利用脂質體肉毒桿菌毒素對膀胱功能障礙的治療的制作方法

專利名稱：利用脂質體肉毒桿菌毒素對膀胱功能障礙的治療的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及膀胱功能障礙、特別是頑固性膀胱過動癥的治療的領域。
背景技術：
尿失禁或膀胱功能障礙是對膀胱控制的降低。癥狀可以從輕度的漏尿到不能控制 的尿濕。上述癥狀可發生在任何人身上，但是隨著年齡的增長變得愈發常見。大部分膀胱 控制問題在肌肉過弱或過于活躍時發生。如果保持膀胱閉合的肌肉過于弱，在打噴嚏、大笑 或提舉重物時可能會漏尿。這是壓力性尿失禁。如果膀胱肌肉過于活躍，則在膀胱中有極 少量尿液時會產生強烈的如廁欲望。這是急迫性尿失禁或膀胱過動癥。尿失禁還有其它原 因，例如前列腺問題和神經損傷。治療方法取決于問題的種類。該治療方法可包括單純的鍛煉，醫生開具的藥物、特 定裝置或方法，或手術。多年來，膀胱內療法一直是主要的治療方法(Parkin等，Urology 49， 105-7(1997))。膀胱內藥物治療在膀胱內提供了高的局部藥物濃度，降低了全身性副作用 的風險，并消除了 口服施用藥劑時尿排泄水平低的問題。經測試，患者對30分鐘的標準滴 注時間有優異的耐受性。臨床上，二甲基亞砜(DMSO) (Rimso-50)是唯一獲FDA批準的膀胱 疼痛綜合征/間質性膀胱炎(PBS/IC)用膀胱內治療，據信DMSO具有抗炎性能和肥大細胞 穩定作用(Sun和Chai，BJU Int 90，381-5 (2002))。然而，DMSO的成功率通常不高。膀胱 上皮主要依賴于表面糖胺聚糖(GAG)層的存在和細胞間接觸的結構完整性(也就是緊密 連接)，以保持對有毒尿廢物的不可滲透性(Parsons等，Science208,605-7 (1980))。在該 屏障受到損壞時，泄漏進入下膀胱層的尿液成分引起了膀胱內的刺激性變化，并導致對感 覺神經纖維的刺激以及疼痛、尿急和尿頻癥狀(Lavelle等，Am J Physiol Renal Physiol 283, F242-53(2002))。尿路上皮和GAG還提供了有效進行膀胱內藥物遞送用的重要屏障。更為重要的是，膀胱過動癥(OAB)困擾了美國17%的男女(年齡越大發病率越 高)，并且據估計產生了 164億美元的經濟負擔。許多專家認為25%的OAB患者會尋求醫 學治療。保守估計，口服藥物治療對那些尋求治療的4百萬OAB患者中的25%無效，這部分 患者將尋求用于頑固性OAB的療法。在最近幾年中，出現了幾種OAB用新型抗毒蕈堿藥物和改良劑型。2008年有6種 獲FDA批準的OAB抗毒蕈堿藥劑，其全球銷售為每年20億美元。但是，由于功效有限且具 有諸如口干、便秘和認知功能障礙等副作用，有不到20%的患者繼續使用抗毒蕈堿治療。 常用作抗毒蕈堿性頑固性患者用二線治療的兩種方法是獲FDA批準的骶神經刺激(SNS) (Interstim, Medtronics Inc.)和BoNT的逼尿肌內注射，所述注射法處于用于頑固性OAB 的FDAII期試驗中(Botox，Allergan Inc.，)。現今正在進行施用肉毒桿菌毒素的若干臨 床試驗。已經表明肉毒桿菌毒素有助于治療頑固性膀胱過動癥(OAB)，但是其需要進行膀胱 鏡檢查過程，以將該毒素直接注射到膀胱壁中。因為該毒素被注射到膀胱逼尿肌中，并可減 弱膀胱的收縮力，高達43%的患者可能患上尿潴留。
制藥工業也顯示出對開發與間質性膀胱炎有關的尿急和尿頻的治療有極大的興 趣。最近，這些療法已包括卡介苗(BCG)、類辣椒辣素(resiniferatoxin) (RTX)、透明質酸 (Cystistat)、透明質酸鈉(SI-7201)，以及骶神經刺激裝置。需要能夠簡單地滴注肉毒桿菌毒素(BoNT)而無需針頭注射。此外，需要在低濃度 下將BoNT遞送至膀胱上皮內襯和感覺神經末端，這可有助于改善下尿路癥狀，而不引起潴 留和/或膀胱肌無力。其它泌尿疾病如尿路感染和膀胱癌中也存在對局部膀胱內藥物遞送和藥物在膀 胱內較長時間接觸的需求。用于膀胱功能障礙的持續性藥物遞送系統不能商購獲得。其它方法嘗試將帶有藥 物的球囊容器或基體材料置入膀胱中以進行持續性藥物釋放，但是這些機械性方法引起了 刺激、疼痛，并由于其大小和形狀可引起膀胱頸出口堵塞導致的梗阻。使用膀胱內BoNT滴注的有限次臨床經驗至今為止是不成功的。膀胱內BoNT滴注 缺乏功效的可能原因包括受尿液中蛋白酶類的降解、在尿液中的稀釋或從滴注至膀胱內腔 的BoNT溶液進入尿路上皮的攝取不良。因此，本發明的一個目的在于提供通過滴注到膀胱中而遞送藥物的方法和組合 物，從而治療OAB和膀胱的其它紊亂。

