專利名稱：具有延長的體內半衰期的因子viii，馮·維勒布蘭德因子或它們的復合物的制作方法
具有延長的體內半衰期的因子Vl II，馮·維勒布蘭德因子
或它們的復合物
技術領域：
本發明涉及編碼凝血因子VIII (FVIII)及馮 維勒布蘭德因子(VWF)以及它們的復合物及它們的衍生物的修飾的核酸序列，含該核酸序列的重組表達載體，用該重組表達 載體轉化的宿主細胞，所述核酸序列編碼的重組多肽及衍生物，所述重組多肽及衍生物具 有生物活性，及相比未修飾的野生型蛋白具有延長的體內半衰期和/或提高的體內恢復。 本發明還涉及導致提高的表達產率的相應FVIII序列。本發明還涉及制備該重組蛋白及它 們的衍生物的方法。本發明還涉及用于人基因治療的轉移載體，其包括該修飾的核酸序列。
背景技術：
有各種出血障礙凝血因子缺陷引發。最常見的障礙是血友病A及B，分別由凝血因 子VIII及IX缺陷所致。另一已知的出血障礙是馮·維勒布蘭德病。在血漿中，FVIII大多以與VWF的非共價復合物形式存在，及其促凝劑功能加速因 子X到Xa的因子IXa依賴的轉變。由于FVIII與VWF的復合物形成，長時間認為，FVIII 與VWF功能是同一分子的2個功能。到了七十年代才得知FVIII與VWF是在生理條件下形 成復合物的獨立的分子。到了八十年代測定出約0.2nmol/L的解離常數(Leyte et al., Biochem J 1989，257 :679_683)，及研究了 2 種分子的 DNA 序列。經典的血友病或血友病A是遺傳的出血障礙。其由凝血因子FVIII的染色體X-聯 鎖的缺陷所致，及以每10，000個人介于1個和2個個體之間的發病率幾乎僅影響男性。 X-染色體缺陷可被本身不是血友病患者的女性攜帶者傳遞。血友病A的臨床表現是增加的 出血趨勢。用FVIII濃縮物治療之前，患嚴重的血友病的人的平均壽命少于20年。自血漿 的FVIII濃縮物的使用顯著改善了血友病A患者的狀況，大大增加了平均壽命，假設他們中 的大部分活大致正常壽命的可能性。但是，已有某些有關源于血漿的濃縮物及它們的使用 的問題，其中最嚴重的問題是病毒傳播。迄今，導致乙型肝炎，非甲非乙型肝炎及AIDS的病 毒已經嚴重危害人群。從此以后，已新開發了不同的病毒滅活方法及新的高度純化的FVIII 濃縮物，它們也對于血漿來源的FVIII建立了非常高的安全標準。FVIII 的 cDNA 的克隆(Wood et al. 1984. Nature 312 330~336 ；Vehar et al. 1984. Nature 312 =337-342)使重組表達FVIII成為可能，導致開發了幾種重組FVIII 產物，它們已在1992和2003之間被有關機關批準。位于氨基酸Arg-740和Glu_1649之間 的FVIII多肽鏈的中央B結構域對于全生物活性似乎不是必需的事實也導致開發了刪除了 B結構域的FVIII。成熟的FVIII分子由2332個氨基酸構成，其可分為3個同源A結構域，2個同源C 結構域及1個B結構域，它們以下列順序排列A1-A2-B-A3-C1-C2。成熟的人FVIII的完整 氨基酸序列示于SEQ IDNO :15。在其分泌到血漿的過程中，FVIII被細胞內加工為一系列金 屬-離子連接的異源二聚體作為單鏈FVIII，其在B-A3邊界及在B-結構域內的不同位點被 切割。此加工產生由Al，A2及B-結構域的不同部分構成的異源重鏈分子，其具有90kD 200kDa的分子大小。此重鏈經金屬離子結合到輕鏈，所述輕鏈由A3，Cl及C2結構域構成 (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83 :89_96)。在血漿中，此異源二聚體FVIII以高親和性結 合馮 維勒布蘭德因子(VWF)，其保護其免于成熟前分解代謝。在血漿中非活化的FVIII結 合VWF的半衰期為約12小時。
通過由FXa及凝血酶在重鏈內的氨基酸Arg372及Arg740，及在輕鏈中的Argl689 蛋白水解切割活化凝血因子FVIII，導致馮·維勒布蘭德因子釋放及產生活化的FVIII異 源二聚體，其會在磷脂表面上與FIXa及FX形成tenase復合物，前提是Ca2+存在。異源二 聚體由Al結構域(50kDa片段)，A2結構域(43kDa片段)及輕鏈(A3-C1-C2) (73kDa片 段)構成。因此，活化形式的FVIII (FVIIIa)由通過二價金屬離子連接物與經凝血酶切割 的A3-C1-C2輕鏈連接的Al-亞基及與Al及A3結構域相對松散連接的游離A2亞基構成。為避免過量凝集，FVIIIa必需在活化之后很快滅活。經活化的蛋白C(APC)通過在 Arg336及Arg562切割的FVIIIa滅活不被認為是主要的限速步驟。反倒是非共價附著的 A2亞基從異源二聚體解離是凝血酶活化之后FVIIIa滅活中的限速步驟(Fay et al. 1991. J. Biol. Chem. 266 8957, Fay & Smudzin 1992. J. Biol. Chem. 267 13246-50) 這是很快的 過程，其解釋血漿中FVIIIa的短半衰期，其僅2. 1分鐘(Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83 89-96)。由于FVIII的約12 14小時的短血漿半衰期，嚴重的血友病A患者經歷預防性 治療FVIII必需每周靜脈內(i. v.)施用約3次。每次靜脈內施用都麻煩，伴隨疼痛及承擔 感染的風險，尤其是被診斷為血友病A的患者自己或兒童的父母在家進行時。因此非常需要制造出允許制備含FVIII的藥物組合物的具有增加的功能半衰期 的FVIII，其必需低頻度施用。已做了幾種嘗試，即通過如下手段延長非活化的FVIII的半衰期減少其與細 胞受體的相互作用(wo 03/093313A2, WO 02/060951A2)，將聚合物共價附著到FVIII (TO 94/15625，WO 97/11957 及 US4970300)，包裹 FVIII (W0 99/55306)，導入新的金屬結合位點 (W097/03193)，通過Jj太鍵(W0 97/40145 及 WO 03/087355)或二硫鍵(W002/103024A2)將 A2 結構域共價附著到A3結構域，或將Al結構域共價附著到A2結構域(W02006/108590)。增加FVIII或VWF的功能半衰期的其他方法是FVIII的PEG化(W0 2007/126808， WO 2006/053299, WO 2004/075923)或 VWF 的 PEG 化(W0 2006/071801)，具有增加的半衰期 的PEG化的VWF還會間接增加血漿中存在的FVIII的半衰期。