專利名稱：抵抗胞內勞森菌的疫苗的制作方法
抵抗胞內勞森菌的疫苗本發明涉及用于抵抗胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis)感染的疫苗，在這 個意義上，疫苗是至少提供胞內勞森菌感染的負面影響降低的組合物，如組織損傷和/或 臨床病征(如，下降的體重增加，腹瀉等)的負面影響。許多動物(特別是豬)的增生性腸炎呈現出不成熟隱窩上皮細胞粘膜增生的臨床 病征和病理癥狀，特別是在末端回腸中。可以受到影響的小腸的其他部位包括空腸、盲腸和 結腸。斷奶幼畜和仔豬主要受到體重快速減輕和脫水的典型臨床表現的影響。豬的自然臨 床疾病在全世界范圍內發生。該疾病始終與胞內曲狀細菌(目前已知為胞內勞森菌)的存 在相關。通常，對抗胞內勞森菌的口服接種疫苗已經顯示出是一種在經濟上有效的措施， 以控制回腸炎和更好地開發豬的遺傳生長潛能(Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3. 0 (豬增生性腸炎技術手冊3. 0)，2006年7月；獲自Boehringer Ingelheim)。此外，口服而非非腸道的疫苗接種將降低血液攜帶感染(如通過多次使用的 針的PRRS)的傳播以及注射部位反應的減少和保留在畜體內的針。與單獨的疫苗接種相 比，這將減少動物和人的應激、時間、勞動成本和精力(McOrist :"Ileitis-0ne Pathogen, Several Diseases，，，IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, 2004 年 6 月 28 日)。通常了解減毒活疫苗方法的優勢是免疫的功效通常是相對良好的，因為宿主的免 疫系統以更“自然”的方式暴露于生物體的所有抗原物質。特別地，對于胞內細菌劑，如胞 內勞森菌，由于基于完全的和合適的T細胞的免疫應答，認為活的減毒疫苗方法給接種疫 苗的動物給予了最好利用的保護。這與用于胞內細菌的亞基或殺滅疫苗類型相關的不定的 差的免疫性相反。這對于專性胞內細菌(如，胞內勞森菌或衣原體(Chlamydia))也特別如 此，這些胞內細菌在粘膜內引起致病的感染。研究表明目標胞內細菌完整的活減毒形式最 好遞送至靶粘膜，它們需要作為完整的活細菌形式，以在靶粘膜中產生完全保護性的免疫 應答，而且與使用部分細菌成分相比，它們在免疫上也是較好的。一般的理解是需要口服給予對抗胞內勞森菌的疫苗(參見上文中提到的 Technical Manual 3.0)。這是基于如下的事實身體抵抗回腸炎的基礎是小腸中的局部 免疫力，這是細胞介導的免疫力和通過抗體(尤其是IgA)的局部防御的結果。根據目前 的知識，血清抗體(IgG)不能給予任何保護，只是因為它們沒有到達腸腔。已經在研究中 證明了口服疫苗接種產生細胞介導的免疫力，以及在腸道中局部產生IgA(Murtaugh，見 Agrar-und Veter inar -Akademie, Nutztierpraxis Aktuel 1, Ausgabe 9, Juni 2004 ；禾口 Hyland 等，見 Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338)。相反， 肌內給藥沒有產生保護。此外，緊次于對抗胞內細菌的成功疫苗必須誘導細胞介導的免疫 力以及局部抗體的產生的一般了解，本領域技術人員知道實際上僅有非常低百分比的口服 攝入的抗原被腸上皮細胞吸收，并且胞內勞森菌摻入細胞中是通過細菌啟動的活性過程。 因此，滅活的疫苗將給腸提供具有不充足的免疫原性抗原(Haesebrouck等，見Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268)。