仿生細胞支架的制作方法

專利名稱：仿生細胞支架的制作方法
技術領域：
本發明涉及促進細胞活性，如血管形成、血管發生、分化和增殖的三維植入物和組 織支架。
背景技術：
組織缺氧導致機體內由血管生成素蛋白，包括血管內皮生長因子(VEGF)激發的 快速血管生成。目前對于組織活力的觀點是較深層的細胞是否接受到充足的營養和氧氣用 于正常的活動和最終的存活。對于完整的組織，由微血管灌注控制這種必要的營養水平。但 是，還沒有有效定量確定的3D模型，其能夠測試基質和細胞密度的相互作用或相互依賴， 和體外的氧消耗的擴散途徑。因此，細胞易受到低氧水平的影響的觀念、以及細胞反應的性 質是不清楚的。

發明內容
本發明人已認識到即使在降低的氧條件下，三維仿生植入物的核心區域中的細胞 不發生快速的細胞死亡，并且可較長時間保持活性。在可用于控制哺乳動物細胞生長和增 殖的三維仿生移植物中產生營養和/或代謝物梯度。這些梯度也可以誘導細胞產生促血管 生成的生理反應。產生這些反應的植入物可用于治療應用，該應用中，需要提高血管生成和 /或血管發生。本發明的方面涉及仿生空間結構中的營養和/代謝物梯度在控制哺乳動物細胞 生長和增殖中的應用。本發明的一個方面提供了用于哺乳動物細胞培養的支架，包括在其表面上具有口袋的凝膠，其中該口袋中容納哺乳動物細胞。合適的哺乳動物細胞包括內皮細胞，成纖維細胞，如人的真皮或肌腱成纖維細胞， 基質細胞，如骨髓來源的基質細胞，以及平滑肌細胞，和干細胞。合適的干細胞包括角膜(緣)干細胞；皮膚表皮干細胞；消化道(腸)干細胞；口 腔_生殖(orogenital)干細胞；支氣管和其它上皮干細胞；骨髓基質干細胞；和生長板干 細胞。口袋是凝膠表面內的凹形空間或穴形空間。口袋包括凝膠表面上的開口，其可以 使細胞進和出，還包括限定了凝膠中口袋的邊界的壁。優選，口袋的壁具有足夠防止口袋坍 塌的剛性。口袋的尺寸適合于容納哺乳動物細胞群。口袋的尺寸決定了 口袋內細胞的數量和 缺氧梯度程度，并且可根據支架的特定應用進行變化。合適的口袋深度至少為50 μ m，至少為IOOym或至少150 μ m。合適的口袋深度可 達 500 μ m，達 1000 μ m 或達 1500 μ m。合適的口袋直徑至少為50 μ m，至少為100 μ m或至少150 μ m。
在一些實施方式中，口袋直徑可為50μπι至2000μπι，更優選直徑為100 μ m至 500 μ m,并且深度可為100 μ m至5000 μ m,優選深度為200 μ m至5000 μ m。支架的壁可包括其他的連接蛋白，例如胞外基質蛋白，如纖維連接蛋白、玻連蛋白 和纖維蛋白(纖維素，fibrin)。口袋中的哺乳動物細胞群，如干細胞，形成三種截然不同的細胞-表面和細胞-細 胞連接的極性，其模擬了天然哺乳動物細胞巢。接近口袋壁的哺乳動物細胞在一面上具有 細胞-膠原蛋白接觸，在相對面上具有細胞-細胞接觸。不接近口袋壁的(也就是在口袋 中心的)哺乳動物細胞被其它細胞所圍繞，在其周圍都具有細胞-細胞接觸。接近口袋開 口的哺乳動物細胞具有細胞_細胞接觸，在其相對面具有細胞_液體接觸。口袋中的哺乳動物細胞的代謝活性(其可伴隨著細胞分裂和細胞密度的升高)消 耗擴散因子、營養、氧和葡萄糖，產生代謝廢物。因為通過經凝膠的擴散，擴散因子進入口 袋，接近凝膠的哺乳動物細胞(如干細胞)接觸高水平的這些因子。此外，通過經凝膠的擴 散，代謝廢物離開口袋，因此這些細胞接觸低水平的細胞代謝物。因為它們被其它消耗可擴散因子(如氧)的哺乳動物細胞所包圍，不接近凝膠的 哺乳動物細胞接觸低水平的這些因子。此外，這些細胞會在所有表面上接觸高水平的細胞 代謝物。因此支架可產生和保持模擬哺乳動物細胞巢的口袋中的擴散因子(如營養、氧和 葡萄糖)和代謝廢物(如CO2、乳酸和氨)的濃度梯度。口袋中的擴散因子的梯度刺激口袋中的哺乳動物細胞(如干細胞)的分化和增 殖。可通過調整梯度濃度和哺乳動物細胞的極性來控制口袋中的哺乳動物細胞的分化和增 殖。這可通過改變口袋形狀、細胞密度、凝膠性能或因子的外部濃度來實現。利用口袋中的細胞量確定口袋中可實現的擴散因子(如營養、氧和葡萄糖)的最 低水平。優選，口袋中只充滿細胞。口袋中接種的細胞數量越大，就實現得越快。例如，口 袋可接種超過500萬個細胞/毫升，超過1500萬個細胞/毫升或超過5000萬個細胞/毫 升。隨著哺乳動物細胞增殖和口袋內的細胞數量升高，細胞遷移和經口袋開口遷出增 多。此外，從口袋遷出的細胞(如干細胞)可能已經被刺激分化了。增殖速率以及口袋和 口袋開口的尺寸決定了細胞遷出口袋的速率。培養哺乳動物細胞的方法可包括提供在其表面具有口袋的凝膠，向口袋接種哺乳動物細胞，以及在培養基中孵育凝膠；其中口袋中的細胞代謝造成營養物的量從口袋的側邊向內逐漸降低。例如，可通過塑性壓制成型將口袋模壓在凝膠表面上以生產適合于控制哺乳動物 細胞生長和增殖的支架。在W02006/003442中更詳細地描述了塑性壓制成型。可制造微結 構的“模具”或模板，其對應于凝膠中的口袋所需的形狀(patterning)。然后，模具和凝膠 之間的接觸將口袋的形狀模壓在凝膠中。換句話說，在模具的接觸表面存在一個或多個突 出，模具和凝膠之間的接觸使這些突出將口袋模壓在凝膠的表面中。凝膠中的口袋在尺寸 和設置上對應于模具上的突出的尺寸和設置，適合于哺乳動物細胞的生長。例如，可通過模具以塑性壓制膠原凝膠從而產生如上所述的深度為200 μ m至5000 μ m、直徑為50-2000 μ m 的穴形口袋。圖16示出了包括模壓了 口袋的膠原凝膠的支架的實施例。適合于制造模具或模板表面上的突出和其它微結構的技術在所屬領域中是熟知 的。例如，可通過標準蝕刻技術將突出或其它微結構施加于玻璃或硅模具，或通過電火花腐 蝕技術施加于金屬模具。在一些實施方式中，可使用多孔模板或模具。如本文所述，當其被塑性壓縮時，這 可使液體離開凝膠。例如，可使用已成形為包含用于將口袋模壓在支架凝膠中的突出或其 它微結構的燒結材料(金屬、塑料或陶瓷)來生產多孔模具。本文所述的用于哺乳動物細胞培養的支架可用于體內細胞生長和仿生植入物。在3D構建體中的暴露于如氧的擴散因子梯度的哺乳動物細胞可產生血管生成因 子，如VEGF。本發明的多個方面涉及植入物中的血管生成因子的產生，其可用于誘導或促進 血管生成(例如，醫療應用中)。在移植之后可原位完全或部分地產生血管生成因子梯度。誘導或促進血管生成的 方法包括將血管生成植入物定位以接觸需要血管形成或灌注的組織，其中該血管生成植入 物包括哺乳動物細胞，以及；允許細胞進行呼吸，其中細胞呼吸降低植入物的氧壓，以及；氧壓的降低致使細胞表達一種或多種血管生成因子。在一些實施方式中，在被定位以接觸組織之前，對包括哺乳動物細胞的植入物進 行體外培養，從而體外培養的細胞的呼吸降低植入物中的氧壓，并在植入物被定位于體內 之前致使細胞表達一種或多種血管生成因子。在移植之后，細胞在宿主體內持續表達血管 生成因子。在其它實施方式中，包括哺乳動物細胞的植入物在被定位以接觸組織之前，沒有 在體外培養。植入物可包括流動懸浮液中的高密度哺乳細胞團或可包括并入了哺乳動物細胞 的凝膠。移植之前，可在體外完全產生血管生成因子梯度。誘導或促使血管生成的方法包 括；體外培養包括哺乳動物細胞的血管生成植入物，以及；允許細胞進行呼吸，從而細胞呼吸降低氧壓，氧壓的降低致使細胞表達一種或多 種血管生成因子，殺死所述哺乳動物細胞，以及，將血管生成植入物定位以接觸需要血管形成或灌注的組織。因為呼吸細胞對氧的需求超過了通過表面灌注供應的氧，因此氧壓降低。隨著離 植入物表面的距離加大，植入物中的氧壓可能從植入物表面向內逐漸降低。這種氧壓的逐 漸的降低可造成植入物中的細胞表達的血管生成因子的量由植入物表面向內逐漸升高， 即，隨著離表面的距離加大，氧壓降低，而血管生成因子表達量升高。植入物中的氧壓可以逐漸降低至位于植入物核心(即，離表面最遠的植入物部分)的最低值。或者，最低氧壓可以出現在除了核心的植入物的其它部分，例如當細胞在整 個植入物不是均勻分布的情況下。植入物中的最低氧壓取決于移植物中的細胞密度和細胞的代謝活性。與相同密度 的具有低代謝活性細胞相比，植入物中具有高代謝活性的細胞會產生較低的氧壓。在一些實施方式中，植入物中的最低氧壓是非病理性的，S卩，不足以降低細胞活性 或誘導細胞死亡。