專利名稱：人源化抗因子d抗體及其用途的制作方法
人源化抗因子D抗體及其用途對相關申請的交叉引用依據37CFR § 1. 53(b)提交的此非臨時申請依據35USC § 119(e)要求2008年4月 28日提交的美國臨時申請流水號61/048，431和2008年4月四日提交的美國臨時申請流 水號61/048，689的好處，通過述及將其內容完整收入本文。
背景技術：
補體系統在清除免疫復合物和對傳染劑、外來抗原、受到病毒感染的細胞和腫瘤 細胞的免疫應答中發揮中樞作用。然而，補體還涉及病理性炎癥和自身免疫病。因此，抑制 過度的或不受控制的補體級聯活化能給具有此類疾病和狀況的患者提供臨床好處。補體系統涵蓋兩種截然不同的活化途徑，稱作經典和旁路途徑(V. M. Holers,在 Clinical Immunology-Principles and Practice 中，R.R.Rich 編，MosbyPress ;1996, 363-391)。經典途徑是一種鈣/鎂依賴性級聯，其在正常情況中通過形成抗原-抗體復合 物來活化。旁路途徑是一種鎂依賴性級聯，其通過C3在某些易感表面(例如酵母和細菌細 胞壁多糖，和某些生物聚合物材料)上沉積和活化來活化。補體途徑的活化產生補體蛋白 質的生物學活性片段，例如C3a、Wa和Cfe過敏毒素和C^b_9膜攻擊復合物(MAC)，其介導 涉及白細胞趨化性，巨噬細胞、嗜中性粒細胞、血小板、肥大細胞和內皮細胞活化，血管通透 性，細胞溶解，和組織損傷的炎癥活性。因子D是一種高度特異性的絲氨酸蛋白酶，其對于旁路補體途徑的活化是至關 重要的。它切割結合至C3b的因子B，產生C3b/m3酶，即旁路途徑C3/C5轉化酶的活性成 分。因子D可能是抑制的合適靶物，因為它在人體中的血漿濃度非常低(1.8yg/ml)，而 且它已經顯示出是旁路補體途徑活化的限制酶(P. H. Lesavre和H. J. Muller-Eberhard, J. Exp. Med.，1978 ； 148 :1498-1510 J.E. Volanakis et al. , New Eng. J. Med. ,1985 ；312 395-401)。已經在動物模型和離體研究中證明下調補體活化有效治療數種疾病適應證， 例如系統性紅斑狼瘡和腎小球腎炎(Y. Wang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ； 1996， 93 :8563-8568)、類風濕性關節炎(Y. Wang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.，1995 ； 92 :8955-8959)、心肺轉流術和血液透析(C. S. Rinder，J. Clin. Invest.，1995 ；96 1564-1572)、器官移植中的超急性排斥反應(T. J. Kroshus etal.，Transplantation，1995 ； 60 :1194-1202)、心肌梗死(J. W. Homeister et al.，J. Immunol.，1993 ；150 :1055-1064 ； H. F. Weisman et al.，Science, 1990 ;249 146-151)、再灌注損傷(E. A. Amsterdam et al.， Am. J. Physiol.，1995 ；268 :H448_H457)、和成人呼吸窘迫綜合征(R. Rabinovici et al.， J. Immunol. , 1992 ； 149 :1744-1750)。另外，其它炎性狀況和自身免疫/免疫復合物疾病也 與補體活化密切有關(V. M. Holers,見上文；B. P. Morgan. Eur. J. Clin. Invest.，1994 :24 219-228)，包括熱傷、嚴重的哮喘、過敏性休克、腸炎癥、蕁麻疹、血管性水腫、血管炎、多發 性硬化、重癥肌無力、膜性增生性腎小球腎炎、和斯耶格倫氏綜合征。補體介導的病癥領域需要抗體治療劑，而本發明的人源化抗因子D抗體及其抗體 變體及其片段(例如抗原結合片段)提供對于滿足這種需要有用的高親和力抗體。
發明概述一方面，本發明一般性涉及能夠抑制與因子D有關的生物學活性的抗體。一方面，本發明涉及具有多種治療上想要的特征的人源化抗因子D抗體。本發明 包括這些人源化抗因子D抗體的HVR的氨基酸序列，和它們相應的核酸序列。本發明包括 所述人源化抗因子D抗體的重鏈和輕鏈可變域的氨基酸序列，和它們相應的核酸序列。本 發明包括所述人源化抗因子D抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列，和它們相應的核酸序列。一方面，本發明范圍內的具體抗體包括但不限于如下的人源化抗因子D抗體， 其包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、 238-8、238-9、238-10或238-11的HVR。在一個實施方案中，所述人源化抗因子D抗體包 含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、 238-9、238-10或238-11的重鏈和/或輕鏈可變域。在一個實施方案中，所述人源化抗因 子 D 抗體包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、 238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的重鏈和/或輕鏈。在一個實施方案中，本發明包 括人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、 238-9、238-10或238-11。在一個實施方案中，本發明包括人源化抗因子D Fab克隆#238、 238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10 或 238-11 全長抗體 的抗體片段(例如抗原結合片段)。在一個實施方案中，本發明包括全長抗體或其抗原結 合片段，其包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、 238-7、238-8、238-9、238-10或238-11重鏈和/或輕鏈的抗原結合序列。在一個實施方案 中，此類抗原結合序列包含至少一個、兩個、或三個重鏈HVR。在一個實施方案中，此類抗原 結合序列包含至少一個、兩個、或三個輕鏈HVR。在一個實施方案中，此類抗原結合序列包含 至少部分或整個重鏈可變域。在一個實施方案中，此類抗原結合序列包含至少部分或整個 輕鏈可變域。一方面，本發明提供人源化抗因子D Fab克隆#111的抗體片段(例如抗原結合片 段)或全長抗體，其包含對人源化抗因子D Fab克隆#111的至少一處序列修飾，其中此類 全長抗體或此類抗原結合片段包含人源化抗因子DFab克隆#111重鏈和/或輕鏈的抗原結 合序列。在一個實施方案中，人源化抗因子D Fab克隆#111的抗體片段(例如抗原結合片 段)或全長抗體包含對人源化抗因子D Fab克隆#111序列的至少一處修飾，包含人源化抗 因子D Fab克隆#111重鏈和/或輕鏈的抗原結合序列，還與人源化抗體Fab克隆#111結 合基本上相同的表位。在一個實施方案中，此類抗原結合序列包含至少一個、兩個或三個重 鏈HVR。在一個實施方案中，此類抗原結合序列包含至少一個、兩個或三個輕鏈HVR。在一 個實施方案中，此類抗原結合序列包含至少部分或整個重鏈可變域。在一個實施方案中，此 類抗原結合序列包含至少部分或整個輕鏈可變域。在一個實施方案中，此類所述抗體片段 或所述全長抗體中的修飾在重鏈中。在一個實施方案中，此類所述抗體片段或所述全長抗 體中的修飾在輕鏈中。在一個實施方案中，此類所述抗體片段或所述全長抗體中的修飾在 重鏈可變域中。在一個實施方案中，此類所述抗體片段或所述全長抗體中的修飾在輕鏈可 變域中。在一個實施方案中，此類所述抗體片段或所述全長抗體中的修飾在至少一個、兩個 或三個重鏈HVR中。在一個實施方案中，此類所述抗體片段或所述全長抗體中的修飾在至 少一個、兩個或三個輕鏈HVR中。
一方面，本發明關注本發明的抗體或其片段(例如抗原結合片段)，其以至少約 10_9至10_12M的結合親和力結合因子D。一方面，本發明關注本發明的抗體或其片段(例如抗原結合片段)，其中此類 抗體的Fab片段以Fab片段對因子D摩爾比約0.05 1(0.05)至約10 1(10)、或約 0.09 1(0. 09)至約 8 1(8)、或約 0.1 1 (0. 1)至約 6 1(6)、或約 0.15 1(0. 15) M 約 5 1(5)、或約 0.19 1(0. 19)至約 4 1 )、或約 0.2 1 (0. 2)至約 3 1(3)、或約 0.3 1(0. 3)至約 2 1 O)、或約 0.4 1(0. 4)至約 1 1(1)、或約 0.5 1 (0. 5)至約 1 2(0. 5)、或約 0.6 1(0. 6)至約 1 3 (0. 33)、或約 0. 7 1 (0. 7)至約 1 4(0.25)、 或約0.8 1(0. 8)至約1 5(0. 2)或約0.9 1 (0. 9)至約1 6 (0. 17)抑制因子D的 生物學功能。一方面，本發明的抗體包括人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。另一方面、本發明包括人源化抗因子D抗體的抗體片段(例如抗原結合片段)。本 發明的抗體片段可以是例如Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv、(scFv) 2、dAb、互補決定區(CDR)片 段、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、或自抗體片段形成的多特異性抗體。在本發明的其它方面，本發明包括組合物，其包含本發明的抗體或其片段(例如 抗原結合片段)。在另一個實施方案中，本發明提供編碼本發明的抗體或其片段(例如抗 原結合片段)的至少一部分的載體和細胞系。一方面，本發明包括本發明的抗體或其片段 (例如抗原結合片段)和組合物的制備方法、生產方法、和使用方法。在一個實施方案中，本 發明的抗體或其片段(例如抗原結合片段)的制備方法包括(a)在適合于編碼本發明的 抗體或其片段(例如抗原結合片段)的多核苷酸表達的條件下培養包含載體的宿主細胞， 例如真核或CHO細胞，該載體進一步包含編碼所述抗體或其片段(例如抗原結合片段)的 多核苷酸，并(b)分離所述抗體或其片段(例如抗原結合片段)。又一方面，本發明關注組合物，其包含與載體組合的本發明的抗體或其片段(例 如抗原結合片段)，如本文中所描述的。任選地，所述載體是藥學可接受載體。本發明的另一方面是這些人源化抗體或其抗體片段(例如抗原結合片段)制備用 于預防和/或治療與過度的或不受控制的補體活化有關的病癥的藥物或組合物的用途。它 們包括心肺旁路手術期間的補體活化；急性心肌梗死、動脈瘤、中風、出血性休克、擠壓傷、 多器官功能衰竭、hypobolemic shock、腸缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再灌注損傷 所致補體活化。補體活化已經顯示出與炎性狀況有關，諸如重度燒傷、內毒素血癥、感染性 休克、成人呼吸窘迫綜合征、血液透析；過敏性休克、嚴重的哮喘、血管性水腫、克羅恩氏病、 鐮狀細胞貧血、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。所述病癥可以是不良藥物反應、藥物變 態反應、IL-2誘導的血管滲漏綜合征或放射攝影(對比)造影劑變態反應的結果。它還包 括自身免疫病，諸如系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風濕性關節炎、阿爾茨海默氏病和多 發性硬化。在另一個實施方案中，補體活化還與移植排斥有關。在另一個實施方案中，補體 活化還與眼疾病有關(其病理涉及補體包括經典和旁路補體途徑的所有眼狀況和疾病)， 諸如例如但不限于黃斑變性性疾病諸如所有階段的老年性黃斑變性(AMD)包括干性和濕 性(非滲出性和滲出性)形式、糖尿病視網膜病和其它缺血相關視網膜病、脈絡膜新血管形 成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黃斑水腫、病理性近視、von Hippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌 病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網膜新血管形成。在一個例子中，補體相關眼狀況包括老年性黃斑變性(AMD)包括非滲出性(例如中期(intermediate)干性 AMD或地圖樣萎縮(geographic atrophy,GA))和滲出性(例如濕性AMD (脈絡膜新血管形 成(CNV))AMD、糖尿病視網膜病(DR)、眼內炎和葡萄膜炎。在一個進一步的例子中，非滲出 性AMD可包括硬玻璃疣、軟玻璃疣、地圖樣萎縮和/或色素結塊的存在。在另一個例子中， 補體相關眼狀況包括老年性黃斑變性(AMD)，包括早期AMD (例如包括多個小的玻璃疣至一 或多個非滲出性的中等大小的玻璃疣)、中期AMD (例如包括廣泛的中等玻璃疣至一或多個 大玻璃疣)和晚期AMD (例如包括地圖樣萎縮或晚期濕性AMD (CNV)。在一個進一步的例子 中，中期干性AMD可包括大的匯合的玻璃疣。在一個進一步的例子中，地圖樣萎縮可包括光 感受器和/或視網膜色素上皮(RPE)損失。在一個進一步的例子中，地圖樣萎縮的區域可 以是小的或大的，和/或可以在黃斑區域中或在周邊視網膜中。在一個例子中，所述補體相 關眼狀況是中期干性AMD。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是地圖樣萎縮。在一個例子 中，所述補體相關眼狀況是濕性AMD (脈絡膜新血管形成(CNV))。另一方面，本發明提供試劑盒，其包含本發明的抗體或其片段(例如抗原結合片 段)。在一個實施方案中，本發明提供試劑盒，其包含本發明的抗體或其片段(例如抗原結 合片段)和使用指令。在一個實施方案中，本發明關注試劑盒，其包含本發明的抗體或其片 段(例如抗原結合片段)和施用所述抗體來治療補體相關病癥的指令。在一個實施方案 中，本發明提供試劑盒，其包含裝有組合物的第一容器，該組合物包含本發明的一種或多種 抗體或其抗體片段(例如抗原結合片段)；和裝有緩沖劑的第二容器。