USA)。一般地，所述藥物組合物可以制成各種形式，優選與眼內給藥相容的形式。穩定劑、濕潤和乳化劑、用于改變滲透壓的鹽或用于確保適當PH值的緩沖液也可以任選地存在于所述藥物組合物中。藥物制劑中基因遞送載體的量可以廣泛變化，即按重量計，從少于約0. 1% (通常為或至少為約2% )至多達20%至50%或更多，并且可以根據所選給藥的特定模式主要按流體體積、粘性等選擇。所述藥物組合物可以包含適合用于給藥的其他試劑，這些其他試劑可具有與要遞送的光敏蛋白(例如 ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A、ChR2 C128S、ChR2 C128T、ChRl_ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01記？、恥冊、州 冊、黑視蛋白以及它們的變體)相似的藥理活性，甚至與其相比具有附加的藥理活性。試劑盒本發明還提供了用于實施本發明方法的包含各種材料的試劑盒。在一種實施方式中，所述試劑盒包含編碼光敏蛋白多肽(例如ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A,ChR2 C128S, ChR2 C128T, ChRl_ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF, ChF、ChIEF, NpHR、eNpHR、黑視蛋白以及它們的變體)的載體，所述載體適合用于遞送至受試者，尤其是受試者的眼部，并且適合來提供光敏多肽在眼部細胞的表達，尤其是哺乳動物細胞中。所述試劑盒可以包括在無菌瓶中的載體，可以被標記用途。所述載體可以提供于藥物組合物中。在一種實施方式中，所述載體包裝于病毒中。所述試劑盒可進一步包括適合與小瓶一起使用的針和/或注射器， 或者可選擇地，包括含有載體的針和/或注射器，該針和/或注射器優選為無菌的。在另一實施方式中，所述試劑盒包括適合用于將載體遞送至眼部的導管，所述導管可以任選地附著于用于載體遞送的注射器上。所述試劑盒還可包括使用說明，例如關于給藥途徑、劑量、 給藥方案、給藥位置等的說明。裝置圖12C中的數據示出光敏蛋白的遞送可以在正常視力范圍內進行。在一些實施方式中，為了更大的效力，可以使用內部或外部裝置。在一種實施方式中，諸如護目鏡之類的外部裝置可以用于光的產生和/或放大。在具有部分視力的受試者正接受治療的實施方式中，即受試者的光感受器僅部分受損并且光敏蛋白(如ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF、ChF、ChlEF、NpHR、eNpHR、 黑視蛋白以及它們的變體)正被遞送的治療中，可以調節刺激以便存活的和/或健康光感受器未被光產生/放大裝置過度驅動。在各種實施方式中，限制光產生/放大裝置的過度驅動可以通過以下方式實現i)均勻刺激，但是通過植入的或外部隱形眼鏡型局部太陽眼
28鏡(光感受器上著色、光敏蛋白轉導區域上光亮)遮蔽存活的或健康的光感受器細胞使其不受明亮的光線刺激；ii)調節刺激強度以匹配要刺激的細胞類型；或者iii)調節刺激至接近視覺動態范圍上限。在一種實施方式中，植入內部光發生裝置。在另一實施方式中，與所述裝置聯合或獨立地植入保護性的光學鏡型或隱形眼鏡型屏障。在具體實施方式
中，這種光學鏡或隱形眼鏡保護光感受器不受光刺激。在具體的實施方式中，鏡片使光感受器上著色和光敏蛋白轉導區域上光亮。在一些實施方式中，利用頭部安裝的外部裝置或眼鏡。在一些實施方式中，當自然或環境光未能觸發所述光敏元件達到期望的程度時，提供額外的光生產或產生源，如LED 陣列/激光系統。在一些實施方式中，所述外部眼鏡可以附加包括相機和圖片處理部件，用于所呈現圖像的過濾、增強、處理和分解。圖13圖示了具有相聯合的光產生元件(LED陣列 /激光系統)的護目鏡樣裝置，該光產生元件可以觸發光敏蛋白的表達。在一種實施方式中，示例性相機系統包括至少三種主要組件1)小的眼鏡內置相機，2)圖像處理部件，和幻包括LED和/或激光系統的光遞送系統。所述相機可以為單鏡頭相機或為雙相機系統，雙相機系統有可能提供雙目成像和深度信息。所述相機可以捕獲可見光或紅外光。所述相機可以適應各種照明條件或可以被固定。所述圖像處理部件(IPU) 可以提供任何數量的信號轉化，包括放大、增加或降低對比度、從運動恢復結構、邊緣增強或時間濾波(即整合)。此外，可以利用顯著性算法以便僅增強視野內的某些物體(例如移動的汽車、門口)，而濾出較不重要的物體(例如云)。所述LED和/或激光照明陣列系統可以包括高密度LED陣列或掃描激光系統，所述掃描激光系統由一個(1)或更多個激光器組成。光的位置可以是固定的，也可以移動。例如，使用眼移動跟蹤裝置作為輸入，光相對于眼部的定位可以隨著眼移動而移動。這圖示于圖13中。