由于以上所列方法中尚未有一種方法得到獲得批準的FVIII藥物，且由于向 FVIII野生型序列導入突變或導入化學修飾至少要承擔產生免疫原性FVIII變體的理論風 險，因此仍需要開發呈現延長的半衰期的修飾的凝血因子VIII分子。鑒于潛在的血栓形成風險，相比延長FVIIIa的半衰期，更期望延長非活化形式的 FVIII的半衰期。有缺失，功能上有缺陷或僅以減少的量在不同形式的馮·維勒布蘭德病(VWD)中 可用的VWF是哺乳動物血漿中存在的多聚體粘著糖蛋白，其有多種生理功能。初次止血期 間，VWF發揮血小板表面上的特異受體與細胞外基質成分(例如膠原)之間的介質的作用。 而且，VWF發揮促凝劑FVIII的載質及穩定蛋白的作用。VWF在內皮細胞及巨核細胞中合成 為2813個氨基酸的前體分子。野生型VWF的氨基酸序列及cDNA序列公開于Collins etal. 1987，Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397。前體多肽，前原 VWF，由見于成熟的血 漿VWF的22個殘基的信號肽，741個殘基的原肽及2050個殘基的多肽構成(Fischer et al.，FEBS Lett. 351 =345-348,1994) 0在內質網切割信號肽之后，在2個VWF單體之間形成 C-端二硫橋。在轉運通過分泌通路期間添加12個N聯的及10個0聯的碳水化合物側鏈。 更重要的是，VffF 二聚體經N-端二硫橋多聚化，及在晚期高爾基體中用酶PACE/弗林蛋白 酶切割下741個氨基酸長度的原肽。VWF(VWF-HMWM)的原肽以及高分子量多聚體儲存在內 皮細胞的魏伯爾_帕拉德小體內或血小板的α-顆粒內。一旦分泌到血漿中，蛋白酶ADAMTS13在VWF的Al結構域內切割VWF。血漿VWF因 此由整個范圍的多聚體構成，所述范圍從500kDa的單個二聚體到由分子量超過10，OOOkDa 的達多于20個二聚體構成的多聚體。VffF-HMWM因此具有最強的止血劑活性，其可以利托菌 素輔因子活性(VWF = RCo)測量。VWF:RCo/VWF抗原比越高，高分子量多聚體的相對量越高。VWF中的缺陷引發馮·維勒布蘭德病(VWD)，其特征在于多少顯著的出血表型。3 型VWD是最嚴重形式，其中WF完全缺失，1型VWD涉及定量喪失WF,且其表型可非常微 小。2型VWD涉及VWF的定性缺陷，且可嚴重如3型VWD。2型VWD有許多亞型，其中一些關 聯于高分子量多聚體的缺失或減少。2a型Von VWD的特征在于缺失中等的及大的多聚體。 2B型VWD的特征在于缺失最高分子量的多聚體。VWD是人最常見的遺傳出血障礙，且可通 過用含質粒或重組來源的VWF的濃縮物的取代療法治療。VWF可從人血漿中制備，例如描述 于EP 05503991。EP 0784632描述了分離重組VWF的方法。血漿中FVIII以高親和性結合von VWF，其保護其免于成熟前分解代謝，及因此除 了其初次止血中的作用之外，還在調節血漿FVIII水平中起關鍵作用，結果還是控制二次 止血的中心因子。血漿中非活化的FVIII束縛于VWF的半衰期為約12 14小時。3型 馮 維勒布蘭德病中，無或幾乎不存在VWF，FVIII的半衰期僅為約6小時，由于FVIII的降 低的濃度，該患者中導致微小到溫和的血友病A的癥狀。VWF對FVIII的穩定作用還用于輔 助 CHO 細胞中 FVIII 的重組表達(Kaufman et al. 1989，Mol Cell Biol)。 而今，血友病A及VWD的標準治療涉及頻頻靜脈輸注FVIII制劑及VWF濃縮物或 包括源于人供者血漿的FVIII及VWF的復合物的濃縮物，或在FVIII的情況中，基于重組 FVIII的藥物制劑。同時這些取代療法一般有效，例如在經歷預防性治療的嚴重的血友病A 患者中，由于約12小時的FVIII的短血漿半衰期，FVIII必需每周靜脈內(i. v.)施用約3 次。非血友病患者中上述的FVIII活性水平，例如通過升高0.01U/ml的FVIII水平， 將嚴重的血友病A轉變為溫和的血友病A。在預防性治療中，劑量方案設計為FVIII活性 的低谷水平不降到非血友病患者中FVIII活性的2 3%水平以下。每次靜脈內施用都麻 煩，伴隨疼痛及承擔感染的風險，尤其是常在由被診斷為患血友病A的患者自身或兒童的 父母進行的家中治療中。此外，頻頻靜脈內注射不可避免地導致瘢痕形成，干擾將來的輸 注。由于嚴重的血友病的預防性治療開始于生命的早期，兒童常常小于2歲，這更難以每周 注射FVIII 3次到那么小的患者的靜脈內。對于受限的時期，端口系統的植入常為替代性 方法。盡管重復的感染可發生，且端口可導致身體運動期間的不便，然而他們通常認為相比 靜脈內注射有利。人循環中人VWF的體內半衰期為約12 20小時。在VWD (例如3型)的預防性治 療中還高度希望發現延長VWF的功能半衰期的方法。另一加長VWF的功能半衰期的方法是PEG化(W02006/071801)，PEG化的VWF有增加的半衰期，其還間接加長血漿中存在的FVIII 的半衰期。但是，PEG或其他分子與治療性蛋白的化學綴合總是要承擔如下風險，由于與其他 蛋白的重要相互作用位點被罩住，特異活性降低，化學綴合在制備該蛋白中增加了額外的 步驟，降低了最終產率及加大的制備的成本。對人健康的長效影響也不清楚，因為目前已知 的PEG化的治療性蛋白不是如在馮 維勒布蘭德病的預防中施用的VWF或在血友病A中施 用的FVIII的情況中一樣需要終生施用。高度需要 得到未被化學修飾的長壽的VWF。現有技術中已描述了凝血因子與作為加長半衰期的多肽的白蛋白(W0 01/79271)，α-甲胎蛋白(W0 2005/024044)及免疫球蛋白(W02004/101740)的融合。這 些被連接到相應治療性蛋白部分的羧基_或氨基_端或者兩端，有時通過肽接頭連接，優選 通過由甘氨酸及絲氨酸構成的接頭連接。Ballance等人(TO 01/79271)描述了多個不同治療性多肽融合到人血清白蛋白 的N-或C-端融合多肽。其描述了潛在的融合偶體的長列表，但就是否相應白蛋白融合蛋 白實際上保持生物活性及具有提高的特性，未公開幾乎任何這些多肽的實驗數據。所述治 療性多肽列表中也提到了 FVIII及VWF。本領域技術人員不會認真考慮C-端融合，因為在FVIII的氨基酸2303與2332之 間的FVIII的甚C-端部分的FVIII的C2結構域包括血小板膜結合位點，其必要于FVIII 功能。這也是為什么這區域已知有許多導致血友病A的氨基酸突變。因此驚訝地發現，相 對大的異源多肽(如白蛋白)可融合到FVIII的C-端部分，而不通過阻止血小板結合阻止 FVIII功能。此外，C2結構域還含VWF的結合位點。這位點及氨基酸序列1649 1689負 責FVIII與VWF的高親和性結合。因此，本領域技術人員還不預期有C-端白蛋白融合的 FVIII會保持其與VWF結合。