血管發生抑制的制作方法

專利名稱：血管發生抑制的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于抑制血管發生或治療病理性新血管形成如哮喘、關節炎、癌癥和 黃斑變性的組合物和方法。
背景技術：
病理性新血管形成是如濕性年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病增殖性視網膜病 變、類風濕性關節炎、骨關節炎和哮喘的疾病的關鍵成分。其還在腫瘤的生長和擴散中起重 要作用。新血管形成由促血管發生因子和抗血管發生因子的精巧平衡調節。已知血管內皮生長因子(VEGF)是新血管形成必需的。已顯示通過VEGF拮抗劑抑 制或降低VEGF活性在AMD，關節炎動物模型和多種腫瘤模型中抑制新血管形成。抑制或降 低VEGF活性的VEGF拮抗劑包含但不限于VEGF抗體、可溶性受體、受體融合蛋白質、肽和小 分子。已顯示VEGF-Rl(Flt-l)和VEGF-R2 (KDR)蛋白質以高親和力結合VEGF。Flt_l和 KDR在其胞外區都具有7個Ig-樣結構域。已顯示結構域2是VEGF結合必需的。全長、可溶 性受體(結構域1-7)和結構域1-3各自與IgG Fc的融合蛋白可有效地結合VEGF。然而， Fc與Ig-樣結構域2單獨融合不能結合VEGF，Ig-樣結構域1和2也如此。Davis-Smyth， 1996。因此，Ig-樣結構域1和3似乎需要與結構域2 —起進行有效的VEGF結合。發明概述本發明的一個實施方案提供融合蛋白質。該融合蛋白質具有式X-Y-Z。X包含選 自胞外受體、抗體可變區、細胞因子、趨化因子和生長因子的多肽。Y基本上由5-25個氨基 酸殘基的多肽組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區。本發明的另一個實施方案是式X-Y-Z的多肽。X包含選自胞外受體、抗體可變區、 細胞因子、趨化因子和生長因子的多肽。Y基本上由提供5-25個氨基酸殘基的空間間隔 (seperation)的接頭部分組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區。本發明的另一個方面是式X-Y-Z的融合蛋白質。X包含選自胞外受體、抗體可變 區、細胞因子、趨化因子和生長因子的多肽。Y基本上由5-25個氨基酸殘基的多肽組成。Z 是抗體分子的Fc部分。還提供式X-Y-Z的融合蛋白質。X包含選自胞外受體、抗體可變區、細胞因子、趨化 因子和生長因子的多肽。Y基本上由提供5-25個氨基酸殘基的空間間隔的接頭部分組成。 Z是抗體分子的Fc部分。本發明的另一個方面是多聚化多肽X的方法。通過多肽Y將多肽X連接至多肽Z 形成多肽XYZ。X包含選自胞外受體、抗體可變區、細胞因子、趨化因子和生長因子的多肽。 Y基本上由5-25個氨基酸殘基的多肽組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區。形成的多肽XYZ
多聚化。本發明的另一個實施方案提供多聚化多肽X的方法。通過Y部分將多肽X連接至 多肽z形成聚合物XYZ。X包含選自胞外受體、抗體可變區、細胞因子、趨化因子和生長因子的多肽。Y基本上由提供5-25個氨基酸殘基的空間間隔的接頭部分組成。Z是IgG重鏈分子的CH3區。這樣形成的多肽XYZ多聚化。在本發明的一個實施方案中提供核酸分子。該核酸分子編碼包含VEGF-Rl (Flt-I) 的Ig-樣結構域2、接頭和多聚化結構域的融合蛋白質。該融合蛋白質包含選自SEQ ID NO 2、8、21、23和25的序列。在本發明的另一個實施方案中提供融合蛋白質。該融合蛋白質包含 VEGF-Rl(Flt-I)的Ig-樣結構域2、接頭和多聚化結構域。該融合蛋白質包含選自SEQ ID NO :2、8、21、23 和 25 的序列。在本發明的另一個實施方案中提供體外方法。將核酸分子遞送至分離的哺乳動物 細胞。該核酸分子編碼包含VEGF-Rl (Flt-I)的Ig-樣結構域2、接頭和多聚化結構域的融 合蛋白質。該融合蛋白質包含選自SEQ IDN0:2、8、21、23和25的序列。該融合蛋白質的表 達由啟動子控制。形成表達融合蛋白質的細胞。本發明的另一個實施方案是遞送融合蛋白質至哺乳動物的方法。將表達該融合蛋 白質的哺乳動物細胞遞送至哺乳動物。細胞表達和分泌該融合蛋白質，從而向哺乳動物供 給該融合蛋白質。該融合蛋白質包含VEGF-Rl (Flt-I)的Ig-樣結構域2、接頭和多聚化結 構域。