在一個實施方案中， 所述緩沖劑是藥學可接受的。在一個實施方案中，包含本發明抗體或其片段(例如抗原結 合片段)的組合物進一步包含載體，其在一些實施方案中是藥學可接受的。在一個實施方 案中，試劑盒進一步包含對受試者施用所述組合物(例如抗體或其抗體片段(例如抗原結 合片段)的指令。在一個實施方案中，試劑盒進一步包含使用所述試劑盒的指令。一方面，本發明關注制品，其含有對于治療、預防和/或診斷補體相關病癥有用材 料。在一個實施方案中，本發明關注制品，其包含(a)容器；(b)所述容器上的標簽；和(c) 裝在所述容器中的組合物，其包含本發明的抗體或其變體或其片段(例如抗原結合片段)， 其中所述容器上的標簽指明所述組合物可用于治療、預防和/或診斷補體相關病癥。一方面，本發明提供本發明的抗因子D抗體或其抗體片段(例如抗原結合片段)、 本發明的核酸、本發明的表達載體或本發明的宿主細胞在制備用于治療性和/或預防性 處理疾病，諸如補體相關眼狀況的藥物中的用途。在一個實施方案中，所述補體相關眼 狀況選自老年性黃斑變性(AMD)包括非滲出性(例如中期干性AMD或地圖樣萎縮(GA)) 和滲出性(例如濕性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病視網膜病(DR)、眼內炎 (endophthalmitis)和葡萄膜炎。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是中期干性AMD。在 一個例子中，所述補體相關眼狀況是地圖樣萎縮。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是濕 性AMD (脈絡膜新血管形成(CNV))。一方面，本發明提供本發明的制品在制備用于治療性和/或預防性處理疾病，諸 如補體相關眼狀況的藥物中的用途。在一個實施方案中，所述補體相關眼狀況選自老年性 黃斑變性(AMD)包括非滲出性(例如中期干性AMD或地圖樣萎縮(GA))和滲出性(例如濕 性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病視網膜病(DR)、眼內炎和葡萄膜炎。在一個 例子中，所述補體相關眼狀況是中期干性AMD。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是地圖樣萎縮。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是濕性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))。一方面，本發明提供本發明的試劑盒在制備用于治療性和/或預防性處理疾病， 諸如補體相關眼狀況的藥物中的用途。在一個實施方案中，所述補體相關眼狀況選自老年 性黃斑變性(AMD)包括非滲出性(例如中期干性AMD或地圖樣萎縮(GA))和滲出性(例如 濕性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病視網膜病(DR)、眼內炎和葡萄膜炎。在一 個例子中，所述補體相關眼狀況是中期干性AMD。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是地 圖樣萎縮。在一個例子中，所述補體相關眼狀況是濕性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))。附圖簡述
圖1A-1C顯示下述各項的輕鏈可變域的序列比對人源化抗因子D Fab克隆 #111 (SEQ ID NO :1)，人源化抗因子 D Fab，238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238_6、 238-7、238-8、238-9、238-10 和 238-11 (分別為 SEQ IDNO :6_17)和 VL κ I 共有序列(SEQ ID NO 65)。位置依照Kabat編號且高變區(依照Kabat+Chothia HVR定義)框示(HVR (I)HVR-Ll 鑒定為 Al-AlldTSTDIDDDMN(SEQ ID NO 30), ITSTDIDDDLN(SEQ ID NO :31)、 ITSTDIDDDIN(SEQ ID NO :32)、ITSTDIDDD職(SEQ ID NO :33)或 ITSTDIDDDMQ(SEQ ID NO: 34))，(2)HVR-L2 鑒定為 B1-B7(GGNTLRP(SEQ ID NO 35), GGSTLRP(SEQ ID NO :36)或 GGATLRP (SEQ ID NO :37))，(3) HVR-L3 鑒定為 C1-C9 (LQSDSLPYT (SEQ ID NO :38))。每種人 源化抗因子D Fab中的氨基酸變化以粗體和斜體標示。圖2A-C顯示下述各項的重鏈可變域的序列比對人源化抗因子D Fab克隆 #111 (SEQ ID NO :2)和人源化抗因子D Fab，238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238_6、 238-7、238-8、238-9、238-10 和 238-11 (分別為 SEQ ID NO 18-29)和 VH 亞組 7 共有序 列(SEQ ID NO 66)。位置依照Kabat編號且高變區(依照Kabat+Chothia HVR定義) 框示(HVR (I)HVR-Hl 鑒定為 D1-D10 (GYTFTNYGMN(SEQ ID NO 39)，(2) HVR-H2 鑒定為 E1-E19 (WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO :40)，(3)HVR_H3 鑒定為 F1-F6 (EGGVNN(SEQ ID NO: 41),EGGVAN(SEQ ID NO :42),EGGVQN(SEQID NO :43),EGGVNA(SEQ ID NO :44) ^EGGVNQ(SEQ ID NO 45) )0每種人源化抗因子D Fab中的氨基酸變化以粗體和斜體標示。圖3顯示人源化抗因子D Fab 238輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO 46)。該核苷 酸序列編碼人源化抗因子D Fab 238的輕鏈，其中起始和終止密碼子以粗體顯示并標有下 劃線。與圖4(SEQ ID NO 47)中的第一個氨基酸對應的密碼子以粗體和斜體標示。圖4顯示人源化抗因子D Fab 238輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 47)。該氨基酸 序列缺少由圖3中所示SEQ ID NO :46編碼的多肽的N端信號序列。HVR序列以粗體和斜 體標示。可變區是未標有下劃線的區域，而第一恒定域CLl標有下劃線。顯示了框架(FR) 區和 HVR 區FRl-LC (SEQ ID NO :48)，FR2-LC (SEQ ID NO :49)，FR3-LC (SEQ ID NO 50), FR4-LC(SEQ ID NO 51), HVRl-LC(SEQ ID NO :30 (ITSTDIDDDMN))，HVR2-LC(SEQ ID N0: 35(GGNTLRP)), HVR3-LC(SEQ ID NO 38 (LQSDSLPYT))和 CL 1(SEQ IDNO :52)。圖5顯示人源化抗因子D Fab 238重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO :53)。該核苷 酸序列編碼人源化抗因子D Fab 238的重鏈，其中起始和終止密碼子以粗體顯示并標有下 劃線。與圖6 (SEQ ID NO 54)中的第一個氨基酸對應的密碼子以粗體和斜體標示。圖6顯示人源化抗因子D Fab 238重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 54)。該氨基 酸序列缺少由圖5中所示SEQ ID NO 53編碼的多肽的N端信號序列。HVR序列以粗體和斜體標示。可變區是未標有下劃線的區域，而第一恒定域CHl標有下劃線。顯示了框架 (FR)區和 HVR 區FRl-HC (SEQ ID NO :55)，FR2-HC (SEQ ID NO :56)，FR3-HC (SEQ ID NO: 57)，FR4-HC(SEQ ID NO 58),HVRl-HC(SEQ ID NO 39 (GYTFTNYGMN)),HVR2-HC(SEQ ID NO: 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC(SEQ ID NO 41 (EGGVNN))和 CHl(SEQ ID NO :59)。圖7顯示人源化抗因子D Fab 238-1輕鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO 60)。該核 苷酸序列編碼人源化抗因子D Fab 238-1的輕鏈，其中起始和終止密碼子以粗體顯示并標 有下劃線。與圖8(SEQ ID NO 61)中的第一個氨基酸對應的密碼子以粗體和斜體標示。圖8顯示人源化抗因子D Fab 238-1輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO :61)。該氨 基酸序列缺少由圖7中所示SEQ ID NO 60編碼的多肽的N端信號序列。HVR序列以粗體 和斜體標示。可變區是未標有下劃線的區域，而第一恒定域CLl標有下劃線。顯示了框架 (FR)區和 HVR 區FRl-LC (SEQ ID NO :48)，FR2-LC (SEQ ID NO :49)，FR3-LC (SEQ ID NO: 50)，FR4-LC(SEQ ID NO 51),HVRl-LC(SEQ ID NO 30 (ITSTDIDDDMN)),HVR2-LC(SEQ ID NO: 35(GGNTLRP))，HVR3-LC(SEQ ID NO :38 (LQSDSLPYT))和 CLl(SEQ IDNO :52)。圖9顯示人源化抗因子D Fab 238-1重鏈的核苷酸序列(SEQ ID NO 62)。該核 苷酸序列編碼人源化抗因子D Fab 238-1的重鏈，其中起始和終止密碼子以粗體顯示并標 有下劃線。與圖10 (SEQ ID NO 63)中的第一個氨基酸對應的密碼子以粗體和斜體標示。圖10顯示人源化抗因子D Fab 238-1重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 63)。該氨 基酸序列缺少由圖9中所示SEQ ID NO 62編碼的多肽的N端信號序列。HVR序列以粗體 和斜體標示。可變區是未標有下劃線的區域，而第一恒定域CHl標有下劃線。顯示了框架 (FR)區和 HVR 區FRl-HC (SEQ ID NO :64)，FR2-HC (SEQ ID NO :56)，FR3-HC (SEQ ID N0: 57)，FR4-HC(SEQ ID NO 58),HVRl-HC(SEQ ID NO :39 (GYTFTNYGMN))，HVR2-HC(SEQ ID NO: 40 (WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC(SEQ ID NO :41 (EGGVNN))和 CHl(SEQ ID NO :59)。圖11顯示人源化抗因子D Fab克隆#111和人源化抗因子D Fabs 238和238_1 的溶血測定法結果，顯示了對旁路補體活性的抑制。顯示了 IC5tl值。圖12顯示在因子D的三種血清濃度(9. 7nM、16. 2nM和26. 5nM)，人源化抗因子D Fab 238的溶血測定法結果，顯示了對旁路途徑(AP)補體活性的抑制。表3顯示與因子D 的三種血清濃度對應的IC5tl(IiM)和IC9tl(IiM)值(數值代表三項重復實驗的平均值)。表3 中還顯示了抗體對靶因子D摩爾比。圖13顯示使用2. 5mg劑量單次玻璃體內(IVT)注射抗因子D Fab 238，對人眼中 旁路途徑(AP)補體活化的抑制的模擬持續時間(假設抗因子D Fab 238的半衰期(t1/2)= 11.5天，基于自家兔種間縮放)。單次IVT注射抗因子D Fab238估計抑制視網膜組織中的 AP補體活化至少約74天和玻璃體液中的AP補體活化至少約97天。在圖13中，虛線顯示 玻璃體內施用后玻璃體液中的模擬抗因子D Fab 238濃度。在圖13中，實線顯示玻璃體內 施用后視網膜組織中的模擬抗因子D Fab 238濃度。玻璃體液和視網膜組織中的濃度差異 基于視網膜組織分配系數估值20% ；換言之，對玻璃體液施用的總藥物中20%會到達視網 膜組織。發明詳述I.定義貫穿本申請所使用的術語應當用對本領域普通技術人員通常的和典型的意義來解釋。然而，申請人希望下列術語被給予如下文所限定的特定定義。關于抗體鏈多肽序列的短語“基本上相同的，，可解釋為展現出與參照多肽序列至 少70%、或80%、或90%、或95%序列同一性的抗體鏈。關于核酸序列的該術語可解釋為 展現出與參照核酸序列至少約85%、或90%、或95%、或97%序列同一性的核苷酸序列。術語“同一性”或“同源性”應當解釋為指比對序列并在必要時引入缺口以獲取整 個序列的最大百分比同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序 列中與同其比較的相應序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。N端或C端延伸或插入 均不應當解釋為降低同一性或同源性。用于比對的方法和計算機程序是本領域中公知的。 可使用序列分析軟件來測量序列同一性。術語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆 抗體、和多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結 構特征的糖蛋白。雖然抗體展現出對特定靶物的結合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和 其它缺乏靶物特異性的抗體樣分子兩者。天然抗體和免疫球蛋白通常是約150，000道爾頓 的異四聚體糖蛋白，其由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈構成。每個重鏈具有 在一端的可變域(Vh)，接著是若干恒定域。