專利名稱：肝素偶聯的纖維蛋白凝膠及用于制備其的方法與試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及致力于修復受損組織和器官的組織工程，更具體地，涉及與轉移生長 因子有關的組織再生。具體地，提供了制備含有生長因子的與可注射肝素偶聯的纖維蛋白的方法，其中 將與纖維蛋白原偶聯的活化肝素與游離纖維蛋白原混合并溶解，然后將其與凝血酶混合， 從而獲得可注射肝素偶聯的纖維蛋白凝膠。同時，使對肝素具有親和力的生長因子與根據本發(fā)明的上述方法制備的肝素偶聯 的纖維蛋白凝膠物理結合，并注射入人體，從而提供生長因子的長時間緩釋。因此，其可以 用作用刺激諸如骨、皮膚、血管、軟骨等的組織再生的治療藥物。
背景技術：
組織工程是致力于修復由于疾病或意外而受損的組織和器官的研究領域。利用可 注射凝膠作為基質來再生組織的方法已經得到了廣泛的研究，并且可以減少恢復時間、痛 苦及患者的花費，因為可以將藥物容易地注射入靶位點而不需要外科手術方法。目前使用 的可注射凝膠的實例包括膠原蛋白凝膠、纖維蛋白凝膠和褐藻酸凝膠。特別地，由于可以從 患者血液獲得纖維蛋白凝膠，所以其不會引起免疫反應。因此，纖維蛋白凝膠作為用于組織 工程的自體基質獲得了極大的關注。纖維蛋白是一種硬蛋白，其是由血漿中的纖維蛋白原與酶凝血酶的反應所產生的 不溶性蛋白。即，在室溫下，通過酶促聚合，由與纖維蛋白原在凝血酶的存在的反應來制備 凝膠類型的纖維蛋白。這樣制備的纖維蛋白凝膠對于致力于修復受損組織和器官的組織工 程是有意義的。特別地，纖維蛋白凝膠促進遞送生長因子，因此進行了關于纖維蛋白凝膠的 各種研究以再生諸如骨、皮膚、血管、軟骨等的組織。由于肝素，其是一種糖胺聚糖，含有大量的硫酸根，因而帶有大量的負電，因此其 經常用作與特異性肝素偶聯的蛋白偶聯的親和力配體。親和力配體的特征還用于純化蛋白 的色譜。然而，最近的注意力集中于將這種特征用于將肝素偶聯的蛋白固定于蛋白藥物的 載體以特異性地遞送至身體的特定位點。
發(fā)明內容
本發(fā)明涉及制備與肝素直接偶聯的纖維蛋白凝膠的簡單方法，從而獲得所含藥物 的長期緩釋。本發(fā)明還涉及包含與肝素直接偶聯的纖維蛋白凝膠的蛋白載體，從而獲得所含藥 物的長期緩釋；以及用于制備上述纖維蛋白凝膠的試劑盒。
因此，本發(fā)明人進行了關于能夠含有大量生長因子而不使用肽的纖維蛋白凝膠組 合物的研究，從而實現制備與偶聯前活化的肝素直接偶聯的纖維蛋白原，另外，據發(fā)現，難以僅通過肝素直接偶聯的纖維蛋白原的交聯聚合獲得纖維蛋白 凝膠，但是纖維蛋白凝膠允許所含藥物的完美緩釋，并且可以通過與肝素直接偶聯的纖維 蛋白原和未與肝素偶聯的游離纖維蛋白原的交聯聚合來獲得便捷的操作。因此，本發(fā)明一方面提供了制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，該方法包括將 肝素活化；將所述活化的肝素與纖維蛋白原偶聯以制備肝素偶聯的纖維蛋白原；將前一步 驟中制備的肝素偶聯的纖維蛋白原與游離纖維蛋白原混合以制備纖維蛋白原混合物；以及 將前一步驟中制備的纖維蛋白原混合物與凝血酶混合。提供了用于制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的試劑盒，該試劑盒包含肝素偶聯的纖 維蛋白原、未與肝素偶聯的游離纖維蛋白原和凝血酶；以及生長因子載體，該生長因子載體 包含含有與肝素直接偶聯的纖維蛋白原的纖維蛋白凝膠和生長因子。根據制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，可以以低成本制備對諸如生長因子的 藥物具有親和力的肝素偶聯的纖維蛋白凝膠，通過注射入人體，持續(xù)地向局部位置長期持 續(xù)釋放諸如生長因子的藥物，可以將該纖維蛋白凝膠用作非常有效地再生諸如骨、皮膚、血 管、軟骨等的組織的治療藥物。