這是為什么認為只有減毒的活疫苗在腸細胞中誘導足 夠的細胞介導的保護(參見上文中提到的Technical Manual 3.0)。目前，市場上只有一種抵抗胞內勞森菌的疫苗，由Boehringer Ingelheim銷售的viz. Enter i SO1 Ileitis。 這種疫苗是真正的用于口服給藥的活疫苗。本發明的目的是提供抵抗胞內勞森菌感染的可替換疫苗。為此，發明了使用非活 性的含有碳水化合物的組合物，這些碳水化合物在活的胞內勞森菌細胞中也能找到，與這 些細胞的外細胞膜相連，將組合物用于制造抵抗胞內勞森菌感染的疫苗，該疫苗是適于全 身給藥的形式。令人驚訝地，與長久以來對怎樣對抗胞內勞森菌的一般了解相反，發現使用 含有碳水化合物的非活性組合物，例如，從胞內勞森菌的外細胞膜提取的，作為疫苗中的抗 原，可以誘導對抗胞內勞森菌的保護，當將抗原全身給藥時，即，以到達身體循環系統的方 式(包括心血管和淋巴系統)，這種保護與使用活疫苗Enteri so 1 ileitis(根據相應 的說明書來給藥)提供的保護相當或甚至有提高，因此影響作為整體的身體，而不是特定 部位，如胃腸道。例如，可以通過將抗原給予肌肉組織中(肌內)、真皮中(皮內)、皮膚下 (皮下)、粘膜下(膜下)、靜脈中(靜脈內)等來進行全身給藥。除了可獲得的非常好的保 護以外，本發明非活性疫苗的重要優點在于當與活疫苗比較時固有的安全性。通常，可以通過使用本領域已知的方法將含有碳水化合物的組合物用于制造疫 苗，這些方法基本上包括將含有抗原性碳水化合物的組合物(或從其衍生的組合物，如原 始組合物或提取物的稀釋物或濃縮物，一種或多種純化成分等)與藥物學上可接受的載體 混合，所述載體例如為液體載體，如(任選緩沖的)水，或固體載體，如通常用于獲得冷凍干 燥疫苗的那些。因此，可以在工業環境中進行制造，也可以就地(即，在獸醫處、農場等)將 抗原與其他疫苗混合，例如，在實際給藥于動物之前(立即)混合。在疫苗中，抗原應當以 免疫有效量存在，即，能夠刺激目標動物的免疫系統足以至少降低用野生型生物體的接種 后激發的負效應的含量。任選地，可以加入其他物質，如佐劑、穩定劑、粘度調節劑或其他成 分，這取決于預期的用途或所需的疫苗特性。對于全身性疫苗接種，許多形式是合適的，特 別是液體制劑(含有溶解的、乳化的或懸浮的抗原)，以及固體制劑，如植入物或介質形式， 如用于抗原懸浮于液體中的固體載體。全身性疫苗接種，特別是非腸道疫苗接種(即，不通 過消化道)，和用于全身性疫苗接種的合適疫苗(物理)形式已經知道有200多年了。注意到已經報道了胞內勞森菌細菌的亞基作為疫苗中的抗原，用于保護以對抗這 種細菌。然而，這些主要是重組蛋白，并且迄今為止沒有一個證明了能夠提供良好的保護。 也提出了將殺滅的細菌(其固有地含有也能在活的胞內勞森菌細胞中找到的與外細胞膜 相連的碳水化合物)作為對抗胞內勞森菌的疫苗中的抗原，但實際上尚未測試和報道基于 殺滅的全細胞的疫苗能提供良好的保護。除此之外，由于通常的理解是對全身性給藥抗原 來局部(即，在腸中)對抗胞內勞森菌不存在合理的期望，因此沒有結合這些殺滅的細菌來 使用全身性給藥。在這點上，注意到W097/20050 (Daratech PTY Ltd)提及了使用殺滅的胞內勞森菌 細菌來使豬免疫。然而，沒有提及全身性給藥。基于目前的支持，只在口服給藥時，疫苗接 種才是有效的，通常理解口服途徑是為Daratech申請中所述的實驗選擇的給藥途徑。另 一個提及殺滅細菌的專利申請是W02005/011731 (Boehringer Ingelheim)。然而，實際上 公開的只是使用了 口服給藥的活疫苗。沒有顯示殺滅疫苗是有效的，也沒有公開可以全身 性給藥殺滅的疫苗。EP843818 (Boehringer Ingelheim)描述了肌內給藥殺滅的疫苗(段 落