每個輕鏈具有在一端的可變域和在其另一 段的恒定域。“分離的”抗體指已經鑒定且自其天然環境的一種成分分開和/或回收的抗體。其 天然環境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其 它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在一個例子中，將抗體純化至⑴根據Lowry法的 測定，抗體重量超過95%，最優選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至 少15個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或C3)根據還原性或非還原性條件下的 SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優選的銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少一種成分 不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少 一個純化步驟來制備。如本文中所使用的，“抗人因子D抗體”指以如下方式特異性結合人因子D的抗體， 所述結合方式使其抑制或實質性降低補體活化。術語“因子D”在本文中用于指天然序列和變體因子D多肽。“天然序列”因子D指與自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的多肽， 無論其制備模式。如此，天然序列因子D可以從自然界分離，或者可以通過重組和/或合成 手段生成。在成熟因子D蛋白諸如成熟人因子D蛋白(NM_001928)之外，術語“天然序列因 子D”明確涵蓋因子D的天然存在前體形式(例如無活性的前蛋白，其受到蛋白水解切割而 生成活性形式)、因子D的天然存在變體形式(例如可變剪接形式)和天然存在等位變體， 以及因子D分子的與來源于自然界的因子D多肽具有相同氨基酸序列的結構構象變體。非 人動物(包括高等靈長類和非人哺乳類)的因子D多肽被明確包括在此定義內。“因子D變體”意指與天然序列因子D多肽，諸如天然序列人因子D多肽 (NM_001928)具有至少約80%氨基酸序列同一性的如下文中所定義的活性因子D多肽。通 常，因子D變體與成熟人氨基酸序列(NM_001928)具有至少約80 %的氨基酸序列同一性， 或至少約85%的氨基酸序列同一性，或至少約90%的氨基酸序列同一性，或至少約95%的 氨基酸序列同一性，或至少約98%的氨基酸序列同一性，或至少約99 %的氨基酸序列同一性。“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最 大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與 參照因子D序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測定百分比氨基酸序列同 一性目的的對比可以本領域技術范圍內的多種方式進行，例如使用公眾可得到的計算機軟 件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領域技術人員能決定用于 測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然后計算相 對于較長序列的序列同一性，即即使較短序列顯示與較長序列一部分的100%序列同一性， 總體序列同一性也會小于100%。“百分比(％ )核酸序列同一性”定義為對比序列并在必要時引入缺口以獲取最大 百分比序列同一性后，候選序列中與參照因子D編碼序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分 率。為測定百分比核酸序列同一性目的的對比可以本領域技術范圍內的多種方式進行，例 如使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。 本領域技術人員能決定用于測量對比的適宜參數，包括對所比較序列全長獲得最大對比所 需的任何算法。然后計算相對于較長序列的序列同一性，即即使較短序列顯示與較長序列 一部分的100%序列同一性，總體序列同一性也會小于100%。“分離的”核酸分子指已經鑒定且與核酸的天然來源中通常與之關聯的至少一種 污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發現它時的形式或背 景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區別。然而，分離的核酸分 子包括通常表達所編碼多肽的細胞中包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中 的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。“分離的”因子D多肽編碼核酸分子指已經鑒定且與因子D編碼核酸的天然來源中 通常與之關聯的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的因子D多肽編碼核酸分 子不同于在自然界中發現它時的形式或背景。分離的因子D多肽編碼核酸分子因此與存在 于天然細胞中時的編碼核酸分子有區別。然而，分離的因子D編碼核酸分子包括通常表達 因子D的細胞中包含的因子D編碼核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體 定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。術語“拮抗劑”以最廣義使用，包括能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或 干擾因子D生物學活性的任何分子。因子D拮抗劑包括但不限于抗因子D抗體及其抗體變 體、其抗原結合片段，結合因子D且能夠中和、阻斷、部分或完全抑制、消除、降低或干擾因 子D活性(諸如因子D參與補體相關眼疾的病理學的能力)的其它結合性多肽、肽、和非肽 小分子。“小分子”在本文中定義為具有低于約600，優選低于約1000道爾頓的分子量。“有活性的，，或“活性，，或“生物學活性，，在本發明因子D拮抗劑的語境中指拮抗 (部分或完全抑制)因子D生物學活性的能力。因子D拮抗劑的生物學活性的一個例子是 在因子D相關疾病或疾患(諸如例如補體相關眼疾)的狀態(例如病理學)中實現可測量 的改善的能力。所述活性可在體外或在體內測試中測定，包括結合測定法，旁路途徑溶血測 定法(例如測量對旁路途徑補體活性或活化的抑制的測定法)，使用有關動物模型，或人體 臨床試驗。
術語“補體相關病癥”以最廣義使用，包括與過度的或不受控制的補體活化有關的 病癥。它們包括心肺旁路手術期間的補體活化；急性心肌梗死、動脈瘤、中風、出血性休克、 擠壓傷、多器官功能衰竭、hypobolemic shock、腸缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再 灌注損傷所致補體活化。補體活化已經顯示出與炎性狀況有關，諸如重度燒傷、內毒素血 癥、感染性休克、成人呼吸窘迫綜合征、血液透析；過敏性休克、嚴重的哮喘、血管性水腫、克 羅恩氏病、鐮狀細胞貧血、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。所述病癥可以是不良藥物反 應、藥物變態反應、IL-2誘導的血管滲漏綜合征或放射攝影(對比)造影劑變態反應的結 果。它還包括自身免疫病，諸如系統性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風濕性關節炎、阿爾茨海默 氏病和多發性硬化。補體活化還與移植排斥有關。補體活化還與眼疾病有關，諸如老年性 黃斑變性、糖尿病視網膜病和其它缺血相關視網膜病、脈絡膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、 糖尿病黃斑水腫、病理性近視、von Hippel-Lindau病、眼的組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈 阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網膜新血管形成。術語“補體相關眼疾”以最廣義使用，包括病理學涉及補體(包括經典途徑和旁 路途徑，特別是補體旁路途徑)的所有眼疾。補體相關眼疾包括但不限于黃斑變性性疾病 諸如所有階段的老年性黃斑變性(AMD)(包括干性和濕性(非滲出性和滲出性))形式、 脈絡膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性視網膜病變和其它缺血相關視網膜病變、和 其它眼內新血管疾病諸如糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、von Hippel-Lindau病、眼的 組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網膜新血管形成。在 一個例子中，補體相關眼疾包括老年性黃斑變性(AMD)(包括非滲出性(例如中期干性 AMD (intermediate dry AMD)或地圖樣萎縮(GA))和滲出性(例如濕性AMD (脈絡膜新血 管形成(CNV))AMD、糖尿病視網膜病(DR)、眼內炎和葡萄膜炎。在一個進一步的例子中，非 滲出性AMD可包括硬玻璃疣、軟玻璃疣、地圖樣萎縮和/或色素結塊的存在。在另一個例子 中，補體相關眼狀況包括老年性黃斑變性(AMD)，包括早期AMD (例如包括多個小的玻璃疣 至一或多個非滲出性的中等大小的玻璃疣)、中期AMD (例如包括廣泛的中等玻璃疣至一或 多個大玻璃疣)和晚期AMD (例如包括地圖樣萎縮或晚期濕性AMD (CNV)。(Ferris et al., AREDS Report No. 18 ；Sallo et al.，Eye Res. ,34(3) :238-40(2009) Jager et al.，New Engl. J. Med.，359(1) : 1735 (2008))。在一個進一步的例子中，中期干性AMD可包括大的匯 合的玻璃疣。在一個進一步的例子中，地圖樣萎縮可包括光感受器和/或視網膜色素上皮 (RPE)損失。在一個進一步的例子中，地圖樣萎縮的區域可以是小的或大的，和/或可以在 黃斑區域中或在周邊視網膜中。在一個例子中，補體相關眼狀況是中期干性AMD。在一個例 子中，補體相關眼狀況是地圖樣萎縮。在一個例子中，補體相關眼狀況是濕性AMD (脈絡膜 新血管形成(CNV))。“治療”或“處理”指旨在預防病癥發展或改變病癥病理而實施的干預。因而，“治 療”或“處理”指治療性處理及預防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有 病癥的受試者以及要預防病癥的受試者。在免疫相關疾病的治療中，治療劑可直接改變免 疫應答成分的應答程度，或者使得疾病對其它治療劑(例如抗生素、抗真菌劑、抗炎劑、化 療劑等)的治療更敏感。疾病(諸如補體相關眼疾)的“病理”或“病理學”包括所有危及患者康樂的現象。 這包括但不限于異常的或不可控的細胞生長(嗜中性細胞、嗜酸性細胞、單核細胞、淋巴細胞)、抗體生成、自身抗體生成、補體生成、對鄰近細胞正常機能的干擾、細胞因子或其它分 泌產物的異常水平釋放、任何炎性或免疫學應答的抑制或惡化、炎癥細胞(嗜中性細胞、嗜 酸性細胞、單核細胞、淋巴細胞)浸潤入細胞間隙(cellular spaces)等。如本文中所使用的，術語“哺乳動物”指歸為哺乳類的任何動物，包括但不限于人， 高等靈長類，家畜和牲畜，及動物園、運動或寵物動物，諸如馬、豬、牛、犬、貓和雪貂等。在本 發明的一個實施方案中，哺乳動物指人。與一種或多種其它治療劑“聯合/組合”施用包括同時(共同)施用和任何次序 的序貫施用。“治療有效量”指在目標疾病或疾患(諸如例如補體相關眼疾)的狀態(例如病理 學)中實現可測量的改善所需要的“因子D拮抗劑”量。術語“調控序列”指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA 序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結合位 點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關系中，則它是“可操作連接的”。 例如，若前序列(presequence)或分泌前導(secretory leader)的DNA表達成參與多肽分 泌的前蛋白質(preprotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編 碼序列的轉錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結合位點的位置促進翻譯，則它 與編碼序列可操作連接。一般而言，“可操作連接的”意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且 在分泌前導的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過 在方便的限制性位點處的連接來實現。若沒有此類位點，則依照常規實踐使用合成的寡核 苷酸銜接頭或接頭。雜交反應的“嚴格性”可以由本領域普通技術人員容易的確定，而且通常根據探針 長度、洗滌溫度、和鹽濃度憑經驗計算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退火， 而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環境中 時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相 對溫度也越高。結果是，推斷出較高相對溫度會趨向于使反應條件更為嚴格，而較低溫度也 就較不嚴格。關于雜交反應嚴格性的其它細節和解釋，參見Ausube 1等，((CurrentProtoco 1 s in Molecular Biology)), Wiley Interscience Publishers, 1995。“嚴格條件”或“高嚴格性條件”，如本文中所定義的，可如下鑒定(1)采用低離 子強度和高溫進行清洗，例如0. