誘導單核細胞的樹突狀細胞樣分化并提高抗癌免疫活性的用于癌癥治療或預防的醫藥組合物的制作方法

專利名稱：誘導單核細胞的樹突狀細胞樣分化并提高抗癌免疫活性的用于癌癥治療或預防的醫藥組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及可提高抗癌免疫活性的用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物。
技術背景
已知樹突狀細胞(Dendritic cell DC)為生物體內最強的抗原遞呈細胞，通過向 T細胞遞呈抗原而誘導免疫應答。另外，已知DC不僅與T細胞直接作用，而且還與B 細胞、NK細胞、NKT細胞等直接作用，是承擔免疫反應中的中樞作用的細胞。未成熟 DC通過接受抗原刺激，伴隨著CD40、CD80、CD86等的表達上升而獲得較高的T細胞 刺激能力，同時向末梢淋巴組織移動，通過活化與所取入的抗原特異的T細胞而誘導免 疫應答。
通常，被認為能夠由血液前體細胞誘導樹突狀細胞(樣)的分化的物質在文獻 中僅有可列舉的幾種，其基本上為著名的細胞因子。例如，有許多關于利用GM-CSF和 IL-4的合用的分化誘導的報道，將其視為樹突狀細胞分化的黃金標準。除此之外，作為 能夠通過單劑或合用來分化誘導樹突狀細胞的物質，報道有TNF-alpha、IL_2、IL_3、 IL-6、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、HGF (Hepatocyte growth factor,肝細胞生長因子)、 CD40配體、M-CSF、Flt3配體、TGF_beta。這些蛋白質中，作為僅以單劑就能夠由其前 體細胞分化誘導樹突狀(樣)細胞的物質，可列舉出IL-2、IL-15、HGF、CD40配體。 其中在體內Gnvivo)確認到抗癌效果的僅為IL_2(參照非專利文獻1)。
另一方面，作為與細胞的無限增殖化相關的基因，已知有REIC基因，據報道， 癌細胞中該基因的表達受到抑制(參照專利文獻1和非專利文獻2 5)。
REIC基因為Dkk家族的成員，有文獻暗示其中Dkk-I介由Wnt受體而抑制Wnt 信號傳遞(參照非專利文獻6和7)。據報道，Wnt基因在細胞的生長、分化、癌化等重 要的生物學狀況方面發揮著各種作用(參照非專利文獻8)。因此，認為Dkk家族(目前 已知人體中有4個基因)也許同樣地在細胞的生長、分化、癌化方面承擔著重要的功能， 但大部分尚未闡明。
專利文獻1 國際公布第W001/038523號小冊子
非專利文獻1 ZouGM.Etal.，Eur Cytokine Netw.2002 Apr-Jun ； 13(2) 186-99.
非專利文獻2 Tsuji，T.etal.，BiochemBiophys Res Commun 268, 20-4(2000)
非專禾Ij文獻 3 Tsuji, T.et al.，BiochemBiophys Res Commun 289， 257-63(2001)
非專利文獻4 Nozaki，I.etal., IntJOncol 19，117-21 (2001)
非專利文獻5 Kurose，K.etal.，JUrol 171，1314-8(2004)
非專利文獻6 Bafico，A.etal.，Nat Cell Biol 3，683-6(2001)
非專利文獻7 : Hoang，B.H.etal.，Cancer Res 64，2734-9(2004)
非專利文獻8: Moon，R.T.etal.，Science 296, 1644-6(2002) 發明內容
本發明的目的在于通過誘導-活化樹突狀細胞樣細胞而利用免疫療法治療或預防癌癥。
如上所述，作為免疫學中的癌癥治療劑的IL-2蛋白質在腎細胞癌等特殊的癌種 中具有治療效果。然而，臨床上公知的事實是，其所適合給藥的癌種及其效果是有限 的。
本發明人對之前由本發明人分離的REIC (REIC/Dkk-3)蛋白質在癌免疫治療中 的效果進行了深入研究。其結果，本發明人發現，REIC蛋白質誘導單核細胞分化為樹 突狀細胞樣細胞，該樹突狀細胞樣細胞引起針對癌抗原的免疫反應，從而能夠治療或預 防癌癥，由此完成了涉及將REIC蛋白質用作樹突狀細胞分化誘導劑、癌免疫活化劑和癌 癥的治療或預防劑的本發明。本發明人發現，確認到基本上在所有癌種中表達-分泌下 降的REIC蛋白質有可能在這些各種癌種中能夠作為具有癌免疫活化作用的癌癥治療劑使 用，另外關于其治療效果，也可能具有優于IL-2的優越性。本發明人證明了REIC蛋白質 本身能夠誘導抗癌免疫，確認到REIC蛋白質在生物體內的免疫和炎癥現象中的有用性。 從致癌的觀點考慮，認為在癌化進行的組織內REIC蛋白質的濃度較低(這是因為，在許 多種類的癌細胞中，REIC蛋白質的表達、分泌缺乏或降低)，因此，認為抗癌免疫活性 在癌組織內難以被誘導，癌癥從生體免疫中被漏掉(癌細胞的免疫學耐受)，癌增殖、惡 化。這種狀況下，REIC蛋白質作為基于抗癌免疫活化的癌化-致癌預防劑也是有用的。
S卩，本發明如下所述。
[1] 一種單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其含有以下的REIC 蛋白質作為有效成分
(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或
(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸 的氨基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
[2]如[1]所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其中，單核細 胞為末梢血單核細胞。
[3]—種癌免疫活化劑，其含有以下的REIC蛋白質作為有效成分
(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或
(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸 的氨基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
[4]如[3]所述的癌免疫活化劑，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
[5]—種具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有[3] 或[4]所述的癌免疫活化劑。
[6] 一種單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其含有以下的REIC DNA作為有效成分
(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA ；或