，結合段落
)，在段落W115]中，描述了通過在標準大氣條件下儲存在4°C下來殺滅細菌。然而，如通常所知的，在這樣的條件下，胞內勞森菌細菌能夠存活。因此， 這篇文獻沒有教導本發明的主題。還注意到含有碳水化合物的組合物從Kroll等是已知的 (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2005 年 6 月，693—699)，其中i亥碳水 化合物在活的胞內勞森菌中也能找到，與這些細胞的外細胞膜相連。然而，這種組合物是用 于診斷的。出于如上所述的原因，尚未測得其為保護性抗原。在一個實施方案中，含有碳水化合物的組合物是由胞內勞森菌細菌的殺滅產生的 材料。已經發現了非常方便的提供用于根據本發明使用的碳水化合物的方式是簡單地殺滅 胞內勞森菌細胞并使用獲自作為碳水化合物來源的材料。從活細胞提取碳水化合物在理 論上也是可行的(類似于通過除去細胞壁形成活的形骸細胞)，但需要更精密復雜的并因 此更昂貴的技術。該材料可以作為整體使用，例如，胞內勞森菌細胞的全細胞懸浮液或裂解 物，或可以從該材料中純化或甚至分離出碳水化合物。可以通過使用相對簡單的本領域已 知的技術來進行這種方法。在優選的實施方案中，含有碳水化合物的組合物含有殺滅的胞內勞森菌細菌的完 整細胞。已經證明了這是最方便用于提供碳水化合物作為疫苗中的抗原的方式。此外，甚 至可進一步提高疫苗的功效，可能是因為這種將抗原給予目標動物的免疫系統的方式可更 好地模擬碳水化合物的天然環境。在一個實施方案中，疫苗包含水包油型佐劑，其含有亞微米大小的油滴。通常，佐 劑是非特異性的免疫刺激劑。原則上，可以將在免疫事件的級聯中能夠促進或擴大特定的 過程并最終導致更好免疫應答(即，對抗原的綜合身體應答，特別是通過淋巴細胞介導的 應答，并且通常涉及特定抗體或之前敏化的淋巴細胞對抗原的識別)的每種物質定義為佐 劑。已經顯示出使用含有亞微米大小油滴的水包油型佐劑可提供非常好的對抗胞內勞森菌 的保護。實際上，水包油型佐劑這樣結合非活性抗原的應用是常見的。然而，通常知道當油 滴直徑大時獲得最好的免疫刺激特性。特別是，當認為安全性是重要問題時，特別地使用具 有1微米以下直徑的油滴。在這種情況下，可以使用小的液滴，因為已知這些引起較少的組 織損傷、臨床病征等。然而，對于通過全身性疫苗接種獲得腸道相關疾病保護(如本發明中 的情況)來說，可以選擇大的液滴，因為期望免疫應答必須得到明顯加強。相反，我們發現 了對于對抗胞內勞森菌的保護，在組合物中使用小的油滴可提供非常好的結果。在更優選的實施方案中，佐劑包含生物可降解油的液滴和礦物油的液滴，生物可 降解油的液滴的平均大小不同于礦物油的液滴的平均大小。已經顯示出使用生物可降解油 和礦物油的混合物對于功效和安全性提供了非常好的結果。除此之外，組合物的穩定性非 常高，這是重要的經濟優勢。已經證明了穩定性是非常好的，特別是當生物可降解油液滴或 礦物油液滴的平均(容重)大小小于500nm(優選400nm)時。在一個實施方案中，疫苗進一步包含豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae) 和豬圓環病毒的抗原。迄今為止，現有技術中已經提出了胞內勞森菌的組合疫苗。然而，實 際上這些組合中沒有多少的功效得到了測試。這種情況的原因在于通常理解為抗原與胞內 勞森菌抗原的組合只有當勞森菌抗原作為活(減毒)細胞提供時才能獲得成功的保護。