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 十二烷基硫酸鈉， 于50°C ； (2)在雜交過程中采用變性劑，諸如甲酰胺，例如50% (ν/ν)甲酰胺及0.1%牛血 清清蛋白/0. Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液ρΗ 6. 5及750mM氯 化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42°C ；或(3)采用50 %甲酰胺，5xSSC(0. 75M NaCl，0. 075M檸檬 酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0. 焦磷酸鈉，5x Denhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精 DNA(50y g/ml),0. 1% SDS，和 10% 硫酸右旋糖苷，于 42°C，及于 42°C 在 0. 2xSSC(氯化鈉 / 檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中清洗，于55°C，接著于55°C在含EDTA的0. IxSSC中進行高嚴格 性清洗。“中等嚴格條件”可以如 Sambrook 等，《Molecular Cloning :A LaboratoryManual)),New York,Cold Spring Harbor Press, 1989 中所述鑒定，包括使用比上文所述較不嚴格的清洗溶液和雜交條件(例如溫度、離子強度和％ SDQ。中等嚴格條件 的一個例子是于37°C在含20%甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl, 15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉 (pH 7. 6)，5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性的經剪切的鮭魚精DNA 的溶液中溫育過夜，接著于約37-50°C在IxSSC中清洗濾膜。技術人員會認識到如何在必要 時調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度等因素。術語“可變的”在抗體可變域的語境中指可變域的某些部分在抗體間序列差異廣 泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布 于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈二者可變域中稱作互補決定區(⑶幻也稱作高 變區(HVR)的三個區段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的 可變域各自包含四個FR區，它們大多采取β -折疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情 況中形成β-折疊片結構一部分的三個CDR連接。每條鏈中的CDR通過FR區非常接近的保 持在一起，并與來自另一條鏈的CDR —起促成抗體的靶物結合位點的形成(參見Kabat et al.)。如本文中所使用的，免疫球蛋白氨基酸殘基的編號是依照Kabat et al. , (Sequences of Proteins of Immunological Interest, NationalInstitute of Health, Bethesda, Md. 1987)的免疫球蛋白氨基酸殘基編號系統進行的，除非另外指明。術語“高變區”、“HVR”或“HV”在用于本文時指抗體可變域中序列上高度可變 和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個高變區三個在VH中(H1、H2、 H3)，三個在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區的敘述。Kabat互補決定 區(CDR)是以序列變異性為基礎的且是最常用的(Kabat et al. ,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD. (1991))。Chothia 改為指結構環的位置(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917(1987))。Chothia CDR-Hl環的末端在使用Kabat編號規則編號時在 H32與H34之間變化，取決于環的長度(這是因為Kabat編號方案在H35A和H35B處放置 插入；如果35A和35B都不存在，那么該環在32處結束；如果只有35A存在，那么該環在33 處結束；如果35A和35B都存在，那么該環在34處結束)。AbM高變區代表Kabat⑶R與 Chothia結構環之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。“接 觸”高變區是以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些高變區中每 一個的殘基。環KabatAbMChothia接觸
LlL24-L34L24--L34L24--L34L30-L36
L2L50-L56L50--L56L50--L56L46-L55
L3L89-L97L89--L97L89--L97L89-L96
HlH31-H35BH26--H35BH26--H32. · 34H30-H35B
(Kabat 編號)
HlH31-H35H26--H35H26--H32H30-H35
(Chothia 編號)
H2H50-H65H50--H58H52--H56H47-H58
H3H95-H102H95--H102H95--H102H93-H101
高變區可包括如下“延伸的高變區”:VL中的M-36或M-34 (Li)、46-56或 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及 VH 中的 26-35B (Hl)、50-65/47-65 或 49-65 (H2)和 93-102、 94-102或95-102 (H3)。對于這些定義中的每一個，可變區殘基是依照Kabat等，見上文編 號的。“框架”或“FR”殘基指可變域中那些除此處定義的高變區殘基或⑶R殘基以外的殘基。術語“如Kabat中的可變域殘基編號方式”或“如Kabat中的氨基酸位置編號方 式”及其變化形式指 Kabat 等，《Sequences of Proteins of Immunologicallnterest》，第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991)(通 過述及明確收入本文)中用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統。使用此編號 系統，實際的線性氨基酸序列可以包含較少的或另外的氨基酸，對應于可變域FR或CDR的 縮短或插入。例如，重鏈可變域可以包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat的 殘基52a)和重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat的殘基82a、82b和82c等)。 給定抗體的Kabat殘基編號可以通過將抗體序列與“標準"Kabat編號序列對比同源區來確 定。Kabat編號系統一般在提及可變域中的殘基(大約是輕鏈殘基1-107和重鏈殘 基 1-113)時使用(例如 Kabat et al. , Sequences of Immunological Interest. 5thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。 “EU 編號系統”或“EU指數” 一般在提及免疫球蛋白重鏈恒定區中的殘基時使用(例如Kabat et al.，見上文中報道的EU指數；重鏈恒定域中的鉸鏈區大致為重鏈殘基216-230 (EU編號 方式))。“Kabat中的EU指數”指人IgGl EU抗體的殘基編號方式。除非本文中另有說明， 提及抗體可變域中的殘基編號指根據Kabat編號系統的殘基編號方式。除非本文中另有說 明，提及抗體恒定域中的殘基編號指根據EU編號系統的殘基編號方式(例如參見美國臨時 申請60/640，323，關于EU編號方式的圖)。如本文中所使用的，“多肽”一般指具有超過約10個氨基酸的肽和蛋白質。在一 個例子中，多肽是哺乳動物蛋白質，例子包括因子D和因子D的片段和/或變體。在另一個 例子中，多肽是結合人因子D的全長抗體，或其抗體片段(例如抗原結合片段)，例子包括 Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；雙抗體，線性抗體；單鏈抗體分子；和自抗體片段(例如抗 原結合片段)形成的多特異性抗體。起始多肽的“變體”或“氨基酸序列變體”指如下的多肽，其包含與起始多肽的氨 基酸序列不同的氨基酸序列。通常，變體會與天然多肽具有至少80%序列同一性，優選至少 90%序列同一性，更優選至少95%序列同一性，和最優選至少98%序列同一性。百分比序 列同一性是比對序列以提供最大同源性后，通過例如Fitch et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 1382-1386 (1983), Needleman et al. , J. Mol. Biol. , 48 :443-453 (1970)記載的算 法形式確定的。可通過將適當的核苷酸改變引入編碼多肽的DNA或者通過肽合成來制備多 肽的氨基酸序列變體。此類變體包括例如感興趣多肽氨基酸序列中的殘基刪除和/或插入 和/或替代。只要最終的構建物具有所需特性，可進行刪除、插入和替代的任何組合以獲得 最終的構建物。氨基酸變化還可改變多肽的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數目或位 置。用于生成多肽的氨基酸序列變體的方法記載于例如美國專利No. 5，534，615 (通過述及而明確收入本文)。起始抗體的“抗體變體”或“經修飾抗體”指如下的抗體，其包含與起始抗體之氨基 酸序列不同的氨基酸序列，其中起始抗體的一個或多個氨基酸殘基經過修飾。通常，抗體變 體會與起始抗體具有至少80%序列同一性，優選至少90%序列同一性，更優選至少95%序 列同一性，和最優選至少98%序列同一性。百分比序列同一性是比對起始抗體和候選抗體 變體的序列以提供最大同源性后，通過例如Fitch et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 1382-1386 (1983), Needleman et al.，J. Mol.Biol. ,48 :443-453(1970)記載的算法形式確 定的。關于親本序列的特異性或相似性在本文中定義為比對序列并在必要時引入缺口以實 現最大百分比序列同一性后，候選變體序列中與親本抗體殘基相同(即相同殘基)或相似 (即基于共同的側鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見下文)的氨基酸殘基的百分比。例 如，可能希望改進抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可通過將適當的核苷酸改變 引入編碼抗體的DNA或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類變體包括例如感 興趣抗體氨基酸序列中的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構建物具有所需特 性，可進行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構建物。氨基酸變化還可改變抗體的 翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數目或位置。用于生成抗體的抗體序列變體的方法與 例如美國專利No. 5，534，615(通過述及而明確收入本文)中記載的用于生成多肽的氨基酸 序列變體的方法相似。多肽分子的“脫酰胺”變體指如下的多肽，其中原始多肽的一個或多個天冬酰胺(N 或Asn)殘基被轉變成天冬氨酸(D或Asp)，即中性的酰胺側鏈被轉變成總體具有酸性特征 的殘基。通過將天冬酰胺(N或Asn)轉變成谷氨酰胺0^或6111)或丙氨酸(A或Ala)或絲 氨酸 ^或義！·)，可預防脫酰胺(Amphlett，G. etal.，Pharm. Biotechnol.，9 :1-140 (1996))。多肽分子的“氧化”變體指如下的多肽，其中原始多肽的一個或多個甲硫氨酸(M 或Met)或色氨酸(W或Trp)殘基經由甲硫氨酸的硫被轉變成砜或亞砜。通過將甲硫氨酸 (M或Met)轉變成亮氨酸(L或Leu)或異亮氨酸(I或lie)，可預防氧化(Amphlett，G. et al.，Pharm. Biotechnol.，9 1-140(1996))。多肽分子的“焦谷氨酸”變體指如下的多肽，其中原始多肽的一個或多個谷氨酰胺 ⑴或Gln)殘基被轉變成焦谷氨酸，這在谷氨酰胺(例如N端谷氨酰胺殘基)自發環化而產 生焦谷氨酸時發生。通過將谷氨酰胺⑴或Gln)殘基轉變成谷氨酸(E或Glu)，可預防焦谷 氨酸轉變(Amphlett，G. et al. , Pharm. Biotechnol. ,9 :1-140 (1996))。術語“抗體片段”指全長抗體的一部分，通常是靶物結合或可變區。抗體片段的例 子包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段。短語抗體的“功能性片段或類似物”指具有與全長抗 體同樣的定性的生物學活性的化合物。例如，抗人因子D抗體的功能性片段或類似物指能 以如下方式結合因子D的抗人因子D抗體的功能性片段或類似物，所述結合方式使其阻止 或實質性降低補體活化。在用于本文時，關于抗體的“功能性片段”指Fv、F(ab)和F(ab’)2 片段。“Fv”片段是含有完整靶識別和結合位點的最小抗體片段。此區由緊密、非共價結合 的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體(VH-\ 二聚體)組成。