(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜交的DNA，該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
[7]如[6]所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其中，單核細 胞為末梢血單核細胞。
[8] 一種癌免疫活化劑，其含有以下的REIC DNA作為有效成分
(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA ；或
(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜 交的DNA，該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
[9]如[8]所述的癌免疫活化劑，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
[10]—種具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有 [8]或[9]所述的癌免疫活化劑。
[11] 一種單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其含有包含以下 REIC DNA的載體作為有效成分
(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA ；或
(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜 交的DNA，該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞或樹突狀細胞樣細胞的誘導活性 的蛋白質。
[12]如[11]所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其中，其 中，載體為腺病毒載體。
[13]如[11]或[12]所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其 中，單核細胞為末梢血單核細胞。
[14] 一種癌免疫活化劑，其含有包含以下REIC DNA的載體作為有效成分
(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA ；或
(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜 交的DNA，該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞或樹突狀細胞樣細胞的誘導活性 的蛋白質。
[15]如[14]所述的癌免疫活化劑，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
[16]如[14]或[15]所述的癌免疫活化劑，其中，載體為腺病毒載體。
[17]—種具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有 [14] [16]中任一項所述的癌免疫活化劑。
[18]如[17]所述的具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物， 其中，載體為腺病毒載體。
[19] 一種誘導CD14陽性單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的方法，該方法包括 在體外Gn vitro)、在以下REIC蛋白質的存在下培養由動物采集的單核細胞的步驟
(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或
(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸 的氨基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
[20]如[19]所述的方法，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
[21] 一種分化為樹突狀細胞樣的細胞，其利用[19]或[20]所述的方法由通過 REIC蛋白質活化的單核細胞分化誘導而成。
[22]如[21]所述的分化為樹突狀細胞樣的細胞，其中，CDllc、CD40、CD80、 CD86、HLA-DR和CD14為陽性，CDla為陰性。
[23]如[21]所述的分化為樹突狀細胞樣的細胞，其中，在利用流式細胞術分析 細胞表面的抗原的情況下，與使用GM-CSF和IL-4由單核細胞誘導的樹突狀細胞相比， CD14表達得更多，CDla基本上不表達。
本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本國專利申請2008-086516號的說 明書和/或附圖中記載的內容。


圖1是顯示純化的人REIC蛋白質的蛋白印跡分析的結果的照片。
圖2是顯示位相差顯微鏡圖像的照片，其顯示出由于人REIC蛋白質的添加所導 致的末梢血單核細胞分化為樹突狀細胞樣的分化誘導。
圖3是顯示通過人REIC蛋白質的添加而分化誘導的樹突狀細胞樣細胞占全部細 胞的比例的圖。
圖4是顯示由于人REIC蛋白質的添加所導致的末梢血單核細胞(CD14陽性細 胞)分化為樹突狀細胞樣的分化誘導的照片。
圖5是顯示由于人REIC蛋白質的添加所導致的末梢血單核細胞的STAT活化的 照片。
圖6A是顯示通過人REIC蛋白質的添加而分化誘導的樹突狀細胞樣細胞基于流 式細胞術的分析結果的圖。
圖6B是顯示通過人REIC蛋白質的添加而分化誘導的樹突狀細胞樣細胞基于流 式細胞術的分析結果的圖。
圖7是顯示人REIC蛋白質的腫瘤內給藥實驗的方案的圖。
圖8A是顯示人REIC蛋白質的腫瘤內給藥所產生的腫瘤增殖抑制效果(腫瘤體 積的經時變化)的圖。
圖8B是顯示人REIC蛋白質的腫瘤內給藥所產生的腫瘤增殖抑制效果(腫瘤重 量)的圖。
圖8C是顯示人REIC蛋白質的腫瘤內給藥所產生的腫瘤增殖抑制效果(腫瘤的 照片)的照片。
圖9是顯示人REIC蛋白質的腫瘤內給藥所導致的抗癌免疫活性的上升的圖。
圖10是顯示由于人REIC蛋白質的添加所導致的末梢血單核細胞分化為樹突狀 細胞樣的分化誘導的圖。
圖11是顯示通過人REIC蛋白質的添加而誘導的樹突狀樣細胞中的使用了 CD4+T 細胞(淋巴細胞)的同種異體(allogenic)反應誘導活性的圖。
具體實施方式
以下，詳細說明本發明。
對于本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑 和具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有REIC DNA或該DNA編碼的REIC蛋白質作為有效成分。