驚訝地發現，相對于Ballance等人的預測，白蛋白融合到FVIII的N-端不分泌到 培養基。因此及因為如上詳述的理由，更驚訝地發現，于其C-端部分融合到白蛋白的FVIII 分泌到培養基，及保持其包括結合活化的血小板膜及結合VWF在內的生物功能。還驚訝地發現，本發明的修飾的FVIII顯示相比野生型FVIII約20%增加的體內恢復。本領域技術人員還未想到將人白蛋白融合到VWF的N-或C-端。在N-端融合 中，白蛋白部分會在原肽加工期間被切割下。或如果略去原肽，多聚化不會發生。如上所 述，VffF的C-端必要于初始二聚化及必要于分泌，如SchMppenheim等人(Schr^ppenheim R. et al. 1996. Defective dimerization of VffF subunits due to a Cys to Arg mutationin VffD type IID. Proc Natl Acad Sci USA 93 3581-3586 ；Schneppenheim R. et al. 2001. Expression and characterization ofVffF dimerization defects in different types of VffD. Blood97 2059-2066.)，Baronciani 等人(Baronciani L. et al. 2000. Molecularcharacterization of a multiethnic group of 21 patients with VffD type3. Thromb. Haemost 84 :536_540)，Enayat 等人(Enayat MS et al. 2001. Aberrant dimerization of VffF as the result of mutations in thecarboxy-terminal region identification of 3 mutations in members of3 different families with type2A(phenotype IID) VWD. Blood98 :674_680)及 Tjernberg 等人(Τjernberg et al. 2006. HomozygousC2362F VffF induces intracellular retention of mutant VWFresulting in autosomal recessive severe VffD. Br J Haematol. 133 :409_418)所示。因此,本領域技 術人員不會想到大蛋白(如人白蛋白)與VWF的C-或N-端的融合，如其預期VWF的正常 二聚化或多聚化一樣，會被損壞。隨著VWF的更高多聚體在初次止血中最活躍，本領域技術 人員會考慮其他方法延長VWF的功能半衰期。現令人驚訝的發現，異源多肽(例如白蛋白)與VWF的C-端部分融合，不僅使得VWF嵌合蛋白從哺乳動物細胞表達及分泌，還得到保持顯著的VWF活性及形成高分子量多 聚體的修飾的VWF分子。此外，該修飾的VWF分子呈現延長的體內半衰期和/或提高的體 內恢復。發明概述本發明旨在提供具有加長的體內半衰期的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修 飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，以及修飾的 FVIII與修飾的VWF的復合物。本發明中術語“修飾的FVIII”或“修飾的VWF”是指融合到加長半衰期的多肽的 FVIII或VWF多肽，還含蓋FVIII或VWF的天然等位體，變體，刪除及插入。本發明還旨在提供具有提高的體內恢復的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修 飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，以及修飾的 FVIII與修飾的VWF的復合物。本發明另一目的在于，這修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修 飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，以及修飾的FVIII與修飾的 VWF的復合物可由哺乳動物細胞表達，及保持它們相應的生物活性。總之，本發明的所述修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVI11與非修飾的 VffF的復合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF的 復合物意料之外地保持生物活性，具有增加的體內半衰期及體內恢復。本發明的FVIII被修飾且活化之后A2結構域僅保持非共價連接到A3結構域的那 些實施方式的潛在益處是僅非活化形式的FVIII的半衰期增加，而活化形式的FVIII的半 衰期基本上保持相同，其相比導致活化形式的FVIII穩定的FVIII變體，可導致降低的血栓 形成風險。本發明的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復 合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF分子的復合 物可通過加長半衰期的蛋白(HLEP)部分與FVIII的C-端部分或與VWF的C-端部分融合產生。本發明中的HLEP選自白蛋白家族成員，其包括白蛋白，afamin, α -甲胎蛋白及 維生素D結合蛋白，以及免疫球蛋白恒定區部分及能在生理條件下結合白蛋白家族成員以 及結合免疫球蛋白恒定區部分的多肽。最優選的HLEP是人白蛋白。本發明因此涉及于所述修飾的FVIII和/或VWFC-端部分融合到HLEP的修飾的 FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與 修飾的VWF的復合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，特征在于所述修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與修 飾的VWF的復合物，或者所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物具有相比野生型FVIII、 或野生型VWF、或者野生型VWF與野生型FVIII的復合物的功能半衰期延長的功能半衰期。本發明還 涉及C-端融合到多于一個HLEP，其中所述HLEP (其融合幾次)可為相同 的HLEP或可為不同HLEP的組合。