正是在這種構造中， 各可變域的三個⑶R相互作用而在二聚體表面上確定了一個靶物結合位點。六個⑶R 共同賦予抗體以靶物結合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對靶物特異的三個 ⑶R的半個Fv)也具有識別和結合靶物的能力。“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在于一條多肽鏈上。一般而言，Fv多肽在V1^n \結構域之 間還包含多肽接頭，使得sFv能夠形成結合靶物的期望結構。Fab片段包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab，片段與Fab片段的 不同之處在于重鏈CHl結構域的羧基末端增加了少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一個或 多個半胱氨酸。F(ab’ )片段通過切割F(ab’ )2胃蛋白酶消化產物的鉸鏈半胱氨酸處的二 硫鍵生成。抗體片段(例如抗原結合片段)的別的化學偶聯是本領域普通技術人員所知的。在用于本文時，“文庫”或“庫”指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發明的多肽)， 或者編碼這些序列的核酸，這些序列在根據本發明方法導入這些序列的變異氨基酸組合方 面是不同的。術語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成 群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高 度特異的，針對單一靶位點。另外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規 (多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對靶物上的單一決定簇。在它們的特異性 之外，單克隆抗體的優點在于它們可通過雜交瘤培養合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。 修飾語“單克隆”指明抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特 定方法來生成抗體。例如，與本發明一起使用的單克隆抗體可使用公知技術從噬菌體抗體 文庫分離。依照本發明使用的親本單克隆抗體可通過最初由Kohler和Milstein，Nature 256，495 (1975)記載的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組方法來制備。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是包含自非人免疫球蛋白衍生的最少序列 的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如FV、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體的其它靶 物結合子序列)。一般而言，人源化抗體會包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域， 其中所有或基本上所有CDR區對應于非人免疫球蛋白的CDR區，且所有或基本上所有FR區 是人免疫球蛋白共有序列的FR區。人源化抗體還可包含免疫球蛋白恒定區(Fe)的至少一 部分，通常是選定的人免疫球蛋白模板的。術語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”包括后代。還應理解，所有后代在DNA內 容上可能不是精確相同的，這是由于有意或無意的突變。包括具有相同功能或生物學性質 的變體后代，如在最初轉化的細胞中所篩選的。一般而言，本發明中所使用的“宿主細胞”指 原核或真核宿主。術語“載體”指包含與合適的控制序列可操作連接的DNA序列的DNA構建體，所述 合適的控制序列能夠實現DNA在合適的宿主中的表達。此類控制序列包括實現轉錄的啟動 子、任選的控制所述轉錄的操縱基因序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列、和控 制轉錄和翻譯終止的序列。載體可以是質粒、噬菌體顆粒、或僅僅是潛在的基因組插入物。 一旦轉化入合適的宿主中，載體便可獨立于宿主基因組地復制和發揮功能，或者在一些例 子中可以自身整合入基因組中。在本說明書中，“質粒”和“載體”有時可互換使用，因為質 粒是最常使用的載體形式。然而，本發明意圖包括如下的其它形式的載體，其發揮本領域中 已知的等同功能，并且其是本領域中已知的，或變為本領域中已知的。單詞“標記物”在用于本文時指可與分子或蛋白質(例如抗體)直接或間接偶聯的 可檢測的化合物或組合物。標記物可以是自身就可檢測的(例如放射性同位素標記物或熒 光標記物)，或者在酶標記物的情況中，可催化底物化合物或組合物的可檢測的化學變化。
在用于本文時，“固相”指本發明的抗體可粘著其上的非水性基質。本文中所涵蓋 的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔徑玻璃)、多糖(例如瓊脂糖)、聚 丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅酮(Silicone)形成的固相。在某些實施方案中，根據語 境，固相可包括測定板的孔；在其它實施方案中，它是純化柱(例如親和層析柱)。“噬菌體展示”是一種將變異多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在 噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術。噬菌體展示的效用在于能對隨機化蛋白質 變體的大型文庫快速且高效分選那些以高親和力與靶抗原結合的序列的實情。肽和蛋白 質文庫在噬菌體上的展示已經用于對數以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結合特性的 多肽。多價噬菌體展示法已經用于展示小隨機肽和小蛋白質，其通過與絲狀噬菌體的基因 III 或基因 VIII 融合來實現。Wells 和 Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3 :355-362, 及其中引用的參考文獻。在單價噬菌體展示中，將蛋白質或肽文庫與基因III或其一部分 融合，并在存在野生型基因III蛋白時以低水平表達，使得噬菌體顆粒展示一個拷貝的融 合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(avidity effect)相對于多價噬菌體得到了降 低，使得分選基于內在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡化了 DNA操作。Lowman和 Wells (1991)Methods :A companion toMethods in Enzymology 3:205-0216。“噬菌粒”是具有細菌復制起點(例如ColEl)和一個拷貝的噬菌體基因區間的質 粒載體。噬菌粒可利用任何已知噬菌體，包括絲狀噬菌體和λ類噬菌體。質粒一般也會包 含抗生素抗性的選擇標志。克隆入這些載體的DNA區段可以像質粒一起而擴增。在給攜 帶這些載體的細胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質粒的復制模式變成滾環復 制，以生成質粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性 噬菌體顆粒。此術語包括如下的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬 菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。“變異Fc區”包含由于至少一處本文中所定義的“氨基酸修飾”而與另一 Fc區有 所不同的氨基酸序列。優選的是，變異Fc區與天然序列Fc區相比或與親本多肽的Fc區相 比具有至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fc區中或在親本多肽的Fc區中具有約1處 至約10處氨基酸替代，優選約1處至約5處氨基酸替代。變異Fc區在本文中優選與天然序 列!^c區和/或親本多肽的Fc區擁有至少約80%的同源性，最優選與它們具有至少約90% 的同源性，更優選與它們具有至少約95%的同源性。“天然序列人Fc區”的例子顯示于WO 00/42072圖23，而且包括天然序列人IgGl Fc區(非A和A同種異型)；天然序列人IgG2 Fc區；天然序列人IgG3 Fc區；和天然序列人IgG4 Fc區以及它們的天然存在變體。天然 序列鼠Fc區顯示于WO 00/42072圖22A。依照本發明，“改變”的Fcfoi結合親和力指與親本多肽或包含天然序列Fc區的 多肽相比具有增強的或削弱的Fcfoi結合活性。在一個例子中，具有改變的Fcfoi結合親和 力的抗體具有在PH 6. O升高的對Fcfoi的結合和/或在pH7. O降低的對Fcfoi的結合。對 FcR “展示升高的結合”的變體以比親本多肽好的親和力結合至少一種FcR。對FcR “展示 降低的結合”的變體以比親本多肽差的親和力結合至少一種FcR。以比親本多肽“好的親和 力”結合FcR的變體是當結合測定法中多肽變體和親本多肽的量基本上相同時以比親本多 肽實質性好的結合親和力結合FcR的抗體。例如，在測定FcR結合親和力的情況中，具有改 進的FcR結合親和力的多肽變體可展示與親本多肽相比約1. 15倍至約100倍，例如約1. 2倍至約50倍的FcR結合親和力改進。“氨基酸修飾”指預定氨基酸序列的氨基酸序列中的改變。例示性修飾包括氨基酸 替代、插入、和/或刪除。本文中的氨基酸修飾的一個例子是替代。“特定位置(例如Fc區的)處的氨基酸修飾”指特定殘基的替代或刪除，或與特定 殘基相鄰的至少一個氨基酸殘基的插入。“與特定殘基相鄰的”插入意指其1至2個殘基內 的插入。插入可在特定殘基的N末端或C末端。“氨基酸替代”指用另一種不同的替換氨基酸殘基替換在預定氨基酸序列中的至 少一個現有氨基酸殘基。一個或多個替換殘基可以是“天然存在氨基酸殘基”(即由遺 傳密碼所編碼的)，并且選自下組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨 酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)； 異亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸 (Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)。本 文中氨基酸替代的定義還涵蓋用一種或多種非天然存在氨基酸殘基進行的替代。“非天 然存在氨基酸殘基”指能夠與多肽鏈中的相鄰氨基酸殘基共價結合的、在上文所列的那些 天然存在氨基酸殘基以外的殘基。非天然存在氨基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、 正纈氨酸、高絲氨酸、及其它氨基酸殘基類似物，諸如那些在Ellman等，Meth. Enzym. 202 301-336(1991)中記載的。為了生成此類非天然存在氨基酸殘基，可使用Noren等，Science 244:182(1989)和Ellman等，見上文的規程。簡言之，這些規程牽涉用非天然存在氨基酸 殘基化學活化抑制型tRNA，接著在體外轉錄和翻譯RNA。“氨基酸插入”指將至少一個氨基酸摻入預定氨基酸序列。雖然插入通常會由一個 或兩個氨基酸殘基的插入組成，但是本申請涵蓋更大的“肽插入”，例如約3個至約5個或甚 至多達約10個氨基酸殘基的插入。所插入的殘基可以是上文所公開的天然存在的或非天 然存在的。“氨基酸刪除”指從預定氨基酸序列除去至少一個氨基酸殘基。II.詳細描述本文中的發明提供因子D拮抗劑，包括抗因子D抗體及其變體及其片段(例如抗 原結合片段)，它們可用于預防和治療變體相關狀況，包括眼狀況(其病理涉及補體(包括 經典和旁路途徑，特別是旁路補體途徑)的所有眼狀況和疾病)，諸如例如黃斑變性性疾病 諸如所有階段的老年性黃斑變性(AMD)包括干性和濕性(非滲出性和滲出性)形式、脈絡 膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病視網膜病和其它缺血相關視網膜病、眼內炎、和其它 眼內新血管疾病諸如糖尿病黃斑水腫、病理性近視、von Hippel-Lindau病、眼的組織胞漿 菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網膜新血管形成。一組補體相關 眼狀況包括老年性黃斑變性(AMD)包括非滲出性(例如中期干性AMD或地圖樣萎縮(GA)) 和滲出性(例如濕性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))AMD、糖尿病視網膜病(DR)、眼內炎和 葡萄膜炎。在一個例子中，補體相關眼狀況是中期干性AMD。在一個例子中，補體相關眼狀 況是地圖樣萎縮。在一個例子中，補體相關眼狀況是濕性AMD(脈絡膜新血管形成(CNV))。AMD是年齡相關的黃斑變性，它是超過60歲的個體中不可逆的視功能障礙的首要 原因。存在兩種類型的AMD，即非滲出性(干性)和滲出性(濕性)AMD。干性或非滲出性形 式涉及中央視網膜(黃斑)下面的視網膜色素上皮(RPE)的萎縮性和肥大性變化以及RPE上的沉積物(玻璃疣)。具有非滲出性AMD的患者能進展成濕性或滲出性形式的AMD，其中 稱作脈絡膜新血管膜(CNVM)的異常血管在視網膜下形成，滲漏流體和血液，并最終在視網 膜中和在視網膜下引起失明性盤狀瘢痕。非滲出性AMD (其通常是滲出性AMD的前兆)更 常見。非滲出性AMD的表現有所變化硬玻璃疣、軟玻璃疣、RPE地圖樣萎縮、和色素結塊可 存在。補體成分在AMD早期RPE上沉積，而且是玻璃疣的主要組分。1.人源化抗因子D抗體本文中的發明包括人源化抗因子D抗體及其片段的生產和使用。下面的小節中更 詳細地描述了用于生成抗體的例示性方法。用于將非人抗體人源化的方法在本領域是眾所周知的。