REIC DNA的堿基序列如序列號1所示。另外，REIC DNA編碼的REIC蛋白質的氨基酸序列如序列號2所示。
對于本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑 和具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物中含有的REIC DNA所 編碼的蛋白質，其具有序列號2所示的氨基酸序列或與序列號2所示的氨基酸序列實質 上相同的氨基酸序列，其是具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白 質。這里，作為實質上相同的氨基酸序列，可列舉出以下序列在使用BLASTCBasic LocalAlignment Search Tool at the National Center for Biological Information (美國國家生物技 術信息中心的堿基局部對準檢索工具))等(例如，使用默認即初始設定的參數)進行計 算時，與相對于該氨基酸序列而置換、缺失和/或附加一個或兩個以上或者數個(1 10 個、優選為1 5個、進一步優選為1個或2個)氨基酸的氨基酸序列或該氨基酸序列具 有至少85%以上、優選為90%以上、進一步優選為95%以上、尤其優選為97%以上的同 源性的序列。
REIC DNA編碼的蛋白質可以基于序列號1或序列號2的序列信息通過化學合成 而獲得。另外，也可以利用基因工程學的方法以重組REIC蛋白質的形式獲得。此外， 還可以根據W001/038523號公報中的記載來獲得。
對于本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化 劑和具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物中所含的REIC DNA, 其是以下DNA中編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質的 DNA 與具有序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列的DNA在嚴格條件下雜交的 DNA ；在使用 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological biformation(美國國家生物技術信息中心的堿基局部對準檢索工具))等(例如，使用默認 即初始設定的參數)進行計算時，與序列號1所示的堿基序列具有至少85%以上、優選為 90%以上、進一步優選為95%以上、尤其優選為97%以上的同源性的DNA;或編碼相對 于由上述DNA編碼的蛋白質的氨基酸序列而置換、缺失和/或附加一個或兩個以上或者 數個(1 10個、優選為1 5個、進一步優選為1個或2個)氨基酸的氨基酸序列所構 成的蛋白質的DNA。這里，“嚴格條件”是指例如“1XSSC、0.1% SDS、37°C”左右 的條件，更嚴格的條件為“0.5XSSC、0.1% SDS> 42°C”左右的條件，進一步嚴格的條 件為“0.2XSSC、0.1% SDS> 65°C”左右的條件。此外，本發明的單核細胞分化為樹突 狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑和具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或 預防的醫藥組合物中所含的REIC DNA是編碼序列號2所示的蛋白質的DNA。
這里，單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性是指，與單核細胞作用而 分化為樹突狀細胞樣細胞的活性。是否通過REIC蛋白質的添加而分化誘導為樹突狀細胞 樣細胞這一點，可以通過形態特征和表面抗原來檢測。即，作為該樹突狀細胞樣細胞的 特征，可列舉出具有形態學上的樹突狀突起；進一步通過流式細胞術進行分析，作為 表面抗原，樹突狀細胞的標記(marker)即CDllc、CD40、CD80、CD86、HLA-DR為陽 性。
REIC DNA可以基于序列號1的序列信息由人細胞、人組織等獲得。另外，還可以根據W001/038523號公報中的記載來獲得。
此外，本發明還包括含有REIC DNA的載體。通過將該載體導入待測體，REIC 蛋白質在待測體體內表達，從而能夠發揮單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導效 果、癌免疫活化效果和癌免疫活化作用所帶來的癌癥的治療或預防效果。
基因治療中的目標基因(DNA)向待測體的導入可以通過公知的方法進行。作 為將基因導入待測體的方法，有使用病毒載體的方法和使用非病毒載體的方法，公知有 各種方法(別冊實驗醫學、遺伝子治療O基礎技術(基因治療的基礎技術)、羊土社、 1996；別冊實驗醫學、遺伝子導入&発現解析実験法(基因導入和表達分析實驗法)、羊 土社、1997;日本基因治療學會編、遺伝子治療開発研究〃> K 7” ” (基因治療開發 研究手冊)、NTS、1999)。
作為用于基因導入的病毒載體，使用腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉錄病毒等病毒 載體的方法為代表性方法。通過在無毒化的逆轉錄病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、痘病 毒、脊髓灰質炎病毒、辛德比斯病毒、仙臺病毒、SV40、人類免疫缺陷病毒(HIV)等 DNA病毒或RNA病毒中導入目標基因，并使細胞感染重組病毒，能夠在細胞內導入基 因。
在將本發明的基因用于使用了病毒的基因治療中時，優選使用腺病毒載體。作 為腺病毒載體的特征，可列舉出以下幾點(1)能夠在多種細胞中進行基因導入；(2)即 使對于增殖停滯期的細胞也能夠有效進行基因導入；( 能夠通過離心而濃縮，得到高 效價(10 llPFU/ml以上)的病毒；(4)適于向體內的組織細胞中直接進行基因導入。 作為基因治療用的腺病毒，已開發出E1/E3區域缺失的第1代腺病毒載體(Miyake，S., etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，1320，1996)、除了 E1/E3 區域以外 E2 或 E4 區域 也缺失的第 2 代腺病毒載體(Lieber，A.，etal.，J.Virol.，70，8944，1996 ； Mizuguchi, H.&Kay, M.A., Hum.Gene Ther.，10，2013，1999)、腺病毒基因組基本上完全缺失 的(GUTLESS)第 3 代腺病毒載體 Mteinwaerder，D.S.，etal.，J.Virol.，73，9303， 1999)，導入本發明的基因時，沒有特別限定，可以使用任一種腺病毒載體。此外，若 利用對AAV的染色體賦予了重組能力的adeno-AAV雜化載體(adeno_AAV hybrid vector) (Recchia，Α., etal., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 96，2615，1999)、或通過使用轉座子的 基因而在染色體中具有重組能力的腺病毒載體等，則也能夠應用于長期的基因表達中。 另外，通過插入與腺病毒纖維的Hl環(loop)顯示出組織特異的移動性的肽序列，還能 夠對腺病毒載體賦予組織特異性(Mizuguchi，H.&Hayakawa, T.，Nippon Rinsho, 7， 1544， 2000)。
