Pcv2豬肺炎支原體致免疫組合物及其制備方法

專利名稱：Pcv2豬肺炎支原體致免疫組合物及其制備方法
技術領域：
在本發明一個方面，提供了有效誘導抗豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,M. hyo)感染的免疫應答的致免疫組合物。更具體地，本發明涉及有效誘導、 激發、或提供免疫應答的致免疫組合物，所述應答保護接受該組合物的動物，減少豬肺炎支 原體感染的發生率、或減輕其嚴重性。還更具體地，本發明涉及致免疫組合物，其中包括基 于細胞的抗原，優選菌苗(bacterin)，其賦予抗豬肺炎支原體感染的保護性免疫應答。甚至 更具體地，本發明涉及含豬肺炎支原體菌苗的致免疫組合物，給予所述菌苗導致抗豬肺炎 支原體的保護性免疫應答。最具體地，本發明涉及致免疫組合物，其有效賦予接受該致免疫 組合物的豬以保護性免疫應答，其中所述組合物的劑量包括相對效力(relative potency, RP)為至少1.22的豬肺炎支原體菌苗。此外，本發明還提供了制備和施用所述致免疫組合 物的方法。在本發明另一方面中，提供了有效誘導抗2型豬圓環病毒(porcine circovirus 2，PCV2)感染的免疫應答的致免疫組合物。更具體地，本發明涉及有效提供免疫應答的致 免疫組合物，所述應答保護接受該組合物的動物，減少與PCV2感染有關的臨床癥狀的發生 率、或減輕其嚴重性。還更具體地，本發明涉及基于蛋白的致免疫組合物，其賦予抗PCV2 感染的保護性免疫應答。甚至更具體地，本發明涉及含PCV2 0RF2的致免疫組合物，給予 PCV2-0RF2導致抗PCV2感染的保護性免疫應答。最具體地，本發明涉及致免疫組合物，其有 效賦予接受該致免疫組合物的豬以保護性免疫應答，其中所述組合物包含由PCV2 0RF2表 達的蛋白，且具有至少1. 38的RP。此外，本發明還提供了制備和施用所述致免疫組合物的 方法。在本發明另一方面中，提供了組合致免疫組合物，組合疫苗，或多價的致免疫組合 物或疫苗。更具體地，本發明提供了有效誘導免疫應答的致免疫組合物，所述應答抗豬肺炎 支原體和至少一種引起豬其它疾病的生物的感染。還更具體地，本發明提供了有效誘導抗 豬肺炎支原體感染的免疫應答、并有效誘導抗PCV2感染的免疫應答的致免疫組合物。優選 地，所述抗豬肺炎支原體和PCV2的免疫應答足以減少、包括防止與每一種病原體有關的臨 床表現或癥狀的嚴重性或發生率。在所述致免疫組合物的優選形式中，其豬肺炎支原體部 分具有至少1. 22的RP值，其PCV2部分具有至少1. 38的RP值。本發明還提供了制備和施 用所述組合物的方法。現有技術的描述豬肺炎支原體是歸類為支原體科的小細菌(400-1200nm)。豬肺炎支原體與地 方性動物肺炎有關，這種病是常見于生長和肥育豬(growing and finishing pigs)的豬呼吸道疾病。豬肺炎支原體攻擊氣管和肺上皮細胞的纖毛，使纖毛停止敲打(纖毛停滯 (ciliostasis))，并最終引起肺部一些區域萎陷。根據疾病的程度，染病豬的每日增重最多 可減少17%。地方性動物肺炎是豬群中廣泛傳播的疾病，在幾乎每個豬群中都有。豬肺炎 支原體被認為是有利于PRRSV和其它呼吸道病原體進入肺部的主要病原體。三種毒株232， J,& 7448 的基因組已測序(Minion et al. ,J. Bacteriol. 186 7123-33, 2004 ；Vasconcelos et al.，J. Bacteriol. 187 =5568-77,2005)。豬肺炎支原體感染的臨床表現包括干咳、性能 減弱，以及肺損傷。2型豬圓環病毒(PCV2)是小的(直徑17-22nm)、二十面體、無包膜DNA病毒， 含單鏈環狀基因組。PCV2與1型豬圓環病毒(PCVl)共有近80%的序列同一性。但是， 與PCVl通常無毒力不同，被PCV2感染的豬出現綜合征，被稱為斷奶后多系統消耗綜合 征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)。PMWS 的臨床特征有，消 瘦(wasting)，皮膚蒼白(paleness of the skin)，贏弱(unthriftiness)，呼吸困難 (respiratory distress), MMi (diarrhea), ^(icterus and iaundice)。 一些病豬@ 現出所有癥狀，而另一些病豬只有其中的一或兩種癥狀。尸檢期間，也可以在多個組織和器 官上出現顯微鏡檢可見的和肉眼可見的損傷，其中淋巴器官是最常見的損傷部位。PCV2核 酸或抗原量與顯微鏡檢發現的淋巴損傷嚴重性之間有強相關性。被PCV2感染的豬病死率 接近80%。除了 PMWS，PCV2還與數種其它感染有關，包括偽狂犬病(pseudorabies)，豬生 殖呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),Glasser病，鏈 球菌腦膜炎(streptococcal meningitis)，沙門氏桿菌病(salmonellosis)，斷奶后大腸桿 菌病(postweaning colibacillosis)，飲食性肝功能病(dietetic hepatosis), URit^ 性支氣管月市炎(suppurative bronchopneumonia)。PCV2的第2開放閱讀框(0RF2)蛋白在SDS-PAGE凝膠上電泳時具有近30kDa的分 子量，其過去被用于作為PCV2疫苗的抗原性成分。獲得0RF2以用于此類疫苗的典型方法 通常是擴增編碼0RF2的PCV2 DNA,用0RF2DNA轉染病毒載體，用含0RF2 DNA的病毒載體 感染細胞，允許病毒在細胞內表達0RF2蛋白，將細胞裂解，從細胞中提取0RF2蛋白。這些 方法通常在用病毒載體感染細胞后還需要約4天時間。但這些方法的缺點是，提取過程既 費錢又費時。而且，從細胞中回收到的0RF2的量不很多；因此，需要用較大量的病毒載體感 染較大量的細胞，以便獲得足夠量的重組表達的蛋白來用于疫苗等方面。 因此，本領域需要賦予保護性免疫應答的致免疫組合物，所述應答抵抗PCV2感染 和豬肺炎支原體感染，減少所述感染的發生率，和/或減輕所述感染的嚴重性，或防止與所 述感染有關的臨床表現。具體地，本領域需要包含豬肺炎支原體抗原和PCV-2抗原的組合 疫苗，其中所述抗原的量足以在單次給予所述疫苗后賦予保護性免疫應答，所述應答抵抗 PCV2感染和豬肺炎支原體感染，減少所述感染的發生率，和/或減輕所述感染的嚴重性，或 防止與所述感染有關的臨床表現。所述疫苗將改進豬疫苗的順應性(compliance)。發明概述本發明克服了現有技術固有的困難，為本領域提供了顯著的進步。在本發明一個 方面，提供了在豬體內激發抗豬肺炎支原體的保護性免疫應答的致免疫組合物。優選地，所 述致免疫組合物包含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原體的抗原。還更優選地，每一劑 中豬肺炎支原體抗原的量具有至少1. 22的相對效力(RP)值，其中，相對效力值1. 22是指，小鼠被給予了四十分之一(1/40)的所述量的豬肺炎支原體抗原后，至少95%的小鼠，優選 100%的小鼠，在處理后的21天內或第21天之時，在豬肺炎支原體特異性抗體檢測試驗中 測得，產生了可檢測的量的抗體。因此，至少95%、優選100%的小鼠在處理后的21天內或 第21天之時誘導出可檢測的豬肺炎支原體特異性抗體應答所需的豬肺炎支原體抗原量的 40倍，足以在與2型豬圓環病毒的抗原一起給藥后，賦予保護性免疫應答，以抵抗豬肺炎支 原體感染，減少所述感染的發生率，和/或減輕所述感染的嚴重性，或防止與所述感染有關 的臨床表現。換而言之，如上所述的豬肺炎支原體抗原的量，當混合為組合疫苗并被給藥 時，已被顯示能克服任何與PCV2抗原之間的負面干擾。因此，本發明還涉及包含2型豬圓環 病毒抗原和豬肺炎支原體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑中豬肺炎支原體抗原的量具 有至少1. 22的相對效力(RP)值，所述RP值1. 22對應于在至少95%、優選100%的小鼠體 內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的豬肺炎支原體特異性抗體應答所需 的豬肺炎支原體抗原量的40倍。在一些優選形式中，所述組合物還包括或包含佐劑。各種 佐劑都可用于本發明，可由本領域技術人員來進行選擇，但尤其優選卡波姆(carbomer)，更 優選卡波普(Carbopol)。有利地，本發明的致免疫組合物當作為單劑(single dose)對豬 給藥時，賦予保護性免疫應答，所述應答抵抗豬肺炎支原體感染，減少所述感染的發生率， 和/或減輕所述感染的嚴重性，或防止與所述感染有關的臨床表現。所述單劑對豬給藥后 激發了持續至少100，更優選至少110，更優選至少120，還更優選至少130，更優選至少140， 還更優選至少150，更優選至少160，還更優選至少170，更優選至少180，最優選至少184 天的免疫力。換而言之，一劑本發明的致免疫組合物，無需加強免疫或后續用藥，就在至少 100 (110，120，130，140，150，160，170，180，等)、最優選至少184天內，使單個動物或一組動 物的豬肺炎支原體感染臨床表現的發生率或嚴重性減少。至于抗體檢測試驗，本領域技術 人員能找到并利用相應產品。優選ELISA試驗，尤其IDEXX Herdchek豬肺炎支原體測試試 劑盒(IDEXX Laboratories, Inc.，ffestbrook, ME)。具體地，IDEXX Herdchek 豬肺炎支原 體測試試劑盒(IDEXX Laboratories, Inc. , ffestbrook, ME)可用作本發的參考試驗。