非病理性最低氧壓可以是大于SmmHg(大于1. IkPa或大于氧)。例 如，植入物核心的氧壓可以在8mmHg至60mmHg之間。在其它實施方式中，植入物中的最低氧壓可以是病理性的，在產生血管生成因子 之后在植入物中可以發生細胞死亡。在移植到宿主之后，包括活的哺乳動物細胞的植入物可在體內產生一種或多種血 管生成因子。植入物中的細胞對移植之后植入物中氧壓降低做出反應，產生一種或多種血 管生成因子。細胞表達的一種或多種血管生成因子擴散到植入物附近的組織中，誘導或促 使該組織中血管生成。細胞生理濃度的血管生成因子的生理組合的產生引起組織中的血管 生成生理反應的刺激，造成組織的血管形成增加。在被移植到宿主內之前，植入物可在體外產生一種或多種血管生成因子。植入物 中的細胞對標準培養基的體外培養過程中植入物中的氧壓降低做出反應，產生一種或多種 血管生成因子。適合于培養哺乳動物細胞的條件是所屬領域中熟知的。在一些情況下，理 想的是降低對體外培養的氧供給，從而提高或加速植入物內的氧壓降低(即，開始組織缺 氧)。隨著植入物內的氧壓降低，細胞表達的一種或多種血管生成因子擴散到細胞附近的植 入物中。在體外進行預調整(preconditioning)之后，然后包括哺乳動物細胞的植入物可 被移植入體內，從而細胞在宿主體內持續表達一種或多種血管生成因子。或者，在體外培養 之后可殺死植入物中的哺乳動物細胞，例如通過冷凍。然后，在移植之前可儲存移植物。在 移植之后，在體外培養過程中植入物中表達的一種或多種血管生成因子擴散到植入物附近 的組織中，誘導或促進組織中的血管生成。本文所述的植入物的生理濃度的血管生成因子生理組合的擴散引起周圍組織中 的血管生成生理反應的刺激，導致組織的血管形成增多。血管生成生理反應可以是定向的。例如，血管生成因子的濃度梯度的產生沿著濃 度梯度向上促進血管生成(例如，朝向植入物的核心)。血管生成植入物中的細胞表達的血管生成因子還有助于內皮細胞的分化。合適的 內皮細胞可與血管生成植入物整合或定位以接近植入物。本文所述的血管生成植入物可用于促進血管生成和將血管吸引到需要血管形成 或灌注的組織或構建體，例如自然組織、移植物、自體移植物、移植或組織等效構建體。本文所述的血管生成植入物提供了血管生成促進因子源，并且在組織或構建體中 形成血管生成的焦點。血管生成植入物可放置于需要血管形成或灌注提高的任意部位，并 且具有廣泛醫療應用。血管生成植入物可用于，例如促進大型(mm等級)組織工程化構建體中的臨床移 植物(例如，皮膚或肌腱移植物)、自然自體移植物、移植物、傷口部位；激素植入物；不愈合 骨折；和心肌梗死部位的血管形成。血管生成植入物可用于，例如促進，例如藥物儲積池(drug depots)；傷口部位；激素植入物；不愈合骨折；和心肌梗死部位的灌注。在本文所述的方法中，可將植入物置于自然組織中或接觸自然組織，優選在需要 血管形成或灌注的區域。如果需要的話，可通過任意的常規技術固定植入物。例如，可將其 縫合或粘合于合適的位置。在一些實施方式中，可將流動懸浮液中的高密度細胞團在合適 深度的組織點進行注射從而形成局部蓄積。適合深度的組織點可包括組織袋和組織間層。在將包含哺乳動物細胞的植入物置于宿主之后，植入物中的細胞呼吸并耗氧。這 降低了血管生成植入物中的氧壓，致使細胞表達一種或多種血管生成因子。無論在移植之前或之后表達，植入物中的血管生成因子從植入物擴散到附近的組 織或組織等效構建體中，促進天然組織中的血管生成。需要血管形成或灌注的天然組織可 包括修復失敗的部位、慢性創傷、不愈合骨折部位和心肌梗死部位或需要提高藥物或激素 劑量的部位。在本文所述的方法中，血管生成植入物可定位于外部植入物中。定位之后，血管生 成植入物中的細胞呼吸并耗氧。如上所述，這導致血管生成植入物產生血管生成因子并且 擴散到外部植入物中，促進外部植入物的血管生成。外部植入物可為天然的或工程化植入 物、組織等效構建體、重建或美容整形嫁接物(cosmetic grafts)和移植物。在一些實施方 式中，外部植入物可以是非細胞膠原凝膠。本發明的其它方面涉及包括哺乳動物細胞的血管生成植入物，其可用于本文所述 的促進血管生成方法。本文所述的包括哺乳動物細胞的血管生成植入物可用于促進血管生成的方法，包 括將血管生成植入物定位以接觸需要血管形成或灌注的組織，其中血管生成植入物 包括哺乳動物細胞；以及允許細胞進行呼吸，其中細胞呼吸降低氧壓；以及氧壓的降低致使細胞表達一種或多種血管生成因子。本文所述的包括哺乳動物細胞的血管生成植入物可用于制造用于促進血管生成 的方法的藥物，包括將血管生成植入物定位以接觸需要血管形成或灌注的組織，其中血管生成植入物 包括哺乳動物細胞，以及；允許細胞進行呼吸，其中細胞呼吸降低氧壓，以及；氧壓的降低致使細胞表達一種或多種血管生成因子。在上文中更詳細地介紹了促進血管生成的合適的方法。本發明的其它方面涉及包括一種或多種血管生成因子的血管生成植入物，其可用 于如本文所述的促進血管生成的方法。可通過以下方法產生血管生成植入物，該方法包括體外培養包括哺乳動物細胞的植入物；允許細胞進行呼吸，從而細胞呼吸降低氧壓，氧壓的降低致使細胞表達一種或多 種血管生成因子；以及
殺死所述哺乳動物細胞。在表達了一種或多種血管生成因子之后，可處理植入物從而殺死其中的哺乳動物 細胞。可以使用任意合適的方法。在一些實施方式中，可冷凍植入物，例如通過浸入液氮。一旦哺乳動物細胞被殺死，在移植之前可儲存植入物。可以按照常規技術，方便地 將植入物儲藏于4°C、-20°C或-70°C。包括一種或多種血管生成因子的血管生成植入物可用于促進血管生成的方法，包 括將血管生成植入物放置到接觸需要血管形成或灌注的組織，其中血管生成植入物 包括一種或多種血管生成因子；以及使所述一種或多種血管生成因子從植入物擴散到組織。包括一種或多種血管生成因子的血管生成植入物可用于制造用于促進血管生成 方法的藥物，包括將血管生成植入物定位以接觸需要血管形成或灌注的組織，其中血管生成植入物 包括一種或多種血管生成因子；以及使所述一種或多種血管生成因子從植入物擴散到組織。血管生成因子包括如趨化因子和細胞因子的蛋白，其刺激或促進組織中新血 管的形成、發展和生長。血管生成植入物中的細胞表達的一種或多種血管生成因子可 包括酸性和堿性成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子α (TGF-α)和轉化生長因 子β (TGF-β)、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板源生長因子(PDGF)、血管內皮細胞生長因子 (VEGF)、HIF-Ia和血管生長素中的一種或多種。在一些實施方式中，一種或多種血管生成 因子可包括VEGF。用于本文所述的植入物和支架的適合凝膠可包括支架纖維基質和間質液。隨著 纖維形成圍繞初始容納單體的水相間質液的連續網絡，通過支架纖維的接合和延長形成凝 膠。例如，三螺旋膠原蛋白單體最初可溶解在稀酸中，然后被誘導聚合(凝聚)以形成纖維 (例如，于37°C以及中性ρΗ中)。當纖維聚合時，會有相變，纖維的固體網絡以大致相同的 體積和形狀來“支持”剩余的間質液_即其凝膠。由可溶單體至固體聚合物的相變是凝膠 的特點。任意的含水聚合物材料適合用于本文所述的凝膠，包括天然產生的聚合物，例如 蛋白，如絲、纖維蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白或膠原(例如，I型膠原蛋白)，糖蛋白如纖 維連接蛋白，或多糖如幾丁質、或纖維素。在一些優選實施方式中，由膠原制成基質纖維。優 選原生纖維形成的膠原類型，包括的膠原類型是I、II、III、V、VI、IX和XI，以及其(例如 I，III V或II，IX，XI)的組合。例如，I型膠原可用做凝膠或支架材料。在一些優選的實 施方式中，凝膠可包括5%至25%的I型膠原(干/濕重比)，更優選約10%。在一些優選 的實施方式中，凝膠可包括15%至20%的I型膠原(干/濕重比)，更優選約10%。其它合適的纖維支架材料包括合成的聚合物，即不是在人或動物體內天然存在 的聚合物。合適的聚合物包括有機聚合物，如聚內酯、多糖(polyglycone)和聚己內酯 (polycapryolactone)，無機聚合物，如磷酸鹽玻璃，和合成的凝膠化多肽凝膠。