在 這點上，我們參考W02005/011731，其也提出了基于胞內勞森菌的所有種類的組合疫苗。然 而，關于該專利申請的說明書和權利要求結構，受讓人(Boehringer Ingelheim)似乎確信 只有當勞森菌抗原以活細胞形式存在時才能期望組合疫苗具有合理的成功機會。這對于W02006/099561同樣如此，受讓人也是Boehringer Ingelheim)。實際上，基于普通常識，這 是顯而易見的想法。使用以下實施例來進一步解釋本發明。實施例1描述了獲得基本上無蛋白質的含碳水化合物的組合物的方法以及使用 該組合物制得的疫苗。實施例2描述了一個實驗，其中將根據本發明的第二種疫苗與目前市場上的疫苗 和含有胞內勞森菌亞基蛋白的實驗疫苗進行比較。實施例3描述了一個實驗，其中將根據本發明的兩種不同的疫苗與目前市場上的 疫苗進行比較。實施例4描述了一個實驗，其中確定了根據本發明的疫苗的劑量影響。實施例1在這個實施例中，描述了獲得基本上無蛋白質的與胞內勞森菌細胞的外細胞膜相 連的碳水化合物組合物的方法以及可以使用這種組合物制得的疫苗。通常，碳水化合物是 含有碳、氫和氧的有機化合物，碳、氫和氧的比例通常為1 2 1。碳水化合物的實例是糖 (糖類)、淀粉、纖維素和樹膠。通常，它們作為動物膳食中的主要能源。胞內勞森菌是革蘭 氏陰性細菌，因此其含有不完全是由磷脂和蛋白質構成的外膜，而是外膜還含有碳水化合 物，特別是多糖(通常是如脂多糖、脂寡糖或甚至非脂多糖這樣的多糖)。用于疫苗制備的碳水化合物級分取二十微升含有濃度為3.7E8( = 3. 7X IO8)細胞/ml的胞內勞森菌的緩沖水 (0. 04M PBS，磷酸鹽緩沖的鹽水)。通過將它們在100°C下保持10分鐘來裂解細胞。將0. 04M PBS中的蛋白酶K(10mg/ml)加入，至1. 7mg/ml的終濃度。將該混合物在60°C下培養60分 鐘，以降解所有蛋白質并保持碳水化合物完整。隨后，將混合物在100°C下培養10分鐘，以 滅活蛋白酶K。將所得到的材料在2-8°C下儲存，直至進一步使用，所得到的材料是含有碳 水化合物的組合物，特別是含有存在于活的胞內勞森菌細菌中的與其外細胞膜相連的碳水 化合物(參見以下的段落)。將組合物配制于Diluvac forte佐劑中。這種佐劑(參閱EP 0382271)包括7. 5%重量的具有大約400nm的平均容重大小的醋酸維生素E液滴，液滴懸 浮于水中，并用0.5%重量的吐溫80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)穩定。每微菌升疫苗含 有從1. 2E8胞內勞森菌提取的材料。勞森菌碳水化合物抗原的免疫沉淀根據標準程序，在室溫下，用飽和的Na2SO4,將兩批對抗胞內勞森菌完整細胞產生 的單克隆抗體(MoAb’s)進行沉淀。通過離心(10.000g，10分鐘)將沉淀物沉淀。用20% Na2SO4洗滌沉淀物，并重懸浮于0. 04M PBS中。根據制造商的手冊，用0. IM NaPO4(pH 7. 4) 預先洗滌酪氨酰(Tylosyl)激活的Dynal珠粒(DynaBeads，DK)。從每批MoAb，s取出 140 μ g，并加入到2E8預先洗滌過的珠粒中，并在37°C下培養過夜。通過離心沉淀珠粒并通 過抽吸上清液來除去未結合的MoAb’ s。分光光度計測量顯示出20至35%加入的MoAb，s 已經與珠粒結合。將0. 04M PBS中的兩批Iml胞內勞森菌細胞(3. 7E8/ml)超聲波處理1分鐘。將 所得到的細胞裂解物加入到酪氨酰激活的珠粒-單克隆復合物中，并在4°C下培養過夜。用 0. IM NaPO4(pH 7. 