該融合蛋白質包含選自SEQ ID N0:2、8、21、23和25的序列。本發明的另一個方面是向哺乳動物供給融合蛋白質的方法。將包含 VEGF-Rl (Flt-I)的Ig-樣結構域2、接頭和多聚化結構域的融合蛋白質遞送至哺乳動物。該 融合蛋白質包含選自SEQ ID N0:2、8、21、23和25的序列。備選地，可以將編碼所述融合蛋 白質的核酸構建體遞送至哺乳動物，從而由該哺乳動物表達該融合蛋白質。本發明的另一個方面是用VEGF拮抗劑治療哺乳動物眼部疾病的改進方法，所述 拮抗劑包含但不限于本發明的融合蛋白質。該改進包含提供對治療眼部疾病有效的VEGF 拮抗劑的降低的量。可以通過蛋白質或基因治療或其組合施用VEGF拮抗劑。降低的量可 以在哺乳動物中保持至少6個月，例如至少9個月或至少1年。在本發明的一些實施方案中，降低的量可以是約100pg/ml至約100 μ g/ml、Ing/ ml 至約 95 μ g/ml、10ng/ml 至約 85 μ g/ml、100ng/ml 至約 75 μ g/ml、約 100ng/ml 至約 50 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 25 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 15 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 10 μ g/ml 或約 1 μ g/ml 至約 4 μ g/ml。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括對哺乳動物施 用編碼VEGF拮抗劑的核酸。在一些實施方案中，按約100pg/ml至約100 μ g/ml、約lng/ml 至約 95 μ g/ml、約 10ng/ml 至約 85 μ g/ml、約 lOOng/ml 至約 75 μ g/ml、約 100ng/ml 至約 50 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 25 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 15 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 10 μ g/ml 或約1 μ g/ml至約4 μ g/ml的治療有效量表達VEGF拮抗劑，以治療眼部疾病。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括按每單位劑量 約2xl06至約2X1012drp的治療有效量對哺乳動物施用編碼VEGF拮抗劑的病毒載體。在一些實施方案中，治療有效量是每單位劑量約2xl07至約2110"(1印、約2xl08至 約 2xl01Qdrp。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括按每單位劑量 約0. Img至約50mg(優選約0. Img至約5mg,例如約0. Img至約lmg、約0. Img至約0. 5mg和約0. lmg至約0. 25mg)的治療有效量對哺乳動物施用可溶性VEGF受體或變體。可溶性 VEGF受體或其變體包含但不限于本發明的融合蛋白質。在一些實施方案中，可溶性VEGF受體是FLT1D29GLYFC(SEQ IDN0. 1或2)或 D2-9GLY-CH3(SEQ ID NO. 22 或 23)。在一些實施方案中，可溶性VEGF受體的治療有效量是約0. lmg至約25mg、約 0. lmg至約10mg、約0. 5mg至約5mg或約0. 5mg至約2. 5mg。可以反復施用可溶性VEGF受 體或其變體。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括對哺乳動物的 患病眼施用編碼本發明的融合蛋白質的VEGF拮抗劑的核酸以治療眼部疾病，其中VEGF拮 抗劑按約lOOng/ml至約75ii g/ml的治療有效量表達。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括遞送編碼式 X-Y-Z的VEGF拮抗劑的核酸至哺乳動物的患病眼，其中VEGF拮抗劑按約lOOng/ml至約 75ug/ml的治療有效量在患病眼的變移上皮細胞中表達。