根據示例性實施方案的描述，并結合以下的附圖，將明確和更容易地理解本發(fā)明 的這些和/或其他目的。圖1示出證實活化的肝素是否與纖維蛋白原偶聯而獲得的NMR數據；圖2示出證實活化的肝素是否與纖維蛋白原偶聯而獲得的FIlR數據；圖3為示出以下內容的圖可注射肝素偶聯的纖維蛋白凝膠組合物中骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-2(BMP-2)的釋放行為；圖4為示出以下內容的照片分別利用無肝素纖維蛋白原或肝素偶聯的纖維蛋白 原與凝血溶液的混合物，通過交聯聚合的凝膠形成；圖5為示出以下內容的照片根據漸增含量的無肝素纖維蛋白原的凝膠形成；以 及圖6為示出以下內容的圖可注射肝素偶聯的PRP纖維蛋白凝膠組合物中血小板 源性生長因子(PDGF)的釋放行為。
具體實施例方式此后，參照示例性實施方案，將更詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明提供了制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，該方法包括將肝素活化； 將所述活化的肝素與纖維蛋白原偶聯以制備肝素偶聯的纖維蛋白原；將前一步驟中制備的 肝素偶聯的纖維蛋白原與游離纖維蛋白原混合以制備纖維蛋白原混合物；以及將前一步驟 中制備的纖維蛋白原混合物與凝血酶混合。本發(fā)明制備的纖維蛋白凝膠可以為可注射纖維 蛋白凝膠。根據本發(fā)明的制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，纖維蛋白原可以源自哺乳動物，并且優(yōu)選地源自人血漿。術語“肝素偶聯的纖維蛋白原”表示與通過本文所述的肝素活化而制備的肝素偶 聯的纖維蛋白原，并且本文分別使用的術語“游離纖維蛋白原”或“纖維蛋白原”表示未與 其他化合物，特別是未與肝素偶聯的纖維蛋白原。本發(fā)明的方法所用的肝素可以具有1000至20000的低分子量。本發(fā)明的制備纖維蛋白凝膠的方法中肝素的活化指可以通過任何方法將NHS-引 入肝素。盡管肝素的活化可以通過肝素、碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的反應進行，并活 化為NHS-肝素，但是本發(fā)明并不限于此。本發(fā)明的制備纖維蛋白凝膠的方法中肝素偶聯的纖維蛋白原的制備通過NHS-肝 素與纖維蛋白原之間的反應完成。特別地，肝素偶聯的纖維蛋白原通過NHS-肝素的羧基與 纖維蛋白原的蛋白中的氨基之間的反應來制備。同時，可以將通過所述反應制備的肝素偶 聯的纖維蛋白原容易地用于隨后的步驟，或根據其目的保存為液體或干粉類型以用于以后 的用途。優(yōu)選地，可以將肝素偶聯的纖維蛋白原凍干并容易地保存。在本發(fā)明的制備纖維蛋白原凝膠的方法中制備纖維蛋白原混合物中，游離纖維蛋 白原與肝素偶聯的纖維蛋白原的比率可以為1 1至5 1。在該范圍中，可以控制纖維蛋 白凝膠的凝塊形成。當比率低于1 1時，凝膠的機械性質不好，并且難以形成纖維蛋白凝 膠(參見圖幻。如果未形成凝膠，則不能提供本發(fā)明的目的延長的釋放，甚至當注射入人體 時，機械性質很差的凝膠由于大量的初始裂解而不能提供長期緩釋。在另一方面，當比率大 于5 1時，凝膠形成良好，但是纖維蛋白凝膠中與纖維蛋白原混合的肝素的相對量降低， 因而與其偶聯的生長因子的量也降低。因此，用與含有治療有效劑量的蛋白藥物的纖維蛋 白凝膠的量上升，而蛋白藥物的緩釋效率則下降。在一實施方案中，提供了制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的試劑盒，該試劑盒包含 肝素偶聯的纖維蛋白原、無肝素纖維蛋白原和凝血酶。試劑盒中肝素偶聯的纖維蛋白原與 無肝素纖維蛋白原的比率為1 1至5 1?？梢苑謩e地將肝素偶聯的纖維蛋白原、無肝素 纖維蛋白原和凝血酶凍干并保存，在本發(fā)明的制備凝膠的方法前，將它們的每一種溶于緩 沖溶液，然后共同混合。優(yōu)選地，在制備纖維蛋白凝膠之前，利用雙通道注射器，容易地將每 種溶于緩沖溶液的組分混合。