本發明還涉及于C-端部分融合到HLEP的修飾的FVIII，特征在于，所述修飾的 FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與修 飾的VWF的復合物，或者所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物具有相比野生型FVIII、 或野生型VWF、或者野生型VWF與野生型FVIII的復合物的體內恢復提高的體內恢復。本發明的另一實施方式是于C-端部分融合到HLEP的修飾的FVIII多肽，特征在 于，所述修飾的FVIII以比野生型FVIII更高的產率分泌到發酵培養基。本發明另一方面是編碼所述修飾的FVIII和/或所述修飾的VWF的多核苷酸或多 核苷酸的組合。本發明還涉及包括本文所述的多核苷酸的質粒或載體，涉及包括本文所述的多核 苷酸或質粒或載體的宿主細胞。本發明另一方面是產生修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修 飾的VWF的復合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，或者修飾的FVIII與修飾的 VffF的復合物的方法，包括(a)在所述修飾的凝血因子表達的條件下培養本發明的宿主細胞；及(b)任選從宿主細胞或從培養基回收所述修飾的凝血因子。本發明還涉及包括修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的 VffF的復合物，或者非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，或者修飾的FVIII與修飾的VWF 的復合物，多核苷酸，或本文所述的質粒或載體的藥物組合物。本發明另一方面是本發明的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與 非修飾的VWF的復合物，或者非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，或者修飾的FVIII與 修飾的VWF的復合物，一種或多種多核苷酸，或一種或多種質粒或載體，或宿主細胞用于制 備治療或預防血凝集障礙的藥物的用途。發明詳述本發明涉及復合物，其包括=FVIII及von VWF，或其獨立多肽成分之一，其中所 述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的C-端部分融合到加長半衰期的多肽 (HLEP)的N-端部分。本發明還涉及修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的 VffF的復合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者包括修飾的FVIII及 修飾的VWF的復合物，其中所述修飾的FVIII于FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分融合到 HLEP的N-端部分，或所述修飾的VWF于VWF的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的 N-端部分酸。本發明的優選實施方式涉及修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的 FVIII及非修飾的VWF的復合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者包 括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中，
(a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延長的功能半衰期，或(b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延長的功能半衰期，或(c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物具有相比包括野生型FVIII 及野生型VWF的相應復合物的功能半衰期延長的功能半衰期，或(d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比包括野生型FVIII 及野生型VWF的相應復合物的功能半衰期延長的功能半衰期，或(e)所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物具有相比包括野生型FVIII及野生 型VWF的相應復合物的功能半衰期延長的功能半衰期。本發明的優選實施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復 合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述修飾的多肽具有相比相應野生型多肽 的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多 種所述修飾的多肽的復合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應復合物的功能半衰 期增加至少25%的功能半衰期。本發明的另一實施方式是修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII 及非修飾的VWF的復合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者包括修飾 的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中，