在一些實施方式中，纖維支架材料可以是包括兩種或多種不同類型纖維的復合材 料。例如，支架可包括纖維連接蛋白和膠原、膠原和聚交酯、纖維蛋白和膠原、膠原纖維和碳納米管、或纖維、膠原和纖維連接蛋白。間質液通常是水性液體，其支持容納在凝膠中的細胞的生長和增殖。合適的液體 包括哺乳動物細胞培養基，如Eagles MEM溶液。用作生物材料的凝膠的配制和成形技術 在本領域中是熟知的(見，例如，W02006/003442 ;W02007/060459 ;Marenzana et al 2006 Exp Cell Res 312423-433 ；Tomasek et al (2002)Nat Rev Mol Cell Biol 3349-363; Harris et al Nature 290(1981)249-251 ；Elsdale et al 1972 J Cell Biol. 54626-637 ； Kolodney et al J Cell Biol. (1992) 11773-82 ；Eastwood et al Biochem Biophys Acta 1201 (1994) 186-192)ο通常，優選高密度凝膠從而有利于擴散因子(如氧)的梯度形成。適合用于本文所述的植入物的凝膠可具有> 70% (濕/干重比)、> 75%、> 80%、>85%或>90%的液相。例如，合適的凝膠可具有75% (濕/干重比)至95%的液 相，通常是約88%。本文所述的合適的凝膠可具有IxKT6Cm2ZV1至IOxKT6Cm2ZV1的氧擴散系數，更優 選 4xl0"6cm2/s_1 至 5xl0"6cm2/s_1o還可通過確定耗盡之后的O2再平衡速率來測量凝膠滲透性，例如使用亞硫酸鈉或 N2飽和。在一些實施方式中，凝膠可具有經Imm的最短擴散途徑的2mmHg/分鐘至4mmHg/ 分鐘的O2再平衡速率，優選O2耗盡之后在空氣飽和溶液中為約3mmHg/分鐘。適合用于植入物的凝膠滲透性可以與含有5 %至25 %膠原的凝膠相當，優選約 10%的膠原(干/濕重比)。在一些實施方式中，可使用致密的凝膠，其具有與含有15%至 20 %膠原的凝膠相當的滲透性。凝膠在整個植入物中可以是均勻的，細胞產生的血管生成因子可經凝膠在各個方 向上均勻地擴散。可替換地，可構建凝膠，以使細胞產生的血管生成因子在特定的方向上經凝膠擴 散得更快，并產生血管生成因子的定向梯度，即在遠離產生細胞(producer cells)的特定 方向上的梯度。例如，凝膠可包括多層。血管生成因子在凝膠層之間的擴散比經過凝膠層 更快，產生了血管生成因子的定向梯度。例如，可通過將平的凝膠卷成圓柱狀(cylindrical)植入物來形成包括多層的凝 膠(即，具有橫截面的圓柱)。血管生成因子經過凝膠的擴散速度在穿過凝膠層的徑向(即， 與螺旋軸垂直)方向上較慢，而在凝膠層之間的軸向(即，平行于螺旋軸)方向上較快。這種矢量擴散有助于促進其中定向血管形成比較重要的組織中的血管生成，如肌 腱、神經、皮膚和骨骼。在本文所述的促進血管生成的方法中，凝膠整合了活哺乳動物細胞，優選人細胞。 凝膠中可達到的最低氧壓是由凝膠中的細胞密度決定的。優選，凝膠中的細胞密度足以 將O2水平降低至低于60mmHg，低于50mmHg，低于40mmHg，低于30mmHg，低于20mmHg，低于 IOmmHg,低于5mmHg或低于ImmHg。例如，凝膠中的細胞密度可足以將O2水平降低至8mmHg 至60mmHg之間，優選20mmHg至60mmHg之間。例如，凝膠可接種超過1200萬細胞/毫升， 超過1500萬細胞/毫升或超過2000萬細胞/毫升。在一些實施方式中，細胞是成纖維細胞，如人真皮或肌腱成纖維細胞。除了產生胞外基質，成纖維細胞能夠耐受低氧壓，并且相對于其它細胞類型具有低代謝率，因此氧需求低。因此，成纖維細胞呼吸造成的氧壓降低要比其它細胞類型慢得 多。此外，相對于整合其它細胞類型的植入物，整合了成纖維細胞的植入物中的血管生成因 子的產生也降低或拖延。在一些優選的實施方式中，用于血管生成植入物中的細胞不是成纖維細胞。相對 于成纖維細胞，優選的細胞可具有高代謝活性，因此產生梯度快或對低O2敏感，從而快速產 生血管生成因子。合適的細胞可選自由基質細胞(如骨髓來源的基質細胞)，平滑肌細胞和 干細胞(如角膜(緣)干細胞、皮膚表皮干細胞、消化道(腸)干細胞、口腔_生殖干細胞、 支氣管和其它上皮干細胞、骨髓干細胞、生長板干細胞)組成的組。代謝活性升高降低了產 生組織缺氧和產生血管生成因子的時間。在一些優選的實施方式中，合適的細胞包括同種異體的GMP產生細胞(例如，人新 生成纖維細胞)、同種異體的或自體血細胞，或骨髓或其它源的同種異體基因的或自體基質 干細胞/祖細胞，所有這些都可用于GMP級別的臨床應用。細胞類型可反映血管生成植入物被用于的組織或應用。合適的細胞可包括引起過敏反應的作廢人細胞，如時間過期的骨髓細胞或血細 胞；預培養的成纖維細胞；和動物細胞，如來自轉基因豬或羊的人源化細胞。細胞可來源于與血管形成組織相同的組織，或可來源于與血管形成組織不同的組
幺口
/Ν O本文列出的結果顯示血管生成植入物的核心區域的細胞可在持續時間內保持活 性。例如，在一些實施方式中，原位24小時之后，植入物核心的細胞活性可以是至少80%， 至少90%或至少95%。原位5天之后，植入物核心的細胞活性可以是至少70%，至少65% 或至少80 %，在植入物表面上可以是至少80 %，至少90 %或至少95 %。在其它的實施方式中，細胞不保持活性，但是在細胞死亡之前產生一種或多種血 管生成因子。如上文所述，在一些實施方式中，在產生了一種或多種血管生成因子之后，可 處理血管生成植入物從而殺死細胞。可通過將細胞與液體支架基質混合而將細胞接種于基質中，然后使液體基質固化 成凝膠。在凝膠形成之前，優選在合適的溫度、ΡΗ、離子強度和剪切力的條件下進行基質接 種從而保持活力。凝膠中的初始細胞密度可以是約IxlO4至IxlO7細胞/毫升，更優選約 5χ105至IxlO6細胞/毫升。在一些實施方式中，可通過包括塑性壓縮接種了細胞的凝膠的方法來產生如本文 所述的血管生成植入物或哺乳動物細胞支架。這提高了凝膠內的細胞密度。塑性壓縮涉及 使如凝膠的物體變形從而使其體積減小，以致即使撤除了壓力源，物體仍基本保持其新體 積。塑性壓縮是快速的、不依賴于細胞的方法，其是通過將凝膠進行物理處理(如外力或壓 力)產生，物理處理將間質液從凝膠中排出，從而撤除負載之后不會恢復即，凝膠進行了 塑性壓縮。例如，塑性壓縮可形成包括細胞的薄片，其可被卷起或折疊從而產生多層植入物。 W02006/003442更詳細介紹了凝膠的塑性壓縮，包括接種了細胞的凝膠。塑性壓縮可提高凝膠的機械性能。凝膠的無邊界(imconfined)壓縮排出了間質 液，當撤除負載其不會回復即，凝膠進行了塑性壓縮。在未處理的凝膠中，支架基質通常是 體積較大的水合形式。這種支架結構在塑性壓縮的過程中坍塌，但是不損失結構細節，使凝膠中的支架脫水，致使密度和強度升高。可優化塑性壓縮方法從而由標準初始凝膠獲得理想的纖維和細胞的最終比例。例 如，標準凝膠可包括至4%的膠原和0. 2xl06至IOXIO6細胞/毫升。凝膠環境優選保持在可使細胞生存的生理條件下(例如，溫度、pH、水合和離子強 度)。優選塑性壓縮不會顯著改變凝膠液體的離子性能使其偏離生理條件。在壓縮之后，凝膠可進行重復循環的單軸拉伸從而使其機械性能提高。 W02007/060459中描述了合適的循環。在壓縮的膠原凝膠中，重復施加作用力(負載)循環 提高了膠原蛋白纖維的融合從而產生材料強度提高的生物材料(即，斷裂應力、斷裂應變 和/或彈性模量提高)。可進行凝膠或生物材料的附加處理從而產生用于促進血管生成的組織等效植入 物。例如，可將凝膠或生物材料模制和/或成形從而產生組織等效植入物。凝膠或生物材 料可模制成預定的形狀和/或可進行對稱或不對稱的塑性壓縮。包括細胞的凝膠或生物材料可被成形、切割或模制成任意合適的植入物形式，例 如小塊、大塊、管狀、帶狀、條狀、環狀、圓形、毛細管、卷、片狀或線狀。組織等效植入物的最 終形狀將取決于其應用于的特定環境。在一些實施方式中，組織等效植入物可具有可塑的 形式，適合于進一步成形。