通常，人源化抗體具有一 個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們 通常取自“輸入”可變域。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法實施(Jones等， Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等， Science 239 1534-1536 (1988))，通過用嚙齒類CDR或CDR序列替代相應的人抗體序列來 進行。因而，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利No. 4，816，567)，其中基本上少于整 個人可變域用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是將人抗體中的 一些CDR殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代而得到的抗 體。當抗體意圖在于人類治療性用途時，用于生成人源化抗體的人可變域的選 擇，包括輕鏈和重鏈二者，在一些情況中對于降低抗原性和/或HAMA應答(人抗小鼠 抗體)會是非常重要。HAMA應答降低或消除通常是合適治療劑的臨床開發的一個重 要方面。參見例如 Khaxzaeli 等，J. Natl. Cancer Inst. (1988)，80 :937 Jaffers 等， Transplantation(1986) ,41 :572 ；Shawler 等，J.Immunol. (1985),135 1530 ；Sears 等，J. Biol. Response Mod(1984) ,3 138 ；Miller 等，Blood(1983)，62 :988 ;Hakimi 等， J. Immunol. (1991),147 :1352 ；Reichmann 等，Nature (1988)，332 :323 Junghans 等，Cancer Res (1990), 50 :1495。如本文中所描述的，本發明提供了經人源化使得HAMA應答降低或消 除的抗體。可使用本領域已知的常規方法(其中有些在下文中有進一步描述)進一步獲得 這些抗體的變體。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變域序列對已知 的人可變域序列的整個文庫進行篩選。鑒定與嚙齒類最接近的人V結構域序列，并接受其 中的人框架區(FR)用于人源化抗體(Sims等，J. Immunol. 151 =2296(1993) ；Chothia等， J. Mol. Biol. 196 :901 (1987))。另一種方法使用自輕鏈或重鏈特定亞組的所有人抗體的 共有序列衍生的特定框架區。同一框架可用于數種不同的人源化抗體(Carter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :4285 (1992) ；Presta 等，J. Immunol. 151 :2623 (1993))。例如，來自本文所述抗體的氨基酸序列可充當框架和/或高變序列多樣化的起始 (親本)序列。起始高變序列所連接的選定框架序列在本文中稱為受體人框架。盡管受體 人框架可來自或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH區)，優選受體人框架來自或衍生 自人共有框架序列，因為這樣的框架已證實在人類患者中具有最小免疫原性或者沒有免疫 原性。就本文目的而言，“受體人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL 或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架 可包含與之相同的氨基酸序列，或者可包含預先存在的氨基酸序列變化。當存在預先存在的氨基酸變化時，優選存在不超過5個，優選4個或更少，或者3個或更少預先存在的氨基 酸變化。在一個實施方案中，vh受體人框架在序列上vh人免疫球蛋白框架序列或人共有框 架序列相同。在一個實施方案中，vl受體人框架在序列上與vl人免疫球蛋白框架序列或 人共有框架序列相同。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白vl或vh框架序列選集中最常見 的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白vl或vh序列選集來自可變域序列的一個亞組。 通常，序列亞組是如Kabat等人的一個亞組。在一個實施方案中，對于VL，亞組是如Kabat 等人的亞組κ I。在一個實施方案中，對于VH，亞組是如Kabat等人的亞組III。當受體衍生自人免疫球蛋白時，可任選選擇根據它與供體框架序列的同源性而選 擇的人框架序列，即將供體框架序列與人框架序列集合中的各種人框架序列比對，并選擇 最具同源性的框架序列作為受體。受體人框架可來自或衍生自公共數據庫中可得的人抗體 種系序列。在一個實施方案中，本文中的人共有框架來自或衍生自vh亞組vii和/或vl κ 亞組i共有框架序列。在一個實施方案中，用于生成抗因子D抗體的人框架模板可包含來自如下模板的 框架序列，該模板包含用于VH鏈的組合VI-4. lb+(VH7家族)和JH4d和/或用于VL鏈的 組合DPK4 (V κ I家族)和JK2。在一個實施方案中，vh受體人框架包含一項、兩項、三項或所有下述框架序列frl，其包含 qvqlvqsgpelkkpgasvkvsckas (seq id no 2 之氨基酸 1-25)，fr2，其包含 wvrqapgqgle (seq id no 2 之氨基酸 36-49)，fr3,其包含 rfvfsldtsvstayi^qisslkaedtavyycer(seq id no :2 之氨基酸 67-98)、rfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyyce(seq id no 2 之氨基酸 67-97)、rfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyyc(seq id no 2 之氨基酸 67-96)、rfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycs(seq id n0:3)、或rfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycsr(seq ID NO :4)，fr4，其包含 wgqgtlvtvss(seq id no :2 之氨基酸 105-115)。在一個實施方案中，VL受體人框架可包含一項、兩項、三項或所有下述框架序列frl，其包含 diqvtqspsslsasvotrvtitc (seq id no 1 之氨基酸 1-23)，fr2，其包含 wyqqkpgkvpkllis(seq id no 1 之氨基酸；35_49)，fr3,其包含 gvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyc (seq id no :1 之氨基酸 57-88)，fr4，其包含 fgqgtkleik(seq id no 1 之氨基酸 98-107)或 fgqgtkveik (seq id no 5)。雖然受體可在序列上與選定的人框架序列相同，無論它是來自人免疫球蛋白或人 共有框架，在本發明中，受體序列可包含相對于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列而言 預先存在的氨基酸替代。這些預先存在的替代優選是最小限度的；通常相對于人免疫球蛋 白序列或共有框架序列而言的僅四處、三處、兩處或一處氨基酸差異。將非人抗體的高變區殘基摻入VL和/或VH受體人框架。例如，可摻入對應于 Kabat⑶R殘基、Chothia高變環殘基、Abm殘基和/或接觸殘基的殘基。任選的是，摻入如下延伸的高變區殘基:對-36或對-34 (Li)，46-56 或 50-56 (L2)和 89-97 (L3), 26-35B (Hl)， 50-65,47-65 或 49-65(H2)和 93-102,94-102 或 95-102(H3)。一方面，本發明提供包含重鏈可變域的抗因子D抗體，該重鏈可變域包含SEQ ID NO :2。一方面，本發明提供包含輕鏈可變域的抗因子D抗體，該輕鏈可變域包含SEQ ID NO 1。一方面，本發明提供包含重鏈可變域和輕鏈可變域的抗因子D抗體，該重鏈可變域包含 SEQ ID NO :2且該輕鏈可變域包含SEQ ID NO :1。在一個例子中，本發明提供所述抗因子D 抗體的片段(例如抗原結合片段)。一方面，本發明提供包含重鏈可變域的抗因子D抗體，該重鏈可變域包含與氨基 酸序列 SEQ ID NO :2 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，具有至少90^^91^^92^^93^^94%, 95^^96%,97^^98%或99%序列同一性的氨基酸序列相對于參照序列含有替代、插入、或 刪除，但是包含該氨基酸序列的抗體保留結合因子D的能力。在一些實施方案中，在SEQ IDNO 2的序列中總共替代、插入、或刪除1-10個氨基酸。在一些實施方案中，替代、插入或 刪除存在于HVR以外的區域中(即在FR中)。在一些實施方案中，抗因子D抗體包含重鏈 可變域，其包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。在一個例子中，本發明提供所述抗因子D抗體的 片段(例如抗原結合片段)。在一些實施方案中，本發明提供包含輕鏈可變域的抗因子D抗體，該輕鏈可變域 包含與氨基酸序列 SEQ ID NO :1 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，具有至少90^^91^^92%, 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列相對于參照序列含有替 代、插入、或刪除，但是包含該氨基酸序列的抗體保留結合因子D的能力。在一些實施方案 中，在SEQ ID NO :1的序列中總共替代、插入、或刪除1-10個氨基酸。在一些實施方案中， 替代、插入或刪除存在于HVR以外的區域中(即在FR中)。在一些實施方案中，抗因子D抗 體包含輕鏈可變域，其包含氨基酸序列SEQ IDNO :1。在一個例子中，本發明提供所述抗因 子D抗體的片段(例如抗原結合片段)。抗因子D抗體可包含任何合適的框架可變域序列，前提是抗體保留結合因子D的 能力。例如，在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含重鏈可變域框架序列，其是 VI.4. Ib+和JH4d的組合(見圖3)。在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含人亞 組VII重鏈框架共有序列。在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含重鏈可變域框 架序列，其包含包含SEQ IDNO :2之氨基酸1-25的FRl、包含SEQ ID NO :2之氨基酸36-49 的FR2、包含SEQ ID NO :2之氨基酸67-98的FR3和包含SEQ ID NO :2之氨基酸105-115的 FR4。在這些抗體的一個實施方案中，重鏈可變域序列包含第40位和/或第88位(Kabat編 號方式)處的替代。在這些抗體的一個實施方案中，第40位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A) 和/或第88位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)。在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗體 包含輕鏈可變域框架序列，其是DPK4和JK2的組合(見圖4)。在一些實施方案中，本發明 的抗因子D抗體包含人κ I輕鏈框架共有序列。在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗 體包含輕鏈可變域框架序列，其包含包含SEQ ID NO 1之氨基酸1-23的FRl、包含SEQID NO :1之氨基酸；35-49的FR2、包含SEQ ID NO :1之氨基酸57-88的FR3和包含SEQ ID NO 1之氨基酸98-107的FR4。在這些抗體的一個實施方案中，輕鏈可變框架序列包含第15