(a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型 FVIII及野生型VWF的相應復合物的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比野生型FVIII與野 生型VWF的相應復合物的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比野生型FVIII與野生 型VWF的相應復合物的抗原半衰期延長的抗原半衰期。本發明的優選實施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復 合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述修飾的多肽具有相比相應野生型多肽 的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多 種所述修飾的多肽的復合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應復合物的抗原半衰 期增加至少25%的抗原半衰期。本發明的再一實施方式是修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII 及非修飾的VWF的復合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者包括修飾 的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中，(a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的體內恢復增加的體內恢復，或(b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的體內恢復增加的體內恢復，或(c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型 FVIII及野生型VWF的相應復合物的體內恢復增加的體內恢復，或(d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型 FVIII及野生型VWF的相應復合物的體內恢復增加的體內恢復，或(e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應復合物的體內恢復增加的體內恢復。本發明的另一優選的實施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述修飾的多肽具有相比相應野生 型多肽的體內恢復增加至少10%的體內恢復，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括 多種所述修飾的多肽的復合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應復合物增加至少 10%的體內恢復。本發明的另一優選的實施方式是(a)如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述 修飾的多肽的復合物，其中所述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的C-端氨 基酸融合到HLEP的N-端部分，或(b)如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述 修飾的多肽的復合物，其中所述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的C-端部 分融合到HLEP的N-端氨基酸，或(c)如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述 修飾的多肽的復合物，其中所述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的C-端氨 基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。本發明的另一優選的實施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多 肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述修飾的多肽具有野生型多肽的 生物活性的至少10%，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的 復合物具有野生型FVIII與野生型VWF的相應復合物的生物活性的至少10%。本發明還包括制備具有增加的功能半衰期的修飾的FVIII或修飾的VWF的方法， 包括將加長半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分或融合到 VffF的主要翻譯多肽的C-端部分；以及制備包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物，或 者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合 物的方法，通過混合上述方法制備的修飾的FVIII與野生型VWF，或通過混合野生型FVIII 與上述方法制備的修飾的VWF，或通過混合上述方法制備的修飾的FVIII與修飾的VWF。本發明還包括下列物質用于制備同時、分開或依次用于治療出血障礙，優選用于 治療血友病A和/或馮·維勒布蘭德病的聯合藥物制劑的用途(a)上述方法制備的修飾的FVIII及野生型VWF，或(b)野生型FVIII及上述方法制備的修飾的VWF，或(c)上述方法制備的修飾的FVIII及上述方法制備的修飾的WF0本發明中的“功能半衰期”是所述修飾的FVIII或所述修飾的VWF，或者修飾的 FVIII與非修飾的VWF的復合物或非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，或者修飾的 FVIII與修飾的VWF的復合物一旦施用給哺乳動物的生物活性半衰期，及可在所述修飾的 FVIII或所述修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，或者非修飾的FVIII 與修飾的VWF的復合物，或者所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物已施用之后，從所述 哺乳動物以不同的時間間隔取得的血樣品中體外測量。詞"融合"或"融合的"是指將氨基酸添加到FVIII的C-端部分和/或VWF的 C-端部分。當本文說道“融合到FVIII的C-端氨基酸”或“融合到VWF的C-端氨基酸”，時，是指于成熟的野生型FVIII的氨基酸2332的cDNA序列精確融合到FVIII的C-端氨基 酸，或于野生型成熟的VWF的氨基酸2050精確融合到VWF的C-端氨基酸。成熟的FVIII或 成熟的VWF是指原肽切割之后的相應多肽。但是，本發明還含蓋本發明中的“融合到FVIII 的C-端部分”或“融合到VWF的C-端部分”，其還可包括分別融合到FVIII和/或VWF分 子，其中一個或多個氨基酸位置，直到η個氨基酸從FVIII和/或VWF的C-端氨基酸被刪 除。η是不應大于FVIII和/或VWF的氨基酸總數的5%，優選不大于的整數。