發明內容
脂質體用于膀胱內藥物遞送，特別是BoNT的遞送，以通過降低膀胱刺激和尿頻而 幫助改善下尿路癥狀。與注射相比，該系統使用了較低且更為安全的劑量的BoNT，降低了尿 潴留的風險。以30ml 60ml的常用體積，將作為液體制劑的脂質體-BoNT簡單滴注到膀胱中， 達到的功效與現今用膀胱鏡針頭注射BoNT達到的功效相似。所述劑量可以低于注射所用 劑量，從而尿潴留的風險極小。脂質體-BoNT可保護BoNT免于遭受膀胱和尿液的分解。實施例將證明所述制劑的功效。
具體實施例方式I.脂質體-藥物制劑脂質體封裝應可解決滴注后吸收不良的問題。BoNT的脂質體封裝可防止BoNT在 尿液中降解，并使得從粘附在膀胱表面的脂質體穿過尿路上皮進行無障礙吸收。由于BoNT 包埋在脂質體內，BoNT不易受到尿液的稀釋，而且脂質體表面的BoNT的局部濃度可以足夠 高，以加快從粘附于膀胱內腔表面的脂質體中濾出的BoNT的進入。A脂質體脂質體(LP)為球形囊泡，并由以水性隔區隔開的同心磷脂雙層組成。LP具有 粘附于細胞表面并在細胞表面生成分子膜的特性。脂質體是由同心磷脂雙層組成的脂 囊泡，所述磷脂雙層封閉了水性內腔(Gregoriadis等，Int J Pharm 300，125-30 2005 ； Gregoriadis 和 Ryman，Biochem J 124，58P (1971))。脂囊泡包含一個或幾個由一個(單層) 或多個(多層)磷脂雙層描繪的水性隔區(Sapra等，Curr Drug Deliv 2，369-81 (2005))。 臨床中脂質體的成功歸因于其制劑中所使用的脂質的無毒性質。脂質體的脂質雙層和水性內核都可用作治療目的。脂質體作為較低劑量下提高功效用的毒素載體已得到充分研 % (Alam^, MoI Cell Biochem 1 12,97-1071992 ；Chaim-Matyas φ, Biotechnol Appl Biochem 17(Ptl)，31-61993 ;de Paiva 和 Dolly, FEBS Lett 277,171-4(1990) ；Freitas 禾口 Frezard，Toxicon 35，91—100 (1997) ；Mandal 禾口 Lee，Biochim BiophysActa 1563， 7-17(2002))。脂質體具有在細胞和組織表面形成分子膜的能力，現今已對脂質體作為可能的 治療劑來促進傷口愈合并作為眼淚替代物促進治愈干眼病進行了測試。臨床研究已經 證實了脂質體作為局部愈合劑的功效(Dausch等，Klin Monatsbl Augenheilkd 223， 974-83(2006) ；Lee 等，Klin Monatsbl Augenheilkd 221，825-36 (2004))。脂質體也用于 眼科中，以改善角膜炎、角膜移植排斥反應、葡萄膜炎、眼內炎和增生性玻璃體視網膜病變 (Ebrahim 等，2005 ；Li 等，2007)。脂質體作為多種化學治療劑用藥物載體得到了廣泛的研究(該主題約有25，000 篇已公布的科學文章)(Gregoriadis，N Engl J Med 295,765-70(1976) ；Gregoriadis 等， Int J Pharm 300，125-30 (2005))。諸如多柔比星等水溶性抗癌物可在由磷脂雙層界定的 脂質體水性隔區內得到保護，而諸如兩性霉素和辣椒素等脂溶性物質可整合到磷脂雙層中 (Aboul-Fadl, Curr Med Chem 12，2193-214 (2005) ；Tyagi 等，J Urol 171，483-9 (2004))。 使用脂質體可顯著地提高環孢霉素的局部和玻璃體遞送(Lallemand等，Eur JPharm Biopharm 56，307-182003)。