專利名稱：包含脂質體、抗原、多核苷酸和含疏水物質的連續相的載體的組合物的制作方法
技術領域：
本申請涉及包含脂質體、抗原、Poly I:C多核苷酸和含疏水物質的連續相的載體 的組合物，及其應用。
背景技術：
常規疫苗可以包含抗原、佐劑和藥學可接受的載體。已知Poly I:C多核苷酸可 以用作佐劑。還已知脂質體可以用于疫苗組合物中(參見申請人的已授權的美國專利 6，793，923)。然而，就申請人的知識而言，本領域沒有教導或暗示將抗原、Poly I:C多核苷 酸、脂質體和疏水性載體組合在疫苗組合物中。
發明內容
申請人:現在已經發現，與包含在水性載體中的Poly I:C多核苷酸的常規疫苗組合 物或包含脂質體、疏水性載體和明礬佐劑的組合物相比，包含抗原、Poly I:C多核苷酸、脂 質體和含疏水物質的連續相的載體的組合物可以出人意料地提供更高的抗體效價和更高 百分比的激活的或記憶性⑶8+T細胞。因此，在一個方面，本發明提供了一種組合物，其包含(a)抗原；(b)脂質體；(C) Poly I:C多核苷酸；和(d)含疏水物質的連續相的載體。在另一個方面，本發明提供了一種制備組合物的方法，所述方法包括以任意的順 序合并a)抗原；(b)脂質體；(C)Poly I:C多核苷酸；和(d)含疏水物質的連續相的載體。 在一個實施方案中，所述抗原包封在脂質體中。在一個實施方案中，所述Poly I:C多核苷 酸包封在脂質體中。在另一個方面，本發明提供了根據上述方法制備的組合物。在另一個方面，本發明提供了包括將如上所述的組合物施用于受試者的方法。在 一個實施方案中，該方法是誘發該受試者中針對所述抗原的抗體應答或細胞介導的免疫應 答的方法。在結合附圖評閱本發明的具體實施方案的下列描述后，本發明的其他方面和特征 對于本領域普通技術人員來說將是顯而易見的。
在附圖中，其僅以實例的方式圖示說明了本發明的實施方案圖1是顯示三組小鼠(n = 9或10)如下接種疫苗的結果的圖1組小鼠用在配制成脂質體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗B，本發明)的30微升劑量中的1微克rHA和 4微克Poly I :C進行疫苗接種。2組小鼠用包含30微升劑量的脂質體/明礬/疏水性載體 制劑中的1微克rHA和60微克明礬的疫苗A進行處理。3組小鼠用1微克rHA和60微克 明礬/30微升劑量的對照明礬疫苗進行疫苗接種。體液免疫應答通過如本文所述的ELISA 測量。對于每個處理組，對于每個時間點將終點抗體效價的IoglO值進行平均并計算標準 差。使用T檢驗(student T test)計算P值。圖2是顯示兩組小鼠(n = 9或10)如下接種疫苗的結果的圖1組小鼠用在配制 成脂質體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗B，本發明)的30微升劑量中的1微克rHA和 4微克Poly I :C進行疫苗接種。2組小鼠用1微克rHA和4微克Poly I:C/30微升劑量的 對照Poly I :C疫苗進行處理。體液免疫應答通過如本文所述的ELISA測量。對于每個處 理組，對于每個時間點將終點抗體效價的IoglO值進行平均并計算標準差。使用T檢驗計 算P值。圖3是顯示兩組小鼠(n = 8或9)如下接種疫苗的結果的圖1組小鼠用單劑量的 在配制成凍干脂質體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗C，本發明)的50微升劑量中的1 微克rHA和10微克Poly I :C進行疫苗接種。2組小鼠用1微克rHA和100微克明礬/50 微升劑量的對照明礬疫苗進行處理；小鼠在疫苗接種后21天加強免疫。體液免疫應答通過 如本文所述的ELISA測量。對于每個處理組，對于每個時間點將終點抗體效價的IoglO值 進行平均并計算標準差。圖4.在用配制在脂質體/Poly I: C/油性載體疫苗中的rHA抗原進行疫苗接種后 增強的抗rHA抗體應答。