本發明中，將含有REIC DNA的腺病毒載體稱為Ad-REIC。
另外，可以不使用上述病毒而使用重組了質粒載體等基因表達載體的重組表達 載體，將目標基因導入細胞或組織中。例如，可以通過脂質轉染法、磷酸鈣共沉淀法、 DEAE-葡聚糖法、使用了微小玻璃管的DNA的直接注入法等向細胞內導入基因。另 外，還可以通過利用了內含型脂質體(internal liposome)的基因導入法、利用了靜電型脂 質體(electorostatictype liposome)的基因導入法、HVJ-脂質體法、改良型HVJ-脂質體法 (HVJ-AVE脂質體法)、使用了 HVJ-E(envelope，包膜)載體的方法、受體介導性基因導 入法、利用基因槍將DNA分子與載體(金屬顆粒)一起移入細胞中的方法、裸DNA的直接導入法、利用各種聚合物的導入法等，使重組表達載體進入細胞內。作為該情況下 使用的表達載體，只要是能夠在生物體內表達目標基因的載體，就可以使用任意的表達 載體，例如可列舉出 pCAGGS (Gene 108，193-200(1991))、pBK-CMV、pcDNA3、1、 pZeoSV(Invitrogen 公司、Stratagene 公司)、pVAXl 等表達載體。
含有REIC DNA的載體還可以適當包含用于轉錄基因的啟動子或增強子、polyA 信號、導入了基因的細胞的標記和/或用于篩選的標記基因等。作為此時的啟動子，可 以使用公知的啟動子。
為了將本發明的含有REIC DNA的載體導入待測體，可以使用將基因治療劑直 接導入體內的體內Gn vivo)法；以及從人體中取出某種細胞，然后在體外將基因治療劑 導入該細胞中，再使該細胞返回體內的回體(exvivo)法等(NIKKEI SCIENCE、1994年4 月號、20-45 頁;月刊藥事，36(1)，23-48(1994)；實驗醫學增刊，12(15)，(1994)； 日本基因治療學會編，基因治療開發研究手冊，NTS，1999)。
本發明中，單核細胞包括末梢血來源的單核細胞、骨髓來源的單核細胞、脾 細胞來源的單核細胞、臍帶血來源的單核細胞，其中優選為末梢血來源的單核細胞。 單核細胞可以通過以下方式采集以CD14陽性為特征，從生物體采集單核細胞， 在利用REIC蛋白質誘導為樹突狀細胞樣細胞的情況下，以CD14的存在為指標通過 FACS (Fluorescentactivated cell sorter,熒光激活細胞分選儀)或流式細胞器等采集。對單 核細胞來源的動物種類沒有限定，可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、綿 羊、豬、牛、馬、山羊、猴、人等哺乳動物。利用FACS分離特定的細胞群時只要通過 公知的方法進行即可。作為FACS、流式細胞器，例如可以使用FACS vantage(Becton， Dickinson and Company 制造)、FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company 制造)等。
單核細胞的培養可以通過眾所周知的人淋巴系細胞的培養技術進行。作為培養 液，例如可以使用RPMI1640或DMEM的公知的基本培養基。可以在這些基本培養基中 添加適當的抗生素或動物血清等進行培養。對培養容器沒有限定，可以根據培養規模而 適當選擇并使用市售的盤、碟、燒瓶。
本發明包括以下方法在體外、在REIC蛋白質的存在下培養單核細胞，并誘導 單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞。該方法中，例如以IO4 IO7細胞/ml的濃度使用單 核細胞、以1 20 μ g/ml的濃度添加REIC蛋白質而進行培養即可。
在生物體內，樹突狀細胞在癌免疫、炎癥等的機理中發揮著極其重要的作 用。利用本發明的方法由REIC蛋白質分化誘導的樹突狀細胞樣細胞在形態學上與利用 IL-4+GM-CSF誘導的樹突狀細胞相似，但嚴格來說是不同的新型的樹突狀細胞樣細胞。 由REIC蛋白質誘導的樹突狀細胞樣細胞具有樹突狀的形態。另外，作為樹突狀細胞的標 記的CDllc、CD40、CD80、CD86、HLA-DR為陽性。從這點來看，本發明的新型的 樹突狀細胞樣細胞可以被分類為樹突狀細胞。然而，作為樹突狀細胞的標記的CDla為 陰性，通常在樹突狀細胞中被視為陰性化的CD14為陽性。
在受到REIC蛋白質的刺激而由CD14陽性單核細胞誘導的情況下，稱為“通過 REIC蛋白質活化的、分化為樹突狀細胞樣的細胞(REICactivated monocyte with dendritic cell features,具有樹突狀細胞形態的REIC活化單核細胞)，，。
本發明包含通過REIC蛋白質由CD14陽性單核細胞誘導的樹突狀細胞樣細胞。
經REIC蛋白質誘導而得到的樹突狀細胞樣細胞能夠用于癌免疫療法。即，從待 測體采集單核細胞，將該單核細胞與REIC蛋白質一起培養，誘導樹突狀細胞樣細胞，并 將所得到的樹突狀細胞樣細胞返送回待測體，由此能夠將樹突狀細胞樣細胞自身用于癌 癥的治療或預防等。此時，通過REIC蛋白質誘導的樹突狀細胞樣細胞與癌種非特異性作 用，能夠發揮癌免疫治療效果，但在誘導樹突狀細胞樣細胞時也可以添加癌種特異性的 腫瘤抗原。另外，也可以將所誘導的樹突狀細胞樣細胞與特定的腫瘤抗原一起培養。通 過用癌種特異性的腫瘤抗原刺激樹突狀細胞樣細胞，能夠腫瘤特異性地攻擊癌細胞。另 外，通過本發明的REIC蛋白質誘導的樹突狀細胞樣細胞具有使CD4+T細胞增殖的能力， 能夠增大待測體的抗癌免疫活性。
樹突狀細胞樣細胞可以通過皮內給藥、皮下給藥、靜脈內給藥或淋巴結內給藥 來進行給藥。
另外，REIC蛋白質被認為具有從細胞外與細胞作用而掌管細胞的分化的細胞 因子樣作用，被認為在生物體內廣泛具有與免疫性、炎癥性相關的功能。因此，可以將 REIC蛋白質或編碼REIC蛋白質的DNA給藥至待測體，作為體內的樹突狀細胞樣細胞分 化誘導劑、或樹突狀細胞樣細胞活化劑使用。REIC蛋白質在待測體內誘導樹突狀細胞樣 細胞，其結果，受到樹突狀細胞樣細胞的作用，在待測體內具有抗癌性的淋巴細胞全身 性活化，從而發揮癌免疫作用。因此，REIC蛋白質或編碼REIC蛋白質的DNA能夠作 為癌免疫活化劑使用。此外，由于通過REIC蛋白質誘導的樹突狀細胞樣細胞具有癌免 疫作用，因而能夠將REIC蛋白質或編碼REIC蛋白質的DNA作為用于癌癥的治療或預防 的醫藥組合物(癌免疫治療劑)使用。此時，可以將REIC蛋白質或編碼REIC蛋白質的 DNA單獨給藥，這種情況下，能夠癌種非特異性地發揮效果。或者，也可以與特定的腫 瘤抗原一起給藥。這種情況下，能夠癌種特異性地發揮效果。