在其他相關的示例性實施方式中，圖像增強裝置，如Telesens0ry(http:// www. telesensory. com)所提供的圖像增強裝置，可以與如 Microvision (http //www. microvision. com/milprod. html)所開發的視網膜掃描裝置(RSD)結合，以提供能夠將明亮的、增強的圖像直接遞送至具有受損視力的患者的視網膜的頭戴設備。簡而言之，RSD投射圖像至視網膜上使得個體無需額外屏幕或顯示器就能看到大的全運動圖像。因此，通過在具有受損視力的個體視網膜上直接投射增強圖像，可能會改善被認為是失明或接近失明的個體的視力。雖然本文示出和描述了本發明的一些實施方式，對于本領域技術人員來說顯而易見的是這些實施方式僅以實例的方式提供。在不背離本發明的前提下，對于本領域技術人員來說現在將出現許多變體、變化和取代。應當理解的是，在實施本發明時可以利用本文所描述的本發明的實施方式的各種替代物。實施例實施例1 注射方法根據視覺與眼科研究協會(Associationof Research in Vision and Ophthalmology)的視覺與眼科研究動物應用聲明和佛羅里達大學(University of Florida)動物管理和使用委員會 Gnstitutional Animal Care和Use Committee)的指導原則，操作關于動物的所有程序。
對于玻璃體內注射，將小鼠用氯胺酮(ketamine，72mg/kg)/甲苯噻嗪(xylazine， 4mg/kg)通過腹膜內注射麻醉。麻醉之后，使用配有33號針規的平端針的Hamilton注射器。針穿過鞏膜，在赤道處臨近角膜緣進入 玻璃體腔。注射在直接觀察到所述針在玻璃體腔中部時進行。遞送的總體積為1. 5μ 1，包含所測試AAV載體的不同濃度。對于視網膜下注射，在麻醉之前1小時，用阿托品(atropine)滴眼劑擴大小鼠的眼睛，接著局部給予2. 5%苯腎上腺素。然后將小鼠用氯胺酮(7aiig/kg)/甲苯噻嗪(^ig/ kg)通過腹膜內注射麻醉。用30 1/2號針規的一次性針穿過角膜在瞳孔內形成小孔，并且通過角膜孔將在Hamilton注射器中的33號針規的平端鈍針引入至視網膜下空間并遞送 1. 5μ 1 的 AAV。AAV 載體的一般滴度為 1. 3 X IO12 至 3. 0 X IO130_仿丨丨2 :f帝細攤測_草雙擁胞調AAV血娜1、2、5、7、8雙9本實施例進行了用于視網膜雙極細胞最佳轉導的已知和被表征了的病毒載體的篩選。將攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的AAV血清型1、2、5、7、8和9分別視網膜下注射4周大 Wrdl小鼠。Rdl純合子小鼠攜帶rdl突變，并且在這些小鼠中視桿細胞光感受器退化開始于出生后(P)IO日左右，且到P21日差不多完成。在強的非細胞類型特異性啟動子CBA(CMV 即時早期增強子與牛肌動蛋白啟動子加上內含子1-外顯子1銜接點的融合)的控制下放置GFP。1個月之后，測試小鼠的GFP表達。用AAV7注射的小鼠的PKC α抗體雙重標記顯示轉導的細胞最可能是殘留(無外段)的光感受器，而不是雙極細胞。然后在8周大的小鼠中進行AAV7視網膜下注射，此時有殘留的光感受器的機會較少。結果發現AAV7在轉導視網膜雙極細胞時非常有效，導致在單次注射后GFP表達于至少75%的全部雙極細胞中(圖9)。這些圖像是在注射之后16周獲得的，其額外地顯示使用AAV7遞送機制的GFP 表達穩定至少4個月。AAV7是可以用于以有效和穩定的方式轉導雙極細胞的血清型。實施例3 用血清型AAV5、AAV2 Y444F突變體和AAV8 Y733F突變體轉導視網膜雙極細胞如圖10所示，將小鼠用1. 5μ 1不同血清型的腺相關病毒(AAV)進行視網膜下(右眼)和玻璃體內(左眼)注射。所測試的血清型包括AAV2、AAV5和AAV8，全部都是傳統野生型血清型。此外，還注射了單個酪氨酸至苯丙氨酸突變的血清型AAV2 Y444F突變體和 AAV8 Y733F突變體，其中444和733分別指示病毒衣殼酪氨酸點突變的位點。病毒包含自身互補型DNA構建體GRM6-ChR2-GFP，其中GRM6為驅動在ON雙極細胞(包括視桿雙極)中的細胞特異性表達的代謝型谷氨酸受體6調控序列，ChR2為治療性光敏蛋白基因，并且GFP 為報告基因。圖10中的圖像顯示GFP(報告基因)的總體表達。這種表達在黑白圖像中顯示為白色。這指示了 ChR2的總體表達，因為ChR2-GFP復合體為融合蛋白。注意在所述INL中 GFP表達的小環，顯示ChR2-GFP蛋白復合體的表達是膜結合的。這些數據顯示具有腺相關病毒構建體的遞送導致ChR2-GFP在全部3只失明小鼠模型(rdl、rdl6和rho-/-)中的強烈表達。這是使用視網膜下注射3種不同的血清型進行的(第1列)。當使用酪氨酸至苯丙氨酸突變體血清型時，使用視網膜下或玻璃體內注射，可能得到在雙極細胞(INL)中的良好表達。然而，野生型血清型需要視網膜下注射來得到雙極細胞的合理轉導；使用野生型血清型的玻璃體內注射不能有效地轉導雙極細胞(第2列)。