25位、第43位和/或第104位(Kabat編號方式)處的一處或多處替代。在這些抗體的一個 實施方案中，第15位是半胱氨酸(C)或纈氨酸(V)，第43位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)， 第104位是纈氨酸(V)或亮氨酸(L)。在一個例子中，本發明提供所述抗因子D抗體的片段 (例如抗原結合片段)。另外，抗因子D抗體可包含任何合適的恒定域序列，前提是抗體保留結合因子D的 能力。例如，在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含重鏈恒定域的至少一部分。在 一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含α、δ、ε、Y、或μ重鏈之一或組合的重鏈 恒定域。根據其重鏈恒定域(Ch)氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類別或同種型。有 五類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分別具有稱作α、δ、ε、Y和μ的重鏈。根 據Ch序列和功能的較小差異，γ和α類可進一步分為亞類，例如人類表達下列亞類IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含重鏈恒定 域，其包含導致對效應器功能(例如結合親和力)期望影響的氨基酸位置替代。在一個實 施方案中，本發明的抗因子D抗體包含重鏈恒定域，其包含不導致對效應器功能(例如結合 親和力)影響的氨基酸位置替代。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含IgG型 (例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的重鏈恒定域且進一步包含第114位(Kabat編號方式； 等同于EU編號方式中的118)、第168位(Kabat編號方式；等同于EU編號方式中的172)、 第172位(Kabat編號方式；等同于EU編號方式中的176)和/或第2 位(EU編號方式) 處的替代。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4)型的重鏈恒定域且進一步包含第114位處的替代，其中第114位是半胱氨酸(C)或丙 氨酸(A),第168位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A),第172位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A) 和/或第2 位是脯氨酸(P)、精氨酸(R)或絲氨酸( 。在一個例子中，本發明提供所述 抗因子D抗體的片段(例如抗原結合片段)。另外，例如在一些實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含輕鏈恒定域的至少一 部分。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含κ或λ輕鏈之一或組合的輕鏈恒 定域，根據其恒定域氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的輕鏈可歸入兩種截然不同類型 中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含 輕鏈恒定域，其包含導致對效應器功能(例如結合親和力)期望影響的氨基酸位置替代。在 一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含輕鏈恒定域，其包含不導致對效應器功能(例 如結合親和力)影響的氨基酸位置替代。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含 κ型的輕鏈恒定域且進一步包含第110位、第144位、第146位和/或第168位(Kabat編 號方式)處的替代。在一個實施方案中，本發明的抗因子D抗體包含κ型的輕鏈恒定域且 進一步包含第110位、第144位、第146位和/或第168位處的替代，其中第110位是半胱 氨酸(C)或纈氨酸(V)，第144位是半胱氨酸(C)或丙氨酸(A)，第146位是異亮氨酸(I) 或纈氨酸(V)，第168位是半胱氨酸(C)或絲氨酸(S)。在一個例子中，本發明提供所述抗 因子D抗體的片段(例如抗原結合片段)。2.經過修飾的抗因子D抗體本文中的方面包括經過修飾的抗因子D抗體，例如經過修飾的人源化抗因子D抗 體，及其變體，及其片段(例如抗原結合片段)的生產和使用。下面的小節中更為詳細地描 述了用于生成經過修飾的抗體的例示性方法。
可以修飾親本抗因子D抗體(包括人源化抗因子D抗體)以生成經過修飾的抗因 子D抗體及其變體。在一個實施方案中，經過修飾的抗因子D抗體及其變體可具有勝過親 本抗體改良的物理、化學、生物學或同質性特性。在一個例子中，本發明提供所述抗因子D 抗體的片段(例如抗原結合片段)。在一個實施方案中，本發明的抗體包含親本抗體的一個或多個高變區中的一處或 多處氨基酸改變(例如替代)。或者/另外，可以在親本抗體的框架區中引入一處或多處 改變(例如替代)。要修飾的框架區殘基的例子包括那些直接非共價結合抗原的(Amit et al.，(1986) Science, 233 :747-753)；與 CDR 相互作用 / 影響 CDR 構象的(Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol.，196 :901-917)；和 / 或參與 VL-VH 界面的(EP 239 400B1)。在某些 實施方案中，一個或多個此類框架區殘基的修飾導致抗體對抗原的結合親和力增強。例如， 在本發明的這個實施方案中可以改變約1個至約5個框架殘基。要修飾的框架或HVR區殘 基的例子包括如下的位點，其中此類位點處的修飾導致生成脫酰胺變體(例如天冬酰胺(N 或Asn)殘基被修飾成天冬氨酸(D或Asp))、氧化變體(例如甲硫氨酸(M或Met)殘基和/ 或色氨酸(W或Trp)殘基被修飾成砜或亞砜)或焦谷氨酸變體(例如谷氨酰胺⑴或Gln) 殘基被修飾成焦谷氨酸)。要修飾的框架區殘基或HVR區殘基的例子包括可能的脫酰胺位 點(即天冬酰胺(N或Asn))、氧化位點(即甲硫氨酸(M或Met)或色氨酸(W或Trp))或 焦谷氨酸轉變位點(即谷氨酰胺⑴或Gln))，其中此類位點處的修飾分別預防脫酰胺和/ 或氧化和/或焦谷氨酸轉變。為了預防形成脫酰胺變體，可以將天冬酰胺(N或Asn)突變 成丙氨酸(A或Ala)、谷氨酰胺0!或6111)或絲氨酸(S或kr)。為了預防形成氧化變體， 可以將甲硫氨酸(Met)或色氨酸(W或Trp)突變成亮氨酸(L)或異亮氨酸(I)。為了預防 形成焦谷氨酸變體，可以將谷氨酰胺0!或6111)突變成谷氨酸(E或Glu) (Amphlett, G. et al.，Pharm. Biotechnol.，9 1-140 (1996))。或者/另外，可以在親本抗體的Fc區中有一處 或多處框架區改變(例如替代)。在一個例子中，本發明提供所述抗因子D抗體的片段(例 如抗原結合片段)。在一個實施方案中，本發明的抗體包含變異Fc區，使得抗體的體內半衰期相對于 親本抗體或包含天然序列Fc區的抗體延長或縮短。在一個實施方案中，抗體包含提高或降 低新生兒Fc受體(Fcfoi)對抗體的結合親和力的變異Fc區(參見W02000042072，通過述 及而完整收錄)。例如，此類抗體可包含Fc區氨基酸位置238、252、253、254、255、256、洸5、 272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、 388、400、413、415、424、433、434、435、436、439 或 447 任一處或多處的氨基酸修飾，其中 Fc 區中殘基的編號方式是如Kabat中的EU索引的。此類對Fcfoi的結合降低的多肽變體可包 含 Fc 區氨基酸位置 252、253、254、255、沘8、309、386、388、400、415、433、435、436、439 或 447 任一處或多處的氨基酸修飾，其中Fc區中殘基的編號方式是如Kabat中的EU索引的。或 者，上文所述多肽變體可展示升高的對Fcfoi的結合，而且包含Fc區氨基酸位置238、256、 265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434任一處或多處的氨基酸修飾，其中Fc區中殘基的編號方式是如Kabat中的EU索引的。 例如，抗體包含以相對于親本抗體或包含天然序列Fc區的抗體延長的體內半衰期結合的 變異Fc區。例如，抗體包含以相對于親本抗體或包含天然序列Fc區的抗體升高的親和力 結合Fcfoi的變異Fc區。
可如下測量Fcfoi結合親和力可以使用例如BiaCore 3000設備通過表面等離振子共振來研究本發明抗體針對 人Fcfoi的結合。使用胺偶聯試劑盒將人Fcfoi偶聯至傳感器芯片。例如，可以將CM5傳感 器芯片用EDC/NHS以5ml/min活化7分鐘。可以在活化后的芯片上以lOml/min流速注射 100mg/ml人Fcfoi達30秒鐘至2分鐘以給出100至200的最終結合響應單位(RU)。偶聯 后，可以通過以5ml/min注射35ml IM乙醇胺氫氯化物來封閉Fcfoi偶聯的芯片。可以測定在pH 6.0或？!1 7. 4本發明的抗體對人Fcfoi的結合。用于結合實驗的 運行緩沖液是含有0.01% P20和0.02%疊氮化鈉的PBS pH 6.0或pH 7.4。可以將本發明 的抗體交換緩沖液入pH 6. O或pH 7. 4的運行緩沖液。在一個實施方案中，在25°C實施實 驗。對于pH 6. O運行，使抗體(濃度范圍4mM至0. 7nM)以30ml/min流過Fcfoi包被的芯片 4分鐘，然后容許自芯片解離5分鐘。對于pH 7. 4運行，將抗體(濃度范圍12mM至IOOnM) 以20ml/min注射流過Fcfoi包被的芯片1. 5分鐘，然后釋放2分鐘。還讓抗體流過傳感器 芯片上未綴合的點以容許自對Fcto偶聯芯片的結合減去背景非特異性結合。可以在各注 射之間用30秒0. IM TRIS pH 8. 3脈沖再生芯片。可在每次注射期結束時記錄每次注射的 穩態RU，稍后通過將穩態RU針對注射濃度繪圖來計算解離常數(Kd)。用于生成此類經過修飾的抗體及其片段(例如抗原結合片段)及其變體的一種有 用規程稱作“丙氨酸掃描誘變”(Cunningham 和 Wells (1989) kience244 :1081-1085)。這 里，一個或多個高變區殘基用丙氨酸或多丙氨酸殘基替代，以影響氨基酸與抗原的相互作 用。然后通過在或對替代位點引入更多或其它的突變，推敲那些對替代表現出功能敏感性 的高變區殘基。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但是突變本身的性質 不需要預先決定。如本文所述對如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學活性(即結合 親和力或溶血測定法)。通常，會從保守替代諸如下文顯示在標題“優選替代”下的那些開始。如果此類替 代導致生物學活性(例如結合親和力)的改變，那么引入下表中稱為“例示替代”的或如下 文中關于氨基酸種類的進一步描述的更實質性改變，并篩選產物。下表中列出了優選的替 代。表1:優選替代
原始殘基例示替代優選替代Ala (A)val; leu; ilevalArg (R)Iys； gin; asnIysAsn (N)gin; his; Iys; arggin
權利要求
1.一種抗因子D抗體，其包含參照抗體的輕鏈HVR，其中所述抗因子D抗體在所述參照 抗體的一個或多個位置處進一步包含替代，其中所述參照抗體包含含有ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO 30)的輕鏈 HVR-I、包含 GGNTLRP(SEQ ID NO 35)的輕鏈 HVR-2、和包含 LQSDSLPYT(SEQ IDNO :38)的輕鏈HVR-3，且其中所述替代是下述一項或多項(a)輕鏈的第33位氨基酸是L或I；(b)輕鏈的第34位氨基酸是A或Q；(c)輕鏈的第52位氨基酸是S或A；(d)輕鏈的第104位氨基酸是V；(e)重鏈的第1位氨基酸是E；(f)重鏈的第99位氨基酸是A或Q；或(g)重鏈的第100位氨基酸是A或Q。
2.一種抗因子D抗體，其包含參照抗體的重鏈HVR，其中所述抗因子D抗體在所述參 照抗體的一個或多個位置處進一步包含替代，其中所述參照抗體包含含有GYTFTNYGMN(SEQ ID NO 39)的重鏈 HVR-I、包含 WINTYTGETTYADDFKG (SEQ ID NO 40)的重鏈 HVR-2、和包含 EGGVNN(SEQ ID NO 41)的重鏈HVR-3，且其中所述替代是下述一項或多項(a)輕鏈的第33位氨基酸是L或I；(b)輕鏈的第34位氨基酸是A或Q；(c)輕鏈的第52位氨基酸是S或A；(d)輕鏈的第104位氨基酸是V；(e)重鏈的第1位氨基酸是E；(f)重鏈的第99位氨基酸是A或Q；或(g)重鏈的第100位氨基酸是A或Q。
3.一種抗因子D抗體，其包含參照抗體的輕鏈HVR和重鏈HVR，其中所述抗因子D 抗體在所述參照抗體的一個或多個位置處進一步包含替代，其中所述參照抗體包含含有 ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO :30)的輕鏈HVR-I、包含GGNTLRP(SEQ ID NO :35)的輕鏈HVR-2、和 包含 LQSDSLPYT (SEQ ID NO 38)的輕鏈 HVR-3、及包含 GYTFTNYGMN(SEQ ID NO :39)的重鏈 HVR-I、包含 WINTYTGETTYADDi7KG (SEQ IDNO 40)的重鏈 HVR-2、和包含 EGGVNN (SEQ ID NO: 41)的重鏈HVR-3，且其中所述替代是下述一項或多項(a)輕鏈的第33位氨基酸是L或I；(b)輕鏈的第34位氨基酸是A或Q；(c)輕鏈的第52位氨基酸是S或A；(d)輕鏈的第104位氨基酸是V；(e)重鏈的第1位氨基酸是E；(f)重鏈的第99位氨基酸是A或Q；或(g)重鏈的第100位氨基酸是A或Q。
4.一種抗因子D抗體，其包含(a)至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自下組的HVR (i)包含選自SEQID NO 39的氨基酸序列的HVR-Hl ；(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 40的HVR-H2 ；(iii)包含選自SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44 禾口 SEQ ID NO 45的氨基酸序列的HVR-H3 ；(iv)包含選自SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO: 32、SEQID NO :33 禾口 SEQ ID NO 34的氨基酸序列的HVR-Ll ；(ν)包含選自 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO :36 和 SEQ ID NO :37 的氨基酸序列的 HVR-L2 ；和(vi)包含選自SEQ ID NO 38的氨基酸序列的HVR-L3 ；或(b)至少一個變異HVR，其中所述變異HVR包含SEQ ID NO :39、40、41、42、43、44、45、30、 31、32、33、34、35、36、37或38中所示序列的至少一個殘基的修飾。
5.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 39的HVR-Hl。
6.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 40的HVR-H2。
7.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 41的HVR-H3。