兩組小鼠(n = 9或10)如下接種疫苗1組小鼠用在配制成脂質 體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗B，本發明)的30微升劑量中的1微克rHA和4微克 Poly I:C進行疫苗接種。2組小鼠用疫苗A，30微升劑量的脂質體/明礬/疏水性載體制 劑中的1微克rHA和60微克明礬進行處理。體液免疫應答通過如本文所述的ELISA測量。 對于每個處理組，對于每個時間點將終點抗體效價的IoglO值進行平均并計算標準差。使 用T檢驗計算P值。圖5.在用配制在脂質體/Poly I: C/油性載體疫苗中的rHA抗原進行疫苗接種后 增強的抗rHA抗體應答。兩組小鼠(n = 9或10)如下接種疫苗1組小鼠用在配制成脂質 體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗B，本發明)的30微升劑量中的1微克rHA和4微 克Poly I:C進行疫苗接種。2組小鼠用1微克rHA和4微克Poly I:C/30微升劑量的對 照Poly I :C疫苗進行處理。體液免疫應答通過如本文所述的ELISA測量。對于每個處理 組，對于每個時間點將終點抗體效價的IoglO值進行平均并計算標準差。使用T檢驗計算 P值。圖6.在用配制在凍干脂質體/Poly I:C/油性載體疫苗中的rHA抗原進行疫苗接 種后增強的抗rHA抗體應答。兩組小鼠(n = 9或10)如下接種疫苗1組小鼠用單劑量的 在配制成凍干脂質體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗D，本發明)的50微升劑量中的 1.5微克rHA和12. 5微克Polyl: C進行疫苗接種。2組小鼠用1.5微克rHA和100微克明 礬/50微升劑量的對照明礬疫苗進行處理；小鼠在疫苗接種后觀天G周)加強免疫。體 液免疫應答通過如本文所述的ELISA測量。對于每個處理組，對于每個時間點將終點抗體 效價的IoglO值進行平均并計算標準差。使用T檢驗計算P值。
圖7.疫苗接種后⑶8-陽性T細胞群內的抗原特異性⑶8細胞的數目。三組BALB/ c小鼠(n = 4)如下進行疫苗接種1組小鼠用在配制成凍干脂質體/Poly I C/疏水性載 體疫苗(疫苗D，本發明)的50微升劑量中的1. 5微克rHA和12. 5微克基于RNA的Poly I :C佐劑進行肌內疫苗接種。2組小鼠用50微升的疫苗D皮下接種。3組小鼠用在50微升 的50毫摩爾磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)中的1. 5微克rHA和100微克Liiject Alum佐劑進行 肌內接種。所有疫苗僅給予一次而不用加強免疫。在疫苗接種后22天使用三色流式細胞 分析在動物的脾細胞中檢測抗原特異性CD8+T細胞。細胞用抗CD8 β -APC，抗CD19-FITC和 對攜帶rHA、I9L的優勢免疫表位的H2_Dd特異的PE-五聚體進行染色。結果表示為CD8 β 陽性/CD19陰性細胞群的群體中五聚體陽性細胞的平均百分比，+/_標準差。減去在從原態 (naiVe)細胞中分離的脾細胞中檢測的背景染色。與3組相比*P = < 0. 025，**P =<0. 005。圖8.針對在本發明中配制的rHA的單次疫苗接種后的血凝抑制(HAI)效價。一 組小鼠和一組兔(n = 5)如下進行疫苗接種該組小鼠用在配制成凍干脂質體/Poly I:C/ 疏水性載體疫苗(疫苗Ε，本發明)的50微升劑量中的0.5微克rHA和12微克Poly I:C 進行疫苗接種。該組兔用在200微升劑量的凍干脂質體/Poly I:C/疏水性載體制劑中的 疫苗F(本發明)，2微克rHA和50微克Poly I :C進行處理。體液免疫應答通過如本文所 述的血凝抑制測定，在疫苗接種前(接種前)和接種后4周(兔)或5周(小鼠)進行測 量。對于每個處理組，將HAI效價的IoglO值進行平均并計算標準差。圖9.在用配制在脂質體/Poly I:C/油性載體疫苗中的β -淀粉樣蛋白和F21E 肽的混合物接種后增強的抗-β-淀粉樣蛋白抗體應答。