在本發明另一方面中，提供了在豬體內激發抗PCV2的保護性免疫應答的致免疫 組合物。優選地，所述致免疫組合物包含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原體的抗原。 還更優選地，每一劑中PCV2抗原的量具有至少1.38的相對效力(RP)值，其中，相對效力值 1.38是指，小鼠被給予了二十分之一(1/20)的所述量的PCV2抗原后，至少85%的小鼠，在 處理后的21天內或第21天之時，在PCV2特異性抗體檢測試驗中測得，產生了可檢測的量 的抗體。優選地，相對效力值1.38是指，小鼠被給予了十分之一(1/10)的所述量的PCV2 抗原后，至少95 %的小鼠，優選100 %的小鼠，在處理后的21天內或第21天之時，在PCV2 特異性抗體檢測試驗中測得，產生了可檢測的量的抗體。因此，至少85 %的小鼠在處理后的 21天內或第21天之時誘導出可檢測的PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的20倍， 或優選地，至少95%、優選100%的小鼠在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的 PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的10倍，足以在與豬肺炎支原體抗原一起給藥后， 賦予保護性免疫應答，以抵抗PCV2感染，減少所述感染的發生率，和/或減輕所述感染的嚴 重性，或防止與所述感染有關的臨床表現。換而言之，如上所述的PCV2抗原的量，當混合為 組合疫苗并被給藥時，已被顯示能克服任何與豬肺炎支原體抗原之間的負面干擾。因此，本 發明還涉及包含2型豬圓環病毒抗原和豬肺炎支原體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑
6中PCV2抗原的量具有至少1. 38的相對效力(RP)值，所述RP值1. 38對應于在至少85%的 小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的PCV2特異性抗體應答所需的 PCV2抗原量的20倍。根據另一方面，本發明還涉及包含2型豬圓環病毒抗原和豬肺炎支原 體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑中PCV2抗原的量具有至少1. 38的相對效力(RP)值， 所述RP值1. 38對應于在至少95%、優選100%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天 之時誘導出可檢測的PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的10倍。在該實施方案的一些優選形式中，所述組合物還包括或包含佐劑。各種佐劑都可 用于本發明，可由本領域技術人員來進行選擇，但尤其優選卡波姆，更優選卡波普。有利地， 本發明的致免疫組合物當作為單劑對豬給藥時，賦予保護性免疫應答，所述應答抵抗PCV2 感染，減少所述感染的發生率，和/或減輕所述感染的嚴重性，或防止與所述感染有關的臨 床表現。所述單劑對豬給藥后激發了持續至少100，更優選至少110，更優選至少120，還 更優選至少130，更優選至少140，還更優選至少150，更優選至少160，還更優選至少170， 更優選至少180，最優選至少184天的免疫力。換而言之，一劑本發明的致免疫組合物，無 需加強免疫或后續用藥，就在至少100(110，120，130，140，150，160，170，180，等)、最優選 至少184天內，使單個動物或一組動物的PCV2感染臨床表現的發生率或嚴重性減少。至 于抗體檢測試驗，本領域技術人員能找到并利用相應產品。優選ELISA試驗，尤其優選 Nawagitgul, P.等人(其教導和內容都引入本文做參考)在Modified indirect porcine circovirus(PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 :33_40 (2002)中 所述方法。在本發明另一方面，提供了含有有效量的豬肺炎支原體抗原和有效量的PCV2抗 原的致免疫組合物。優選地，豬肺炎支原體抗原和PCV2抗原分別如上述具有至少1. 22和 1. 38的RP值，其中對于豬肺炎支原體而言RP值為1. 22、以及對于PCV2而言RP值為1. 38 是指，接受四十分之一的豬肺炎支原體所述量和十分之一的PCV2抗原所述量的小鼠，在處 理后的21天內或第21天時，有95%、優選100%在豬肺炎支原體和PCV2特異性抗體檢測 試驗中測得產生了可檢測的量的抗體。因此，至少95%、優選100%的小鼠在處理后的21 天內或第21天之時誘導出可檢測的豬肺炎支原體特異性抗體應答所需的豬肺炎支原體抗 原量的40倍，以及至少95%、優選100%的小鼠在處理后的21天內或第21天之時誘導出 可檢測的PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的10倍，已顯示足以在與豬肺炎支原體 抗原一起給藥后，賦予保護性免疫應答，以抵抗PCV2感染和/或豬肺炎支原體感染，減少所 述感染的發生率，和/或減輕所述感染的嚴重性，或防止與所述感染有關的臨床表現。換而 言之，上述PCV2抗原量和豬肺炎支原體抗原量，當混合為組合疫苗并被給藥時，已顯示能 克服兩種抗原之間的任何負面干擾。因此，本發明還涉及包含2型豬圓環病毒抗原和豬肺 炎支原體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑中豬肺炎支原體抗原和PCV2抗原的量分別具 有至少1. 22和1. 38的相對效力值，其中，對于豬肺炎支原體而言RP值為1. 22對應于在至 少95%、優選100%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的豬肺炎 支原體特異性抗體應答所需的豬肺炎支原體抗原量的40倍，且其中，對于PCV2而言RP值 為1. 38對應于在至少85%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測 的PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的20倍。優選地，對于PCV2而言RP值為1. 38對應于在至少95%、優選100%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢 測的PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的10倍。在該實施方案的一些優選形式中， 所述組合物還包括或包含佐劑。各種佐劑都可用于本發明，可由本領域技術人員來進行選 擇，但尤其優選卡波姆，更優選卡波普。有利地，本發明的致免疫組合物當作為單劑對豬給 藥時，激發保護性免疫應答。所述單劑對豬給藥后激發了持續至少100，更優選至少110，更 優選至少120，還更優選至少130，更優選至少140，還更優選至少150，更優選至少160，還 更優選至少170，更優選至少180，最優選至少184天的免疫力。換而言之，一劑本發明的 致免疫組合物，無需加強免疫或后續用藥，就在至少100 (110，120，130，140，150，160，170， 180，等)、最優選至少184天內，使單個動物或一組動物的豬肺炎支原體感染和PCV2感染 臨床表現的發生率或嚴重性減少。至于抗體檢測試驗，本領域技術人員能找到并利用相應 的方法和產品。優選ELISA試驗，對于PCV2抗體檢測試驗尤其優選Nawagitgul，P.等人 (其教導和內容都引入本文做參考)在Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein (0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 :33_40 (2002)中所述方法，對于豬肺炎支 原體抗體檢測試驗尤其優選IDEXX Herdchek豬肺炎支原體測試試劑盒。在本發明另一方面中，提供了在豬體內激發抗豬肺炎支原體的保護性免疫應答的 方法。總體上，所述方法包括對有需要的動物，優選豬，給予本發明的致免疫組合物的步驟。 優選地，所述致免疫組合物包含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原體抗原。還更優選地， 每一劑中豬肺炎支原體抗原的量具有至少1. 22的相對效力(RP)值，其中，對于豬肺炎支原 體而言RP值1. 22是指，小鼠被給予了四十分之一的所述量的豬肺炎支原體抗原后，至少 95%、優選100%的小鼠，在處理后的21天內或第21天之時，在豬肺炎支原體特異性抗體 檢測試驗中測得，產生了可檢測的量的抗體。因此，本發明還涉及在豬體內激發抗豬肺炎支 原體的保護性免疫應答的方法，包括對所述豬給予含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原 體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑中豬肺炎支原體抗原的量具有至少1. 22的相對效力 值，其中，所述RP值1. 22對應于在至少95%、優選100%的小鼠體內，在處理后的21天內 或第21天之時，誘導出可檢測的量的豬肺炎支原體特異性抗體應答所需的量的40倍。在 一些優選形式中，所述組合物還包括或包含佐劑。各種佐劑都可用于本發明，可由本領域 技術人員來進行選擇，但尤其優選卡波姆，更優選卡波普。有利地，本發明的致免疫組合物 當作為單劑對豬給藥時，激發保護性免疫應答。