在另一實施方案中，提供了用于制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的試劑盒，該試劑 盒除了肝素偶聯的纖維蛋白原、未與肝素偶聯的游離纖維蛋白原和凝血酶以外，包含與肝 素偶聯的生長因子。生長因子可以選自但不限于BMP、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長 因子-β (TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)。在本發(fā)明 中，可以包含至少一種生長因子，其可以是例如，通過混合各種類型的生長因子而產生的混 合物，例如富含血小板的血漿(PRP)。如何控制用于制備纖維蛋白的其他組分或反應條件是本領域技術人員已知的。例 如，為了溶解纖維蛋白原混合物，可以使用抑酶肽溶液。當通過纖維蛋白原與凝血酶的交聯 聚合來制備纖維蛋白時，抑酶肽延緩纖維蛋白的天然酶促降解。在本發(fā)明的方法中，可以將 凝血酶溶于含有氯化鈣的溶液中。取決于纖維蛋白原和凝血酶溶液的濃度，可以控制凝塊 形成時間和凝塊硬度。在這種情況下，溶解的凝血酶的量可以與纖維蛋白原混合物相同。在本發(fā)明的另一實施方案中，提供了生長因子載體，其包含具有肝素直接偶聯的
5纖維蛋白原的纖維蛋白凝膠；以及至少一種生長因子。使本發(fā)明制備的纖維蛋白凝膠與上 述生長因子鍵合，并以纖維蛋白凝膠組合物的形式注射入人體，從而向局部位置長期釋放 生長因子。因此，其可以用作刺激諸如骨、皮膚、血管、軟骨等的組織再生的治療藥物。特別 地，通過簡單地注射入人體，通過本發(fā)明的方法制備的纖維蛋白凝膠可以廣泛地用于治療 骨缺損、灼傷、糖尿病或缺血性足部潰瘍、缺血性心臟病、肢體缺血、退行性軟骨病等。實施例實施例1 肝素的活化將IOOmg(0. 00002摩爾)低分子量肝素(分子量=4000-6000 ；Sigma)完全溶于 Iml的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES，Sigma)緩沖溶液(0. 05M，pH 6.0)中，并向其中添加 0. 0046g的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，0. 00008M)和0. 015336g的鹽酸N-(3- 二甲基氨基丙 基)-N-乙基碳二亞胺(EDC，0. 004M)以在4°C下反應12小時，從而制備NHS-肝素溶液。利 用丙酮酸酐(acetone anhydride)，將NHS-肝素溶液沉淀并萃取，然后凍干M小時。^MM 1-1 活化的肝素與纖維蛋白原的偶聯將實施例1中制備的凍干NHS-肝素(60mg)和人血漿來源的纖維蛋白原(IOOmg) 完全溶于20ml的磷酸緩沖鹽水(pH 7.4)中，并在4°C下反應3小時。此時，纖維蛋白原緩 慢地溶解，從而不起泡。反應后，利用丙酮酸酐將所得的溶液沉淀并避光凍干，從而制備肝 素偶聯的纖維蛋白原。通過NMR和FTIR分析證實了活化的肝素與纖維蛋白原的偶聯，并且 分析結果分別示于圖1和2中。同時，將如上制備的肝素偶聯的纖維蛋白原完全溶于20ml 的磷酸緩沖鹽水中，并且于4°C下，通過多孔膜袋(MWCO :12-14000)滲析M小時將殘留的 未反應肝素洗脫，同時更換蒸餾水超過3次。將洗脫的肝素偶聯的纖維蛋白原避光凍干48 小時，從而獲得肝素偶聯的纖維蛋白原的白色粉末。實施例1-2 肝素偶聯的纖維蛋白原中肝素的定量實施例1-1中制備的肝素偶聯的纖維蛋白原中的肝素通過甲苯胺藍分析來定量。 簡言之，將肝素偶聯的纖維蛋白原添加至試管中的2ml的0. 02% NaCl水溶液中，然后添加 500 μ 1的含0. 005%甲苯胺藍的0. OOlN HCl溶液。將上述混合物孵育30分鐘，并溫和地搖 動。向混合物中添加3ml正己烷并劇烈搖動10至15秒，然后將混合物放置以穩(wěn)定層。當確 定除去泡時，借此穩(wěn)定地分離己烷的上層和水的下層，從水的下層取出約200μ 1的樣品以