植入和產生血管生成因子之間的時間取決于植入物的細胞密度、途徑長度和細胞 代謝活性。可針對特定的應用、部位或組織，通過改變這些參數來優化血管生成植入物的性 能。如上所述，植入物可在體外進行預調整從而在植入之前產生血管生成因子。例如，這可 用于當植入物接種了數量少的細胞時(例如，2xl07細胞/毫升或更少，IxlO7細胞/毫升或 更少，或5xl06細胞Il毫升或更少)。一旦形成，如上所述包括細胞的植入物會穩定地具有合適配比和比例的血管生成 因子，從而刺激附近組織的血管生成生理反應。在一些實施方式中，可直接使用或在體外預調整之后將包括活哺乳動物細胞的植 入物用作血管生成發生器(motor)。在其它的實施方式中，在體外培養之后，可整體或通過隨后分區或其它控制破碎 和/或分割來冷凍或凍干植入物。盡管不再含有活細胞，得到的植入物包括血管生成因子， 其從植入物擴散出來從而促進周圍組織的血管生成。通過原始凝膠基質的結構(納米-微 米-級別)可控制擴散的方向。包括血管生成因子而不包含活細胞的植入物是高度穩定的，保存期限(貨架壽 命)長，可用于臨床和獸醫應用的現成應用從而刺激血管生成。例如，在外科手術過程中可 將植入物直接提供給臨床需要的任意位置；使用常規針頭注射或使用常規的內窺鏡作為其 它治療的部分進行提供。這可使臨床醫生能夠控制局部組織灌注。本文所述的方法可用于促進需要血管形成或灌注的組織的血管生成，例如具有血 管形成缺陷的組織。具有血管形成缺陷的組織可包括其可受益于刺激血管生成、提高血流 量和/或提高血管分布的任意組織。例如，本文所述的方法可用于促進血管生成從而加速或提高創傷或潰瘍愈合，皮 膚移植物、肌皮瓣(musculocutaneous flaps)或其它的外科手術移植組織(例如，重新接 上斷肢)的血管形成從而保存其功能和活力；手術縫合(例如，胃腸外科手術之后的腸的重新連接的部分)的愈合或改善皮膚的生長。本文所述的方法還可用于促進治療與血管形成降低或受損相關的疾病和狀況中 的，或可受益于刺激血管生成、提高血流量和/或提高血管形成的疾病和狀況中的血管生 成。可治療的狀況的實施例包括與血管(如動脈、靜脈或毛細血管)堵塞相關的任意情況。 情況的實施例包括血管閉塞疾病，如冠狀動脈閉塞癥、頸動脈閉塞癥和動脈閉塞癥；外周動 脈疾病；動脈粥樣硬化；肌內膜增殖(例如，由于血管手術或球囊血管成形術或血管支架 術)；血栓閉塞性脈管炎；血栓性疾病；腸系膜缺血或肢體缺血；器官狹窄；脈管炎、心肌梗 死或腦梗死或其它的與血流量降低相關的血管性死亡、中風、肢體缺損。根據本發明的各個其它方面和實施方式對于所屬領域的一般技術人員會是顯而 易見的。本文所用的“和/或”意指具體公開包括兩個特定要素或成分中的每一個或其中 之一。例如，“A和/或B”可被認為是具體公開(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每一個， 好像每一個在本文中單獨列出一樣。除非文中另有說明，上文列出的特征的描述和定義不限定于本發明的任意特定方 面或實施方式，并且等效應用于描述的所有方面和實施方式。


下面通過實施例的方式并參考下文描述的附圖和表來說明本發明的某些方面和 實施方式。圖1圖示了在塑性壓縮的螺旋構建體的中心具有氧探針的實驗設置。構建體被培 養在50ml培養基中。圖2示出了無細胞的塑性壓縮構建體中心的氧水平。圖3示出了具有亞硫酸鈉的無細胞的塑性壓縮構建體的脫氧作用，隨后在DMEM培 養基中氧化(值為4. 5+/-0. 5mmHg/分鐘和3. 2+/-0. 5mmHg/分鐘)。利用曲線圖的近似直 線部分估算梯度(對應于脫氧和再氧化速率)。圖4示出了接種了細胞(cell-seeded)的塑性壓縮構建體的中心的氧水平。測量 了不同細胞密度的氧水平，5. 8x106-23. 2x106細胞/ml，放大率比例條50mm (0. 5xl06-2xl06 細胞/構建體)，*P < 0.0001。對于每一數據組，η的平均值=3。時間“0”被認為是當探 針被放置于構建體中的時間點。圖5 示出了接種了 5. 8χ106細胞/ml (上部)、11.6χ106細胞/ml (中部)和 23. 2xl06 細胞/ml (下部)的塑性壓縮構建體的中心和外部區域的共焦圖像。圖6示出了接種了細胞的構建體中心的氧水平，構建體中有2xl06個細胞 (23. 2xl06細胞/ml)，經過10天周期，在第5天從構建體的中心和表面具有支持性的細胞 活力。曲線圖示出了 η的平均值=3。顯微圖片的放大率比例條是100mm。圖7示出了第24小時不同細胞密度的構建體中的VEGF水平。未發現不同細胞密 度之間的VEGF水平的顯著差異。圖8示出了經過10天周期含有200萬細胞/構建體的構建體的VEGF水平(以 GAPDH為參照，以第1天作為固定校準)在第8天測量顯示出統計學上的顯著升高，其在第 10 天降低(**p < 0. 001，*p < 0. 05)。
圖9示出了接種2xl06細胞，培養8天(VEGF表達峰)的螺旋構建體，將其展開從 而研究構建體的三個區域中的VEGF(因為將這些對應的區域螺旋對應于初始構建體中心、 中部和表面的三個不等厚度，分別大約是7、5和3層)。VEGF表達歸一化到GADPH，以第1 天作為固定校準，其在第24h時是23. 2xl06細胞/ml。發現凝膠中心的VEGF的水平顯著較 高(*p < 0. 001)。圖10示出了本文所述的仿生干細胞穴的實施例。圖11示出了利用ELISA確定的接種了 2xl06HDF并且體外孵育5和10天的膠原 構建體的HIF-Ia水平。圖12示出了利用ELISA確定的接種了 2xl06HDF并且體外孵育5和10天的膠原 構建體的VEGF水平。圖13示出了接種了 2x106HDF的膠原構建體，通過體外孵育5天進行預調整(上) 或沒有進行預調整(下)，并且皮下植入兔子內保持1周。圖14示出了接種了 2xl06HDF，冷凍在液氮中沒有進行預調整并且皮下植入兔子內 保持1周的對照膠原構建體(上部)，以及沒有接種細胞或進行冷凍，皮下植入兔子內持續 1周后的對照非細胞膠原構建體(下部)。圖15示出了接種2xl06HDF，通過體外孵育10天進行預調整，然后冷凍在液氮中， 并且接著皮下植入兔子內保持1周的膠原構建體。圖16示出了具有用于容納哺乳動物細胞的壓模口袋的膠原支架。
具體實施例方式 方法細胞培養和擴增如以前文獻[13]所述，從新生包皮移植人真皮新生成纖維細胞(在包皮環切術之 后，從手術室新鮮獲得，具有完全倫理許可的)。細胞保持在Dulbecco's modified Eagles 培養基中(DMEM，Gibco，Paisley，英國)，±真充了 10% FCS (First Link, West Midlands，英 國)，2mM谷氨酸鹽和青霉素/鏈霉素(1000U/ml ;100mg/ml，Gibco Chemicals)。為了從單 層培養物分離細胞，以0. IM PBS洗滌含有細胞的燒瓶，并且與胰島素(0. 5%,5mMEDTA) 一 起于37°C孵育5分鐘。3D塑性壓縮膠原凝膠培養一旦分離，計數細胞，并且將其植入3D I型膠原凝膠。將膠原凝膠放入模型中 (2. 2x3. 3x1 cm3)。為 了制備膠原凝膠，將 0. 5ml 10_EaglesMEM 溶液(Gibco)加入到的 4ml 0. IM醋酸中的鼠尾I型膠原(First Link)中，蛋白濃度2. 035mg/ml，利用從黃色至不均勻 的粉紅色(cirrus pink)的顏色指示變化以5MNa0H來進行中和[14]。將該凝膠制備物加入 到細胞懸浮液中。在設定和孵育之后，常規地通過壓縮和使用網孔和紙片層來吸干(blot) 的組合將凝膠壓縮[12]。簡單地說，將165-mm厚的不銹鋼網和尼龍網層放置于雙層吸水紙 上。將膠原凝膠放置于尼龍網上，覆蓋第二個尼龍網，在室溫下裝上120g扁平金屬塊(鋼) 持續5分鐘，產生在兩個尼龍網之間被保護的膠原蛋白平片(50-60mm厚)。然后將這些致 密的膠原蛋白片卷起從而產生緊密螺旋纏繞的棒，直徑為2. 3mm，長度為21mm。通過塑性壓 縮，細胞密度升高，細胞密度的升高與凝膠體積的降低成正比，最終細胞密度被計算為初始細胞密度χ體積變化倍數。因此對于5ml的一般初始凝膠體積，膠原蛋白的比例是0. 2%, 在壓縮之后其升高至11% (通過干/濕重比測量)，其對應于58倍升高。