實施例4 形成AAV7-GRM6_ChR2以在視網膜On-雙極細胞中津立光敏件mGluR6為G-蛋白偶聯的代謝型谷氨酸受體，即在視網膜中特異性表達于ON雙極細胞中(Tian 2006)。構建所述腺相關病毒血清型7 (AAV7)，mGluR6調控序列片段基因序列(在圖6中示出)GRM6和視紫紅質通道蛋白-2(ChR2)來形成AAV7-GRM6_ChR2構建體。 編碼ChR2和eGFP的cDNA被克隆至mGluR6調控序列片段-SV40最小啟動子的下游(即 3')。未使用IRES;將ChR2和GFP融合。一旦使用病毒遞送機制遞送這種病毒載體構建體并表達，就能在視網膜ON雙極細胞中建立具有高時空分辨率的光敏性。這種方法使用 ChR2類光激活分子來直接使剩下的視網膜神經元對光敏感，從而可恢復視網膜對光學信息的響應。實施例5 :AAV8 突變體 Y733F-GRM6_ChR2 和 AAV8 突變體 Y446F_CBA_ChR2 在視網膜ON-雙極細胞中津立光敏件使用AAV8 (在733位點)的酪氨酸突變型，在雙極細胞特異性啟動子GRM6控制下，以自身互補型結構，可在rdl小鼠中恢復視覺行為效力，如圖11和12所示。圖11圖示在用酪氨酸突變體AAV載體視網膜下注射之后1個月，通過免疫組織化學分析冷凍視網膜切片中EGFP的表達。示例性切片圖示了用血清型2Y444(a)或血清型8 Y733 (b)轉導之后，EGFP熒光在視網膜中的分布和強度。圖像被定向，使得玻璃體面向底部，而光感受器層面向頂部。來自用血清型2Y444視網膜下注射小鼠眼部的光感受器、RPE細胞和神經節細胞中的EGFP熒光。(c)在血清型8 Y733遞送之后，在光感受器、RPE細胞和米勒細胞中的 EGFP熒光。(d)通過使用谷氨酰胺合成酶(GQ抗體的免疫染色米勒細胞突起(紅色)的檢測。(e)合并圖像顯示來自用血清型8 Y733治療的眼部視網膜切片中EGFP熒光(綠色) 和GS染色(紅色)的共定位；(f)校準線ΙΟΟμΜ。gcl，視網膜節細胞層；ipl，視網膜內網層；inl，內核層；onl，外核層；os，外段；rpe，視網膜色素上皮。 使用AAV8 (在446位點)的酪氨酸突變型，在非細胞特異性啟動子CBA(CMV即時早期增強子與牛β-肌動蛋白啟動子加上內含子1-外顯子1銜接點的融合，和ChR2)控制下，以自身互補型結構，可以靶向大部分或全部雙極細胞，并且恢復視覺功能，如圖12所
7J\ ο實施例6 :AAV5-CBA-ChR2在視網膜On雙極細胞中建立光敏性使用AAV5、非細胞類型特異性啟動子CBA(CMV即時早期增強子與牛β -肌動蛋白啟動子加上內含子1-外顯子1銜接點的融合)和ChR2，以自身互補型結構，可以靶向全部雙極細胞，并且恢復視覺功能和行為(圖12)。將治療的小鼠用1. 5 μ 1不同血清型的腺相關病毒(AAV)進行視網膜下(右眼)和玻璃體內(左眼)注射。所測試的血清型包括AAV2、 AAV5和AAV7，全部都是傳統野生型血清型。此外，還注射了所述單個酪氨酸至苯丙氨酸的突變血清型AAV2Y444F突變體和AAV8 Y733F突變體，其中444和733分別指示病毒衣殼的酪氨酸點突變的位點。病毒包含自身互補型DNA構建體GRM6-ChR2-GFP，其中GRM6為驅動在ON雙極細胞(包括視桿雙極細胞)中的細胞特異性表達的調控序列，ChR2為治療性光敏蛋白基因，并且GFP為報告基因。然后對這些小鼠進行水迷宮任務(圖12A)訓練14日，對于野生型小鼠是7日，并且記錄發現目標(具有4X6LED光源的黑色平臺)的時間。圖12B示出經治療的、未治療的和野生型小鼠發現目標所花費的平均時間隨訓練時間的變化。未治療和治療組都包括來
31自rdl、rdl6和rho-/-(不同失明小鼠模型，其具有導致光感受器疾病的不同類型的基因突變，)組的樣本。這些數據證明用ChR2治療的小鼠能夠通過使用視覺信息學習行為任務， 表明諸如ChR2的光敏蛋白具有恢復至少一些視覺功能的能力。 然后在不同光水平下評估動物在任務中的表現。圖12C示出由rdl、rdl6和 rho-/"經治療的、假手術注射(假手術注射小鼠代表未治療的rdl、rdl6和rho-/-的平均值)和野生型小鼠發現目標花費的平均時間隨光強度的變化。這些數據顯示治療的小鼠可以在多種光水平下執行任務，并且它們的表現依賴于所呈現光的量。
權利要求
1.一種重組核酸，其包含可操作地連接至代謝型谷氨酸受體6 (mGluR6)調控序列或其片段的編碼光敏蛋白的核酸。
2.權利要求1所述的核酸，其中所述光敏蛋白選自=ChRUChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥!11 、6恥! 、 黑視蛋白以及它們的變體。