化學治療劑的遞送使藥物動力學得以提高，并使毒性得以降低 (Gregoriadis, Trends Biotechnol 13, 527-37 (1995) ；Gregoriadis禾口 Allison, FEBS Lett 45,71-41974 ;Sapra 等，Curr Drug Deliv 2，369-81 (2005))。已有多于 10 種脂質體和脂類 制劑獲監管機構的批準，并且許多種脂質體藥物正處于臨床前開發或臨床試驗中(Barnes， Expert Opin Pharmacother 7,607-15(2006) ；Minko 等，Anticancer AgentsMed Chem 6, 537-52(2006))。Fraser等在Urology，2003 ；61 :656_663中證明，脂質體的膀胱內滴注提 高了有功能障礙的尿路上皮的屏障性能，并在有膀胱過動癥的大鼠模型中部分逆轉了高排 尿頻率，所述大鼠的膀胱過動癥是通過用硫酸魚精蛋白破壞尿路上皮并隨后用KCl刺激膀 胱而誘導。Tyagi等在J Urol, 2004 ；171 ；483-489中報道，脂質體是辣椒素的膀胱內施用 的優質載體，與30%乙醇相比，有較少的載體誘導性炎癥。從在數以千計患者的臨床中使用 脂質體的大量臨床經驗中，已經充分了解了關于脂質體的急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒 性優選的安全性數據。目標臨床途徑用脂質體的安全使用也得到了其在患者中作為抗癌藥 載體的廣泛應用的支持。B用于滴注的肉毒桿菌毒素(BoNT)和其它藥物由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產生的肉毒桿菌神經毒素被認為是已知的 對人最強的生物毒素(Smith & Chancellor, J Urol, 171 =2128(2004) BoNT 已經有效用 于與肌肉過度收縮有關的不同疾病。在7種免疫學上不同的神經毒素(A型 G型)中， BoNT-A是臨床上最為常用的肉毒桿菌毒素。在最近幾年中，BoNT-A和BoNT-B已經成功地 通過在多個位置進行逼尿肌內BoNT-A注射而用于治療患有神經原性膀胱過動癥的脊髓損 傷患者(Schurch 等，2000)。腎上腺皮質激素(ACh)和去甲腎上腺素釋放抑制的作用已知BoNT通過抑制 ACh在神經肌肉接點處的釋放和自主神經傳遞而發揮作用。在肌肉內注射BoNT后，在骨骼肌和平滑肌中可產生暫時的化學去神經作用和肌肉松弛(Chuang和Chancellor，J Urol. 176(6Ptl) :2375-82 (2006))。Smith 等(J Urol, 169 :1896(2003))發現，將 BoNT 注 射到大鼠近端尿道括約肌中使標記的去甲腎上腺素在高電場刺激而不在低電場刺激下發 生顯著的下降，這表明BoNT抑制了自主神經末端處的去甲腎上腺素釋放。感覺機制抑制的作用越來越多的證據支持BoNT還抑制膀胱內的傳入神經 傳遞的觀點(Chuang 等，J Urol 172,1529-32(2004) ；Khera 等，Neurochem Int,45 987(2004))。已經表明，BoNT抑制神經肽、谷氨酸鹽和三磷酸腺苷的釋放，這些物質是疼痛 感的介體(Cui等，Pain, 107 :125(2004)) 0在乙酸誘導的膀胱過動模型中觀察到了相似的 作用。在人類逼尿肌過動中發現，與逼尿肌內注射BoNT后的尿急程度降低有關的感覺受體 P2X3和瞬時受體電位香草酸(Vanilloid)I型受體(TRPVl)在尿路上皮下的神經纖維中水 平的降低(Apostolidis 等，J Urol, 174 :9772005)。BoNT的靶蛋白是處于脂質環境中的整合膜蛋白。脂質體可以通過使與尿路上皮的 粘附更強而提高諸如BoNT等金屬蛋白酶的活性。膀胱鏡引導的注射是目前在臨床中對膀 胱施用BoNT的標準做法。近年來，有研究評估了在膀胱刺激的動物模型中進行BoNT的膀 胱內滴注的可能(Khera等，toology 66，208-12 (2005))。文獻中先前的報道表明，對VAMP 有特異性的BoNT的金屬蛋白酶活性因脂質膜的存在而顯著提高。這種作用提供了對以下 事實的解釋這些神經毒素對插入至脂質囊泡中和神經元中的VAMP比對分離的VAMP分子 具有更強的活性。