作為本發明的治療或預防對象的癌癥，可列舉出腦/神經瘤、皮膚癌、胃癌、 肺癌、肝癌、淋巴瘤/白血病、結腸癌、胰腺癌、肛門/直腸癌、食道癌、子宮癌、乳 癌、腎上腺癌、腎癌、腎盂輸尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、陰莖癌、睪丸癌、 骨/骨肉瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、間皮瘤等。尤其優選為乳癌、膀胱癌。
本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑、 和具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物包含REIC DNA、含有該 DNA的載體、或該DNA編碼的蛋白質以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑、和 具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物能夠以各種形態給藥，可列 舉出利用片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等的經口給藥，或者利用注射劑、點滴 劑、栓劑、噴霧劑、滴眼劑、經鼻給藥劑、粘貼劑等的非經口給藥。
本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑、和 具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物還可以局部給藥，例如可以 通過利用注射向癌癥部位給藥來發揮其效果。
優選在癌病變局部1次或多次直接注入以使本劑遍布癌病變整體。
本發明的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑、癌免疫活化劑、和 具有癌免疫活化作用且用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物包含在制劑領域中常用的載體、稀釋劑、賦形劑。例如，作為片劑用的載體、賦形劑，使用乳糖、硬脂酸鎂等。作 為注射用的水性液，使用生理鹽水、葡萄糖或含有其他佐劑的等滲液等，可以合用例如 乙醇、丙二醇等多元醇；非離子表面活性劑等適當的增溶劑。作為油性液，使用芝麻 油、大豆油等，作為增溶劑，可以合用苯甲酸芐酯、苯甲醇等。
其給藥量根據癥狀、年齡、體重等而異，可以隔數日或數周或數月給藥一次， 將O.OOlmg IOOmg通過皮下注射、肌肉注射、或靜脈注射進行給藥。
通過以下的實施例來具體說明本發明，但本發明不限于這些實施例。
重組人REIC蛋白質的制備
重組人REIC蛋白質利用以下方法制備。
1.利用電穿孔法將編碼全長人REIC的基因的質粒導入CHO細胞中，確定人 REIC穩定表達的克隆。使用含有2mM L-谷氨酰胺和8 μ M嘌呤霉素的無蛋白質培養基 (C5467, Sigma)，將總計IO7個細胞以5% CO2> 37°C的條件平穩地振蕩培養1周。通 過5分鐘、2,OOOrpm的離心分離回收CHO培養細胞，收集上清(IL)。
2.以40分鐘、4°C、15000rpm的條件將上清離心分離。
3.使用 Ο.Μμιη 的濾器(TP"505、TPP, Trasadingen> 瑞士)過濾上清。
4.向上清(IL)中添加 TALON 樹脂(#635501 Clontech Laboratories)(相對于床體 積為3ml的樹脂)。
5.在4°C整夜平穩旋轉。
6.以4°C、700g、5分鐘的條件進行離心分離，收集樹脂。
7.除去上清。
8.用40ml的清洗緩沖液(50ml的磷酸鈉，600mM NaCl)清洗TALON樹脂。
9.以4°C、700g、5分鐘的條件進行離心分離。
10.除去上清。
11.重復3次上述8 10的步驟。
12.添加TALON樹脂和15ml的清洗緩沖液，重懸浮。
13.將3ml的TALON樹脂移至重力流柱。
14.在柱中添加15ml的洗脫緩沖液，將帶有HIS標簽的蛋白質洗脫，回收人 REIC蛋白質。
15.為 了供于 FPLC (Fast Prtein Liquid Chromatography,快速蛋白質液相色譜)， 使用20mM Tris-HCl、pH7.5、0. IM NaCl對洗脫液進行透析。
16.使用 FPLC(MonoQ5/50GL 柱、GE Healthcare)，在以下條件下純化人 REIC蛋白質。
緩沖液
MonoQ 緩沖液 A 20mm Tris-HCL pH7.5、0. IM NaCl
MonoQ 緩沖液 B: 20mm Tris-HCL pH7.5、0.5M NaCl
流速lml/分鐘
流量70ml
級分大小Iml
17.使用抗人REIC抗體，通過SDS-PAGE和蛋白印跡法分析級分。通過SDS-PAGE確認到最終制備物的純度超過95% (圖1)。
18.回收適當的級分。
19.使用PBS進行透析，儲備或使用。
20.使用 CentriplusYM-5O (#4423，milipore)進行濃縮。
21.利用Bradford法檢驗蛋白質濃度。
22.直至使用前將蛋白質的儲備溶液保存于-80°C。
人單核細胞的制備
對于人PBMC (末梢血單核細胞)，通過利用Ficoll-Paque離心分離的標準方法由健康供體的血液進行制備。利用臺盼藍排除法測量細胞的回收率，確認生存率為99%以 上。為了制備單核細胞，將PBMC重懸浮在LGM-3培養基(淋巴細胞增殖培養基_3， 不含有血清，Lonza)中，將塑料上附著的細胞(以2小時、37°C、IOcm碟孵育)作為單 核細胞使用。在若干實驗中，使用CD14+磁活化細胞分選微珠(MACS ； Miltenymiotec) 分離CD14+單核細胞。將純化的CD14+單核細胞重懸浮于LGM-3培養基中。由流式細 胞術結果可知，純度總是高于95%。
人單核細胞的處理
單獨培養PBMC，或在重組人REIC蛋白質(10 μ g/ml)或GM-CSF (R&D Systems) +IL_4 (R&D Systems)(分別為2ng/ml)的存在下培養PBMC。利用位相差顯微鏡觀察細胞。
圖2顯示單獨培養、和在重組人REIC蛋白質或GM-CSF+IL-4存在下培養的 PBMC在第0天、第2天和第7天的位相差顯微鏡像。在右側的框中顯示出單獨培養的 第0天、在REIC蛋白質存在下培養的第7天、在GM-CSF+IL-4存在下培養的第7天的 像的方形虛線部的放大像。如圖所示，通過在REIC蛋白質的存在下培養PBMC，確認 到了樹突狀細胞樣細胞的分化。