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括通過玻璃體內 (intravitreal)注射(例如中央玻璃體注射)遞送編碼式X-Y-Z的VEGF拮抗劑的核酸至 哺乳動物的患病眼，其中VEGF拮抗劑按約lOOng/ml至約75 y g/ml的治療有效量表達。在一些實施方案中，VEGF拮抗劑按約100pg/ml至約100 y g/ml、lng/ml至約 95 u g/ml、10ng/ml 至約 85 u g/ml、100ng/ml 至約 50 u g/ml、約 1 u g/ml 至約 25 u g/ml、約 1 U g/ml至約15 u g/ml、約1 ii g/ml至約10 u g/ml或約1 ii g/ml至約4 u g/ml的治療有效 量表達。在一個實施方案中，編碼VEGF拮抗劑的核酸是病毒載體。在另一個實施方案中， 病毒載體是AAV，例如AAV2。在一個實施方案中，VEGF拮抗劑在哺乳動物中表達至少6個月，例如至少9個月 或1年。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括按每單位劑量 約2xl06至約2xl012drp的治療有效量對哺乳動物的患病眼施用式X-Y-Z的VEGF拮抗劑。在一些實施方案中，治療有效量是每單位劑量約2xl07至約ZxlO^drp或約2xl08 至約 2xl010drpo在一些實施方案中，施用第二 VEGF拮抗劑。第二 VEGF拮抗劑可以是融合多肽，其 包含融合至IgG重鏈分子的VEGF受體，優選融合至IgG的Fc或CH3的VEGF-R1，更優選融 合至Fc或CH3的VEGF-R1的結構域2。可以使用接頭(例如9Gly)連接VEGF受體和IgG 結構域。第二 VEGF拮抗劑可以是VEGF抗體，例如貝伐單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗 (ranibizumab)。本發明的另一個方面是治療哺乳動物眼部疾病的方法。該方法包括對哺乳動物的 患病眼施用式X-Y-Z的VEGF拮抗劑，其中VEGF拮抗劑為每單位劑量約0. lmg至約50mg的
治療有效量。在一些實施方案中，治療有效量是約0. lmg至約25mg、約0. lmg至約10mg、約 0. 5mg 至約 5mg 或約 0. 5mg 至約 2. 5mg。
本發明的另一個方面是降低接受眼部基因治療的哺乳動物眼內渾濁(haze)的方 法。該方法包括對哺乳動物(例如在眼內)施用包含不超過總病毒殼體90%的空病毒殼體 的基因治療病毒體。在一些實施方案中，空病毒殼體不超過總病毒殼體的80%、70%、60%或50%。在 一些實施方案中，基因治療病毒體基本上無空病毒殼體。在一個實施方案中，病毒體是AAV病毒體，例如AAV2病毒體。在一些實施方案中，眼部疾病選自濕性年齡相關性黃斑變性(濕性AMD)、黃斑水 腫、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變和糖尿病性視網膜病變。
為本領域提供了治療血管增殖和炎癥相關疾病的方法和物質(agent)的本發明 的這些和其他實施方案將在后面更詳細地描述。相對于蛋白質的天然形式，該物質提供提 高的穩定性和生物利用率。附圖簡述

圖1. D2-9Gly_Fc構建體中的9-Gly接頭的柔性區。通過Karpus和Schultz (1985) 法預測的相對柔性顯示，與不包含9-Gly接頭的D2-Fc構建體相比，D2_9Gly-Fc蛋白質中 的作為一個區域的聚甘氨酸九聚體(9-Gly)接頭(氨基酸94-103)具有高于平均值的柔性 (> 1)。兩種融合蛋白質都包含相同氨基酸序列(框內)SP-信號肽(氨基酸-24至-1)、 Flt-I結構域2 (氨基酸1至93)和IgGl-Fc殘基(244個氨基酸)。箭頭表示用SignalPV2. 0 程序(Nielsen等，1997)預測的信號肽酶切割位點。圖2. D2-9Gly-Fc對D2_Fc的生物學活性。293細胞生長于饑餓培養基(M199+5% FCS)，并用包含CMV啟動子控制下的D2-9Gly-Fc和D2_Fc表達盒的質粒轉染。72小時 后收集條件培養基(CM)。將HUVEC用含VEGF(10ng/mL)的饑餓培養基接種于96孔板中 (2E3細胞/孔)，24小時后加入50ul含VEGF (10ng/mL)的CM。將對照(+/-VEGF)與來自 對照pEGFP(Clontech ；pEGFP攜帶野生型綠色熒光蛋白質(GFP)的紅移變體，該變體已針 對在哺乳動物細胞中更亮的熒光和更高的表達進行了優化)質粒轉染的CM孵育。