進行ELISA。然后，利用UV分光光度計，于630nm處分析樣品。計算的肝素含量為42. 73mg/ g°實施例2 含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的纖維蛋白凝膠的制備將骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)溶于用作蛋白酶抑制劑的抑酶肽溶液中。將實施例1-1 中制備的肝素偶聯的纖維蛋白原(3:3mg)與可商購的人血漿來源的纖維蛋白原(66mg)以 1 2的比率混合，并溶于上述抑酶肽溶液(ΙΟΟΟμΙ)中，從而制備纖維蛋白原溶液。同時， 將等量的人血漿來源的凝血酶(IOmg)溶于溶解了氯化鈣的溶液(1000 μ 1)中，并與所述纖 維蛋白原溶液混合，從而獲得BMP偶聯的纖維蛋白凝膠(ΙΟΟμΙ)蛋白載體。實施例2-1 纖維蛋白凝膠中的BMP的釋放行為通過人工地將BMP與可商購的無肝素纖維蛋白凝膠混合來獲得對照組1，通過將 肝素和BMP與可商購的纖維蛋白凝膠混合來獲得對照組2。S卩，在對照組1和2中，使BMP 不與纖維蛋白凝膠和肝素混合，或者與纖維蛋白和肝素之一混合。
同時，將作為實驗組的實施例2中制備的BMP偶聯的纖維蛋白凝膠組合物緩慢地 在37°C下攪拌，并檢查BMP釋放行為觀天。BMP釋放行為示于圖3的圖中。如圖3所示， 可以證實，在開始的3天中，從對照組1和2的纖維蛋白凝膠組合物釋放了約80%或更多的 BMP，而在13天內從實驗組(本發(fā)明的實施例2)的纖維蛋白凝膠組合物中緩慢地釋放了約 80%或更多的與肝素偶聯的BMP。實施例3 游離纖維蛋白原和肝素含量對制備纖維蛋白凝膠的影響的評價通過凝血酶的作用檢查了肝素偶聯的纖維蛋白原是否能夠單獨地制備纖維蛋白 凝膠。不混合無肝素纖維蛋白原，根據實施例1制備了肝素偶聯的纖維蛋白原，并且利 用包含凝血酶的纖維蛋白制備條件，在形成凝膠的程度中進行檢查。當將抑肽酶緩沖溶液 中的纖維蛋白原與凝血酶溶液的混合物僅利用無肝素纖維蛋白原通過交聯進行聚合時，促 進了凝膠形成，但是當僅利用肝素偶聯的纖維蛋白原通過交聯將該混合物進行聚合時，沒 有形成凝膠(參見圖4)。在圖4中可以證實，甚至當在凝膠形成反應后將形成板傾斜時，利 用無肝素纖維蛋白原的產物不流動(rim)，而利用肝素偶聯的纖維蛋白原的產物不能形成 凝膠，因而會流動。然后，通過分別將纖維蛋白原與肝素偶聯的纖維蛋白原以1 1、1.5 1和2 1 的比率混合來制備纖維蛋白凝膠，所述纖維蛋白原在開始反應前沒有與肝素偶聯(游離纖 維蛋白原)。在圖5中，示出了根據無肝素纖維蛋白原的漸增含量而形成的凝膠。無肝素纖 維蛋白原含量的增加促進形成凝膠。實施例4 纖維蛋白凝膠中血小板源性生長因子的釋放行為將Iml富含血小板的血漿(PRP)與IOOmg纖維蛋白原混合物混合，所述纖維蛋白 原混合物是通過將實施例1-1中制備的肝素偶聯的纖維蛋白原與可商購的人血漿來源的 纖維蛋白原以1 2的比率混合而制備的，并且將人血漿來源的凝血酶(IOmg)溶于溶解了 氯化鈣的溶液(1000 μ 1)中，并與所述纖維蛋白原混合物溶液混合，從而獲得100 μ 1的PRP 偶聯的纖維蛋白凝膠蛋白載體。作為對照組，除了利用可商購的無肝素纖維蛋白凝膠以外，使用如上文所述地制 備的纖維蛋白凝膠蛋白載體。作為實驗組，將體外制備PRP-凝血酶纖維蛋白凝膠和PRP-肝素偶聯的纖維蛋白 原(HCF)在37°C下緩慢攪拌，并檢查血小板源性生長因子(PDGF)的釋放行為10天。PDGF 的釋放行為示于圖6的圖中。如圖6所示，可以證實，在第1天至第6天，從對照組纖維蛋 白凝膠釋放了大部分PDGF，而從實驗組緩慢地釋放了 PDGF，并且第10天的水平甚至高于第 1天，所述實驗組為PDGF-肝素偶聯的纖維蛋白凝膠。根據肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的制備方法，可以以低成本制備肝素偶聯的纖維蛋 白凝膠，其是與肝素偶聯的纖維蛋白凝膠，并且對諸如生長因子的藥物具有親和力。