所述單劑對豬給藥后激發了持續至少100， 更優選至少110，更優選至少120，還更優選至少130，更優選至少140，還更優選至少150， 更優選至少160，還更優選至少170，更優選至少180，最優選至少184天的免疫力。換而言 之，一劑本發明的致免疫組合物，無需加強免疫或后續用藥，就在至少100 (110，120，130， 140，150，160，170，180，等)、最優選至少184天內，使單個動物或一組動物的豬肺炎支原體 感染臨床表現的發生率或嚴重性減少。至于抗體檢測試驗，本領域技術人員能找到并利用 相應產品。優選ELISA試驗，尤其優選IDEXX Herdchek豬肺炎支原體測試試劑盒(IDEXX Laboratories, Inc.，ffestbrook, ME)。在本發明另一方面中，提供了在豬體內激發抗PCV2的保護性免疫應答的方法。總 體上，所述方法包括對有需要的動物，優選豬，給予本發明的致免疫組合物的步驟。優選地， 所述致免疫組合物包含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原體抗原。還更優選地，每一劑中PCV2抗原的量具有至少1.38的相對效力(RP)值，其中，對于PCV2而言RP值1.38是指， 小鼠被給予了二十分之一的所述量的PCV2抗原后，至少85%的小鼠，在處理后的21天內 或第21天之時，在PCV2特異性抗體檢測試驗中測得，產生了可檢測的量的抗體。優選地， 對于PCV2而言RP值為1. 38是指，小鼠接受十分之一的所述量的PCV2抗原后，至少95%、 優選100%的小鼠在處理后的21天內或第21天之時產生可檢測的量的抗體。因此，本發 明還涉及在豬體內激發抗PCV2的保護性免疫應答的方法，包括對所述豬給予含PCV2抗原 和豬肺炎支原體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑中PCV2抗原的量具有至少1. 38的相對 效力值，其中，所述RP值1. 38對應于在至少85%的小鼠體內，在處理后的21天內或第21 天之時，誘導出可檢測的量的PCV2特異性抗體應答所需的量的20倍。優選地，所述RP值 為1. 38對應于在至少95%、優選100%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘 導出可檢測的PCV2特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的10倍。在該實施方案的一些優 選形式中，所述組合物還包括或包含佐劑。各種佐劑都可用于本發明，可由本領域技術人員 來進行選擇，但尤其優選卡波姆，更優選卡波普。有利地，本發明的致免疫組合物當作為單 劑對豬給藥時，激發保護性免疫應答。所述單劑對豬給藥后激發了持續至少100，更優選至 少110，更優選至少120，還更優選至少130，更優選至少140，還更優選至少150，更優選至 少160，還更優選至少170，更優選至少180，最優選至少184天的免疫力。換而言之，一劑 本發明的致免疫組合物，無需加強免疫或后續用藥，就在至少100 (110，120，130，140，150， 160，170，180，等)、最優選至少184天內，使單個動物或一組動物的PCV2感染臨床表現的 發生率或嚴重性減少。至于抗體檢測試驗，本領域技術人員能找到并利用相應的方法和產 品。優選ELISA試驗，尤其優選Nawagitgul，P.等人(其教導和內容都引入本文做參考) 在Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 :33_40(2002)中所述方法。 在本發明另一方面，提供了在豬體內激發抗豬肺炎支原體感染和PCV2感染的保 護性免疫應答的方法。在優選形式中，該方面包括含有效量的豬肺炎支原體抗原和有效量 的PCV2抗原的致免疫組合物。優選地，豬肺炎支原體抗原和PCV2抗原分別如上述具有至 少1. 22和1. 38的RP值，其中對于豬肺炎支原體而言RP值為1. 22、以及對于PCV2而言RP 值為1. 38是指，接受四十分之一的豬肺炎支原體所述量和十分之一的PCV2抗原所述量的 小鼠，在處理后的21天內或第21天時，有95%、優選100%在豬肺炎支原體和PCV2特異性 抗體檢測試驗中測得產生了可檢測的量的抗體。因此，本發明還涉及在豬體內激發抗豬肺 炎支原體和PCV2的保護性免疫應答的方法，包括對所述豬給予含PCV2抗原和豬肺炎支原 體抗原的致免疫組合物，其中，每一劑中豬肺炎支原體抗原和PCV2抗原的量分別具有至少 1. 22和1. 38的相對效力值，其中，對于豬肺炎支原體而言RP值為1. 22對應于在至少95%、 優選100%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的豬肺炎支原體 特異性抗體應答所需的豬肺炎支原體抗原量的40倍，且其中，對于PCV2而言RP值為1. 38 對應于在至少85%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的PCV2特 異性抗體應答所需的PCV2抗原量的20倍。優選地，對于PCV2而言RP值為1. 38對應于在 至少95%、優選100%的小鼠體內、在處理后的21天內或第21天之時誘導出可檢測的PCV2 特異性抗體應答所需的PCV2抗原量的10倍。在該實施方案的一些優選形式中，所述組合物還包括或包含佐劑。各種佐劑都可用于本發明，可由本領域技術人員來進行選擇，但尤其 優選卡波姆，更優選卡波普。有利地，本發明的致免疫組合物當作為單劑對豬給藥時，激發 保護性免疫應答。所述單劑對豬給藥后激發了持續至少100，更優選至少110，更優選至少 120，還更優選至少130，更優選至少140，還更優選至少150，更優選至少160，還更優選至少 170，更優選至少180，最優選至少184天的免疫力。換而言之，一劑本發明的致免疫組合物， 無需加強免疫或后續用藥，就在至少100 (110，120，130，140，150，160，170，180，等)天、最 優選至少184天內，使單個動物或一組動物的豬肺炎支原體感染和PCV2感染臨床表現的發 生率或嚴重性減少。至于抗體檢測試驗，本領域技術人員能找到并利用相應的方法和產品。 優選ELISA試驗，對于PCV2抗體檢測試驗尤其優選Nawagitgul，P.等人(其教導和內容 都弓 I入本文做參考)在 Modified indirect porcine circovirus (PCV) type 2-based and recombinant capsid protein(0RF2)-based ELISA for the detection of antibodies to PCV Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 =33-40(2002)中所述方法，對于豬肺炎支原體抗體檢測試 驗尤其優選IDEXX Herdchek豬肺炎支原體測試試劑盒。本文中，“保護性免疫應答”是指，豬肺炎支原體感染或PCV2感染的臨床、病理學、 或組織病理學癥狀的發生率減小或嚴重性減輕，包括徹底阻止這類癥狀。在本發明另一方面中，提供了制備用于激發抗PCV2和豬肺炎支原體的免疫應答 的組合物的方法，所述組合物優選抗原性組合物或致免疫組合物，例如疫苗。總體上，所述 方法包括將構建體轉染到病毒中的步驟，其中所述構建體包含i)來自PCV2 0RF2的重組 DNA, ii)用經轉染的病毒感染生長培養基中的細胞，iii)使病毒從PCV2 0RF2表達重組 蛋白，iv)從上清中回收所表達的0RF2蛋白，以及，ν)將回收的蛋白與合適的佐劑和/或 其它可藥用載體組合，與豬肺炎支原體菌苗和合適的佐劑一起，制備組合物。由于所述致 免疫組合物中各種成分的長期穩定性，該組合物可以在混合后長達3年內對動物給藥。本 文所述組合物的優選形式具有豬肺炎支原體成分，該成分的RP值大于約1. 22，更優選約 1. 22-4. 5，更優選約1. 22-3. 5，最優選約1. 22-2. 8。豬肺炎支原體的RP值大于約1. 22是 指，用RP值1.22之豬肺炎支原體抗原量的四十分之一量處理后，95%、更優選100%的小鼠 在21天內或第21天時，用豬肺炎支原體-特異性抗體檢測試驗測得，產生了可檢測的量的 抗豬肺炎支原體抗體。“佐劑”在本文中可包括氫氧化鋁和磷酸鋁，皂苷(saponin)如Quil A， QS-21(Cambridge Biotech Inc. , Cambridge ΜΑ), GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals, Inc.，Birmingham, AL)，油包水乳劑，水包油乳劑，水包油包水乳劑。乳劑可尤其基于輕液 體石蠟油(European Pharmacopea類型)；因烯烴寡聚產生的類異戊二烯油(isoprenoid oil)如角鯊烷(squalane)或角鯊烯油(squalene oil)，尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線 性烷基的酯，更尤其植物油，油酸乙酯，丙二醇二 _ (辛酸酯/葵酸酯)，甘油三_ (辛酸酯/ 葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用 以便形成乳劑。乳化劑優選非離子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇(marmide) 的酯(例如無水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的 酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們任選 乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic產品，特別是L121。