通常，η 是20，優選15，更優選10，再更優選5或更小(例如1，2，3，4或5)。 在一實施方式中，所述修飾的FVIII具有以下結構N-FVIII-C-L1-H，[式 1]其中，N是FVIII的N-端部分，Ll是化學鍵或接頭序列，H 是 HLEP，及C是FVIII的C-端部分。另一實施方式中所述修飾的VWF具有以下結構N-VWF-C-L1-H,[式 2]其中，N是VWF的N-端部分，Ll是化學鍵或接頭序列，H 是 HLEP，及C是VWF的C-端部分。Ll可為由一個或多個氨基酸構成的化學鍵或接頭序列，例如1 20，1 15，1 10，1 5或1 3(例如1，2或3)個氨基酸，及其可彼此相同或不同。通常，接頭序列不存 在于野生型凝血因子的相應位置。存在于Ll中的適宜氨基酸的例包括Gly及Ser。優選的HLEP序列如下所述。本發明還包括到相應HLEP的精確“N-端氨基酸”的 融合體，或到相應HLEP的“N-端部分”的融合體，其包括N-端刪除HLEP的一個或多個氨 基酸。本發明的所述修飾的FVIII或所述修飾的VWF或所述修飾的FVIII與非修飾的 VffF的復合物，非修飾的FVIII與所述修飾的VWF的復合物或所述修飾的FVIII與修飾的 VffF的復合物可包括多于一個HLEP序列，例如2或3個HLEP序列。這些多個HLEP序列可 串聯融合到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分，例如作為連續重復子。FVIII可在各階段經蛋白水解加工。例如，如上所述，在其分泌到血漿期間，單鏈 FVIII在細胞內在B-A3邊界及在B-結構域內的不同位點被切割。重鏈經金屬離子束縛到 具有結構域結構A3-C1-C2的輕鏈。FVIII經在重鏈內的氨基酸Arg372及Arg740及在輕鏈 內的Argl689蛋白水解切割而活化產生活化的由Al結構域，A2結構域，及輕鏈(A3-C1-C2) 構成的FVIII異源二聚體，73kDa片段。因此，活躍形式的FVIII (FVIIIa)構成由通過二價 金屬離子連接物與凝血酶切割的A3-C1-C2輕鏈連接的Al-亞基及與Al及A3結構域相對 松散連接的游離A2亞基。因此，本發明還含蓋不存在為單鏈多肽，但由經非共價鍵彼此連接的幾個多肽(例如1個或2個或3個)構成的修飾的FVIII。優選N-FVIII-C包括FVIII的全長序列。只要保持FVIII的生物活性，還包括 FVIII的N-端，C-端或內部缺失。如果具有缺失的FVIII保持至少10%，優選至少25%， 更優選至少50%，最有選至少75%的野生型FVIII的生物活性，則在本發明中認為保持生 物活性。FVIII的生物活性可如下所述由本領域技術人員測定。測定FVIII的生物活性的適宜測試例如一步或兩步凝集試驗(Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloomed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992)或顯色底物 FVIII: C 試驗(S. Rosen，1984. Scand J Haematol 33: 139-145，suppl.)。將這些參考文獻的內容通過引用并入本文。成熟的野生型的人凝血因 子FVIII的cDNA序列及氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO 14及SEQ ID NO :15。說道特 定序列的氨基酸位置，是指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白中的位置，及不排除突變的存 在，所述突變例如在所述序列中的其他位置的缺失，插入和/或置換。例如，SEQ ID N0 15 的〃 Glu2004〃中的突變不排除在修飾的同源體中，在SEQ ID NO 15的位置1 2332的 一個或多個氨基酸缺失。術語〃凝血因子VIII"，〃因子VIII 〃及“FVIII"在本文互換使用。“凝血因 子VIII"包括野生型凝血因子FVIII，以及具有野生型凝血因子FVIII的促凝劑活性的野 生型凝血因子FVIII的衍生物。衍生物可相比野生型FVIII的氨基酸序列有缺失，插入和 /或添加。術語FVIII包括蛋白水解加工形式的FVIII，例如活化之前的形式，包括重鏈及 輕鏈。術語〃 FVIII"包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少25%，更優選至少 50%，最有選 至少75%的任何FVIII變體或突變體。作為非限制性實施例，FVIII分子包括阻止或減少APC切割的FVIII突變 體(Amano 1998. Thromb. Haemost. 79 :557_563)，進一步穩定 A2 結構域的 FVIII 突變 體(W0 97/40145)，導致增加的表達的 FVIII 突變體(Swaroop et al. 1997. JBC 272 24121-24124)，降低其免疫原性的 FVIII 突變體(Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82 505-508)，由差異表的重鏈及輕鏈重構的 FVIII (Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31 95-100)，降低與受體結合導致FVIII如HSPG(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP (低 密度脂蛋白受體關聯蛋白)分解代謝的FVIII突變體(Ananyeva et al. 2001. TCM, 11 251-257)，二硫鍵-穩定的 FVIII 變體(Gale et al.，2006. J. Thromb. Hemost. 4 1315-1322)，具有提高的分泌特性的 FVIII 突變體(Miao et al.，2004. Blood 103 3412-3419)，具有增加的輔因子特異活性的FVIII突變體(ffakabayashi et al. ,2005. Biochemistry 44 :10298_304)，具有提高的生物合成及分泌，將少的ER伴侶蛋白相互作 用，提高的ER-Golgi轉運，增加的活化或針對滅活的抗性及提高的半衰期的FVIII突變體 (總結于 Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30 227-237)。所有這些 FVIII 突變體及變體通 過引用整體并入本文。VWF可在各階段經蛋白水解加工。例如，如上所述，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A2 結構域內切割VWF。因此，本發明還含蓋已被蛋白水解切割(例如被ADAMTS13)的修飾的 VWF。所述切割會產生在它們的末端包括至少1個或最多2個已被ADAMTS 13切割的VWF 單體的VWF多聚體鏈。