用50ng Flt-I-IgG重組蛋白質(R&DSystems)處理陽性對照。處理后3天用CellTiter 96 AQuews 試劑(Promega)對HUVEC的增殖進行測定。數據代表每個實驗測定三次的兩次實驗的OD49tl 的平均值的平均值。圖3. D2-9Gly-Fc和D2_Fc的蛋白質印跡分析。與在還原凝膠中的遷移相比，在非 還原凝膠中遷移時，D2-9Gly-Fc和D2_Fc蛋白質的大小似乎都是兩倍大。表達D2_9Gly-Fc 和D2-Fc的質粒轉染293細胞后，來自條件培養基的蛋白質通過SDS電泳分離，并轉移至 PVDF膜。用山羊抗-人抗-IgGl Fc和兔抗-山羊IgG-HRP抗體探測印跡。圖4.包含9Gly接頭和VEGF Ex3的sFlt-Ι雜合蛋白質。D2_9Gly-Ex3/CH3與之 前構建的蛋白質的結構比較。三種蛋白質都包含Flt-I結構域2的相同的氨基酸序列，其 由Flt-I信號肽的24個氨基酸和Flt-I結構域2的93個氨基酸組成。D2-9Gly-Ex3/CH3 包含9Gly接頭的9個氨基酸、VEGF Ex3的14個氨基酸和人IgGl重鏈Fc的CH3區的120 個氨基酸。圖 5. D2-9Gly-Ex3/CH3 對 D2_9Gly_Fc 的生物學活性。與對照蛋白質 D2_9Gly_Fc 和D2-Fc相比，蛋白質D2-9Gly-Ex3/CH3 (其中結構域2通過9Gly接頭和VEGF Ex3連接至 CH3區)也有效地抑制VEGF-依賴的HUVEC增殖。用50ng重組Flt-l-IgG (R&D Systems)作為對照。圖 6.比較 D2-(Gly4Ser)3_Fc 與 D2_9Gly-Fc 和 D2_9Gly_Ex3/CH3 的蛋白質活性的 HUVEC增殖測定。圖7.蛋白質印跡。來自用表達(l)D2-9Gly-Fc、(2)D2-(G4S)3_Fc 和(3)EGFP 蛋白 質的質粒轉染的293細胞的條件培養基(15ul CM)的蛋白質(非還原或還原)通過SDS電 泳分離，并轉移至PVDF膜。用山羊抗-人IgGl Fc和兔抗-山羊IgG-HRP抗體探測印跡。圖8.有/無9Gly接頭或VEGF Ex3的蛋白質的組合。三種有或無9Gly接頭和/ 或VEGF Ex3的新蛋白質D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2_Ex3/CH3的結構比較。圖9.用具有9Gly、Ex3和CH3組合的Flt_l (D2)構建體進行的HUVEC增殖測定。 包含蛋白質D2-Ex3/CH3、D2_9Gly_CH3和D2-CH3的來自293細胞的條件培養基(5ul)與 D2-9Gly-Fc 和 D2_9Gly_Ex3/CH3 比較。圖 10.蛋白質印跡。用表達(l)D2-9Gly_Fc、(2)D2_9Gly_CH3 (52/26kDa)禾P (3) D2-CH3 (50/25kDa)的質粒轉染293細胞。來自293細胞條件培養基的蛋白質(15ul CM, 非還原和/或還原)通過SDS電泳分離，并轉移至PVDF膜。用抗-人VEGF-R1HRP綴合物 (R&D Systems)探測印跡。圖11. VEGF “體外”結合測定。將包含已知濃度的D2-9Gly_Fc和Fit-ID(1_3)對 照可溶性受體(濃度為0. 29至150pM)的來自293細胞的條件培養基連續稀釋，并與10pM VEGF混合。然后通過ELISA測量未結合的VEGF的量。D2_9Gly-Fc以高于其他所有構建體 的親和力結合VEGF。“n”代表獨立實驗(轉染和結合測定)的次數。圖12.用BIAcore儀器通過表面等離振子共振測量可溶性Flt_l構建體的結合動 力學。將sFlt-1構建體固定于傳感芯片，按0. 2至15nM的濃度范圍注入VEGF165。用BIA Evaluation程序評估傳感圖(sensorgram)，測定速率常數Ka和Kd，并從Kd/Ka = KD的比計 算解離常數(Kd)。越低的Kd表示越好的親和力。圖13A-13C。圖13A顯示具有多種接頭的Flt_l構建體的表達水平。圖13B顯示 具有多種接頭和IgGlFc的CH3部分的Flt-1構建體的二聚化或多聚化。非還原和還原條件 間的差異表明蛋白質已多聚化。圖13C顯示在VEGF存在下的HUVEC增殖測定中，存在于條 件培養基中的Flt-1構建體的抑制性生物活性。每種構建體顯示接近于無VEGF下的HUVEC 增值水平的抑制活性。圖14.