參見 Hunter 等，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed. Stewart-Tul1,D. E. S. ). John Wiley and Sons, NY, pp51_94(1995)and Todd et al. , Vaccine 15: 564-570(1997)。例如，可使用〃 Vaccine Design, The Subunit and Adiuvant Approach ", M-Powell和M. Newman編，Plenum Press, 1995的第147頁描述的SPT乳劑，以及該書第183 頁所述的MF59乳劑。另一例佐劑是從丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及順丁烯二酸酐和鏈烯基 (alkenyl)衍生物的共聚物選出的化合物。有利的佐劑化合物是交聯的丙烯酸或甲基丙烯 酸聚合物，尤其是與糖(sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯。這些化合物已知被稱為卡波姆 (Phameuropa Vol. 8，No. 2，June 1996)。本領域技術人員還可參見美國專利2，909，462， 它描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯，所述化合物具有至少3個羥 基，優選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和脂烴基 (aliphatic radical)取代。優選的基團是那些含有2_4個碳原子的基團，例如乙烯基，烯 丙基，和其它烯屬不飽和基團(ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團自 身可包含其它取代基，如甲基。這些產品以卡波普的名義出售；(BF Goodrich, Ohio, USA) 特別合適。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇(allyl pentaerythritol)交聯。這其 中，可提及卡波普974P，934P和971P。最優選使用卡波普971P。在順丁烯二酸酐和鏈烯基 衍生物的眾多共聚物中，順丁烯二酸酐與乙烯的共聚物EMA(Monsanto)也可以考慮。這些 聚合物在水中溶解產生酸性溶液，經中和，優選中和至生理pH，以便產生佐劑溶液，能向其 中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。其它合適的佐劑包括，但不限于，RIBI佐 MMMi (Ribi Inc.), Block co-polymer (CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA)，單磷酰脂質AOiionophosphoryl lipid Α)，Avridine脂質-胺佐劑，大腸桿菌不耐熱腸 毒素(重組或其它)，霍亂毒素，IMS 1314或胞壁酰二肽，等等。優選地，佐劑添加量為約100 μ g-約IOmg/劑。還更優選地，佐劑添加量為約 100 μ g"約IOmg/劑。還更優選地，佐劑添加量為約500 μ g-約5mg/劑。還更優選地，佐劑 添加量為約750 μ g-約2. 5mg/劑。最優選地，佐劑添加量為約Img/劑。因此，根據另一方面，制備用于激發抗PCV2和豬肺炎支原體的免疫應答的抗原組 合物例如疫苗的方法包括i)將PCV2 0RF2蛋白與豬肺炎支原體菌苗以及合適的佐劑混 合。優選地，佐劑是卡波姆，更優選是卡波普971P。還更優選地，卡波普971P的添加量是約 500 μ g-約5mg/劑，更優選約750 μ g-約2. 5mg/劑，最優選約Img/劑。此外，疫苗組合物可包括一或多種可藥用載體。本文中，“可藥用載體"包括任 何和所有溶劑，分散介質，包衣，穩定劑，稀釋劑，保存劑，抗細菌和抗真菌劑，等滲劑，吸收 延遲劑，等等。所述致免疫組合物還可包含一或多種免疫調節劑，如白細胞介素，干擾素，或其它 細胞因子。所述致免疫組合物還可包含慶大霉素和硫柳汞。雖然用于本發明的佐劑和添 加劑的量和濃度可以由專業人員很容易地確定，但本發明涉及組合物，其含有約50μ g_約 2000μ g佐劑，優選約250μ g/ml劑疫苗組合物。在另一優選實施方案中，本發明涉及疫苗 組合物，其包含約lug/ml-約60 μ g/ml抗生素，更優選少于約30 μ g/ml抗生素。“PCV2抗原”是指含有至少一種抗原的任何組合物，所述抗原當對豬給藥時，可誘 導、刺激或增強抵抗PCV2感染的免疫應答。優選地，所述PCV2抗原是完整的PCV2病毒，優選為滅活形式，改良的PCV2活病毒或減毒的PCV2病毒，含有至少PCV2的免疫原性氨基酸 序列的嵌合病毒，任何其它含至少PCV2的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。術語"免疫 原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”在本文中是指，在宿主體內激發對 含有所述免疫原性蛋白、免疫原性多肽、或免疫原性氨基酸序列的病原體的免疫應答的任 何氨基酸序列。“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列”在本文中包括 任何蛋白的全長序列，其類似物，或其免疫原性片段。“免疫原性片段"是指蛋白的片段， 其包括一或多種表位，并因此激發抗相應病原體的免疫應答。這類片段可用任意多種表位 作圖技術來鑒定，所述技術是本領域眾所周知的。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed. ,1996)HumanaPress, Totowa, New Jersey。例如，可如下鑒定線性表位在固相支持物上同時合成大量肽，這些 肽對應于蛋白分子的各個部分，使仍附著在支持物上的這些肽與抗體反應。這樣的技術是 本領域已知的，見例如美國專利 4，708，871 ;Geysen et al. (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 3998-4002 ；Geysen et al. (1986)Molec. Immunol. 23 :709_715。同樣地，可以如下 很容易地鑒定構象表位通過例如X-線晶體成像和2-維核磁共振確定氨基酸的空間構象。 參見例如Epitope Mapping Protocols，出處同上。合成的抗原也可以包括在該定義中，例 如，多表位，側翼表位，以及其它重組或合成衍生的抗原。參見例如Bergmarm et al. (1993) Eur.J. Immunol. 23 :2777_2781 ；Bergmann et al. (1996)，J. Immunol. 157 :3242_3249 ； Suhrbier, A. (1997)，Immunol, and Cell Biol. 75402-408 ；Gardner et al.，(1998) 12th World AIDSConference, Geneva,Switzerland,June 28-July 3,1998。最優選地，可用于本發明的疫苗組合物包含PCV2 0RF2蛋白，優選表達在體外培養 的細胞中，并從所述細胞中回收獲得。PCV2 0RF2蛋白的優選例參見W02006-072065，其教 導和內容全部引入本文作參考。簡言之，本文中用于制備組合物以及還用于本文所述方法中的PCV20RF2 DNA和 蛋白是PCV2分離株中的高度保守結構域，并因此，任何PCV20RF2都可用作本文所述PCV2 0RF2 DNA和/或多肽的來源。優選的PCV20RF2蛋白是SEQ ID N0. 11。優選的PCV 0RF2 多肽是SEQ ID N0. 5，但本領域技術人員能理解，該序列可以有多達6-10%的序列同源性的 變動、但仍保留使其可用于致免疫組合物中的抗原性。經修飾的抗原與多核苷酸序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4編碼的PCV2 ORF 2蛋白相比，能賦予至少70%、優選80%、更優 選90%的保護性免疫力，就認為該經修飾的抗原仍保留了抗原性。“致免疫組合物”在本文 中是指，在宿主中激發“免疫應答”的PCV2 0RF2蛋白，所述應答是針對PCV2 0RF2蛋白的 細胞介導免疫應答和/或抗體介導免疫應答。優選地，該致免疫組合物能針對PCV2感染和 與其有關的臨床表現賦予保護性免疫力。在一些形式中，PCV2 0RF2蛋白的免疫原性部分 在組合物中用作抗原性成分。術語“免疫原性部分”在本文中分別是指，PCV2 0RF2蛋白和 /或多核苷酸的截短的和/或替代的形式，或片段。優選地，所述截短形式和/或替代形式， 或片段包含全長0RF2多肽的至少6個連續氨基酸。更優選地，所述截短形式和/或替代形 式，或片段具有全長0RF2多肽的至少10個，更優選至少15個，還更優選至少19個連續氨 基酸。這方面優選的兩種序列是本文的SEQ ID NOs. 9和10。還可理解，所述序列可以是更 大的片段或截短形式的一部分。本文另一優選的PCV2 0RF2多肽由SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4編碼。但本領域技術人員能理解，，該序列可以有多達6-20%的序列同源性的變動、但仍保留使其可用于致免疫組合物中的抗原性。在一些形式中，0RF2的截短形式或替換形 式，或片段被用作組合物中的抗原性成分。優選地，所述截短形式和/或替代形式，或片段 包含全長0RF2核苷酸序列(例如SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4)的至少18個連續核苷酸。 更優選地，所述截短形式和/或替代形式，或片段具有全長0RF2核苷酸序列(例如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4)的至少30個，更優選至少45個，更優選至少57個連續核苷酸。