人們期望細胞密 度會以相同的程度改變，由總的100000細胞/ml (或50萬細胞/構建體)至580萬細胞/ ml的終密度；200000細胞/ml (或100萬細胞/構建體)至1160萬細胞/ml ；400000細胞 /ml (或200萬細胞/構建體)至2320萬細胞/ml[15]。氧監控將光纖氧探針(Oxford Optronix, Oxford，英國)插入3D螺旋構建體的中心，并 且沿著構建體的軸放置于中間(圖1)。然后使用氰基丙烯酸酯膠于末端將構建體封住。因 為構建體末端被封，因此研究> Imm的擴散長度，并且主要是指徑向(側向)擴散。傳感探 針(直徑280mm)的尖端整合了在氧滲透基質中的氧敏感發光探針。在分子氧的存在下，發 光被淬滅，因此當周圍培養基的氧濃度較低時，發光壽命會較長。精確至0. 7mmHg的探針的 刻度主要依賴于發光壽命(而不是強度)對氧濃度的關系[16]。該方法產生了非常穩定的 標準反應，因此每一探針以最慢的取樣率可使用達6天。因此，監控構建體超過6天，撤走 過期的探針，在第5天插入新探針(見下文)。在每一實驗之后，檢查外部培養基中的探針 的讀數從而確定反應沒有漂移。光纖探針可與連接于A/D轉換器(12位)的0XyLabp02ETM 系統聯合使用，使用Labview將結果記錄在IBM PC計算機上。結果被表示為分壓值，也就 是以mmHg計的p02 (例如，7. 6mmHg對應于1 %的氧)。可根據進行的實驗改變取樣率，實現 總反應時間< 10秒(對于脫氧測量，圖2和圖3)并且對于如圖4和5所示的長期研究達 到 30秒。對于氧經過構建體的擴散速率的研究，我們將含有探針的構建體轉移至37°C 的3%亞硫酸鈉的缺氧溶液中。用曲線圖的近直線部分估算了脫氧和再氧化的速率，如圖1 至3所示。將樣品保持在7. 5% CO2富集培養箱中進行監控。在每一實驗的結尾，移走構建 體，測試培養基中的環境O2壓，其大致保持在140mmHg。細胞活力使用活細胞/死細胞生存力/毒性試劑盒(Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit (Molecular Probes, L-3224)估計了細胞活力，該試劑盒是基于分別以鈣黃綠素AM和 溴乙啡啶均二聚體(EthD-I)同時確定活細胞和死細胞從而定量分析。根據制造商的方案 用活細胞/死細胞減少的生物危害生存力/毒性試劑盒(Live/Dead Reduced Biohazard Viability/Cytotoxicity) (Molecular Probes, L-7013)進行了定量分析。使用了綠色熒 光核酸染料SYT0_10和Dead Red (溴乙啡啶均二聚體_2)，在捕獲圖像之后，計數活/死細 胞核從而確定活力百分比。從氧測量中獨立判斷每一構建體中的細胞活力。在塑性壓縮 的構建體的兩個區域(核心和表面)選擇確定O2的代表部分，并且使用共聚焦顯微鏡方法 (Bio-Rad Radiance 2100,Carl Zeiss Ltd，Hertfordshire，英國)進行細胞可視化。Mol. Life Sci. Research Article 3。VEGF mRNA的定量PCR分析。與氧測量獨立地進行從實驗 構建體提取RNA。從整個構建體提取RNA，或從螺旋構建體的特定區域(核心、中部和表面) 提取。通過展開該螺旋體并且切割成對應于核心、中部和表面的三個不同的區域，在培養后 將這些區域分隔開來。使用Qiagen RNeasymethod (Qiagen，英國)從細胞3D塑性壓縮構建 體分離總細胞RNA。首先將構建體在液氮中速凍，在每一樣品中加入含2-巰基乙醇的500ml 裂解緩沖液，使其在室溫下溶解40分鐘(Qiagen，英國)。然后使用21-G針頭吸入得到的 溶液，然后遵循商業試驗方案(Qiagen，英國)。在無RNA酶的水中洗脫RNA，通過260nm和280nm 的分光光度計來確定濃度(Genequant，Pharmacia Biotech，NJ，USA)。使用 Amplitaq 反轉錄酶進行 cDNA 第一鏈的合成(Applied Biosystems，Roche)。將總 RNA(0. 5mg RNA)在 38. 85ml的水中稀釋。每一管中再加入9. 15ml的標準混合物(dNTP、RNA酶抑制劑、MgCl2、 寡聚胸腺嘧啶隨機引物；Applied Biosystems，Roche)，于70°C加熱持續10分鐘；然后每一 管中加入2ml的反轉錄酶，在40°C孵育管持續1. 5小時，然后于90°C加熱持續2分鐘從而 使殘留的任何酶變性。VEGF的實時定量PCR使用Applied Biosystems7300 實時 PCR 系統(CA, USA)以 Taqman 通用 PCR 標準 混合物(Applied Biosystems)進行相對定量PCR。將9ml/反應的cDNA與Iml所需的基因 探針(VEGF，Applied Biosystems 分析編號Hs00900057_ml 或GAPDH，Applied Biosystems 分析編號Hs99999905_ml)和 IOml 的 Mastermix (Applied Biosystems)在 96 孔板中進行 混合，從而在Applied Biosystems 7300實時PCR機器中進行循環和分析(反應總體積 20ml)。引物序列未公布，由Applied Biosystems (Roche)保密。調整每一引物設置從而在 7300實時PCR機器中最優運行。組合熱循環和擴增特異性軟件能夠檢測作為單管反應中逐 個循環累積的PCR產物。每一樣品的值歸一化到對應的GAPDH結果，其在任意測試的樣品 中不會顯著變化。通過表示相對于校準的每一樣品/GAPDH比來進行相對定量。該校準設 定為第1天每一構建體200萬個細胞。該校準與每一測試一起運行并進行比較。通過這樣 做，可以解釋運行之間的任意的小變化，因為我們是依賴于相對定量。在每一 PCR運行中測 量該校準(無顯著變化)，并且其總被設定一致，樣本的變化表達為相對于其的倍數升高或 降低。在細胞密度、培養周期和區域試驗的情況下，其被設定為24小時的200萬細胞/構 建體。因此，基因表達變化的所有相對定量都是相對于其設定的。MM圖1中示意性顯示了 3D監控設置。無細胞的構建體上的確認和校正研究(圖2) 顯示了無細胞的構建體的核心中的O2壓的穩定基線水平，經過24小時具有可忽略的氧消 耗(與外部培養基無顯著差異)，與探針的最低O2消耗一致。通過添加并且隨后去除和洗 去3%的亞硫酸鈉溶液來使系統隔絕O2，證實了核心O2水平的細胞依賴性消耗和恢復(圖 3)。觀察到氧水平在幾分鐘內降低程度逐步加大，在大約30分鐘后達到零。注意，探針的 時間反應被設置為< 10秒。通過將仍含有探針的構建體轉移回空氣飽和的溶液測量了恢 復至空氣飽和PO2水平，其大約以3. 2x0. 5mmHg/分鐘的速率發生。使用N2飽和培養基而不 是亞硫酸鈉試劑可發現類似的快速再平衡速率。細胞構建體在其核心(其中放置探針)經 過24小時的周期表現出時間依賴性氧消耗(圖4)。氧水平朝向基本穩定狀態或平穩值快 速降低，基本穩定狀態或平穩值根據細胞密度變化。因此，細胞消耗似乎是影響構建體中的 氧水平的唯一因素。細胞密度是氧消耗反應程度的關鍵決定因素，較低的核心PO2與較高 的細胞密度相關，該細胞密度范圍是從0、580萬、1160萬至2320萬細胞/ml。在這種情況 下，隨著細胞密度的每一升高，平穩O2壓顯著降低(p<0.001)。接種了 50萬細胞(終密 度為580萬細胞/ml)的構建體中心的氧水平在24小時后大約是80mmHg，與接種了 200萬 細胞(最終細胞密度是2320萬細胞/ml)的構建體相比，其水平是 25mmHg。在這24小時期間，在核心，細胞接觸低水平氧對細胞活力沒有影響。接觸了 SOmmHg和25mmHg之后，構建體核心的細胞都具有超過95%的活力(圖5)。因此細胞接觸低至25mmHg的氧壓在長達5天的時間不會提高細胞死亡。在第10天，在核心中觀察到達 55%的細胞死亡，與之相比表面上是40%。在這樣的3D模型中，關鍵的較高分子量營養物 的擴散也是細胞生存的限定因素。