這種脂質增高作用是由脂質帶來的。該研究對將脂質體用作BoNT滴注 用遞送載體的合理性有很強的支持。可滴注到膀胱中的其它藥物也可使用脂質體遞送系統進行遞送，特別是具有可由 局部遞送避免的全身副作用的那些藥物。可以使用所述脂質體遞送系統遞送的合適的藥物或活性劑包括但不限于，癌癥治 療藥、免疫調節藥、鎮痛藥、消炎劑、抗組胺藥、內啡肽、前列腺素、大麻類(Canaboid)TRP受 體、肽、蛋白，以及抗體、質粒、裸DNA、病毒載體、RNA、siRNA、氨基酸；透明質酸；戊聚糖多硫 酸鈉、β "3受體激動劑和拮抗劑、Ghrelin受體激動劑和拮抗劑以及諸如利多卡因等局部 麻醉劑。示例性癌癥治療藥包括順鉬、卡鉬、絲裂霉素、奧沙利鉬、氮芥、環磷酰胺、苯丁酸 氮芥、長春新堿、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、長春堿、多柔比星、甲氨蝶呤、長春瑞濱、長 春地辛、紫杉醇(taxol)及其衍生物、伊立替康、托泊替康、安吖啶、足葉乙甙、磷酸足葉 乙甙、替尼泊苷、表鬼白毒素、曲妥珠單抗(HERCEPTIN )、西妥昔單抗、和利妥昔單抗 (RITUXAN 或MABTHERA )、貝伐單抗(AVASTIN )和它們的組合。示例性的免疫調節藥包括干擾素和卡介苗。所述藥物遞送組合物也可用于遞送合適的藥物，從而治療間質性膀胱炎、膀胱疼 痛綜合征、膀胱過動癥、膀胱癌、前列腺癌和由細菌、真菌或病毒引起的尿路感染。II.制造方法脂質體的制造脂質體的制造方法描述于上述文獻中并且是眾所周知的。在一個實施方式中，水性脂質體懸浮液通過微流化制成。最終產物可能遭 受一系列的穩定性問題，如聚集、融合和磷脂水解(Nounou等，Acta Pol Pharm 62,381-91(2005))。在能夠實現脂質體產物的臨床益處之前，脂質體產物必須具備足夠的化學和物理 穩定性(Torchilin，Adv Drug Deliv Rev 58，1532-55 (2006))。在一個優選的實施方式中， 脫水脂質體由磷脂在叔丁醇(TBA)/水共溶劑系統中的均質分散液形成。對脂質體的各向 同性的單相溶液進行冷凍干燥，以在無菌小瓶中生成脫水脂質體粉末。在從小瓶中除去水 和TBA后，冷凍干燥步驟留下了空心脂質囊泡或脫水脂質體。加入生理鹽水時，該凍干產物 自發形成均質脂質體制劑(Amselem 等，J Pharm Sci 79，1045-52 (1990) ；Ozturk 等，Adv Exp Med Biol 553，231-42 (2004))。低濃度的脂質可理想地用于本方法，因為脂質和TBA 的比例是影響所得脂質體制劑的尺寸和多分散性的關鍵因素。脂質體BoNT的制備在一個優選的實施方式中，通過稍作修改的脫水-復水法制備脂質體 BoNT ( “LPA-08”)。在37°C下用BoNT在注射用水中的溶液(50單位/ml)對先前步驟中制 得的脂質體進行水化。然后在37°C的溫度下使用水浴對所述混合物進行2小時的溫育以形 成寡層(oligolamellar)水化脂質體。分別以0. 5%、1 %、2. 5%和5%濃度(重量/體積， w/v)的甘露醇向最終混合物中加入甘露醇，然后在丙酮-干冰浴中進行冷凍。甘露醇在冷 凍干燥過程中作為冷凍保護劑。冷凍混合物在-40°C和5毫巴下進行凍干過夜。用鹽水對 凍干塊進行再懸浮至所需的BoNT終濃度。通過在12，OOOXg下使用超速離心機進行離心 30分鐘而從包埋的BoNT中除去游離BoNT。洗滌3次之后，使沉淀再次重懸浮于鹽水中。將烈性細菌毒素配制到脂質體中需要謹慎的對待。BoNT不能暴露于制造脂質體中 常用的有機溶劑。使用薄膜水化法和脂質二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)完成實施例。簡言 之，首先在氮氣細流下于圓底燒瓶中對DPPC的氯仿溶液進行蒸發。在真空下對脂質膜進行 干燥過夜。然后用BoNT水溶液對干燥脂質進行水化。如下文實施例2所證明，通過仔細地控制BoNT和脂質的比例獲得了最佳結果。如 本研究所證明，利用常規實驗可以確定最佳比例和脂質組分。III.