“序列同一性”如本領域已知的那樣，是指兩個或更多個多肽序列或者兩個或更 多個多核苷酸序列，即參考序列和需要與該參考序列比較的給定序列之間的關系。序列 同一性如下確定根據給定序列與參考序列的鏈之間的配對情況，以產生最高水平序列 相似性為目的，將給定序列與參考序列進行最佳比對，然后比較這兩個序列。通過這種比 對，使一個位置比對一個位置，得到序列同一性，例如，在某一個位置的核苷酸或氨基酸殘 基相同時，序列在該位置是“同一的”。再將該位置同一性的個數除以參考序列的核苷酸 或殘基總數得到％序列同一性。序列同一性可以很容易地用已知方法計算，所述方法包 括但不限于，Computational Molecular Biology, Lesk, Α. N. , ed. , Oxford University Press, New York(1988), Biocomputing :Informatics andGenome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York(1993) ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey(1994)； Sequence Analysis in MolecularBiology, von Heinge, G. , Academic Press (1987)； Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J. ,eds. ,M.Stockton Press, New York(1991) ；andCarillo, H.，and Lipman, D.，SIAM J. Applied Math. ,48 1073(1988), 其教導引入本文作參考。優選的確定序列同一性的方法被設計成使所測試的序列最為匹 配。確定序列同一性的方法可在確定給定序列之間序列同一性的公共計算機程序中編輯。 這類程序包括，但不限于，GCG 程序包(Devereux，J.，etal.，Nucleic Acids Research, 12(1) 387(1984)), BLASTP，BLASTN and FASTA(Altschul，S. F. et al.，J. Molec. Biol.， 215:403-410(1990)。BLASTX 程序可從 NCBI 和其它來源獲得(BLAST Manual, Altschul, S. et al. ,NCVI NLM NIHBethesda, MD 20894，Altschul，S. F. et al. ,J. Molec. Biol. ,215 403-410(1990)，其教導引入本文做參考)。這些程序用缺省空隙權重實現對序列的最佳比 對，以便在給定序列和參考序列之間產生最高水平的序列同一性。例如，一個多核苷酸與 參考核苷酸序列具有至少例如85 %，優選90 %，更優選95 %的“序列同一性”是指，該給定 多核苷酸的核苷酸序列除了相對于參考核苷酸序列的每100個核苷酸而言可能包含多達 15個，優選多達10個，更優選多達5個點突變以外，與參考序列相同。換而言之，在具有與 參考核苷酸序列至少85%，優選90%，更優選95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，多 達15%，優選10%，更優選5%的核苷酸在參考序列中被缺失或被另一核苷酸取代，或者， 數量上占參考序列總核苷酸的多達15%，優選10%，更優選5%的核苷酸可被插入該參考 序列中。參考序列的這些突變可發生在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置，或這些末端 位置之間的任何位置，可以是單個地散在參考序列的眾多核苷酸之間，也可以是以一個或 多個連續序列的形式散在參考序列中。類似地，一個多肽與參考氨基酸序列具有至少例如 85%，優選90%，更優選95%的序列同一性是指，該多肽的給定氨基酸序列除了相對于參 考氨基酸序列的每100個氨基酸而言可能包含多達15個，優選多達10個，更優選多達5個 氨基酸改變以外，與參考序列相同。換而言之，為獲得與參考氨基酸 列有至少85%，優選90%，更優選95%同一性的給定多肽序列，參考序列中多達15%，優選多達10%，更優選多 達5%的氨基酸殘基被刪除或被另一氨基酸取代，或者，數量上占參考序列氨基酸總數的多 達15 %，優選多達10 %，更優選多達5 %的氨基酸可被插入該參考序列中。參考序列的這些 改變可發生在參考氨基酸序列的氨基端位置或羧基端位置，或這些末端位置之間的任何位 置，可以是單個地散在參考序列的眾多殘基之間，也可以是以一個或多個連續序列的形式 散在參考序列中。優選地，不相同的殘基位置因保守氨基酸取代而有別。但是，在確定序列 同一性時，保守取代不算是匹配。“序列同源性”在本文中是指，確定兩序列之間相關程度的方法。為確定序列同源 性，將兩個或多個序列最佳比對，需要時引入空隙。但與“序列同一性”不同，在確定序列同 源性時，保守氨基酸取代都算做匹配。換而言之，為獲得與參考氨基酸序列有95%序列同源 性的多肽或多核苷酸，參考序列中85 %，優選90 %，更優選95 %的氨基酸殘基或核苷酸必 需匹配，或者包含被另一氨基酸或核苷酸保守取代的情況，或者，數量上占參考序列氨基酸 殘基或核苷酸總數的多達15 %，優選多達10 %，更優選多達5 %的氨基酸或核苷酸(不包括 保守取代)可被插入該參考序列中。優選同源序列包含至少50個，更優選100個，更優選 250個，更優選500個核苷酸的序列。“保守取代”是指，將氨基酸殘基或核苷酸用另外的具有相似特性(包括大小、疏水 性等)的氨基酸殘基或核苷酸替換，使得總體功能不發生顯著改變。“分離的，，是指“經人工手段，，從其天然狀態分離，即如果它出現在自然界，則相對 于它原來的環境發生改變，或脫離原環境，或兩者。例如，在活體生物中天然存在的多核苷 酸或多肽不是“分離的”，但相同的多核苷酸或多肽與其天然狀態下共存的物質分開就是 “分離的，，，本文采用的就是這樣的術語。優選地，所述PCV20RF2蛋白是i)含有 SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO 11的多肽；ii)任何與多肽i)至少80%同源的多肽，iii)多肽i)和/或ii)的任何免疫原性部分，iv)iii)的免疫原性部分，包含序列 SEQ ID N0:5，SEQ ID NO 6, SEQID N0:9，SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11中的至少10個連續氨基酸，ν)由包含SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的DNA編碼的多肽。vi)由與多核苷酸ν)至少80%同源的多核苷酸編碼的任何多肽，vii)多核苷酸ν)和/或vi)編碼的多肽的任何免疫原性部分，viii) vii)的免疫原性部分，其中編碼所述免疫原性部分的多核苷酸包含序列SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4中的至少30個連續氨基酸。優選任一種所述免疫原性部分具有由序列SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4編碼的 PCV2 0RF2蛋白的免疫原性特征。如上所說，組合物中PCV2 0RF2部分的相對效力(RP)為至少1. 38，更優選為約 1. 38-4. 5，還更優選為約1. 38-3. 5，更優選為約1. 38_3，最優選為約1. 38-2. 75。與確定豬 肺炎支原體的RP值為至少1. 22相似，PCV2的RP值大于約1. 38是指，小鼠用RP值1. 38 的PCV2抗原量的二十分之一量處理，在處理后或給予PCV2抗原后的21天內或第21天時，用PCV2-特異性抗體檢測試驗測得，85%的小鼠產生可檢測的量的抗PCV2抗體。優選地， PCV2的RP值大于約1. 38是指，小鼠用RP值1. 38的PCV2抗原量的十分之一量處理，在處 理后或給予PCV2抗原后的21天內或第21天時，用PCV2-特異性抗體檢測試驗測得，95%、 優選100%的小鼠產生可檢測的量的抗PCV2抗體。本發明中致免疫組合物所用的PCV2 0RF2蛋白可以用任何方式來衍生，包括分離 和純化PCV2 0RF2，標準的蛋白合成，以及重組方法學。優選的獲得PCV2 0RF2多肽的方法 還可參見WO 2006-072065，其對應于美國專利申請系列號11/034，797，其教導和內容引入