早先已經建立了葡萄糖擴散系數，未發現這對于相同的 3D模型中的細胞是有限定的[17]。圖6顯示了以初始細胞密度為200萬細胞(2320萬細胞/ml)接種的構建體的核心 O2經過10天的曲線圖。重要的是，在初始24小時跌至 25mmHg的第一個平衡水平之后， 核心氧壓升高至約60mmHg的第二個升高的穩定期。這可能是細胞消耗變化的結果，而不是 材料性能變化的結果(圖6)。經過10天，通過增殖，細胞數量沒有大的變化。5天后，核心 細胞活力仍然是80%，表面上的接近于100%。因此，在30小時和36小時培養期之間，穩 定的核心O2壓升高了 35mmHg(升高倍數> 2)，大約達到60mmHg。這是在6個小時期間中 發生的，與成纖維細胞代謝的變化和O2利用一致。在隨后的24小時基本保持在該水平，然 后在隨后的72小時中逐漸降回至 20mmHg。在研究的三種細胞密度的構建體中和經過10天培養的2320萬細胞/ml的構建體 中測量了 VEGF mRNA表達水平(圖7和圖8)。在24小時階段，三種細胞密度的相對VEGF 基因表達水平沒有顯著性差異，在這里顯示為相對于最高細胞密度(圖7)。經過更長的10 天周期，2320萬細胞/ml構建體中的VEGF表達水平顯著變化(圖8)。在第1天和第3天 之間(2320萬細胞/ml) VEGF表達升高了 5倍(ρ < 0. 05)，隨后在第3天和第7天之間有 小的逐步升高，達到了比第1天的水平增長了 11倍(P < 0. 05)。但是最大的變化是在第7 天和第8天之間觀察到的。表達跳至140倍，總共達到第1天的151倍。緊接著就是完全 表達(149倍)的崩塌，這使到第10天表達已返回至第1天水平。生長因子表達的顯著時 間峰(temporal spike)的這種模式是基于依次運行的多個不同分子元件的控制系統的特 征，這正是對血管生成刺激所預期的。如在該系統中，當只監控有序混合物中的一個生長因 子時，則會預期到VEGF表達中這樣的尖峰。在研究的較低細胞密度中未觀察到經過10天 的這種VEGF調節形式。在8天的培養期確定了貫穿螺旋構建體(2320萬細胞/ml)的厚度的VEGF表達的 區域變化，沿著O2壓梯度也是如此(核心、中部和表面)。在培養之后，通過展開螺旋構建 體測量了區域變化(圖9)。認為在大部分培養期間，凝膠核心部分的細胞(其是探針取樣 的區域)接觸20mmHg至60mmHg之間的O2水平，中部區域接觸60mmHg至IOOmmHg之間的O2 水平，在非常接近通氣培養基的外部接觸IOOmmHg至HOmmHg之間的O2水平。在核心區域 發現VEGF水平顯著較高，其中細胞接觸最低的O2水平。圖9顯示在這些條件下(即，第8 天的基礎區域異質)第8天的(2320萬細胞/ml)的VEGF表達梯度。重要的是，表面區域 中的細胞仍然表現出水平升高的信息(高于第1天的基礎VEGF水平4.7倍)。在中部和核 心區域，升高到高于第1天水平的7. 1倍和10. 1倍的表達，與O2壓和VEGF基因表達的直接 關系一致。然而，如果在表面區域發現了高O2壓，這表示細胞或者對可用的O2的極微弱降 低極度敏感，或者更可能是，表面區域細胞對產生的并且從核心細胞擴散出的早期細胞因 子或代謝信號(在這里未測量)做出反應。這表示存在擴大VEGF表達提高的區域的系統。“較深層，，細胞接受充足營養物和氧用于正常活性和最終用于生存的能力主導了 目前對于組織活力和3D細胞構建體的觀點。在完整組織中，這樣的因子顯然受到微血管灌 注的存在和速率的控制。沒有該過程時，在3D培養中，細胞完全依賴于從構建體邊緣的簡單擴散。但是，很少有(如果有的話)有效地定量確定的3D模型，其能夠測試基質密度和 細胞密度在O2消耗上的相互作用。因此，對于細胞易受低O2的影響的性能，以及其反應的 速率、程度和性質(不含細胞死亡)的概念是過分簡單的。重要的是，許多是基于腫瘤或其 它細胞群，胞外基質環境很少或沒有。本研究發展了第一個結締組織3D監控模型，以便精 確確定哪些因素控制并且它們怎樣影響駐留細胞的行為和生存。使用該模型，經過幾天研 究氧對VEGF的時間依賴性，以及空間測量。在該系統(體內)中有幾個達到3D構建體和組織的核心(離灌注點最遠)的最 低O2壓水平和速率的關鍵決定因素(1)細胞密度，其被認為是均勻分布的，但是可區域性 地變化和隨時間變化，(2)基質密度/對限定擴散成分(O2或其它營養物)的可滲透性，和 (3)細胞類型或細胞活性(即，細胞的O2需求，其取決于需氧/厭氧和活躍/靜止期；例如， 軟骨細胞、真皮成纖維細胞、成肌細胞)。3D膠原構建體的塑性壓縮工藝提供了對所有這些 因素的控制。通過初始接種和初始膠原含量(分別)乘以壓縮倍數(x58)確定細胞和基質 密度。膠原蛋白基質具有約88%水的納米纖維狀網格，使其對于O2是高度滲透的。在實驗的最初10-30分鐘，O2的初始消耗速率是非線性的，但是此后基本是穩定 的。在該系統中，O2降低的速率和O2的平衡消耗是完全可預知的，取決于細胞密度(圖4)。 除了相對較高的基質密度和構建體中心產生的O2消耗，以最高的細胞密度，在24小時時， 細胞活性未受影響，5天后只是稍微降低(活細胞>80%)(圖6)。為了將這與細胞對低O2 水平的反應的其它工作進行聯系，病理組織缺氧通常設定為< 或8mmHg[6’18]。結果是高 細胞密度構建體的核心的PO2水平從未跌至低于18mmHg，因此不是常規的組織缺氧(細胞 缺氧)(圖6)。這對于認為擴散梯度> Imm通常損害細胞的傳統看法提出了質疑，但是支持 這樣的觀點，即致密的纖維狀膠原只是代表了弱的擴散屏障(即，對于小分子是高度滲透 性的)。考慮到具有約88%液相的基質納米纖維狀網結構，這種對O2的高度滲透性是合理 的。在這里通過4. 5x0. 5mmHg/分鐘的O2再平衡速率(Imm的最短擴散途徑)確定了這種 高滲透性。重要的是，核心O2壓的更大幅度降低顯然取決于細胞數量，顯示出不一定是基質 擴散途徑長度決定細胞反應，而是覆蓋的每一個消耗O2的細胞層數目。這深入了解了為什 么與結締組織相比，細胞富集而基質薄弱的結構(腫瘤、器官)的核心更容易發生核心細胞 壞死。與第8天的總讀數相比，不同區域測量的VEGF整體水平顯著較低。這可能是由于處 理構建體慢，因為它們必須被小心地展開，在這期間(達1小時)VEGF值可能已經降低，因 為整個構建體中的細胞都接觸了正常含氧量，包括展開的最后階段的核心區域。接觸低氧 壓的細胞通過顯著升高TGF-b、血小板源生長因子(PDGF)和VEGF表達來產生反應。因此， 這樣看起來似乎一定程度地接觸低水平氧事實上有助于組織構建體成熟，并且事實上會對 細胞生存有益。改變O2壓對細胞增殖和分化的影響對于理解生理微環境如何影響細胞行為 是關鍵性的，已有工作顯示低水平的氧提高了多種細胞類型的增殖，包括成纖維細胞[22’23]。 降低的O2壓下的細胞生長不一定導致細胞死亡。當在2%氧( 15.2mmHg)下培養時，刺 激了滋養層細胞增殖，而當20% (152mmHg)時，細胞確實脫離細胞周期，開始提高分化[22]。 本研究中測量到的降低的02壓(降低至15mmHg)接近Ma等人的研究中使用的O2壓[22]，雖 然直接外推法在這里是不可靠的(dangerous)，但是由于細胞類型和細胞密度的差異，可提 取某些類似的。例如，其確實突出了似是而非的觀點3D細胞/基質培養物復合物由于氧消耗在中心可能發生細胞死亡，相較之下，數據顯示組織培養中的氧壓水平降低能提高細 胞增殖，并且事實上模擬了許多天然的細胞環境。因此，氧壓的準確和3D定位測量對于決 定我們對于任意給定3D組織模型的理解是關鍵性的。例如，必須調控局部的高水平和低水 平氧從而在不同階段刺激細胞增殖和細胞分化來使模型成熟。對持續的低氧壓(> 24小時，高密度)的三個細胞反應的第一個是顯著轉換至無 氧代謝，在23小時之后表現為氧壓的相對升高(圖4)。盡管證實這超過了本研究的范圍， 這樣的轉換至主導糖分解代謝似乎是最合理的解釋，因為在這種情況中可排除能夠解釋這 種核心O2升高的細胞數量或基質可滲透性的變化。這種細胞代謝的一致轉換不是令人驚 奇的。但是，確實顯示出這樣的細胞具有低O2反應，即使高于常規的病理組織缺氧，并且這 會激發進一步的下游反應。大多數組織修復和組織工程整合方法取決于由數種血管生成蛋 白(包括VEGF)激發的快速血管生成。