脂質體BoNT的遞送脂質體-BoNT滴注對患者而言更為舒適，且與原本限于對膀胱鏡BoNT注射熟練且 經認證的醫生中的治療形式不同，脂質體-BoNT滴注可使更多的醫生診所提供這種治療形 式。BoNT是大分子且不會穿過細胞層到達肌肉和神經末端。不使用脂質體進行的BoNT滴 注需要會損傷膀胱內襯的腐蝕劑，如魚精蛋白。這種方法沒有獲得FDA的批準并可引起膀 胱疼痛和損傷。BoNT的滴注可降低患頑固性膀胱過動癥的患者的治療成本。不同實驗室 報道的多種研究對在膀胱刺激的動物模型中進行BoNT的膀胱內滴注的可能性進行了評估 (Chuang等，2004 ；Khera等，2005)。但是，關于BoNT的膀胱內滴注的有限臨床經驗是不成 功的。脂質體封裝解決了滴注后吸收不良的問題。因為BoNT包埋在脂質體的內部，則不易 受到尿液的稀釋，且脂質體表面處BoNT的局部濃度足夠高，從而加快從粘附于膀胱表面的 脂質體中濾出的BoNT的被動擴散。脂質體的脂質屏障也可在脂質體被膀胱吸收之前防止 尿中蛋白酶和蛋白水解酶的接近從而防止對BoNT進行切割。滴注方法是已知的。例如，參見Lawrencia 等，Gene Ther 8，760-8 (2001) ；Nogawa 等，J Clin Invest 115，978-85 (2005) ；Ng 等，Methods Enzymol 391,304-132005 ；Tyagi 等，J Urol 171，483-9 (2004) ；Trevisani等，J Pharmacol Exp Ther 309，1167-73(2004)；Trevisani 等，Nat Neurosci 5，546-51 (2002)) ； (Segal 等，1975). (Dyson 等，2005). (Batista 等，2005 ；Dyson 等，2005)。如下文實施例1所證明，脂質體-BoNT的體積在遞送功效中是至關重要的。可利 常規實驗來優化遞送體積。所公開的脂質體也可用于將治療劑滴注至其它位置，例如泌尿道，包括尿道、膀 胱、輸尿管和腎內收集系統；婦科位置，如陰道、子宮、輸卵管；胃腸位置，包括口腔、食道、 胃、小腸、結腸、直腸、肛門；以及外耳或內耳；皮膚和鼻子。通過參照以下非限制性實施例，可進一步理解本發明。實施例1 膀胱膨脹對滴注后脂質體BoNT吸收的影響材料和方法通過以遞增的體積滴注同樣劑量的脂質體BoNT來確定膀胱膨脹對滴注后脂質體 BoNT吸收的影響。用不同體積滴注液(0. 5ml,0. 55ml,0. 6ml)中相同組成的脂質和BoNT(每 一單位的BoNT為0. 5mg脂質)制成的脂質體滴注大鼠。將脂質體滴注至氟烷麻醉下的大 鼠膀胱中，停留時間為30分鐘；然后允許動物在給予食物和水并裝于籠中的條件下進行恢 復。M小時后在尿烷麻醉下(劑量1. Og/kg體重)，通過以0. 04ml/分鐘的速率灌輸鹽水 而對經處理的大鼠進行經尿道開放性膀胱測壓(transurethral opencystometry)。在獲得 1小時的正常基準后，灌輸乙酸的鹽水溶液(0.25%)以誘導膀胱刺激。在用不同體積的滴 注液進行BoNT治療7天后，通過在尿烷麻醉下進行連續的經尿道膀胱測壓來評估膀胱膨脹 作用。MM用0. 5ml標準體積滴注的大鼠顯示了通過以0. 08ml/分鐘的速率持續灌輸鹽水而 誘導的反射性排尿時的正常CMG。但是，用高出10% 20%體積的滴注液(0. 55ml或0. 6ml 體積的滴注液)中同樣劑量的脂質體BoNT灌輸的大鼠顯示了鹽水膀胱測壓下的充溢性尿 失禁(overflow continence)。小體積滴注限制了 BoNT只對尿路上皮作用，而滴注體積10% 20%的增加卻顯 著地降低了吸收屏障，并允許BoNT在滴注后到達逼尿肌。以大體積的脂質體BoNT滴注的 大鼠在清醒狀態下顯示出尿潴留，而在麻醉狀態下顯示出充溢性尿失禁，從而表明了對反 射性排尿的強烈抑制。有趣的是注意到，麻醉狀態下的充溢性尿失禁反映了藥物對排尿反 射的傳入支(afferent arm)作用的理想特征。麻醉狀態下的充溢性尿失禁轉化成清醒狀 態下傳入輸入的降低。BoNT是分子量為150kD的大分子，因此作為吸收機制在很大程度上可排除擴散。 胞吞作用是膀胱吸收中更為可能的機制。先前的研究顯示，尿路上皮的傘細胞中的內吞隨 如靜水壓等外部刺激而增加。