3.權利要求1所述的核酸，其中所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、至少約80%、至少約90%或者至少約95%相同的光敏蛋白。
4.權利要求1所述的核酸，其中所述mGluR6調控序列片段包含少于約1000個、少于約 750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。
5.權利要求1所述的核酸，其中所述mGluR6調控序列或者其片段為mGluR6啟動子或者增強子。
6.權利要求1所述的核酸，所述核酸還包含綠色熒光蛋白。
7.權利要求1所述的核酸，其中所述核酸被包裹于重組腺相關病毒(AAV)的衣殼中。
8.權利要求7所述的核酸，其中所述重組腺相關病毒的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、 AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAV11、AAV12 以及它們的雜合體。
9.權利要求7所述的核酸，其中所述重組腺相關病毒的血清型選自AAV2、AAV5、AAV7、 AAV8以及它們的雜合體。
10.權利要求1所述的核酸，其中所述核酸被包裹于選自下列重組病毒的衣殼中重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。
11.一種載體，其包含編碼光敏蛋白的核酸，所述核酸可操作地連接至代謝型谷氨酸受體6(mGluR6)調控序列或其片段。
12.權利要求11所述的載體，其中所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥!11 、6恥! 、 黑視蛋白以及它們的變體。
13.權利要求11所述的核酸，其中所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、 至少約80%、至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。
14.權利要求11所述的載體，其中所述mGluR6調控序列片段少于約1000個、少于約 750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。
15.權利要求11所述的載體，其中所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示的序列。
16.權利要求11所述的載體，其中所述載體包含重組腺相關病毒(AAV)。
17.權利要求11所述的載體，其中所述載體包含選自以下的重組病毒重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。
18.權利要求16所述的載體，其中所述AAV為的血清型選自AVV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVl 1、AAV12 以及它們的雜合體。
19.權利要求18所述的載體，其中所述AAV包含突變的衣殼蛋白。
20.權利要求19所述的載體，其中所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。
21.權利要求20所述的載體，其中所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、W44F、 Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。
22.權利要求20所述的載體，其中所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。
23.一種治療患有眼部疾病或障礙的受試者的方法，所述方法包括向感染的眼部引入重組腺相關病毒(AAV)，所述重組腺相關病毒(AAV)包含可操作地連接至代謝型谷氨酸受體6調控序列(mGluR6調控序列)或其片段的光敏蛋白。
24.權利要求23所述的方法，其中所述眼部疾病或障礙由光感受器細胞退化引起。
25.權利要求23所述的方法，其中所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥!11 、6恥! 、 黑視蛋白以及它們的變體。
26.權利要求23所述的方法，其中所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、 至少約80%、至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。
27.權利要求23所述的方法，其中所述mGluR6調控序列片段少于約1000個、少于約 750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。