4)將酪氨酰激活的珠粒-單克隆復合物洗滌三次。以連續的方式，將珠粒在 0. 5ml 的 0. 04M PBS 中的 8M 脲(El) ；0. 5ml IOmM 甘氨酸 pH2. 5 (E2)；和 0. 5ml 50mM HCl (E3)中洗滌來洗脫結合的化合物。洗脫后，用100 μ 1和200 μ 1 IM Tris/HCl (pH 8. 0) 中禾口 E2禾口 E3。從每個步驟取樣并裝載于SDS-PAGE凝膠上。使用考馬斯亮藍(CBB)和銀染將凝膠 染色或弄污。使用如上所述的相同MoAb’s來產生斑點。凝膠和斑點的觀察顯示出MoAb’s 識別具有21和24kDa表觀分子量的條帶，這些條帶在CBB凝膠上未看到，但在銀染的凝膠 上看到了。此外，確定了結合MoAb’s的細胞級分是蛋白酶K抗性的。因此，基于這些結果， 可以推斷出該級分含有碳水化合物(即，所有蛋白被裂解了，并且超聲波處理的DNA級分在 銀染中沒有作為清晰的條帶顯示出來)，并且碳水化合物與胞內勞森菌的外細胞膜(即對 抗這種級分產生的MoAb’s也識別完整的胞內勞森菌細胞)相連(即，形成其的一部分或與 其結合)。已知胞內勞森菌是革蘭氏陰性細菌的事實，因此認為碳水化合物組合物包括多 糖。實施例2進行該實施例來測試在疫苗中配制碳水化合物抗原的方便方法，S卩，通過殺滅的 完整細胞(也稱為菌苗)。作為對照，使用了可購得的疫苗Enterisol iieitis和包含 蛋白質亞基的實驗亞基疫苗。接著，將未接種疫苗的動物用作對照。實施例2的實驗設計如下制得滅活的完整細胞疫苗。收集源自患有PPE的豬的腸的活胞內勞森菌細 胞。用0.01%BPL(i3-丙內酯)將細胞滅活。所得到的材料，在本發明的意義上固有地是 非活性的含有碳水化合物的組合物(特別是因為它含有存在于活胞內勞森菌細菌中的與 外細胞膜相連的碳水化合物)，將其以大約2. 8 X IO8細胞/ml疫苗的濃度配制于Diluvac forte佐劑中(參見實施例1)。亞基疫苗含有重組Ρ1Λ和P4，如從EP1219711中所知的(分別為19/21和37kDa 蛋白)，并且該重組蛋白通過基因5074、4320和5464來表達，如W02005/070958中所述。將 蛋白質配制于Diluvac forte佐劑中。疫苗含有大約50 μ g每種蛋白/微升。使用了四十六周大的SPF豬。將豬分成4組，每組十頭豬。根據制造商的說明，組 1 口服接種一次(T = (m)2ml “Enter i sol ileitis”(Boehringer Ingelheim)。組 2和組3肌內接種兩次(在T = O和T = 4周時)，分別接種2ml如上所述的滅活勞森菌完 整細胞疫苗和重組亞基組合疫苗。組4留著作為未接種的對照。在T = 6周時，所有的豬 用均質的胞內勞森菌感染的粘膜口服激發。隨后，每日觀察所有豬的豬增生性腸病(PPE) 的臨床病征。在激發之前和之后，以規則的時間，從豬取樣血清血液(用于血清學)和糞便 (用于PCR)。在T = 9周時，將所有豬安樂死并進行尸檢。獲取回腸的組織學樣品并通過 顯微鏡進行檢查。從感染的粘膜制備激發接種物將500克感染的粘膜(從感染的腸刮下來的)與 500ml生理鹽水混合。將該混合物在通用勻漿器中在冰上全速均質一分鐘。在T = 6周時， 用20ml激發接種物口服激發所有豬。在T = 0、4、6、7、8和9w時，獲取每只豬的糞便樣品(克含量)和血清血樣并冷凍 儲存直至測試。在定量PCR(Q-PCR)中測試糞便樣品并表示為以皮克(pg)計的量的對數。 在常用的IFT測試(檢測對抗血清中完整胞內勞森菌細菌的抗體的免疫熒光抗體測試)中測試血清樣品。對于組織學評分，獲取回腸的相關樣品，在4%緩沖的福爾馬林中固定，常規 包埋并切片。用蘇木精-曙紅(HE染色)和使用抗胞內勞森菌單克隆抗體的免疫組織化學 染色(IHC染色)將這些切片染色。通過顯微鏡檢查這些切片。組織學評分如下HE染色