另外，通過與對肝素具有親和力的生長因子結合，可以將通過本發(fā)明的方法制備 的肝素偶聯的纖維蛋白凝膠制備為含有生長因子的纖維蛋白凝膠組合物。通過本發(fā)明的方 法制備的纖維蛋白凝膠組合物可以有效地遞送生長因子，因此通過注射入人體，持續(xù)地向 局部位置長期持續(xù)釋放諸如生長因子等的藥物，通過本發(fā)明的方法制備的纖維蛋白凝膠組 合物可以以低成本開發(fā)為能夠有效地治療治療骨缺損、灼傷、糖尿病或缺血性足部潰瘍、缺血性心臟病、肢體缺血和退行性軟骨病的高效治療藥物。 盡管示出和描述了本發(fā)明的示例性實施方案，但是本領域技術人員應當理解，可 以對所述的示例性實施方案做出各種變化而不偏離由所附權利要求及其等同物所定義的 本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，包括a)將肝素活化；b)將所述活化的肝素與纖維蛋白原偶聯以制備肝素偶聯的纖維蛋白原；c)將游離纖維蛋白原與步驟b)中的肝素偶聯的纖維蛋白原混合以制備纖維蛋白原混 合物；以及將凝血酶與步驟c)中的纖維蛋白原混合物混合。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述纖維蛋白凝膠為可注射凝膠。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述纖維蛋白原為源自哺乳動物的纖維蛋白原。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述哺乳動物為人。
5.如權利要求1或2所述的方法，其中所述肝素的分子量為約1000至約20000。
6.如權利要求1或2所述的方法，其中在步驟a)中，通過肝素、碳二亞胺和N-羥基琥 珀酰亞胺之間的反應將所述肝素活化為NHS-肝素。
7.如權利要求1或2所述的方法，其中在步驟b)中，所述肝素偶聯的纖維蛋白原通過 NHS-肝素的羧基與所述纖維蛋白原的蛋白中的氨基之間的反應來制備。
8.如權利要求1或2所述的方法，其中步驟c)中的纖維蛋白原混合物通過將所述纖維 蛋白原與所述肝素偶聯的纖維蛋白原以11至51的比率混合來制備。
9.用于制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的試劑盒，包含肝素偶聯的纖維蛋白原；未與肝素偶聯的游離纖維蛋白原；以及凝血酶。
10.如權利要求9所述的試劑盒，還包含與肝素偶聯的生長因子。
11.如權利要求9或10所述的試劑盒，其中所述生長因子包括選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMPs)、血管內皮生長因子(VEGFs)、轉化生長因子-β (TGF-β )、血小板源性生長因子 (PDGFs)和成纖維細胞生長因子(FGF)的至少一種。
12.生長因子載體，包含含有與肝素直接偶聯的纖維蛋白原的纖維蛋白凝膠和至少一 種生長因子。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，該方法包括將肝素活化；將所述活化的肝素與纖維蛋白原偶聯以制備肝素偶聯的纖維蛋白原；將游離纖維蛋白原與所述肝素偶聯的纖維蛋白原混合以制備纖維蛋白原混合物；并將凝血酶與所述纖維蛋白原混合物混合。另外，本發(fā)明提供了通過上述方法制備的肝素偶聯的纖維蛋白凝膠及用于制備其的試劑盒。根據制備肝素偶聯的纖維蛋白凝膠的方法，可以以低成本制備對諸如生長因子的藥物具有親和力的肝素偶聯的纖維蛋白凝膠，通過注射入人體，持續(xù)地向局部位置長期持續(xù)釋放諸如生長因子的藥物，可以將肝素偶聯的纖維蛋白凝膠用作非常有效地再生諸如骨、皮膚、血管、軟骨等的組織的治療藥物。
文檔編號A61F2/10GK102065917SQ200980123952
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權日2008年4月28日
發(fā)明者梁熙錫, 田梧住, 金柄秀 申請人:漢陽大學校產學協力團