在各自培養的第7天，測定樹突狀細胞樣細胞占全部細胞的比例。通過人REIC 蛋白質添加而分化誘導的樹突狀細胞樣細胞占全部細胞的比例如下測定。即，在3次獨 立的實驗中，對于各個組((_)組、人REIC蛋白質、IL-4+GM-CSF組)的樹突狀細胞樣 細胞(形態學上較大、且能夠確認到樹突狀突起的細胞)，分別在添加后第7天在顯微鏡 下隨機選擇的共計5個視野中目視各100個細胞，并進行計算。結果如圖3所示。單獨 培養PBMC時樹突狀細胞樣細胞的比例為百分之幾，而在REIC蛋白質存在下培養時為約 40%,在GM-CSF+IL-4存在下培養時為約60%。另外，通過REIC蛋白質誘導的樹突 狀細胞樣細胞在形態學上與通過GM-CSF+IL-4誘導的樹突狀細胞類似。
單獨培養CD14+細胞和CD14陰性細胞，或在重組人REIC蛋白質(1 μ g/ml或 10 μ g/ml)或GN-CSF+IL_4(分別為2ng/ml)的存在下培養CD14+細胞和CD14陰性細 胞。利用位相差顯微鏡觀察細胞。末梢血單核細胞由單核細胞和淋巴細胞構成，為了明 確樹突狀細胞樣細胞由這些細胞中的哪種細胞分化誘導而成，使用市售的附著有抗CD14 抗體的珠，對于CD14陽性的單核細胞和CD14陰性的淋巴細胞，分別嘗試添加人REIC 蛋白質所產生的樹突狀細胞樣分化誘導。圖4顯示出由CD14+細胞誘導樹突狀細胞樣分 化的結果。如圖4所示，僅在CD14陽性的單核細胞中觀察到樹突狀細胞樣的分化誘導， 如圖所示，被分化誘導的細胞的頻率依賴于所添加的REIC蛋白質的濃度而增加。由以上內容可知，關于人REIC蛋白質，具有將末梢血單核細胞(CD14陽性)分化誘導為樹突狀 細胞樣的作用。另外，確認到該作用具有用量依賴性。
蛋白印跡分析
利用人REIC蛋白質(10 μ g/ml)或GM_CSF+IL_4 (分別為2ng/ml)處理后， 將細胞用磷酸緩沖生理鹽水(PBS)清洗2次，并用溶解緩沖液(50mMHEPES，pH7.4, 250mM NaCl, 1 % NP-40, ImM DTT，ImM PMSF, 5 μ g/ml 抑月太酶，2mM Na3VO4, ImM NaF和IOmM β-GP)溶解，提取蛋白質。離心后，將上清中的蛋白質調整為在各實 驗中相等，用等量的2XSDS樣品緩沖液稀釋，在95°C加熱處理5分鐘。將樣品(IOyg 蛋白質)供于7.5%的SDS-PAGE凝膠，電印跡至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。使用含有 10%脫脂乳粉、6%甘氨酸和0.1%的Tween-20的TBS，在室溫下進行1小時印跡。蛋白 質使用1000倍稀釋的兔多克隆抗人REIC抗體(Abarzua F.et al.，Cancer Res.2005 Nov 1 ； 65(21) 9617-22),抗磷酸化 Statl (Try701)抗體(#9171、Cell Signaling Technology) > 抗磷酸化Stat3 (Try705)抗體(#9131)和抗磷酸化Stat5 (Try694)抗體(#9351)進行確定。 在用添加有0.1%的Tween-20的TBS(T-TBS)充分清洗后，用結合有辣根過氧化物酶的 二次抗體處理印跡，在用T-TBS充分清洗后，利用增強化學發光檢測法(ECL試劑盒， Amersham Pharmacia Biotech)使其顯色。
圖5顯示末梢血單核細胞的STAT通過人REIC蛋白質的添加而活化的結果。 磷酸化STAT-I (Tyr)、磷酸化STAT-3 (Tyr)、磷酸化STAT-5 (Tyr)的表達的上升意味著 這些蛋白質的活化，這被認為在血細胞的分化時很重要。即，該蛋白印跡法的觀察結 果強烈暗示了 REIC蛋白質具有介導細胞內STAT信號的血細胞分化能力。除此之外， REIC蛋白質對于STAT活化(磷酸化)所帶來的作用模式與樹突狀細胞-陽性對照的通過 IL-4+GM-CSF的添加所帶來的作用模式不同。這與流式細胞術中的結果一并暗示了，通 過REIC蛋白質的添加，誘導了與陽性對照的樹突狀細胞不同的樹突狀細胞樣細胞。
流式細胞術分析
通過添加冷PBS來結束細胞培養，然后冰冷10分鐘進行孵育。接著，利用巴 氏吸管將細胞重懸浮，并回收。通過胰蛋白酶處理來回收所附著的細胞，并與浮游細胞 混合。使用通過100 μ 1的PBS稀釋了 5倍的PE結合抗體，將約5X IO5個細胞在冰上孵 育 60 分鐘。所使用的 PE 結合抗體為 CDllc(12-0116、eBioscience)、CD14(12-0149)、 CDla (12-0019)、CD40 (1 2-0409)、CD80 (1 2-0809)、CD83 (1 2-0839)、 CD86 (12-0869)、HLA-DR(12-9956) 將同種型(isotype)相同的 PE 結合免疫球蛋 白G(IgG) (12-4714、12-4732)作為陰性對照使用。孵育后，用Iml的PBS將細胞清 洗一次，并重懸浮于500μ1的PBS中。然后，使用FACS Calibur流式細胞器(Becton Dickinson)采集IO4個細胞，利用CellQuest軟件(BectonDickinson)進行分析。基于這 些細胞的特征性的前向散射圖而設定適當的門，僅對門內的細胞進行分析。將與同種型 相同的對照抗體一起孵育的對照細胞相比顯示出更高平均熒光強度(MFI)的細胞視為陽 性。死細胞通過利用了碘化丙啶(PI)的染色和/或散射特性而除去。通過PI染色可知， 多于99%的細胞存活。
FITC標記顆粒的內吞作用
回收細胞后，將細胞以5 X IO6細胞/ml的濃度重懸浮于冷PBS中。將50 μ g的FITC結合葡聚糖(DX FITC ； FD40, Sigma)添加至懸浮液0.5ml中，接著將細胞在4°C 或37°C下孵育1小時。利用Iml的冷PBS清洗2次，將由FACSCalibur流式細胞器取得 的IO4個細胞用CellQuest軟件進行分析。
圖6A和圖6B顯示出通過人REIC蛋白質的添加而分化誘導的樹突狀細胞樣細胞基于流式細胞術的分析結果。
使用圖6A的圍起來的部分的細胞進行流式細胞術。該范圍的依據在于以下兩 點避開待測物中的細胞的殘骸，且在作為陽性對照的IL-4+GM-CSF添加組中能夠清 晰地監測樹突狀細胞。
在圖6A的右側的圖中，CDllc為骨髓系白血球的標記(不是淋巴細胞)。另 外，CD14為單核細胞或巨噬細胞的標記。此外，DX FITC是指帶有FITC的標簽的葡聚 糖。該物質常用于白血球系細胞的吞噬能力(內吞作用)的評價。
因此，通過REIC蛋白質的添加而分化誘導的細胞來源于骨髓系白細胞，與通過 IL-4+GM-CSF的添加而誘導的樹突狀細胞相比更接近單核細胞系細胞，而且，其是具有 與樹突狀細胞大致相同的異物-抗原吞噬能力的樹突狀細胞樣細胞。