優選N-VWF-C包括VWF的全長序列。只要保持VWF的生物活性，還包括VWF的 N-端，C-端或內部缺失。如果具有缺失的VWF保持至少10%，優選至少25%，更優選至 少50%，最有選至少75%的野生型VWF的生物活性，則在本發明中認為保持生物活性。 野生型VWF的生物活性可由本領域技術人員使用利托菌素輔因子活性(Federici AB et al. 2004. Haematologica 89 :77_85)，VWF 與血小板糖蛋白復合物 Ib-V-IX 的 GP Iba 的結 合(Sucker et al. 2006. Clin ApplThromb Hemost. 12 :305_310)，或膠原結合試驗(Kallas & Talps印· 2001. Annals of Hematology 80:466—471)的方法來測定。在上述定義內〃 FVIII"和/或〃 VWF 〃還包括可在個體之間存在及出現的天然 等位變異。在上述定義內“FVIII"和/或"VWF"還包括FVIII及或VWF的變體。該變體 與野生型序列相差一個或多個氨基酸殘基。該差異的例可包括保守氨基酸置換，即具有類 似特性的氨基酸組內置換，例如(1)小氨基酸，(2)酸性氨基酸，(3)極性氨基酸，(4)堿性 氨基酸，(5)疏水性氨基酸，及(6)芳族氨基酸。所述保守置換的例顯示于下表。表權利要求
1.復合物，其包括因子VIII(FVIII)及馮·維勒布蘭德因子(VWF)，或其獨立多肽成 分之一，其中所述復合物的至少一種多肽成分或其獨立成分中的至少一種于其主要翻譯產 物的C-端部分融合到加長半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。
2.修飾的FVIII，或者 修飾的von VWF，或者 包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中，所述修飾的FVIII于FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或 所述修飾的VWF于VWF的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分酸。
3.權利要求1或2的 修飾的FVIII，或者 修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中，(a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延長的功能半衰期，或(b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延長的功能半衰期，或(c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物具有相比包括野生型FVIII及野 生型VWF的相應復合物的功能半衰期延長的功能半衰期，或(d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比包括野生型FVIII及野 生型VWF的相應復合物的功能半衰期延長的功能半衰期，或(e)所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF 的相應復合物的功能半衰期延長的功能半衰期。
4.權利要求3的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾 的多肽的復合物，其中，所述修飾的多肽具有相比相應野生型多肽的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物具有相比野 生型FVIII與野生型VWF的相應復合物的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期。
5.權利要求1或2的 修飾的FVIII，或者 修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中(a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應復合物的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比野生型FVIII與野生型 VffF的相應復合物的抗原半衰期延長的抗原半衰期，或(e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF 的相應復合物的抗原半衰期延長的抗原半衰期。
6.權利要求5的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾 的多肽的復合物，其中，所述修飾的多肽具有相比相應野生型多肽的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物具有相比野 生型FVIII與野生型VWF的相應復合物的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期。
7.權利要求1或2的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物，其中(a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的體內恢復增加的體內恢復，或(b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的體內恢復增加的體內恢復，或(c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型FVIII 及野生型VWF的相應復合物的體內恢復增加的體內恢復，或(d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型FVIII 及野生型VWF的相應復合物的體內恢復增加的體內恢復，或(e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復合物具有相比所述包括野生型FVIII及 野生型VWF的相應復合物的體內恢復增加的體內恢復。