用視網膜新血管形成(NV)的鼠的氧誘導視網膜病變(0IR)模型，對小鼠眼 部施用Flt-1構建體之一，并測定新血管形成。將小鼠暴露于高氧條件。測定治療眼中新 血管形成事件的數目，與同一動物的未治療眼中的事件比較。若新血管形成事件降低超過 50 %，則認為該動物是“反應者”。圖15.原位雜交測定顯示AAV2-SFLT1D29GLYFC在一組動物中的表達水平和定位。發明詳述本發明人發現，無結構域1和3的Flt-1 Ig-樣結構域2能夠有效地結合VEGF， 并抑制VEGF-依賴的內皮細胞增殖。可以通過接頭將結構域2共價連接至多聚化結構域。 接頭一般是多肽鏈。鏈的長度可以是6、7、9、11、13、15或更多個氨基酸殘基，但一般是5至 25個殘基。取決于長度和側鏈組成，接頭可以具有但不需具有高于平均值的柔性。可以用 本領域已知的算法計算柔性。多聚化結構域是多聚體蛋白質中促進亞基形成例如二聚體、三聚體、四聚體等的那些部分。適用于有效結合VEGF和/或抑制VEGF-依賴的內皮細胞增 殖的重組蛋白質選自SEQ ID NO :2、8、21、23和25。此外，發明人已發現，多聚化結構域和接頭可以與多種其他蛋白質或蛋白質的部 分一起使用，以誘導多聚化。這類蛋白質可以是僅在多聚化時結合配體或受體的蛋白質，或 可以是多聚化時其結合親和力增強的蛋白質。適用于多聚化的蛋白質包含胞外受體(包含 其部分)、抗體可變區、細胞因子、趨化因子和生長因子。適合的蛋白質包含酪氨酸激酶受 體和絲氨酸蘇氨酸激酶受體。胞外受體的具體實例包含EGF受體、G蛋白偶聯受體、FGF受 體、Fc受體、T細胞受體等。抗體可變區的實例包含Fab、F(ab’)2*ScFv。細胞因子的實 例包含 GM-CSF、IL-1 a、IL-1 3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、 IL-18、IL-21、IL-23、IFN-a、IFN_3、IFN_ y、MIP_1 a、MIP_1 3、TGF_3、TNFa 和 TNF-3。 趨化因子的實例包含 BCA-1/BLC、BRAK、趨化因子 CC-2、CTACK、CXCL-16、ELC、ENA、ENA-70、 ENA-74、ENA-78、嗜酸性粒細胞趨化蛋白(Eotaxin)、Exodus-2、CXXXC 趨化分子、GCP-2、 GRO、GRO a (MGSA)、GR0-旦、GR0- y、HCC-1, HCC-4, 1-309, IP-10, I-TAC, LAG-1, LD78-旦、 LEC/NCC-4、LL-37、淋巴細胞趨化蛋白(Lymphotactin)、MCP、MCAF(MCP-1)、MCP-2、MCP-3、 MCP-4、MDC、MDC、MDC-2、MDC-4、MEC/CCL28、MIG、MIP、MIP-1 a、MIP-1 旦、MIP-1 8、MIP-3/ MPIF-1、MIP-3 a、MIP-3bet、MIP-4 (PARC)、MIP-5、NAP-2、PARC、PF-4、RANTES、RANTES-2、 SDF-la、SDF-10、TARC和TECK。生長因子的實例包含人雙調蛋白、人血管發生蛋白質、 人ACE、人血管生成素、人血管位蛋白(Angiopoietin)、人制管張素、人3動物纖維素、 人 BMP、人 BMP-13/CDMP-2、人 BMP-14/CDMP-1、人 BMP-2、人 BMP-3、人 BMP-4、人 BMP-5、人 BMP-6、人BMP-7、人BMP-8、人BMP-9、人集落刺激因子、人flt3_配體、人G-CSF、人GM-CSF、 人M-CSF、人結締組織生長因子、人Cripto-1、人Cryptic、人ECGF、人EGF、人EG-VEGF、人促 紅細胞生成素、人胎球蛋白、人FGF、人FGF-1、人FGF-10、人FGF-16、人FGF-17、人FGF-18、 人 FGF-19、人 FGF-2、人 FGF-20、人 FGF-3、人 FGF-4、人 FGF-5、人 FGF-6、人 FGF-7/KGF、人 FGF-8、人FGF-9、人FGF-酸性、人FGF-堿性、人⑶F_ 11、人⑶F_ 15、人生長激素釋放因子、人 HB-EGF、人調蛋白、人HGF、人IGF、人IGF-I、人IGF-II、人抑制素、人KGF、人LCGF、人LIF、人 混合生長因子(Human Miscellaneous Growth Factor)、人MSP、人肌肉生長抑制素(Human Myostatin)、人肌肉生長抑制素前肽、人神經生長因子、人制癌蛋白M、人PD-ECGF、人PDGF、 人PDGF (AA同型二聚體)、人PDGF (AB異源二聚體)、人PDGF (BB同型二聚體)、人PDGF (CC同 型二聚體)、人PIGF、人PIGF、人PIGF-1、人PIGF-2、人SCF、人SMDF、人干細胞生長因子、人 SCGF- a、人SCGF-0、人血小板生成素、人轉化生長因子、人TGF-a、人TGF-0和人VEGF。