兩組小鼠(η = 9)如下進行疫苗 接種1組小鼠用在配制成脂質體/明礬/疏水性載體疫苗(疫苗G)的100微升劑量中的 10微克β -淀粉樣蛋白、20微克F21E和200微克明礬進行疫苗接種。2組小鼠用10微克 β-淀粉樣蛋白、20微克F21E和10微克Poly I C/配制成脂質體/Poly I:C/疏水性載體 (疫苗H，本發明)的100微升劑量進行處理。體液免疫應答通過如本文所述的ELISA測定。 對于每個處理組，對每個時間點將終點抗體效價的IoglO值進行平均并計算標準差。使用 T檢驗計算P值。圖10.配制在脂質體/polyl:C/疏水性載體制劑中的疫苗能夠引起細胞和體液 免疫應答。兩組小鼠(n = 5)如下進行疫苗接種1組小鼠用在配制成凍干脂質體/Poly I C (高)/疏水性載體疫苗(疫苗E，本發明)的50微升劑量中的0. 5微克rHA和12微克 Poly I :C進行疫苗接種。2組小鼠用0.5微克rHA和2. 5微克Poly I: C/配制成凍干脂質 體/Poly I:C(低)/疏水性載體(疫苗I，本發明)的50微升劑量進行處理。體液(IgGl) 和細胞(IgG2A)免疫應答的指示劑通過如本文所述的ELISA進行測量。對于每個處理組， 對每個時間點將終點抗體效價的IoglO值進行平均并計算標準差。圖11是顯示用表達HPV16 E7的C3細胞植入并且在8天后如下進行疫苗接種的 C57BL/6小鼠的平均腫瘤體積的圖1組小鼠用含有配制在具有疏水性載體的乳液中的15 微克FP抗原和150微克基于RNA的Poly I:C的100微升(對照乳劑疫苗)進行疫苗接 種。2組小鼠用含有配制在脂質體/Poly I: C/疏水性載體中的15微克FP抗原和150微克 Poly I:C的100微升(疫苗K，本發明)進行疫苗接種。3組小鼠僅接受100微升PBS。所 有組含8只小鼠。植入后一周一次測量腫瘤尺寸，測量5周。圖11顯示對每組計算的平均 腫瘤體積+/-SEM。使用T檢驗計算1組和2組的P值，Y =< 0. 1，**p =<0. 05。
圖12是顯示用表達HPV16E7的C3細胞植入并且在5天后如下進行疫苗接種的 C57BL/6小鼠的平均腫瘤體積的圖1組小鼠接受含有配制在脂質體/Poly I:C/疏水性載 體中的10微克FP抗原和20微克基于DNA的Poly I C的100微升(疫苗L，本發明)。2 組小鼠接受含有配制在凍干脂質體/Poly I:C/疏水性載體中的10微克FP抗原和20微克 基于DNA的Poly I C的50微升(疫苗M，本發明)。3組小鼠接受含有配制在凍干脂質體 /疏水性載體中的10微克FP抗原的50微升(佐劑對照)。4組小鼠僅接受100微升PBS。 所有組含10只小鼠。植入后一周一次測量腫瘤尺寸，測量5周。圖12顯示對每組計算的 平均腫瘤體積+/-SEM。使用T檢驗計算2組和3組的P值，Y =< 0. 5。圖13.在用配制在凍干脂質體/Poly I C/油性載體疫苗中的rHA抗原進行疫苗 接種后增強的抗rHA細胞應答。兩組小鼠(η = 9或10)如下進行免疫1組小鼠用單劑量 的在配制成凍干脂質體/Poly I:C/疏水性載體疫苗(疫苗D，本發明)的50微升劑量中 的1. 5微克rHA和12. 5微克Poly I :C進行疫苗接種。2組小鼠用1. 5微克rHA和100微 克明礬/50微升劑量的對照明礬疫苗進行處理；小鼠在疫苗接種后觀天G周)加強免疫。 抗原特異性細胞應答通過對H2-Kd表位IYSTVASSL特異的⑶8+T細胞的五聚體染色和流式 細胞術進行測量。如本發明所述進行疫苗接種的小鼠產生抗原特異性的長效細胞應答。使 用T檢驗計算P值。
具體實施例方式本申請涉及包含脂質體、抗原、Poly I:C多核苷酸和含疏水物質的連續相的載體 的組合物和它們的應用。與包含在水性載體中的Poly I:C多核苷酸的常規疫苗組合物或包含脂質體、疏水 性載體和明礬佐劑的組合物相比，將抗原、Poly I :C多核苷酸、脂質體和含疏水物質的連續 相的載體結合在一起的本發明組合物提供了令人驚訝地更高的抗體效價。實施例1和2中描述的數據總結在表1中表 1.