8.權利要求7的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾 的多肽的復合物，其中，所述修飾的多肽具有相比相應野生型多肽的體內恢復增加至少10%的體內恢復，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物具有相比野 生型FVIII與野生型VWF的相應復合物增加至少10%的體內恢復。
9.以上權利要求中任一項的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括 多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的 C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分。
10.以上權利要求中任一項的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括 多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的 C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸。
11.以上權利要求中任一項的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括 多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述復合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產物的 C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。
12.以上權利要求中任一項的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括 多種所述修飾的多肽的復合物，其中，所述修飾的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10%，或所述包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物具有野生型 FVIII與野生型VWF的相應復合物的生物活性的至少10%。
13.以上權利要求中任一項的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括 多種所述修飾的多肽的復合物，其中所述HLEP選自白蛋白家族蛋白及免疫球蛋白恒定 區。
14.權利要求13的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復合物或包括多種所述修 飾的多肽的復合物，其中所述HLEP是白蛋白或其片段。
15.以上權利要求中任一項的重組的修飾的FVIII，其中所述重組的修飾的FVIII以比 野生型FVIII更高產率由哺乳動物細胞分泌。
16.多核苷酸或多核苷酸組，其編碼權利要求1 15中任一項的多肽，或者包括所述修 飾的多肽的復合物或包括多種所述修飾的多肽的復合物。
17.質粒或載體，所述質粒或載體包括權利要求16的多核苷酸，或質粒或載體組，所述 組包括權利要求16的多核苷酸組。
18.權利要求17的質粒或載體，或者質粒或載體組，所述質粒或載體是表達載體。
19.權利要求17的載體或載體組，其為用于人基因治療的轉移載體。
20.宿主細胞，其包括權利要求16的多核苷酸或多核苷酸組，或者權利要求17 19中任一項的質粒或載體，或者質粒或載體組。
21.產生修飾的VWF的方法，包括(a)在所述修飾的VWF表達的條件下培養權利要求20的宿主細胞；及(b)任選從宿主細胞或從培養基回收所述修飾的VWF。
22.藥物組合物，其包括權利要求1 15中任一項的多肽或包括所述修飾的多肽的復合物，權利要求16的多核苷酸或多核苷酸組，或權利要求17 19中任一項的質粒或載體，或者質粒或載體組。
23.下列用于制備治療或預防血凝集障礙的藥物的用途權利要求1 15中任一項的多肽或包括所述修飾的多肽的復合物，權利要求16的多核苷酸或多核苷酸組，或權利要求17 19中任一項的質粒或載體，或者質粒或載體組，或權利要求20的宿主細胞。
24.權利要求23的用途，其中所述血凝集障礙是血友病A。
25.權利要求23的用途，其中所述血凝集障礙是馮·維勒布蘭德病。
26.權利要求23 25中任一項的用途，其中所述治療包括人基因治療。
27.制備具有增加的功能半衰期的修飾的FVIII或修飾的VWF的方法，包括將加長半衰 期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分或融合到VWF的主要翻譯 多肽的C-端部分。
28.制備下列復合物的方法包括修飾的FVIII與非修飾的VWF的復合物，或者 包括非修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物，或者 包括修飾的FVIII與修飾的VWF的復合物， 如下制備混合通過權利要求27的方法制備的修飾的FVIII與野生型VWF，或 混合野生型FVIII與通過權利要求27的方法制備的修飾的VWF，或 混合通過權利要求27的方法制備的修飾的FVIII與修飾的VWF。
29.下列物質用于制備同時、分開或依次用于治療出血障礙，優選用于治療血友病A和 /或馮·維勒布蘭德病的聯合藥物制劑的用途(a)通過權利要求27的方法制備的修飾的FVIII及野生型VWF，或(b)野生型FVIII及通過權利要求27的方法制備的修飾的VWF，或(c)通過權利要求27的方法制備的修飾的FVIII及通過權利要求27的方法制備的修 飾的VWF。
全文摘要
本發明涉及編碼凝血因子VIII(FVIII)及馮·維勒布蘭德因子(VWF)以及它們的復合物及它們的衍生物的修飾的核酸序列，含該核酸序列的重組表達載體，用該重組表達載體轉化的宿主細胞，所述核酸序列編碼的重組多肽及衍生物，所述重組多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修飾的野生型蛋白具有延長的體內半衰期和/或提高的體內恢復。本發明還涉及導致提高的表達產率的相應FVIII序列。本發明還涉及制備該重組蛋白及它們的衍生物的方法。本發明還涉及用于人基因治療的轉移載體，其包括該修飾的核酸序列。
文檔編號A61K38/37GK102076855SQ200980123818
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月24日 優先權日2008年6月24日
發明者H·林德, H·米茲尼爾, S·舒爾特, T·魏默, U·克龍塞勒, W·朗 申請人:Csl百靈有限公司