Flt-1受體蛋白質具有包含7個Ig-樣結構域的胞外部分。這些結構域定位于 Genbank 檢索號 P17948(也見 SEQ ID NO :15)的氨基酸殘基編號 32. . . 123、151. . . 214、 230. . . 327,335. . . 421,428. . . 553,556. . . 654 和 661. . . 747。殘基編號 1-26 包含信號肽。 Flt-1蛋白質由Genbank檢索號NM_002019(SEQ ID NO 14)所示DNA序列編碼。可以按本領域已知使用多聚化結構域。可以使用IgGl或IgG2 A重鏈的Fc部分 的序列，例如單獨使用CH3(氨基酸371-477)或使用CH2和CH3結構域(247-477) 二者。 Ig分子的Fc部分是通過用木瓜蛋白酶切割全抗體分子獲得的部分。也可以用其他方法獲 得這些部分。IgGl入重鏈蛋白質序列見Genbank檢索號Y14737和SEQ ID N0:10。可以使 用例如來自其他IgG類型和來自IgA、IgM、IgD或IgE抗體的其他Fc區。還可以使用VEGF的多聚化區。編碼VEGF的DNA序列顯示于Genbank檢索號NM_003376和SEQ ID NO :11。 VEGF的氨基酸序列顯示于Genbank檢索號CAC19513和SEQ ID NO :12。由VEGF外顯子 3 (VEGFEx3)編碼的VEGF的多聚化區(SEQ ID NO 13)大致處于VEGF蛋白質(SEQ ID NO: 12)的氨基酸殘基75-88。多聚化結構域可以引起單體融合蛋白質的至少5%、10%、20%、 30%、40%、50%、60%、75%、80 %、85%、90%或95%在非變性聚丙烯酰胺凝膠上以適合于 多聚體的速率遷移。糖基化可以影響蛋白質在凝膠中的遷移。雖然在此顯示具體的序列， 但也可以使用諸如等位變體的變體。這類變體一般與所公開的序列具有至少85%、90%、 95%、97%、98%或 99%的同一性。如本文所示，可以用例如還原和非還原凝膠測定多聚化。還可以通過檢測蛋白質 對其配體/受體的提高的親和力來測定多聚化。在這一點上，可以使用BiaCore 表面等離 振子共振測定法。這些測定法通過測量靠近傳感芯片表面的水性層中折射率的變化來檢測 物質變化。可以使用本領域已知的任意方法來檢測多聚化。本發明的接頭部分可以包含例如5-100個氨基酸殘基、5-75個氨基酸殘基、5_50 個氨基酸殘基、5-25個氨基酸殘基、5-20個氨基酸殘基、5-15個氨基酸殘基、5_10個氨基酸 殘基、5-9個氨基酸殘基。有用的接頭的實例包含gly9 (SEQ ID NO :27)、glu9 (SEQ ID NO 28)、ser9(SEQ ID NO 29), gly5cyspro2cys (SEQ ID NO :30)、(gly4ser) 3 (SEQ ID NO :31)、 SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO :32)、ProSerCysValProLeuMetAr gCysGlyGlyCysCysAsn(SEQ ID NO 13), GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEQ ID NO: 26)，和Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEQ ID N0:34)。可以使 用的其他多肽接頭包含不同長度(包含5、7或30個殘基)的聚甘氨酸。此外，Flt-I的其 他部分可以用作接頭，例如Flt-I的結構域3。見SEQ ID N0:15。也可以從其他聚合物產 生接頭部分，例如聚乙二醇。這類接頭可以具有10-1000、10-500、10-250、10-100或10-50 個乙二醇單體單位。適合的聚合物應具有與適當范圍的氨基酸殘基所占據的尺寸相似的尺 寸。一般尺寸的聚合物提供約10-25埃的空間。可以通過本領域已知的任意方法產生本發明的融合蛋白質。雖然可以通過合成或 通過連接產生的部分來產生這類蛋白質，但也可以使用重組產生。