另外，圖6B中，CDla為樹突狀細胞的標記之一，被認為與非肽性的抗原(類 脂物抗原等)的遞呈有關。另外，CD40為樹突狀細胞的標記之一，為CD40配體(即使 單劑也具有樹突狀細胞誘導能力)的受體。CD80為樹突狀細胞的標記之一，和CD86 — 起與對于T淋巴細胞的抗原遞呈相關。CD83為樹突狀細胞的標記之一，作為成熟樹突狀 細胞的標記使用。CD86為樹突狀細胞的標記之一，作為未成熟樹突狀細胞的標記使用。 HLA-DR為樹突狀細胞的標記之一，隨著樹突狀細胞的分化而強烈表達。
因此，通過REIC蛋白質的添加而分化誘導的細胞顯示出與通過IL-4+GM-CSF 的添加而誘導的樹突狀細胞所類似的(不相同)標記表達模式。
與其他的體外實驗的結果一并來看，結論為，通過REIC蛋白質的添加，由末梢 血CD14陽性單核細胞分化誘導了樹突狀細胞樣的細胞。該細胞與末梢血單核細胞在形 態學上不同，而且，與通過IL-4+GM-CSF的添加而誘導的樹突狀細胞也不同。
圖6所示的結果表明，人REIC蛋白質和通過REIC蛋白質而誘導的樹突狀樣細 胞，(與利用IL-4+GM-CSF的治療或IL-4+GM-CSFDC同樣地)通過進一步提高生物體 內的抗原吞噬-抗原遞呈能力，使抗癌免疫活化。
利用體內實驗的REIC蛋白質的腫瘤抑制效果的檢驗
向小鼠(C57BL6、雄性)的皮下注入RM9細胞(1父106個)。注入后第7、9、 11、13、15、17和19天(將注入后第7天作為REIC蛋白質的給藥起始)將REIC蛋白 質(100yg(300yl))或作為對照的PBS (300 μ 1)注入所形成的全部腫瘤。第21天處死 小鼠，判斷皮下腫瘤的治療效果，進行抗癌免疫活性的測定。將體內實驗的方案示于圖 7。在處理后數天后測定腫瘤的大小。腫瘤體積通過1/2Χ(最小直徑)2Χ(最大直徑) 求得。
圖8Α顯示治療后的腫瘤體積的經時變化。另外，圖8Β顯示由小鼠采集的腫瘤 的重量。此外，圖8C顯示由小鼠采集的腫瘤的照片。如圖8Α 8C所示，通過人REIC 蛋白質的給藥能夠抑制腫瘤增殖。
利用體外細胞溶解測定的REIC蛋白質的抗癌免疫活性上升效果的檢驗
從通過圖7所示的方法處理的小鼠或對照小鼠(REIC蛋白質給藥開始后第14天) 中采集脾細胞，將該脾細胞作為效應物與RM9細胞(靶標)一起用96孔圓底盤進行培 養。效應物/靶標比(E/T比)為100 1、50 1、25 1或12.5 1。將5X103的靶 標細胞添加至1個孔中。回收上清，使用非放射性細胞毒性測定(CytoTOX96、Promega) 對由溶解的RM9細胞放出的乳酸脫氫酶進行測定。溶解細胞的比率由下式計算。
(實驗中的放出-效應物的自發的放出)/(靶標的最大放出-靶標的自發的放 出)X100(% )
圖9顯示對于小鼠脾細胞的RM9細胞進行抗癌細胞免疫活性分析的結果。如圖 9所示，在給予REIC蛋白質的情況下，溶解細胞的比例依賴于效應物比而上升，可判斷 出REIC蛋白質具有提高抗癌細胞免疫活性的效果。
本實施例中，數據以平均士SEM表示。將非配對Student t_檢驗用于2組間的 統計分析。在ρ值<0.05的情況下，認為具有顯著性差異。
人REIC蛋白質的添加所導致的由末梢血單核細胞分化為樹突狀細胞樣的分化誘導
在REIC蛋白質的添加組、IL-4單獨的添加組、GM-CSF單獨的添加組、 IL-4+GM-CSF的添加組之間，對于分化誘導的樹突狀細胞樣細胞占全部細胞的比例進行 了比較。圖10的縱軸表示樹突狀細胞樣細胞的比例(形態學上較大、且能夠確認突起的 樹突狀細胞樣細胞占全部細胞的比例)，在各自添加后第7天，在顯微鏡下通過目視隨機測量。
如圖10所示，在添加了人REIC蛋白質的組中，分化為樹突狀細胞樣細胞的分 化誘導在統計學上明顯多于IL-4單獨的添加組和GM-CSF單獨的添加組(用*表示)。
由此可知，在圖10所示的濃度下人REIC蛋白質誘導人的末梢血單核細胞分化 為樹突狀細胞樣的細胞的能力明顯高于作為細胞因子已知的IL-4或GM-CSF分別單獨使 用的情況。即，人REIC蛋白質與IL-4或GM-CSF之類的各細胞因子相比，在樹突狀細 胞樣細胞的分化誘導方面具有優越性、更高的有用性。
通過人REIC蛋白質的添加而誘導的樹突狀樣細胞中的使用了 CD4+T細胞(淋巴 細胞)的同種異體(allogenic)反應誘導活性
為了評價通過REIC蛋白質而誘導的樹突狀樣細胞的抗癌免疫功能，對于使用 了 CD4+T細胞(淋巴細胞)的同種異體(allogenic)反應誘導活性進行了評價。在第0 天，使用用于回收CD14+單核細胞的微珠(MicroBeads)(MiltenyiBiotec),從末梢血單 核細胞回收CD14+單核細胞，分別添加人REIC蛋白質和IL-4+GM-CSF。在第7天將 各細胞回收，作為通過REIC蛋白質而誘導的樹突狀樣細胞和通過IL-4+GM-CSF而誘 導的樹突狀細胞(陽性對照用)。另外，在第7天，使用用于回收CD4+T細胞的微珠 (MiltenyiBiotec)，從樹突狀細胞的供體和HLA-DR不共通的供體的末梢血單核細胞選 擇并回收CD4+T細胞。在該CD4+T細胞中，以濃度0.05 μ M添加發出熒光的化學物質 CFSE并在室溫下培養5分鐘，由此進行細胞標記，作為同種異體的原態(naive) CD4+T細 胞使用。同樣地，在第7天，對于96孔圓底盤的每一個孔，與CD4+T細胞(1 X IO5個) 一起對通過REIC蛋白質而誘導的樹突狀樣細胞(6.25X 103個)、或作為陽性對照的通過 IL-4+GM-CSF而誘導的樹突狀細胞(6.25X 103個)進行共培養。作為陰性對照，還僅對16CFSE標記的CD4+T細胞進行培養。在37°C、5% C02、 95%大氣下的培養條件下在孵育器中共培養4天。在第11天，在熒光顯微鏡下的隨機的視野中，對CFSE為陽性的淋巴 細胞的數目進行計量。結果示于圖11。如圖11所示，通過共培養，由REIC蛋白質誘導的樹突狀樣細胞(REIC/ Dkk-3Mo)具有統計學上明顯多于對照組的增殖CD4+T細胞的能力(用*表示)。另 外表明，該能力與作為陽性對照的通過IL-4+GM-CSF誘導的樹突狀細胞在統計學上同 等。即，本實施例表明，人REIC蛋白質和由REIC蛋白質誘導的樹突狀樣細胞與利用 IL-4+GM-CSF的治療或IL-4+GM-CSFDC同樣地，在提高臨床中的抗癌免疫、治療癌癥 的方面，為非常有用的手段。工業實用性REIC蛋白質與IL-2或以往已知的許多具有免疫活性作用的細胞因子群相比，具 有以下效果。(1)即使單劑也具有基于抗癌免疫活化的抗腫瘤效果；(2)通過REIC基因表達在許多癌種中缺乏、降低的這種REIC蛋白質本身的特 性，REIC蛋白質制劑對于很寬范圍的癌種有效；(3)通過REIC蛋白質所產生的抗癌免疫活化，不僅對于所給藥的癌癥局部，對 于癌轉移灶也能夠期待改善或預防等作用；以及(4)通過將已知的各種癌抗原蛋白質和本劑同時給藥，能夠介由樹突狀(樣)細 胞等的分化誘導而系統性地活化抗癌免疫，從而對致癌本身進行預防。REIC蛋白質能夠作為癌免疫療法用劑使用。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請直接作為參考而援引到本說明 書中。