未檢測到異常分:=0
可疑損傷分:=1/2
輕微損傷分:=1
中度損傷分:=2
嚴重損傷分:=3
IHC染色
無明顯的胞內勞森菌細菌分:=0
可疑的細菌存在分:=1/2
切片中存在單個/少量細菌分·改=1
切片中存在中等數量的細菌分:=2
切片中存在大量細菌分:=3
單獨記錄每只豬的所有數據。按照激發后不同參數的陽性動物的平均值來計算每
組的分數。使用非參數Marm-Whitney U測試來評價統計學顯著性(雙側檢驗的并將顯著 性水平設定為0. 05)。實施例2的結果血清學在第一次接種之前，測試IFT抗體滴度時，所有豬是血清反應陰性的。用完整細 胞菌苗(組2)接種疫苗后，豬產生了高IFT抗體滴度，而對照和接種亞基疫苗的豬仍然是 陰性的，直至激發(表1)。接種Enterisol 的豬(組1)中的兩只產生了中等的ift滴 度，而該組中的所有其他豬保持血清反應陰性。激發后，所有豬產生了高ift抗體滴度。表 1中描述了平均結果(使用所用的稀釋度，1.0是下側的檢測水平)。表1.接種和激發后豬血清的平均IFT抗體滴度(21og)
組T = O周T = 4周Τ = 6周Τ = 9周1< 1. 01. 11. 7> 11. 42< 1. 03. 7> 11. 8> 12. 03< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 11. 64< 1. 0< 1. 0< 1. 0> 12. 0糞便樣品的實時PCR在激發之前，所有糞便樣品是陰性的。激發后，在所有組中發現了陽性反應。組 1 (P = 0. 02)、組2 (ρ = 0. 01)和組3 (ρ = 0. 03)與對照相比較，具有明顯較低的泄出水平。 表2中給出了激發后的概述。
表2.接種和激發后糞便樣品的PCR平均結果(log pg)
權利要求
1.非活性的含有碳水化合物的組合物的用途，該碳水化合物在活的胞內勞森菌細胞中 也能找到，與這些細胞的外細胞膜相連，該組合物用于制造抵抗胞內勞森菌感染的疫苗，該 疫苗是適于全身給藥的形式。
2.根據權利要求1的用途，其特征在于含有碳水化合物的組合物是從殺滅胞內勞森菌 細菌獲得的材料。
3.根據權利要求2的用途，其特征在于含有碳水化合物的組合物含有殺滅的胞內勞森 菌細菌的完整細胞。
4.根據在前任一項權利要求的用途，其特征在于所述疫苗包含水包油型佐劑，該佐劑 含有亞微米大小的油滴。
5.根據權利要求4的用途，其特征在于所述佐劑包含生物可降解油的液滴和礦物油的 液滴，生物可降解油的液滴的平均大小不同于礦物油的液滴的平均大小。
6.根據在前任一項權利要求的用途，其特征在于所述疫苗進一步包含豬肺炎支原體和 豬圓環病毒的抗原。
7.非活性的含有碳水化合物的組合物，該碳水化合物在活的胞內勞森菌細胞中也能找 到，與這些細胞的外細胞膜相連，該組合物用于制造抵抗胞內勞森菌感染的疫苗，該疫苗是 適于全身給藥的形式。
全文摘要
本發明涉及非活性的含有碳水化合物的組合物的用途，該碳水化合物在活的胞內勞森菌細胞中也能找到，與這些細胞的外細胞膜相連，該組合物用于制造抵抗胞內勞森菌感染的疫苗，該疫苗是適于全身給藥的形式。
文檔編號A61K39/106GK102006883SQ200980113679
公開日2011年4月6日 申請日期2009年4月16日 優先權日2008年4月18日
發明者A·A·C·雅各布斯, C·C·施里爾, P·維爾梅吉, R·P·A·M·塞吉爾斯 申請人:英特威國際有限公司