膀胱填充過程中胞吞和胞吐的速率使得凈效應為添加隔膜并 增加尿路上皮的表面積，從而適應膀胱的伸展。因此，在膀胱伸展后有可能存在更多的胞吞 活動，從而引起膀胱對BoNT更高的攝取。實施例2 脂質與BoNT的比例的影響為了優化BoNT的功效，脂質和毒素應處于最佳的比例。材料和方法用不同比例的脂質制備脂質體BoNT，其中保持BoNT的比例不變。例如，以25IU的BoNT開始，在氟烷麻醉下以不同體積中的相同組成的脂質和BoNT(每一單位的BoNT為 0. 5mg脂質)制成的脂質體對大鼠進行滴注。BoNT的膀胱內劑量保持恒定且脂質濃度不同， 以確定最佳化的毒素脂質比。將脂質體BoNT的功效與鹽水溶液中的游離BoNT進行比較。 滴注7天后，在氟烷麻醉過的大鼠中對減弱乙酸誘導的膀胱刺激的能力進行測試。根據已 出版的研究(Chuang等，2004)將滴注和功效評價之間的間隔期選擇為7天。MM毒素與脂質的最佳比例1 0.5對在膀胱內滴注后提高BoNT的功效是有效的。較 高脂質比下功效降低可能是由于BoNT從多層脂質體中的釋放很慢，從而使BoNT進入膀胱 的攝取效率低。實施例3 大鼠內乙酸誘導的膀胱過動癥中膀胱內BoNT-A脂質體遞送的尿動力效 應和免疫組織化學效應的評估材料和方法脂質體(LP)、肉毒桿菌毒素A (BoNT-A)和脂質毒素(Lipotoxin) (LP+BoNT-A)的制 備將LP(10mg，類脂)分散于生理鹽水(Iml)中，其中所述分散液為脂質體形式。將BoNT-A 溶解于生理鹽水(lml，20u/ml的鹽水溶液，Allergan，Irvine，CA)中。通過改進的脫水-復 水囊泡法(Gregoriadis等，Methods 19，156-621999)制備包埋BoNT-A的LP (稱作脂質毒 素)，所述方法中將20單位的BoNT-A載入IOmg的LP分散液(Iml)中。在不同的動物組中 保持相同劑量的BoNT-A。膀胱內壓測量圖(CMG)所有實驗步驟均在雌性史-道二氏大鼠 (Sprague-Dawleyrat) (220gm 280gm)上進行，并在研究開始前得到了機構動物管理和使 用委員會(Institutional animal care and use committee)的檢查禾口批準。通過皮下注 射尿烷(1.2g/kg)來麻醉動物。將PE-50管通過尿道插入膀胱中，并使其經由三通旋塞連 接至壓力傳感器和注射泵，以用于記錄膀胱內壓和將溶液灌輸到膀胱中。第一天時，通過用 鹽水(0.08ml/分鐘)填充膀胱以引起重復排尿而進行對照CMG。對反射性膀胱收縮的幅 度、壓力閾值(PT)、壓力基準(PB)和收縮間隔(ICI)進行了記錄。每一動物的測量值表示 3至5次膀胱收縮的平均值。第8天時，在鹽水灌輸過程中確定基準測量值后，我們將0.3%的乙酸(AA)以 0. 08ml/分鐘灌輸至膀胱中，以強烈地促使膀胱過動。灌輸30分鐘后測量3至5次膀胱收縮。藥物的滴注在獲得基準CMG后第1天，在氟烷麻醉下用繃帶將PE-50管 (Clay-Adams, Parsippany, NJ)圍繞尿道口原位綁定。使膀胱清空尿液，并通過導管填充 LP、BoNT-A或脂質毒素1小時。心臟灌注CMG研究后第8天，對一些動物(對每一組而言，N = 6)進行深度麻醉， 并經由心臟灌注處死，所述心臟灌注首先使用Krebs緩沖液隨后用4%低聚甲醛固定劑。然 后對所述動物進行解剖以獲得膀胱。組織學將組織學用膀胱組織固定于4%低聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中 4小時，然后在30%蔗糖的PBS溶液中放置過夜。將組織學用樣品包埋在石蠟中，切割成 IOym厚的片并用H&E染色。由AA誘導的炎癥反應按以下O 3的分數分級0 沒有炎性 細胞浸潤或間質性水腫的跡象；1 輕度(少量炎性細胞浸潤和少量間質水腫)；2 中度(中等量炎性細胞浸潤和中度間質水腫)；3:嚴重(彌散存在大量炎性細胞浸潤和嚴重的間質 水腫)。用于CGRP和SNAP-25的免疫熒光顯微法作為選擇，對樣品進行冷凍并固定在 Tissue-Tek OCT 固定介質(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中；在低溫恒溫器上切割 10 μ m厚的縱切片，并固定到SuperFrost載玻片上。