本文作參考。根據另一實施方案，所述PCV2 抗原是 Ingelvac CircoFLEX，(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, USA) ,CircoVac (Merial SAS, Iyon, France), Circo Vent(Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA), Suvaxyn PCV-2 One Dose (Fort Dodge Animal Health, Kansas City，KA，USA)，或上述任一種疫苗中包含的任一種 PCV2 抗原。最優選地，所述PCV2抗原是包括在Ingelvac CircoFLEX中的PCV2抗原，或者是 Ingelvac CircoFLEX。“豬肺炎支原體抗原”是指，包含至少一種在對豬給藥后能誘導、刺激或增強抗豬 肺炎支原體感染的免疫應答的抗原的任何組合物。優選地，所述豬肺炎支原體抗原是豬肺 炎支原體全細胞菌苗，優選滅活形式、改良的活的形式或減毒形式的豬肺炎支原體細菌， 含有至少豬肺炎支原體的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少豬肺炎支原體 的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。優選豬肺炎支原體抗原是滅活的豬肺炎支原體菌 苗。更優選豬肺炎支原體抗原衍生自豬肺炎支原體J菌株。最優選豬肺炎支原體菌苗是包 ^Ingelvac MycoFlex ￡|Ε (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, M0, USA)中的豬肺炎支原體滅活菌苗，或者就是Ingelvac MycoFlex。然而，可用于本發明的 豬肺炎支原體抗原還可選自包括在以下疫苗組合物中的任一種抗原=Porcilis豬肺炎支 原體，Myco Silencer BPM, Myco Silencer BPME，Myco Silencer ME, Myco Silencer Μ, Myco Silencer Once, Myco Silencer MEH(all of Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA)Stellamune Mycoplasma(Pfizer Inc. , New York, NY, USA), SuvaxynMycoplasma, Suvaxyn M. hyo, Suvaxyn MH-One (都來自 Fort Dodge AnimalHealth, Overland Park, KS, USA (Wyeth)。注射時間表是彈性的。本文所述組合物可以在早至3周齡時，直至豬為了接種的 目的提前至少2周暴露于豬肺炎支原體時，投入使用。本發明的組合物可以以任何常規方 式來應用，所述方式包括皮內、氣管內、或陰道內。組合物優選肌肉內或鼻內應用。在動物 機體中，將上述藥物組合物經靜脈注射或直接注射到靶組織中是有利的。全身應用時，優 選靜脈、脈管內(intravascular)、肌肉內、鼻內、動脈內(intra-arterial)、腹腔、口服、 或鞘內(intrathecal)途徑。更為局部的應用可以通過皮下、真皮內(intradermalIy)、
內(intracutaneously) > 內(intracardially) > Bf 內(intralobally) > H 內 (intramedullarly)、肺內(intrapulmonarily)，或者，直接進入或接近需要治療的組織 (結締組織、骨組織、肌肉組織、神經組織、上皮組織)。根據治療所希望達到的持續時間和 效果，本發明的組合物可以給藥一次或數次，還可以間歇給藥，例如以每天給藥的頻率給藥 數日、數周或數月，以及給藥不同劑次(dosages)。但是，如本文詳述，豬肺炎支原體菌苗和PCV2 ORF 2的組合提供了一種致免疫組合物，其僅在一劑給藥后，就在接受該組合物的豬 體內，針對豬肺炎支原體和/或PCV2感染，產生了有效免疫力和/或減弱了與感染有關的 臨床表現的嚴重性或減少了所述癥狀的發生率。“下降”或“減少臨床、病理學和/或組織學癥狀的發生率或減弱其嚴重性”應該是 指，接受疫苗的動物和未接受疫苗或致免疫組合物的“對照”動物，都感染了衍生出疫苗中 免疫活性成分的病原體或被所述病原體攻擊后，在接受疫苗的動物中，所述任一種癥狀的 發生率或嚴重性減小。在此上下文中，術語“下降”或“減少”是指疫苗組與上述對照組相 比，減少至少10%，優選25%，更優選50%，最優選100%。“臨床表現(Clinical signs) ”應指，能直接從活體動物觀察到的病原體感染的 表現，如癥狀(symptoms)。代表性實例取決于所選的病原體，但可包括諸如流鼻涕(nasal discharge)，嗜睡(lethargy)，咳嗽，高熱(elevated fever)，增重或減重，脫水，腹瀉，腫脹 (swelling)，跛行(lameness)等等。PCV2臨床表現可包括消瘦，皮膚蒼白，贏弱，呼吸困難， 腹瀉，和黃疸。豬肺炎支原體感染的臨床表現包括，干咳，性能下降，以及肺損傷。“病理學”表現應指能在顯微鏡下觀察到、或通過生化測試在分子水平觀察到、或 用肉眼在尸檢時觀察到的感染的表現。PCV2的病理學表現包括多組織和器官的顯微鏡檢損 傷和肉眼可見的損傷，以淋巴器官為最常見的損傷部位。“組織病理學”表現應指感染所致組織改變的表現。在本發明另一實施方案中，豬肺炎支原體抗原，優選豬肺炎支原體菌苗，與來自另 一種引起豬疾病的生物的抗原組合。在這樣的情況下，豬肺炎支原體成分的RP值如上述。 在本發明另一實施方案中，PCV2抗原與來自另一種引起豬疾病的生物的抗原組合。在這樣 的情況下，PCV2成分的RP值如上述。此外，在本發明另一實施方案中，PCV2抗原和豬肺炎 支原體抗原，優選豬肺炎支原體菌苗，與來自另一種引起豬疾病的生物的抗原組合。在這樣 的情況下，豬肺炎支原體成分和PCV2成分的RP值如上述。優選另一種引起豬疾病的生物選自胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacilluspleuropneumonia) (1)；腺病毒(2) ；Alpha 病毒如東部馬腦炎病 _ (Easternequine encephalomyelitis viruses) (3) ； H iW 雙 個生 ff # K (Bordetellabronchiseptica) (4)；短電累旋體(Brachyspira spp. ) (5),優選豬病疾 短螺旋體(B. hyodyentheriae) (6)；大腸柔毛短螺旋體(B. piosicoli) (7)，豬布氏 桿菌病(Brucella suis),優選牛型變種(biovars) 1，2，和3型(8)；典型豬瘟病毒 (Classical swine fever virus) (9)；梭狀芽抱桿菌(Clostridium spp.) (10)，優選 艱難梭菌(Cl. Difficile) (11)，產氣莢膜梭菌(Cl. Perfringens)A, B，和 C 型(12)， 諾維氏梭菌(Cl. Novyi) (13)，糜爛梭菌(Cl. Septicum) (14)，破傷風梭菌(Cl. tetani) (15)；冠狀病毒(Coronavirus) (16)，優選豬呼吸道冠狀病毒(PorcineRespiratory Corona virus) (17)；豬附紅細胞體(Eperythrozoonosis suis) (18)；豬紅斑丹毒絲 菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(19)大腸埃希氏菌(Escherichia coli) (20)； 附豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)，優選1，7和14亞型(21)豬血凝性腦脊髓炎 病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus) (22)；日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus) (23)；胞內勞森菌(Lawsonia intracellularis) (24)鉤端螺旋 體(Leptospira spp.) (25)，優選澳洲型鉤端螺旋體(Leptospira australis) (26)；
16犬型鉤端螺旋體(L印tospiracanicola) (27)；流感傷寒型鈞端螺旋體(Leptospira grippotyphosa) (28) ； Hj ifil Jt ^ 螺旋{φ (Leptospira icterohaemorrhagicae) (29)；以及問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans) (30)；波蒙那鉤端螺旋體 (Leptospira Pomona) (31) ； ii ^ ^ il 旋 W (Leptospira tarassovi) (32)；免 枝桿菌(Mycobacterium spp.) (33)優選鳥分枝桿菌(M. avium) (34)，胞內分枝桿菌 (M. intracellulare) (35)以及牛分枝桿菌(M. bovis) (36)；多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) (37)；豬巨細胞病毒(Porcine cytomegalovirus) (38)；豬微小病毒(Porcine Parvovirus) (39)；豬生殖呼吸綜合征(PRRS)病毒(40)偽狂犬病毒(Pseudorabies virus) (41)；輪狀病毒(Rotavirus) (42)；沙門氏菌(Salmonella spp.) (43)，優選鼠傷寒沙門氏 菌(S. thyphimurium) (44)和豬霍亂沙門氏菌(S. choleraesuis) (45)；豬葡萄球菌(Staph. Hyicus) (46)；葡萄球菌(Staphylococcus spp. ) (47)優選鏈球菌(Streptococcus spp.) (48)，優選豬鏈球菌(Strep. Suis) (49)；豬皰疹病毒(50)；豬流感病毒(51)；豬痘病毒 (52)；豬痘病毒(53)；水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus) (54)；豬的水皰疹 (vesicular exanthema)病毒(55)；哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira Hardjο) (56)；豬圓環 病毒(57)；禾口 / 或豬滑液支原體(Mycoplasma hyosynoviae) (58)。