轉錄因子HIF-Ia誘導VEGF的表達，轉錄因子HIF-Ia具有氧敏感降解結構域[24’ 25]。到第8天，細胞密集構建體中測量到VEGF mRNA水平的大幅度提高。這種上調的一個起 因可能是低水平O2或產生的糖分解代謝的持續期[26]。重要的是證實此時細胞死亡不明顯 (在第5天> 80%細胞活力)，因為這顯示了 VEGF反應是不依賴于死亡細胞(dying cells) 的。但是，到第10天，測量到細胞活力的降低，這已成為第10天VEGF水平降低的主要原因。 此外，能夠證明很多(盡管不是全部)VEGF反應是由于構建體核心的細胞，其中水平被認為 是20mmHg至60mmHg的范圍，而相比下構建體表面的是IOOmmHg至140mmHg。這是可實現 的，因為在氧測量之后可以展開3D螺旋模型，因此這可使我們對應空間位置定量標出哪里 的VEGF產生上調。細胞接觸O2取決于它們在凝膠構建體中所位于的特定區域，其相應地影 響了 VEGF水平。重要的是，當構建體接種了不同細胞密度(因此接觸構建體中不同的O2梯 度)時，至24小時未觀察到VEGF的上調。梯度由82mmHg至140mmHg變化(50萬)，66mmHg 至140mmHg (100萬)，和23mmHg至140mmHg (200萬)。這種體外受控系統可以使O2-依賴性 VEGF調控被仔細監控。因為O2水平未跌至低于15mmHg，并且肯定未低至7. 6mmHg (1 %氧)， 不能說VEGF上調的起因是典型的“病理組織缺氧”。因此，這種低水平O2 (生理組織缺氧范 圍內的)對于細胞刺激VEGF的信號的出現可能是通過其轉錄因子HIF-Ia的初始上調實現 的。為了評價體外預調整對于血管生成植入物的作用，如上所述產生3D膠原構建體 并且接種2xl06人真皮成纖維細胞(HDF)。通過ELISA測量體外培養5和10天后構建體中 的血管生成因子HIF-Ia和VEGF的量。體外培養之后在構建體中觀察到高水平的HIF-Ia 和高水平的VEGF(圖11和圖12)。通過ELISA，在未進行體外培養的對照凝膠中，HIF-Ia和 VEGF均未被觀察到。為了評價體內含有活細胞的血管生成植入物的效果，如上所述產生了 3D膠原構 建體并且接種2xl06人真皮成纖維細胞(HDF)(等于23xl06細胞/ml)。構建體進行體外預 調整5天，或不進行預調整。然后將構建體植入非細胞膠原包裹中，并且皮下植入兔子中 (皮下)。1周之后，回收該構建體(見圖13)。都觀察到從宿主向預調整和未預調整構建 體向內生長的血管，表示兩種類型的構建體都刺激兔子宿主中的血管生成反應。相對于未 預調整的構建體，在預調整的構建體中觀察到血管形成的增加。然后以接種了 5x10s人真皮成纖維細胞(HDF)(等于5xl06細胞/ml)的3D膠原構建體重復以上實驗。該構建體進行體外預調整5天，或不進行預調整。然后將構建體植入 非細胞膠原包裹中，并且皮下植入兔子中(皮下)。1周之后，回收該構建體并且評價血管 形成。觀察到進行了體外預調整的構建體中的血管形成。在未進行預調整的含有切105細 胞的構建體中未發生血管形成。在對照實驗中，同時將不含有細胞的3D膠原構建體皮下植入兔子中。1周之后，回 收非細胞構建體并且評價血管形成。未觀察到血管形成。為了評價體內不具有活細胞的血管生成植入物的效果，如上所述產生3D膠原構 建體并且接種MlO6人真皮成纖維細胞(HDF)(等于23xl06細胞/ml)。該構建體不進行預 調整(對照)或通過體外培養10天進行預調整，然后將所有的構建體在液氮中冷凍5分鐘， 植入非細胞膠原蛋白包裹中，皮下植入兔子中(皮下)。1周之后，回收該構建體。在未進 行預調整的對照構建體中未觀察到明顯的血管形成(圖14)。與之相對，在冷凍之前觀察到 宿主血管向內生長到已進行預調整的膠原植入物中(圖15)。因此，顯示出本文所述的細胞和非細胞血管生成植入物都促進血管生成。綜上所述，我們已經建立了基本模型，用于研究3D膠原基質中的人真皮成纖維細 胞的O2消耗。非常明顯，觀察到由于接觸較低水平的氧未對細胞活力造成有害影響。進而， 確定了在低PA但是非組織缺氧條件下的VEGF調節模式。本研究還顯示可改變自然發生 的血管生成信號，用于在植入之后在這樣的3D組織工程改造構建體中誘導血管生成。對于 3D構建體核心中的VEGF的產生，以及其它的細胞產生的血管生成信號，細胞產生的水平越 低，它們離表面越近，這些信號的梯度會誘導從3D構建體的表面朝向核心的血管形成，在 體內情況下可能引起從構建體外部的血管形成。例如，通過了解確定密度的和在確定基質 中的細胞何時和何處會上調VEGF產生，可用于促進植入物的體內整合。參考文獻1 Weaver, V. et al. (1997) J. Cell Biol. 137，231-245.2 Wang, F. et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，14821-14826.3 Weiss, P. (1959) Cellular dynamics. Rev. Mod. Phys. 31,11-20.4 Tomasek, J. J et al. (2002) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3，349-363.5 Grinnel1, F. (2003). Trends Cell Biol.13，264-269.6 Okazaki, K. M. and Maltepe, E. (2006)Regen. Med. 1，71-83.7 fferrlein, R. J. and Glinos, A. D. (1974) Nature 251，317-319.8 Tokuda, Y. et al(2000)J. Cell Physiol. 182，414—420.9 Gnaiger, E. et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97，11080-11085.10 Levenberg, S.et al (2005)Nat. Biotechnol. 23,879-884.11 Lussi, J. W. et al(2006). Biomaterials 27,2534—2541.12 Brown, R. A. et al. (2005) Adv. Funct. Mater. 15，1762—1770.13 Burt, A. and McGrouther, D. A. (1992)Production and use of skin cell cultures in therapeutic situation. In Animal Cell Biotechnology, vol.5, pp. 150-168, Spier, R. Ε. , Griffiths, J. B. (eds. ), Academic Press, New York.14 Cheema, U.et al (2003)Cell Motil. Cytoskeleton 54，226-236.15 Cheema, U. et al. (2007. Biotechnol. Bioprocess. Eng. 12,9-14.
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27,
Seddon, B.M.et al (2001)Radiat. Res. 155，837-846.
Rong, Ζ., et al(2006). Analyst 131，816-821.
Cooper, A.and Beasley, D. (1999)Am. J. Physiol. 277，H1326—H1337.
Falanga, V.et al (1991). J. Invest. Dermatol. 97,634-637.
Kourembanas, S. , et al(1990)J. Clin. Invest. 86,670-674.
Steinbrech, D.S et al (1999)J. Surg. Res. 84,127-133.
Ma, T.et al(2001)Tissue Eng. 7，495-506.