28.權利要求27所述的方法，其中所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示的序列。
29.權利要求23所述的方法，其中所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVll、AAV12 以及它們的雜合體。
30.權利要求四所述的方法，其中所述AAV包含突變的衣殼蛋白。
31.權利要求30所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。
32.權利要求31所述的方法，其中所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、W44F、 Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。
33.權利要求31所述的載體，其中所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。
34.權利要求23所述的方法，其中所述AAV使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/或 ILM剝除引入。
35.權利要求23所述的方法，其中所述AAV被引入至視網膜雙極細胞。
36.權利要求23所述的方法，其中所述方法還包括在眼部外部使用光發生裝置。
37.一種在視網膜雙極細胞中表達外源核酸的方法，所述方法包括向視網膜引入包含可操作地連接至視網膜雙極細胞特異性調控序列的外源核酸的載體，其中所述方法導致至少約25-30%的轉導效率。
38.權利要求36所述的方法，其中所述方法導致至少約40%、50%、60 %、70%、80 %、 或者90%的轉導效率。
39.權利要求36所述的方法，其中所述轉導效率通過定量被感染的視網膜雙極細胞的總數來測定。
40.權利要求36所述的方法，其中所述外源核酸包含光敏蛋白。
41.權利要求40所述的方法，其中所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥!11 、6恥! 、 黑視蛋白以及它們的變體。
42.權利要求40所述的核酸，其中所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、 至少約80%、至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。
43.權利要求36所述的方法，其中所述調控序列包含代謝型谷氨酸受體6調控序列(mGluR6)或其片段。
44.權利要求43所述的方法，其中所述mGluR6調控序列片段少于約1000個、少于約 750個、少于約500個、少于約250個或者少于約100個堿基對。
45.權利要求43所述的方法，其中所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示的序列。
46.權利要求36所述的方法，其中所述外源核酸使用重組腺相關病毒載體(AAV)引入。
47.權利要求46所述的方法，其中所述AAV包含突變的衣殼蛋白。
48.權利要求47所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。
49.權利要求48所述的方法，其中所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、W44F、 Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。
50.權利要求48所述的載體，其中所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。
51.權利要求46所述的方法，其中所述外源核酸使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/ 或ILM剝除引入。
52.權利要求46所述的方法，其中所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVll、AAVl2 以及它們的雜合體。
53.一種引入外源核酸至視網膜細胞核的方法，所述方法包括將包含可操作地連接至視網膜細胞特異性調控序列的外源核酸的載體引入至視網膜細胞，其中所述載體專門設計用來避免泛素介導的蛋白質降解。
54.權利要求53所述的方法，其中所述降解是蛋白酶體介導的。
55.權利要求53所述的方法，其中所述外源核酸包含光敏蛋白。
56.權利要求55所述的方法，其中所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2 C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體 / 嵌合體、ChD、ChEF、ChF、ChIEF、NpHR、eNpHR、 黑視蛋白以及它們的變體。