權利要求
1.一種組合物，包含(a)抗原；(b)脂質體；(C)Poly I :C多核苷酸；和(d)包含疏水物質的連續相的載體。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述PolyI:C多核苷酸包含RNA或DNA。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述PolyI:C多核苷酸包含RNA和DNA。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的組合物，其中所述PolyI:C多核苷酸是均聚物或 雜聚物。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的組合物，其中所述PolyI:C多核苷酸包含均聚的 Poly I :C多核苷酸和雜聚的Poly I :C多核苷酸。
6.一種制備組合物的方法，所述方法包括以任意的順序組合 a)抗原；(b)脂質體；(C)Poly I :C多核苷酸；和(d)包含疏水物質的連續相的載體。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述抗原包封在所述脂質體中。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述PolyI C多核苷酸包封在所述脂質體中。
9.根據權利要求6或7所述的方法，其中所述PolyI C多核苷酸加在所述脂質體的外部。
10.根據權利要求6-9中任一項所述的方法制備的組合物。
11.一種方法，包括將根據權利要求1-5和10中任一項所述的組合物施用于需要其的受試者。
12.根據權利要求11所述的方法，其是在所述受試者中誘發對所述抗原的抗體應答和 /或細胞介導的免疫應答的方法。
13.根據權利要求11所述的方法，其是用于治療和/或預防由表達所述抗原的細菌、病 毒、真菌、寄生蟲、變應原或腫瘤細胞引起的疾病的方法。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述治療和/或預防包括誘發受試者中對所述 抗原的抗體和/或細胞介導的免疫應答，其中所述受試者患有病毒感染或處于發生病毒感 染的危險中。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述病毒感染是流感病毒感染。
16.根據權利要求13所述的方法，其中所述治療和/或預防包括誘發受試者中對所述 抗原的抗體和/或細胞介導的免疫應答，其中所述受試者患有癌癥或處于發生癌癥的危險 中。
17.根據權利要求11所述的方法，其是用于治療和/或預防神經變性疾病的方法，其中 所述神經變性疾病與所述抗原的表達相關。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述神經變性疾病是阿爾茨海默病。
19.根據權利要求11-18中任一項所述的方法，其中所述組合物誘發受試者中的免疫應答為對照組合物誘發的應答的至少1. 5倍高。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述組合物誘發受試者中的免疫應答為對照組 合物誘發的應答的至少5倍高。
21.根據權利要求11-20中任一項所述的方法，其中所述組合物經下述途徑施用鼻、 口咽、眼、口、直腸、舌下、泌尿生殖器粘膜、鼻內、口咽、氣管內、肺內、經皮、經肺、動脈內、皮 內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下或粘膜下。
全文摘要
本發明提供了一種組合物，其包含抗原；脂質體；Poly I:C多核苷酸；和包含疏水物質的連續相的載體。還提供了制備和使用該組合物的方法。
文檔編號A61K9/127GK102056622SQ200980120883
公開日2011年5月11日 申請日期2009年5月22日 優先權日2008年6月5日
發明者A·富恩特斯-奧爾特加, G·M·威爾, L·D·麥克唐納, L·薩瑪特爾, M·卡爾柯達, M·曼索爾 申請人:免疫疫苗技術有限公司