可以用重組DNA的標準 工具產生融合基因序列。可以將融合基因序列插入載體(例如病毒或質粒載體)進行融合 基因序列的復制。可以在融合基因上游引入在最終受體細胞中有功能的啟動子序列。所使 用的啟動子可以是組成型、誘導型或阻抑型啟動子。每種類型的實例為本領域公知。可以通 過本領域已知的任意方法將載體引入宿主細胞或哺乳動物。可以使用的適合的載體包含腺 病毒、腺伴隨病毒、反轉錄病毒、慢病毒(Ientivirus)和質粒。若載體是病毒載體且載體已 包裝，則可以用病毒體感染細胞。若使用裸DNA，則可以使用適合于具體宿主細胞的轉染或 轉化方法。可以使用利用聚合物類、脂質體或納米球的裸DNA制劑進行融合基因遞送。可 以用本發明的重組構建體轉化或轉染的細胞可以是對技術人員方便的任意細胞。可以使用 的示例性細胞類型包含細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞。在哺乳動物細胞中，可以按方便 選擇許多組織類型的細胞。可以使用的示例性細胞是成纖維細胞、肝細胞、內皮細胞、干細 胞、造血細胞、上皮細胞、肌細胞、神經細胞和角質形成細胞。這些細胞可以用來在體外產生 蛋白質，或者可以遞送至包含人類的哺乳動物，以在體內產生所編碼的蛋白質。這種遞送方 法是遞送核酸至哺乳動物、遞送病毒載體至哺乳動物和遞送融合蛋白質至哺乳動物外的另一種選擇。蛋白質或核酸的組合物可以在載體中，例如緩沖液、水性或親脂載體、無菌或非無菌、熱原性或非熱原性載體。非熱原性載體用于可注射制劑。制劑可以是液體或固體，例如 凍干的。制劑可以作為氣霧劑施用。組合物可以包含一種或多種融合蛋白質，或一種或多 種核酸，或融合蛋白質和核酸二者。組合物中的融合蛋白質或核酸可以是同型的，這種情況 下將形成同型多聚體蛋白質，或者它們在組合物中是異源的，這種情況下形成異源多聚體 蛋白質。在異源多聚體的情況中，X部分在融合蛋白質間一般不同，但Z部分在融合蛋白質 間是相同的。可以通過本領域已知的任意方法向細胞或哺乳動物宿主提供融合蛋白質。可以將 蛋白質遞送至細胞或宿主。可以對細胞或宿主施用核酸。可以對細胞或宿主施用轉化或轉 染的細胞。在后一種情況中，希望得到具有相同遺傳背景的細胞，以降低移植排斥。適合遞送至哺乳類宿主動物的細胞包含來自任意器官、腫瘤或細胞系的任意哺乳 動物細胞類型。例如，可以使用人、鼠、山羊、綿羊、牛、狗、貓和豬的細胞。適用的細胞類型非 限制性地包含成纖維細胞、肝細胞、內皮細胞、角質形成細胞、造血細胞、上皮細胞、肌細胞、 神經細胞和干細胞。遞送融合蛋白質或編碼融合蛋白質的核酸的方法包括表達融合蛋白質的細胞的 遞送、融合蛋白質的遞送和編碼融合蛋白質的核酸的遞送。通過例如注射法、導管插入法或 內窺鏡法，可以將融合蛋白質、細胞或核酸直接遞送至所希望的器官或腫瘤。還可以通過靜 脈內、支氣管內、瘤內、鞘內、肌內、眼內、局部、皮下、經皮或口服遞送融合蛋白質、細胞或核 酸。可以有效治療的病人包含患有濕性年齡相關性黃斑變性、糖尿病增殖性視網膜病變、類 風濕性關節炎、骨關節炎、葡萄膜炎、哮喘和癌癥的病人。治療將改善癥狀和/或疾病標志 和/或疾病嚴重度。當遞送至眼睛的前部或中央玻璃體腔(mid-vitreous space)中時，編碼分泌蛋白 質的基因治療病毒載體(例如AVV2)轉導眼中的變移上皮細胞(例如在非人靈長類動物 中)。前房中可獲得產生自轉導細胞的分泌蛋白質。因此，可以通過玻璃體內的病毒基因遞 送治療眼睛前部的疾病。這類前眼疾病(front eye disease)的實例包含但不限于干眼綜 合癥、Sjogren's綜合癥、葡萄膜炎、角膜血管發生、角膜移植排斥。分泌蛋白質的實例包含 但不限于 sFLTl、IL-10、ILlRa、IL18bp、可溶性PDLl-Ig、CTLA4-Ig、可溶性 TNFR-Ig、可溶性 IL-17R和可溶性IL23R。可以以任意希望的載體將核酸遞送至哺乳動物，尤其是遞送至人類。這些載體包 含病毒或非病毒載體，包含腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體和 質粒載體。示例性病毒類型包含HSV(單純皰疹病毒)、腺病毒、AAV(腺伴隨病毒)、HIV(人 免疫缺陷病毒)、BIV(牛免疫缺陷病毒)和MLV(鼠白血病病毒)。可以以提供足夠有效的 遞送水平的任意希望的形式遞送核酸，包含以病毒顆粒形式、以脂質體形式、以納米顆粒形 式和絡合至聚合物類遞送。可以使用蛋白質和核酸治療的組合。例如，可以對病人施用本發明的融合蛋白質。 若觀察到良好的反應，則可以為了長期作用施用編碼該融合蛋白質的核酸分子。備選地，可 以同時或近乎同時施用蛋白質和核酸。在另一種選擇中，可以施用配體的抗體或融合蛋白 質，隨后或同時施用受體的抗體或融合配偶體。另一種選擇使用核酸的組合，其中一種核酸編碼抗體，另一種核酸編碼融合蛋白質。可以與本發明的Flt-I構建體(無論是蛋白質形 式或核酸形式)組合使用的一些抗體是貝伐單抗和蘭尼單抗，二者均針對VEGF。這些抗體 分別對治療癌癥和黃斑變性尤其有用。