通過在丙酮中浸漬15分鐘固定切片， 然后在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中洗滌，并通過在0. 3% H2O2的PBS溶液中溫育切片10分鐘 而封閉內源性過氧化物酶的活性。在PBS中進行進一步洗滌后，將切片在Image-iT 固定 信號增強劑(Molecular Probes, Invitrogen)中進行溫育1小時。對于CGRP免疫染色，然 后用山羊抗CGRP多克隆抗體(Santa Cruz, 1 50稀釋)在+4°C對載玻片進行染色48小 時。第二天然后在PBS中洗滌切片，并用驢抗山羊IgGFITC(Santa Cruz,l 2000稀釋) 溫育1小時。洗滌切片并固定在SlowFade抗褪色金試劑(Molecular Probes, Invitrogen) 中。對于SNAP-25免疫染色，然后用小鼠抗SNAP-25單克隆抗體(AbD，NC，USA，1 2000稀 釋)在+4°C對載玻片進行染色過夜。第二天然后在PBS中洗滌切片，并用山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, 1 2000 稀釋)溫育 1 小時。為 了檢測 肌肉纖維，用四甲基異硫氰酸羅達明(TRITC)標記的鬼筆環肽(Sigma，l 2000稀釋)對 切片進行復染色，洗滌并固定在SlowFade抗褪色金試劑(Molecular Probes, Invitrogen) 中。用熒光顯微鏡檢查載玻片，以記錄圖像。SNAP-25表達的蛋白質印跡分析對一些動物(對每一組而言，N = 6)進行深度麻 醉且不經心臟灌注處死。移出膀胱以根據標準方案(Amersham Biosciences)進行SNAP-25 表達的蛋白質印跡分析。超聲處理和純化之前，使樣品在蛋白提取液(T-PER fierce Biotechnology)中進行均質處理。用 Bradford 蛋白測定法(Bio-feid Laboratories, Hercules, CA)測量總蛋白的量。使用Laemmli緩沖液系統進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳(PAGE)。簡言之，將相當于30yg蛋白質的一等分試樣提取物加載到8%聚丙烯酰胺 凝膠上，在100V的恒定電壓下進行電泳1小時，并轉印至Hybond-P PVDF膜(Amersham Biosciences)。所述膜用封閉劑進行封閉，然后于+4°C用小鼠抗SNAP-25單克隆抗體(AbD， NC,USA, 1 500稀釋)和小鼠抗β肌動蛋白單克隆抗體(Rockland,Gilbertsville,USA, 1 2000稀釋)進行免疫印跡過夜。洗滌后，使用辣根過氧化物酶連接的抗兔或抗小鼠免 疫球蛋白G在室溫下使用5%脫脂奶粉的TBS溶液對所述膜和二抗進行溫育2小時。通過 增強型化學發光(ECL)檢測系統(Amersham Biosciences)使蛋白質印跡可視化。還檢測 了 β肌動蛋白的量作為內標。使用Lab Works ImageAcquisition and Analysis軟件完 成定量分析。統計分析將定量數據表示為平均值加減平均值的標準誤差。使用單向方差分析 和Bonferroni事后檢驗或者在適用時使用Kruskal-Wallis和Durm的事后檢驗進行統計 分析，并認為P < 0. 05有顯著性。MM針對LP、BoNT-A和脂質毒素預處理的CMG響應在第1天膀胱內鹽水滴注期間LP組(對照組),BoNT-A組和脂質毒素組的CMG參 數與第8天的上述參數沒有顯著不同。這些結果表明第8天時正常狀況下的膀胱功能沒有 受到LP、BoNT-A和脂質毒素的預處理的影響。第8天時，開始灌輸后20分鐘 30分鐘，乙酸的刺激作用明顯。在LP和BoNT-A預處理組中，膀胱內滴注AA后的收縮間隔(ICI)分別 明顯地下降了 57. 2%和56.0%。但是，接受了預先脂質毒素處理的大鼠顯示出對AA滴注 的響應明顯降低(ICI降了 21. )。這些結果表明脂質毒素預處理抑制了 AA誘導的膀胱 過動癥，在相同劑量的BoNT-A預處理組中沒有觀察到這種效應。