下文中關于豬病原體的任何引述可通過命名該病原體，例如多殺巴斯德氏菌，或 通過引述上文所示該病原體之后的括號0中的數字編號來進行。例如，多殺巴斯德氏菌可 以表述為多殺巴斯德氏菌或表述為(37)。因此，本發明涉及對豬進行治療和/或預防的組合疫苗，其包括有效減少豬肺炎 支原體和/或PCV2感染的發生率或減輕其嚴重性的免疫因子，以及有效治療和/或預防 由(1)，(2)，(3)，(4)，(5)，(6)，(7)，(8)，(9)，(10)，(11)，(12)，(13)，(14)，(15)，(16)， (17)， (18)， (19)， (20)， (21)， (22)， (23)， (24)， (25)， (26)， (27)， (28)， (29)， (30)， (31)， (32)， (33)， (34)， (35)， (36)， (37)， (38)， (39)， (40)， (41)， (42)， (43)， (44)， (45)， (46)， (47)，(48)，(49)，(50)，(51)，(52)，(53)，(54)，(55)，(56)，(57)和 / 或(58)中任何豬病 原體引起的感染的免疫活性成分，或者是所述豬病原體的免疫活性成分。“免疫活性成分”在本文中是指，在施用該成分的動物體內誘導或刺激免疫應答的 成分。根據優選實施方案，所述免疫應答針對該成分或針對含有該成分的微生物。根據另 一優選實施方案，所述免疫活性成分是減毒的微生物，包括改良的活病毒(MLV)，滅活的微 生物或至少微生物的免疫活性部分。“微生物的免疫活性部分”在本文中是指微生物中含有蛋白、糖(sugar)和或糖蛋 白的級分，其包含至少一種抗原，該抗原在施用該抗原的動物體內誘導或刺激免疫應答。根 據優選實施方案，所述免疫應答針對微生物的所述免疫活性部分，或針對含有該免疫活性 部分的微生物。根據另一方面，組合疫苗中的另一種免疫活性成分選自Enterisol Ileitis， Enterisol Ileitis FF, Enterisol SC-54，Enterisol SC-54FF，Enterisol ERY-ALC， Ingelvac APP ALC，Ingelvac AR4, Ingelvac HP-I，Ingelvac HPE-I，Ingelvac PRRS MLV, Ingelvac PRRS ATP, Ingelvac PRV-Gl，Reprocyc PRRS PLE，Reprocyc
PLE, Tetguard , Toxivac AD+E, Toxivac Plus Parasuis,(者β * 自 Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, USA) ；Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY+PARV0,Porcilis Ery,PorcilisGlasser,Porcilis Parvo,Porcilis Porcoli DF,Porcilis APP, Porcilis AR-T,PorcilisAR-T DF,Porcilis Porcoli,Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, PorcilisPorcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I. D. A. L. , Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Rhinogen BPE，Rhinogen CTE 5000，Rhinogen CTSE，Score, Sow Bac E II，Sow Bac CEII，Sow Bac TREC，ProSystem CE，ProSystem RCE，ProSystem TREC, ProSystem Pillmune，ProSystem R0tamune 帶Imugan II，ProSystem Rota, ProSystem Rotamune KV. ProSystem TG- Emune Rota 帶 Imugan II， ProSystem TGE/Rota，ProSystem TG- Emune 帶 Imugen , ProSystem TGE， MaGESTIC 7，MaGESTIC 8，MaGESTic 帶Spur ,MaGESTic 7 帶Spur , MaGESTic 8 帶 Spur , End- FLUence 帶 Imugen II，End- FLUence 2，PRRomiSE , PRV-Begonia 帶 Dlluvac Forte ,Argus SC/ST，Str印 Bac, Str印 Bac 帶Imugen II， CoIisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo 者β 來自 Intervet Inc. , Millsboro, DE, USA) ；Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraf lu, Akipor 6. 3, Jespur gl-, Jesflu gl_ (都來自 Merial LTD, Duluth, GA) ；ER BAC PLUS，ERBAC , ERBAC PLUS/LEPTOFERM- 5 ，ER BAC Liiptoferm- 5 , Farrowsure , Farrowsure B，FARROWSURE PLUS B, FARROWSURE PLUS, FARROWSURE PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE , FLUSURE RTU, FLUSURE /ER BAC PLUS, FLUSURE/ER BAC PLus , FLUSURE / RESPISURE , FLUSURE / RESPISURE RTU, FLUSURE /RESPISURE- ONE /ER BAC PLUS, FLUSURE/RespiSure 1 ONE /ER BAC Plus , FLUSURE /RESPISURE ONE , FLUSURE/ RESPISURE 1 ONE , FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD LT-C，LITTERGUARD LT, Pleuro Guard 4，Pneumosuis III， Stellamune One, Stellamune Uno, StellamuneOnce, Stellamune Mono, Respisure One, Respisure , Respisure 1 ONE , Respisure 1 One /ER Bac Plus , Enduracell T, Zylexis (formerly known asBaypamune), Atrobac 3, BratiVac , BratiVac ~B, Leptoferm-5. . Parvo- Vac /Leptoferm- 5 , PR- Vac "Killed, PR- Vac , PR-Vac Plus.(都來自 Pfizer Inc. ,New York, NY, USA) ； Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend MH, Suvaxyn Aujeszky Bartha+Diluent, SuvaxynAujeszky Bartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783+o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, M. hyo Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend APP，Suvaxyn RespiFend HPS, Suvaxyn RespiFend MH/HPS，Suvaxyn RespiFend MH，Suvaxyn AR/T/E, Suvaxyn EC-4, Suvaxyn E, Suvaxyn -E, Suvaxyn Ε-oral，Suvaxyn PLE, Suvaxyn PLE/ PrV gpl-，Suvaxyn LE+B, Suvaxyn PLE+B, Suvaxyn PLE+B/PrVgpl-, Suvaxyn SIV, Suvaxyn SIV/Mh-one, Suvaxyn p, Suvaxyn PrV gpl-, Suvaxyn PCV-2 One Shot(都來自 Fort Dodge Animal Health, Overland Park, KS, USA (Wyeth)； SCOURMUNE , SCOURMUNE -C, SCOURMUNE _CR，AR- PAC -PD+ER，AR- PARAPAC +ER，M+ Rhusigen , M+ PAC , MaxiVac Excell 3，MaxiVac HlNl， MaxiVac H3N2，MaxiVac —FLU，MaxiVac _M+, MaxiVac Excell , MaxiVac Excell 3，PARAPAC , PNEU PAC , PNEU PAC _ER，PNEU PAC +ER，PRV/Marker Gold , PRV/Marker Gold , PRV/Marker Gold -MaxiVac FLU, Rhusigen , Gletvax 6， Covexin 8, M+PAC, Gletvax plus, M-Parapac. . SS PAC (者β * 自 Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA) ；AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL，COLISUIN-TP，ERYSIPRAVAC，GRIP0RK, HIPRASUIS- GLAS SER, MYPRAVAC SUIS，NEUMOSUIN,PARVOSUIN,PARVOSUIN-MR,PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS(都來自 Laboratorios Hipra S. A.