8.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 30的HVR-Ll。
9.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 35的HVR-L2。
10.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 38的HVR-L3。
11.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 39的HVR-Hl、包含氨基酸 序歹Ij SEQ ID NO 40的HVR-H2、和包含氨基酸序列SEQ IDNO :41的HVR-H3。
12.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 30的HVR-Ll、包含氨基酸 序列SEQ ID NO 35的HVR-L2、和包含氨基酸序列SEQ IDNO 38的HVR-L3。
13.權利要求4的抗體，其包含含有氨基酸序列SEQID NO 39的HVR-Hl、包含氨基酸 序列SEQ ID NO 40的HVR-H2、包含氨基酸序列SEQ ID NO :41的HVR-H3、包含氨基酸序列 SEQ ID NO 30的HVR-Ll、包含氨基酸序列SEQ ID NO :35的HVR-L2、和包含氨基酸序列SEQ ID NO 38 的 HVR-L3。
14.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID N0:18的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的重鏈可變域。
15.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID N0:19的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的重鏈可變域。
16.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID NO :6的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的輕鏈可變域。
17.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID NO :7的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的輕鏈可變域。
18.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID N0:18的氨基酸序列具有至少 90%序列同一性的重鏈可變域和與選自SEQ ID NO :6的氨基酸序列具有至少90%序列同 一性的輕鏈可變域。
19.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID N0:19的氨基酸序列具有至少 90%序列同一性的重鏈可變域和與選自SEQ ID NO :7的氨基酸序列具有至少90%序列同 一性的輕鏈可變域。
20.權利要求4的抗體，其中該抗體包含選自SEQID NO 18, SEQ ID N0:19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQid no 26, seq id no :27、seqid no 28 和 seq id no 29 的重鏈可變域。
21.權利要求4的抗體，其中該抗體包含選自seqid n0:6、seq id no :7、seq id no: 8、seq id no :9, seq id no: 10、seq id no =iuseq idno : 12、seq id no: 13、seq id no: 14、seq id no: 15、seq id no :16 禾口 seq id no :17 的輕鏈可變域。
22.—種多肽，其包含下述氨基酸序列 X1Vqlvqsgpelkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglewmgwintytgettyaddfkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycereggvx2x3wgqgtlvtvss (seq id no :74)，其中 ^c1 是 q 或 e ;)(2 是 n、a 或 q ；且 x3 是n、a或q。
23.一種多肽，其包含下述氨基酸序列diqvtqspsslsasvgdrvtitcitstdidddx4x5wyqqkpgkvpkll isggx6tlrpgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclqsdslpytfgqgtkx7eik (seq id no :73)，其中)(4是] 、1^或 i ;)(5 是 n、a或 q ;&是仏3或a ；且乂7是1^或v。
24.—種多肽，其包含選自下組的氨基酸序列seq id no :18、seq id no :19、seq id no :20、seq id no :21、seq id no :22、seq id no :23、seq id no :24、seq id no :25、seq id no :26、seq id no :27、seqid no 28 和 seq id no :29。
25.—種多肽，其包含選自下組的氨基酸序列=seq id n0:6、seq id no :7、seq id no: 8、seq id no :9, seq id no: 10、seq id no: 11、seqid no: 12、seq id no: 13、seq id no: 14、seq id no: 15、seq id no :16 禾口 seq id no: 17。
26.一種抗因子D抗體，其包含權利要求22的多肽。
27.一種抗因子d抗體，其包含權利要求23的多肽。
28.一種抗因子d抗體，其包含權利要求22的多肽和權利要求23的多肽。
29.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列seqid no :18。
30.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列seqid n0:19。
31.權利要求4的抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域序列seqid no :6。
32.權利要求4的抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域序列seqid no :7。
33.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列seqid n0:18和輕鏈可變域 序列 seq id no :6。
34.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列seqid n0:19和輕鏈可變域 序列 seq id no :7。
35.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自seqid no力4的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的重鏈可變域。
36.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自seqid no :63的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的重鏈可變域。
37.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自seqid no :47的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的輕鏈可變域。
38.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自seqid no 61的氨基酸序列具有至少 90 %序列同一性的輕鏈可變域。
39.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID NO力4的氨基酸序列具有至少 90%序列同一性的重鏈可變域和與選自SEQ ID NO 47的氨基酸序列具有至少90%序列同 一性的輕鏈可變域。
40.權利要求4的抗體，其中該抗體包含與選自SEQID NO :63的氨基酸序列具有至少 90%序列同一性的重鏈可變域和與選自SEQ ID NO 61的氨基酸序列具有至少90%序列同 一性的輕鏈可變域。
41.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列SEQID N0:54。
42.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列SEQID NO :63。
43.權利要求4的抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域序列SEQID NO :47。
44.權利要求4的抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域序列SEQID NO :61。
45.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列SEQID NO力4和輕鏈可變域 序歹Ij SEQ ID NO :47ο
46.權利要求4的抗體，其中該抗體包含重鏈可變域序列SEQID NO :63和輕鏈可變域 序歹Ij SEQ ID NO :61ο
47.一種多肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :47和61。
48.一種多肽，其包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 54和63。
49.權利要求4或14-19或沈-28的抗體，其中該抗體是人源化的。
50.權利要求4或14-19或沈-28的抗體，其中所述因子D是哺乳動物因子D。
51.權利要求50的抗體，其中所述因子D是人因子D。
52.一種多核苷酸，其編碼權利要求4或14-19或沈-28的抗體。
53.一種多核苷酸，其編碼權利要求22-25或47-48的多肽。
54.一種載體，其包含權利要求52或53的多核苷酸。
55.一種宿主細胞，其包含權利要求M的載體。
56.權利要求55的宿主細胞，其中該宿主細胞是真核的。
57.權利要求55的宿主細胞，其中該宿主細胞是CHO細胞。
58.一種制備抗因子D抗體的方法，其中該方法包括(a)在適合于編碼所述抗體的多核 苷酸表達的條件下培養權利要求56或57的宿主細胞，并(b)分離所述抗體。
59.權利要求4或14-19或沈-28的抗體，其中該抗體是單克隆抗體。
60.權利要求59的抗體，其中該抗體是選自下組的抗體片段Fab、Fab，-SH.Fv.scFv, 或(Fab，)2片段。
61.權利要求59的抗體，其中該抗體是人源化的。
62.權利要求59的抗體，其是在細菌中生成的。
63.權利要求59的抗體，其是在CHO細胞中生成的。
64.一種藥物配制劑，其包含權利要求59的抗因子D抗體，和藥學可接受稀釋劑、載體 或賦形劑。
65.一種制品，其包含(a)權利要求64的藥物配制劑；(b)容器；和(c)包裝插頁或標簽，其指明所述藥物配制劑能用于治療補體相關病癥。
66.一種試劑盒，其包含權利要求4或14-19或沈-觀的抗體和施用所述抗體來治療補 體相關病癥的指令。
67.權利要求66的試劑盒，其中所述補體相關病癥選自包含眼病的組。
68.權利要求67的試劑盒，其中所述眼病選自下組老年性黃斑變性、糖尿病視網膜 病、脈絡膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黃斑水腫、病理性近視、von Hippel-Lindau 病、眼的組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網膜新血管形 成。
69.權利要求68的試劑盒，其中所述老年性黃斑變性選自下組中期干性AMD、地圖樣 萎縮和地圖樣萎縮。
70.一種治療選自包含炎性病癥的組的補體相關病癥的方法。
71.權利要求70的方法，其中所述炎性病癥是自身免疫病。
72.權利要求71的方法，其中所述自身免疫病選自下組系統性紅斑狼瘡、重癥肌無 力、類風濕性關節炎、阿爾茨海默氏病和多發性硬化。
73.一種治療選自包含眼病的組的補體相關病癥的方法。
74.權利要求73的方法，其中所述眼病選自下組老年性黃斑變性、糖尿病視網膜病、 脈絡膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黃斑水腫、病理性近視、von Hippel-Lindau病、 眼的組織胞漿菌病、視網膜中央靜脈阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和視網膜新血管形成。
75.權利要求74的方法，其中所述老年性黃斑變性選自下組中期干性AMD、地圖樣萎 縮和地圖樣萎縮。
76.通過下述方法生成的抗體(a)培養表達包含權利要求14-15、四-30、35-36或41-42任一項的重鏈可變域和權利 要求16-17、31-32、37-38或43-44任一項的輕鏈可變域的抗體的細胞；并(b)自所述培養的細胞分離所述抗體。
全文摘要
本發明涉及抗因子D抗體、它們的核酸和氨基酸序列、包含這些抗體的細胞和載體及它們的生產和它們在制備用于治療與補體活化過度或不受控制有關的疾病和病癥的組合物和藥物中的用途。這些抗體對于疾病的診斷、預防和治療是有用的。
文檔編號A61P27/02GK102066419SQ200980123668
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月27日 優先權日2008年4月28日
發明者亨利·洛曼, 曼諾·范盧克倫坎帕格尼, 查爾斯·M·溫特, 羅伯特·F·凱利, 阿瑟·J·黃 申請人:健泰科生物技術公司