對LP、BoNT-A和脂質毒素預處理的組織學響應如對用蘇木精(hamatoxylin)和 曙紅染色的組織切片的組織病理評估所確定的，AA滴注在LP和BoNT-A預處理組中誘導了 中度炎癥反應。但是，AA誘導的炎癥反應在脂質毒素預處理組中得到了明顯的降低(與LP 和BoNT-A預處理組相比總炎癥分數分別降低了 48. 9%和33. 3% )。這些結果表明脂質毒 素預處理抑制了 AA誘導的膀胱炎癥。LP.BoNT-A和脂質毒素預處理的CGRP免疫染色脂質毒素預處理組中在膀胱粘膜 層處確認了 CGRP免疫染色，而在LP或BoNT-A預處理組中沒有觀察到這種情況。這些結果 表明脂質毒素預處理抑制了 CGRP釋放。LP、BoNT-A和脂質毒素預處理的SNAP-25表達在LP和BoNT-A預處理動物的膀 胱樣品中檢測到SNAP-25陽性神經纖維。但是，在脂質毒素預處理動物中幾乎不能觀察 到SNAP-25陽性神經纖維。蛋白質印跡證明，相比于LP和BoNT-A預處理組，平均SNAP-25 蛋白水平分別有66. 4%的下降和58. 的下降。這些結果表明了脂質毒素預處理降低了 SNAP-25 表達。結論在LP和BoNT-A預處理大鼠中，在膀胱內滴注AA后收縮間隔(ICI)分別降低了 57. 2%和56.0%。但是，接受脂質毒素的大鼠顯示出對AA滴注的響應有明顯降低(ICI降 低了 21. 1% )。另外，與用LP或BoNT-A預處理的大鼠相比，脂質毒素預處理的大鼠在炎癥 反應、SNAP-25表達上有明顯的降低，在CGRP免疫反應性上增力Π。膀胱內脂質毒素的施用切 割SNAP-25并抑制了 CGRP從傳入神經末端的釋放，而且封閉了 AA誘導的膀胱過動癥。這 些結果支持了 LP可作為遞送BoNT-A的高效載體而無需進行注射，和避免了對逼尿肌的影 響。本研究的主要發現在于膀胱內脂質毒素預處理抑制了 AA誘導的膀胱過動癥和炎 癥反應，而在本動物模型中的LP和BoNT-A預處理組中沒有觀察到這種效果。沒有觀察到 尿潴留。另外，與該模型中的LP和BoNT-A預處理組相比，脂質毒素預處理組中的SNAP-25 的表達顯著降低且CGRP顯著增加。膀胱內脂質毒素滴注為遞送BoNT-A提供更為簡單且有 效的方法，而無需進行可能引發尿潴留的注射。
權利要求
1.一種用于滴注到膀胱中的脂質體制劑，所述制劑包含在藥學上可接受的載體中的肉毒桿菌毒素。
2.如權利要求1所述的制劑，其中，將所述脂質與肉毒桿菌毒素的比例調節為使遞送 最優化。
3.一種治療膀胱過動癥和下尿路癥狀的方法，所述方法包括將在脂質體載體中的肉毒 桿菌毒素滴注到膀胱中。
4.如權利要求1所述的制劑或如權利要求3所述的方法，其中，所述肉毒桿菌毒素是7 種血清型的一種或多種，而且是雙鏈或單鏈。
5.如權利要求1所述的制劑或如權利要求3所述的方法，其中，所述肉毒桿菌毒素的劑 量小于為對膀胱過動癥和下尿路癥狀獲得相同效果而通過注射施用的劑量。
6.如權利要求1所述的制劑或如權利要求3所述的方法，其中，對進行滴注的制劑的體 積進行優化，以使攝取最優化。
7.如權利要求1所述的制劑，其中，將所述制劑滴注到其它體腔和體表，所述體腔和體 表包括陰道、肛門、直腸、皮膚、咽喉、口腔、鼻腔和氣道。
全文摘要
本發明涉及一種脂質體，所述脂質體用于膀胱內藥物遞送，特別是肉毒桿菌毒素(BoNT)的遞送，以通過減少膀胱刺激和尿頻而幫助改善下尿路癥狀。本系統使用了較低且更為安全劑量的BoNT，降低了尿潴留的風險。以30ml～60ml的常用體積將作為液體制劑的脂質體-BoNT簡單滴注到膀胱中，達到的功效與現今用膀胱鏡針頭注射BoNT達到的功效相似。所述劑量可以低于注射用量，從而使尿潴留風險顯著減少。脂質體-BoNT可保護BoNT免受膀胱和尿液的破壞。脂質體-BoNT滴注對患者而言更為舒適，且與原本限于對膀胱鏡BoNT注射熟練且經認證的醫生中的治療形式不同，脂質體-BoNT滴注可使更多的醫生診所提供這種治療形式。
文檔編號A61P13/10GK102065841SQ200980120455
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月3日 優先權日2008年4月4日
發明者喬納森·H·考夫曼, 邁克爾·B·錢塞勒 申請人:里培拉藥品公司