， Amer, Girona, Spain) ；Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART+EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M.hyo 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35(都 來 自 IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany) ；Mypravac Suis, (Albrecht GmbH, Germany) ；Haemo Shield P· Parapleuro Shield P· Parapleuro Shield P+BE, Rhinicell FD, Rhini Shield TX4, Prefarrow Shield 9, Prefarrow Strep Shield , Clostratox BCD，Clostratox C，Clostratox Ultra C 1300，Porcine Ecolizer 3+C， Porcine Pili Shield. +C, Porcine Pili Shield Porcine Ecolizer 3, Ery Serum.. Ery Shield. . Ery VacOral, Ery Shield +L5, PanSTAR Ery, Erycel 1. . Parvo Shield E, Parvo Shield L5E，Parvo Shield L5, Parvo Shield , Para Shield ，PneumoSTARSIV， PneumoSTAR Myco, Lepto Shield 5,Myco Shield. . SalmoShield 2, SalmoShield Live, Amitox Tet. . C. Perfringens Type A Toxoid(都來自 Novartis Animal Health, Basel, Switzerland) ；Nitro-Sal (Akro)；或包括在上述組合物中的任何抗原。優選實施方案詳述以下實施例描述了恩發明優選的材料和方法。但應理解，這些實施例僅為舉例，不 應將它們視為對本發明總體范圍的限制。實施例1本項研究設計是為了評價，PCV2-豬肺炎支原體在全劑量和2x1/2劑量時，在組合 產物有兩種不同含量的豬肺炎支原體時的組合效力，而且也是為了證實組合產物與單價豬 肺炎支原體相比的任何干擾。材料和方法將豬分為6組。所有攻擊組(組1-5)每組有大約19只豬。對照組含有未給予治 療也未受攻擊的豬(組6)，該組有5只豬。所有豬在本研究的第61天尸檢。研究時間表見 表1。表 權利要求
在豬體內激發抗豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，M.hyo)的保護性免疫應答的致免疫組合物，所述致免疫組合物包含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原體的抗原，其中每一劑中豬肺炎支原體抗原的量具有至少1.22的相對效力(RP)值，其中豬肺炎支原體的RP值為1.22是指，小鼠被給予了四十分之一(1/40)的所述量的豬肺炎支原體抗原后，95％的小鼠，優選100％的小鼠，在處理后的21天內或第21天之時，在豬肺炎支原體特異性抗體檢測試驗中測得，產生了可檢測的量的抗體。
2.權利要求1的致免疫組合物，每一劑中2型豬圓環病毒的抗原的量具有至少1.38的 相對效力(RP)值，其中2型豬圓環病毒的抗原的RP值為1.38是指，小鼠被給予了十分之 一 (1/10)的所述量的2型豬圓環病毒抗原后，95%的小鼠，優選100%的小鼠，在處理后的 21天內，在2型豬圓環病毒特異性抗體檢測試驗中測得，產生了可檢測的量的抗體。
3.權利要求1或2的致免疫組合物，還包含佐劑。
4.權利要求3的致免疫組合物，所述佐劑為卡波姆(carbomer)。
5.權利要求4的致免疫組合物，所述卡波姆是卡波普(Carbopol)。
6.權利要求1-5之一的致免疫組合物，所述致免疫組合物以單劑對豬給藥時，激發抗 豬肺炎支原體的保護性免疫應答。
7.權利要求2-5之一的致免疫組合物，所述致免疫組合物以單劑對豬給藥時，激發抗 豬肺炎支原體和2型豬圓環病毒的保護性免疫應答。
8.權利要求1-7之一的致免疫組合物，所述致免疫組合物對豬給藥時，激發了持續至 少130天的抗豬肺炎支原體和/或2型豬圓環病毒的免疫力。
9.權利要求8的致免疫組合物，所述致免疫組合物對豬給藥時，激發了持續至少150天 的抗豬肺炎支原體和/或2型豬圓環病毒的免疫力。
10.權利要求8的致免疫組合物，所述致免疫組合物對豬給藥時，激發了持續至少184 天的抗豬肺炎支原體和/或2型豬圓環病毒的免疫力。
11.權利要求1-10之一的致免疫組合物，其中所述特異性抗體檢測試驗是ELISA。
12.權利要求1-11之一的致免疫組合物，其中用于檢測豬肺炎支原體特異性抗體的特 異性抗體檢測試驗是IDEXX Herdchek豬肺炎支原體測試試劑盒。
13.權利要求2-12之一的致免疫組合物，其中用于檢測2型豬圓環病毒特異性抗體的 特異性抗體檢測試驗是，用于檢測豬圓環病毒(PCV)抗體的基于2型PCV且基于重組衣殼 蛋白(0RF2)的改良、間接 ELISA，例如 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 33-40(2002)所述。
14.在豬體內激發抗豬肺炎支原體的保護性免疫應答的方法，包括對所述豬給予致免 疫組合物，該組合物包含2型豬圓環病毒的抗原和豬肺炎支原體的抗原，其中每一劑中豬 肺炎支原體抗原的量具有至少1. 22的相對效力(RP)值，其中豬肺炎支原體的RP值為1. 22 是指，小鼠被給予了四十分之一(1/40)的所述量的豬肺炎支原體抗原后，95%的小鼠，優 選100%的小鼠，在處理后的21天內或第21天之時，在豬肺炎支原體特異性抗體檢測試驗 中測得，產生了可檢測的量的抗體。
15.權利要求14的方法，其中每一劑中2型豬圓環病毒的抗原的量具有至少1.38的相 對效力(RP)值，其中2型豬圓環病毒的抗原的RP值為1.38是指，小鼠被給予了十分之一 (1/10)的所述量的2型豬圓環病毒抗原后，95%的小鼠，優選100%的小鼠，在處理后的21 天內，在2型豬圓環病毒特異性抗體檢測試驗中測得，產生了可檢測的量的抗體。
16.權利要求14或15的方法，其中所述組合物還包含佐劑。
17.權利要求16的方法，所述佐劑是卡波姆。
18.權利要求17的方法，所述卡波姆是卡波普。
19.權利要求14-18之一的方法，所述致免疫組合物以單劑對豬給藥時，激發抗豬肺炎 支原體的保護性免疫應答。
20.權利要求14-18之一的方法，所述致免疫組合物以單劑對豬給藥時，激發抗豬肺炎 支原體和2型豬圓環病毒的保護性免疫應答。
21.權利要求14-20之一的方法，所述致免疫組合物對豬給藥時，激發了持續至少130 天的抗豬肺炎支原體和/或2型豬圓環病毒的免疫力。
22.權利要求21的方法，所述致免疫組合物對豬給藥時，激發了持續至少150天的抗豬 肺炎支原體和/或2型豬圓環病毒的免疫力。
23.權利要求21的方法，所述致免疫組合物對豬給藥時，激發了持續至少184天的抗豬 肺炎支原體和/或2型豬圓環病毒的免疫力。
24.權利要求14-23之一的方法，其中所述特異性抗體檢測試驗是ELISA。
25.權利要求14-24之一的方法，其中用的特異性抗體檢測試驗是IDEXXHerdchek豬 肺炎支原體測試試劑盒。
26.權利要求15-25之一的方法，其中用于檢測2型豬圓環病毒特異性抗體的特異性 抗體檢測試驗是，用于檢測豬圓環病毒(PCV)抗體的基于2型PCV且基于重組衣殼蛋白 (0RF2)的改良、間接 ELISA，例如 Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9 33-40(2002)所述。
全文摘要
本發明提供了多價組合疫苗，其包括有效減少豬肺炎支原體感染發生率或減輕豬肺炎支原體感染的嚴重性的免疫因子(優選豬肺炎支原體菌苗)，或含有豬肺炎支原體菌苗的致免疫組合物，以及至少一種引起豬的其它疾病的致免疫活性成分(優選PCV2)，其中用于所述多價疫苗的優選的PCV2抗原是PCV2 ORF 2蛋白。
文檔編號A61K39/02GK101980720SQ200980110512
公開日2011年2月23日 申請日期2009年1月23日 優先權日2008年1月23日
發明者邁克爾·魯夫, 馬克·艾克梅耶 申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司