Falanga, V.and Kirsner, R. S. (1993)J. Cell Physiol. 154，506-510. Trentin, D. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103，2506-2511. Semenza, G. L. (1998) Curr. Opin. Genet. Dev. 8, 588-594. Kumar, V. B. et al. (2007) J. Cell Physiol. 211，477-485. Mudera V. et al J Tissue Eng Regen Med 2007 ；1 :192-198. 2權利要求
1.一種用于細胞培養的支架，包括在其表面上具有口袋的凝膠，其中所述口袋容納哺乳動物細胞。
2.根據權利要求1所述的支架，其中所述凝膠是膠原凝膠。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的支架，其中所述口袋的深度是200μπι至 5000 μ Hio
4.根據前述權利要求任一項所述的支架，其中所述口袋的直徑是50μ m至2000 μ m。
5.根據前述權利要求任一項所述的支架，其中所述口袋容納超過500萬細胞/毫升。
6.根據前述權利要求任一項所述的支架，其中所述哺乳動物細胞是干細胞。
7.根據權利要求6所述的支架，其中所述干細胞選自由角膜干細胞；皮膚表皮干細胞； 消化道干細胞；口腔_生殖干細胞；上皮干細胞；骨髓基質干細胞；和生長板干細胞組成的 組。
8.根據前述權利要求任一項所述的支架，其中所述口袋只容納細胞。
9.根據前述權利要求任一項所述的支架，其中所述哺乳動物細胞在所述口袋內產生擴 散因子和代謝廢物的濃度梯度。
10.根據權利要求9所述的支架，其中所述濃度梯度刺激所述口袋中的細胞分化和增殖。
11.一種培養哺乳動物細胞的方法，包括 在其表面上提供具有口袋的凝膠；向所述口袋接種哺乳動物細胞，以及 在培養基中孵育所述凝膠；其中所述口袋中的所述細胞的代謝致使營養物的量從所述口袋側邊向內逐漸降低。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述凝膠是膠原凝膠。
13.根據權利要求11或權利要求12所述的方法，其中所述口袋的深度是200μπι至 5000 μ Hio
14.根據權利要求11至13的任一項所述的方法，其中所述口袋的直徑是50μπι至 2000 μ Hio
15.根據權利要求11至14的任一項所述的方法，其中所述口袋容納超過500萬細胞/毫升。
16.根據權利要求11至15的任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是干細胞。
17.根據權利要求11至16的任一項所述的方法，其中所述干細胞選自由角膜干細胞； 皮膚表皮干細胞；消化道干細胞；口腔_生殖干細胞；上皮干細胞；骨髓基質干細胞；和生長板干細胞組成的組。
18.根據權利要求11至17的任一項所述的方法，其中所述口袋只容納哺乳動物細胞。
19.根據權利要求10至16的任一項所述的方法，其中所述營養物的濃度的逐漸降低刺 激所述口袋中的哺乳動物細胞的分化和增殖。
20.一種產生用于培養哺乳動物細胞的支架的方法，包括 提供凝膠，將所述凝膠的表面與在其表面上具有一個或多個突出的模具接觸，以使所述突出在所 述凝膠的表面內壓出口袋；以及向所述口袋接種哺乳動物細胞。
21.一種誘導或促進血管生成的方法，包括將血管生成植入物定位以接觸需要血管形成或灌注的組織，其中所述血管生成植入物 包括哺乳動物細胞；以及 允許所述細胞呼吸，其中所述細胞的呼吸使得氧壓降低；以及所述氧壓的降低致使所述細胞表達一種或多種血管生成因子。
22.根據權利要求21所述的方法，其中在包括所述哺乳動物細胞的所述植入物被定位 以與所述組織接觸之前，進行體外培養，其中體外培養的所述細胞的呼吸降低所述植入物中的氧壓，并且使所述細胞表達一種 或多種血管生成因子。
23.根據權利要求21所述的方法，其中在包括所述哺乳動物細胞的所述植入物被定位 以與所述組織接觸之前，沒有進行體外培養。
24.根據權利要求21至23的任一項所述的方法，其中將組織等效植入物定位以接觸所 述組織之后，所述植入物中的所述哺乳動物細胞的活力為至少80%，持續至少24小時。
25.一種誘導或促進血管生成的方法，包括體外培養包括哺乳動物細胞的血管生成植入物；以及允許所述細胞呼吸，從而所述細胞的呼吸降低氧壓，所述氧壓降低致使細胞表達一種 或多種血管生成因子，殺死所述哺乳動物細胞，以及將所述血管生成植入物定位以與需要血管形成或灌注的組織接觸。
26.根據權利要求25所述的方法，其中通過冷凍所述植入物殺死所述哺乳動物細胞。
27.根據權利要求25或權利要求26所述的方法，其中在被定位以與所述組織接觸之 前，儲存所述血管生成植入物。
28.根據權利要求21至27的任一項所述的方法，其中所述呼吸造成所述植入物內的氧 壓從植入物表面向內逐漸降低。
29.根據權利要求21至28的任一項所述的方法，其中所述凝膠中的所述細胞表達至少 一種血管生成因子，所述血管生成因子的量從所述植入物表面向內逐漸升高。
30.根據權利要求21至29的任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是成纖維細胞。
31.根據權利要求21至30的任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是非成纖維細胞。
32.根據權利要求21至31的任一項所述的方法，其中所述植入物內的氧壓降低至 8mmHg至60mmHg之間的水平。
33.根據權利要求21至32的任一項所述的方法，其中所述植入物包括并入所述哺乳動 物細胞的凝膠。
34.根據權利要求33所述的方法，其中所述凝膠是膠原凝膠。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述凝膠包括5%至25%(干/濕重比)的膠原。
36.根據權利要求33至35的任一項所述的方法，其中所述凝膠被塑性壓縮。
37.根據權利要求21至36的任一項所述的方法，其中所述植入物包括超過1200萬哺乳動物細胞/毫升。
38.根據權利要求21至37的任一項所述的方法，其中所述一種或多種血管生成因子從 所述植入物擴散到所述組織。
39.根據權利要求21至38的任一項所述的方法，其中所述植入物包括多層，并且所述 一種或多種血管生成因子優選在所述層的平面內擴散。
40.根據權利要求21至39的任一項所述的方法，其中通過提供接種哺乳動物細胞的凝 膠、并且塑性壓縮所述凝膠產生所述植入物。
41.根據權利要求21至40的任一項所述的方法，其中所述組織是皮膚或手術移植的組
42.根據權利要求21至41的任一項所述的方法，其中所述組織包括一種或多種創傷或 潰瘍，并且所述組織中的血管生成反應促進所述創傷或潰瘍愈合。
43.根據權利要求21至41的任一項所述的方法，其中所述組織包括手術造成的縫合。
44.根據權利要求21至40的任一項所述的方法，用于在治療與血管形成減少或受損相 關的狀況中促進血管生成。
45.根據權利要求44所述的方法，其中所述狀況選自由血管閉塞疾病； 外周動脈疾病；動脈粥樣硬化；肌內膜增殖；血栓閉塞性脈管炎；血栓性疾病；腸系膜缺血或肢體缺血；器官狹窄；脈管炎、心肌梗死或腦梗死或其它的 與血流量降低相關的血管性死亡、中風和肢體缺損組成的組。
46.一種包括哺乳動物細胞的血管生成植入物，所述植入物用于誘導或促進血管生成的方法；包括 將所述血管生成植入物定位以與需要血管形成或灌注的組織接觸；以及 允許所述細胞呼吸，其中所述細胞呼吸降低所述凝膠中的氧壓，所述氧壓的降低致使所述細胞表達一種或 多種血管生成因子。
47.包括哺乳動物細胞的血管生成植入物用于根據權利要求21至45的任一項所述的 誘導或促進血管生成的方法。
48.包括哺乳動物細胞的血管生成植入物在制造用于誘導或促進血管生成的方法的藥 物中的應用，包括將所述血管生成植入物定位以與需要血管形成或灌注的組織接觸；以及 允許所述植入物中的所述細胞呼吸，其中所述細胞的呼吸降低所述植入物中的氧壓，所述氧壓的降低導致所述細胞表達一 種或多種血管生成因子。
49.根據權利要求48所述的應用，其中所述促進血管生成的方法是根據權利要求21至 45的任一項所述的方法。
50.一種包括利用一種方法形成的一種或多種血管生成因子的血管生成植入物，所述 方法包括體外培養包括哺乳動物細胞的植入物；允許所述細胞呼吸，從而所述細胞的呼吸降低氧壓，所述氧壓的降低導致所述細胞表 達一種或多種血管生成因子；以及 殺死所述哺乳動物細胞。
51.根據權利要求50所述的血管生成植入物，其中通過冷凍所述植入物殺死所述細胞。
52.根據權利要求50或51所述的包括一種或多種血管生成因子的血管生成植入物用 于促進血管生成的方法，包括將所述血管生成植入物定位以與需要血管形成或灌注的組織 接觸，其中所述血管生成植入物包括一種或多種血管生成因子；以及 使所述一種或多種血管生成因子從所述植入物擴散到所述組織。
53.根據權利要求50所述的血管生成植入物，其中所述促進血管生成的方法是根據權 利要求21至45的任一項所述的方法。
54.根據權利要求50或51所述的包括一種或多種血管生成因子的血管生成植入物在 制造用于促進血管生成的方法的藥物中的應用，包括將所述血管生成植入物定位以與需要血管形成或灌注的組織 接觸，其中所述血管生成植入物包括一種或多種血管生成因子；以及 使所述一種或多種血管生成因子從所述植入物擴散到所述組織。
55.根據權利要求54所述的應用，其中所述促進血管生成的方法是根據權利要求21至 45的任一項所述的方法。
全文摘要
本發明涉及包含哺乳動物細胞的仿生植入物，其受到其環境的誘導從而產生擴散因子梯度。這可用于引發生理上的促血管生成反應，其刺激植入物附近的組織中的血管生成和血管再形成，例如在其中需要提高血管生成和/或血管發生的治療應用中。這也可用于提供用于細胞培養和分化的仿生哺乳動物細胞巢。
文檔編號A61L27/00GK102089425SQ200980126446
公開日2011年6月8日 申請日期2009年5月7日 優先權日2008年5月7日
發明者烏姆貝爾·切瑪, 埃克托拉斯·哈德杰帕納伊, 桑迪·麥克羅伯特, 羅伯特·布朗 申請人:Ucl商業有限公司