57.權利要求55所述的核酸，其中所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、 至少約80%、至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。
58.權利要求53所述的方法，其中所述視網膜細胞為視網膜雙極細胞。
59.權利要求58所述的方法，其中所述調控序列包含代謝型谷氨酸受體6調控序列 (mGluR6)或其片段。
60.權利要求59所述的方法，其中所述mGluR6片段少于1000個、少于750個、少于500 個、少于250個或者少于100個堿基對。
61.權利要求59所述的方法，其中所述mGluR6調控序列片段為圖6中所示的序列。
62.權利要求53所述的方法，其中所述載體選自重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。
63.權利要求53所述的方法，其中所述載體為重組腺相關病毒載體(AAV)。
64.權利要求63所述的方法，其中所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVll、AAVl2 以及它們的雜合體。
65.權利要求63所述的方法，其中所述AAV包含突變的衣殼蛋白。
66.權利要求65所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。
67.權利要求66所述的方法，其中所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、Y444F,Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。
68.權利要求66所述的載體，其中所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。
69.權利要求53所述的方法，其中所述載體使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/或 ILM剝除引入。
70.一種轉導視網膜雙極細胞的方法，其包括向視網膜引入包含可操作地連接至調控序列的外源核酸的載體。
71.權利要求70所述的方法，其中所述調控序列為非細胞類型特異性啟動子。
72.權利要求70所述的方法，其中所述調控序列為鳥嘌呤核苷酸結合蛋白α激活活性多肽O(GNAOl)啟動子或者巨細胞病毒(CMV)即時早期增強子與牛β-肌動蛋白啟動子加上內含子1-外顯子1銜接點的融合(CBA、smCBA)。
73.權利要求70所述的方法，其中所述外源核酸包含光敏蛋白。
74.權利要求73所述的方法，其中所述光敏蛋白選自ChRl、ChR2、VChRl、ChR2C128A, ChR2 C128S,ChR2 C128T, ChRl-ChR2 雜合體/嵌合體、010、0^ 、0^、01比？、恥!11 、6恥! 、 黑視蛋白以及它們的變體.
75.權利要求73所述的核酸，其中所述光敏蛋白為ChR2，或者為與ChR2至少約70%、 至少約80%、至少約90%或至少約95%相同的光敏蛋白。
76.權利要求70所述的方法，其中所述載體選自重組腺相關病毒(AAV)、重組逆轉錄病毒、重組慢病毒和重組痘病毒。
77.權利要求70所述的方法，其中所述載體為重組腺相關病毒載體(AAV)。
78.權利要求77所述的方法，其中所述AAV的血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVl 1、AAV12 以及它們的雜合體。
79.權利要求77所述的方法，其中所述AAV包含突變的衣殼蛋白。
80.權利要求79所述的方法，其中所述衣殼蛋白包含突變的酪氨酸殘基。
81.權利要求79所述的方法，其中所述突變的酪氨酸殘基選自Y252F、Y272F、W44F、 Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F 和 Y720F。
82.權利要求80所述的載體，其中所述突變的衣殼蛋白包含酪氨酸殘基突變成苯丙氨酸。
83.權利要求70所述的方法，其中所述載體使用玻璃體內注射、視網膜下注射和/或 ILM剝除引入。
全文摘要
本發明利用將光敏蛋白遞送至感興趣的病變和正常的細胞和組織的載體，提供用于疾病的基因和病原學非特異性以及回路特異性治療的化合物和方法。
文檔編號A61K48/00GK102159713SQ200980127104
公開日2011年8月17日 申請日期2009年5月20日 優先權日2008年5月20日
發明者劉建文, 威廉·豪斯維特, 艾倫·霍爾斯塞杰 申請人:Eos神經科學公司, 佛羅里達大學研究基金公司