權利要求
1.一種單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其含有以下的REIC蛋白質 作為有效成分(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸的氨 基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
2.如權利要求1所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其中，單核 細胞為末梢血單核細胞。
3.一種癌免疫活化劑，其含有以下的REIC蛋白質作為有效成分(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸的氨 基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
4.如權利要求3所述的癌免疫活化劑，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
5.—種具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有權利要 求3或4所述的癌免疫活化劑。
6.—種單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其含有以下的REICDNA作 為有效成分(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA;或(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜交的 DNA,該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
7.如權利要求6所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其中，單核 細胞為末梢血單核細胞。
8.一種癌免疫活化劑，其含有以下的REIC DNA作為有效成分(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA;或(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜交的 DNA,該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
9.如權利要求8所述的癌免疫活化劑，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
10.—種具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有權利要 求8或9所述的癌免疫活化劑。
11.一種單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其含有包含以下REIC DNA的載體作為有效成分(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA；或(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜交的 DNA,該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
12.如權利要求11所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其中，載 體為腺病毒載體。
13.如權利要求11或12所述的單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的分化誘導劑，其 中，單核細胞為末梢血單核細胞。
14.一種癌免疫活化劑，其含有包含以下REIC DNA的載體作為有效成分(a)由序列號1所示的堿基序列構成的DNA ；或(b)與由序列號1所示的堿基序列的互補堿基序列構成的DNA在嚴格條件下雜交的 DNA,該DNA編碼具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
15.如權利要求14所述的癌免疫活化劑，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
16.如權利要求14或15所述的癌免疫活化劑，其中，載體為腺病毒載體。
17.—種具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合物，其含有權利要 求14 16中任一項所述的癌免疫活化劑。
18.如權利要求17所述的具有癌免疫活化作用、用于癌癥的治療或預防的醫藥組合 物，其中，載體為腺病毒載體。
19.一種誘導CD14陽性單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的方法，該方法包括在體 外、在以下REIC蛋白質的存在下培養由動物采集的單核細胞的步驟(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸的氨 基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
20.如權利要求19所述的方法，其中，單核細胞為末梢血單核細胞。
21.一種分化為樹突狀細胞樣的細胞，其利用權利要求19或20所述的方法由通過 REIC蛋白質活化的單核細胞分化誘導而成。
22.如權利要求21所述的分化為樹突狀細胞樣的細胞，其中，CDllc、CD40、 CD80、CD86、HLA-DR 和 CD14 為陽性，CDla 為陰性。
23.如權利要求21所述的分化為樹突狀細胞樣的細胞，其中，在利用流式細胞術分析 細胞表面的抗原的情況下，與使用GM-CSF和IL-4由單核細胞誘導的樹突狀細胞相比， CD14表達得更多，CDla基本上不表達。
全文摘要
本發明提供一種通過誘導、活化樹突狀細胞樣細胞而利用免疫療法治療或預防癌癥的組合物。本發明提供一種癌免疫活化劑，其含有以下的REIC蛋白質作為有效成分(a)由序列號2所示的氨基酸序列構成的蛋白質；或(b)由在序列號2所示的氨基酸序列中置換、缺失或附加一個或兩個以上氨基酸的氨基酸序列構成，且具有單核細胞分化為樹突狀細胞樣細胞的誘導活性的蛋白質。
文檔編號A61P37/04GK102026647SQ20098011678
公開日2011年4月20日 申請日期2009年3月24日 優先權日2008年3月28日
發明者公文裕巳, 柏倉祐司, 渡部昌實, 那須保友 申請人:桃太郎源株式會社