除非另作說明，本發明的實施使用本領域技術內的分子生物學(包含重組技 術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術。這類技術在文獻中闡述透 徹，如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版(Sambrook 等，1989) ；Current Protocols In Molecular Biology(F. M. Ausubel 等 編 輯，1987) ；Oligonucleotide Synthesis (Μ· J. Gait 編輯，1984) ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 編輯，1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc. ) ；Handbook Of Experimental Immunology(D. M. Wei&C. C. Blackwell 編輯)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. M. Miller & Μ· P. Calos H 1987) ；PCR :The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等編輯，1994) ；Current Protocols In Immunology (J. Ε· Coligan 等編輯， 1991) ；Antibodies :A Laboratory Manual (Ε· Harlow 禾口 D. Lane 編輯(1988))；禾口 PCR 2 :A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 禾口 G. R. Taylor 編輯(1995))。如本文所用，本發明的VEGF拮抗劑的“降低的量”指VEGF拮抗劑的局部濃度(哺 乳動物體內)。對相同的疾病指征，當其低于市售“參考VEGF拮抗劑”的局部濃度時，認為 局部濃度是降低的量。例如，“降低的量”可以是參考VEGF拮抗劑的局部濃度的90%、75%、 50%、25%、10%或5%。作為實例，蘭尼單抗(Lucentis)是市售抗-VEGF抗體形式的VEGF 拮抗劑，用于治療AMD。當根據本發明用VEGF拮抗劑治療AMD時，該VEGF拮抗劑的降低的 量定義為局部濃度，該濃度低于對眼部施用抗體后蘭尼單抗的局部濃度。據估計，單劑量后 蘭尼單抗在眼內的局部濃度是約100yg/ml。因此，根據本發明按降低的量提供用來治療 AMD的VEGF拮抗劑，即低于100yg/ml的局部濃度，例如處于或低于95 μ g/ml、85 μ g/ml、 75μ g/ml、50y g/ml、25y g/ml、15y g/ml、10y g/ml 或 5μ g/ml。本發明的 VEGF 拮抗劑是 蛋白質時，其可以通過蛋白質或基因治療提供。如本文所用，“參考VEGF拮抗劑”指市售VEGF拮抗劑。只要參考VEGF拮抗劑拮抗 VEGF信號傳導，其可以是任何形式。例如，參考VEGF拮抗劑可以是融合蛋白質或諸如VEGF 抗體的其他類型的分子。至少約50% -99%或更多存在于貯存物中的病毒體是具有包裝基因組的病毒體 (例如AAV載體顆粒)時，包含病毒載體顆粒(包裝基因組)的病毒體的貯存物或制劑(例 如基因治療病毒體)“基本上無”空病毒殼體。優選地，載體顆粒包含至少約75-85wt%、 更優選約90wt%的病毒體存在于貯存物中，甚至更優選至少約95wt%、或甚至99wt%或更 多的病毒體存在于貯存物中，或這些范圍間的任意整數的病毒體存在于貯存物中。因此，當 約40 %至約1 %或更少、優選約25 %至約15 %或更少、更優選約10 %或更少、甚至更優選約 5%至約或更少產生的貯存物包含空病毒殼體時，貯存物基本上無空病毒殼體。可以按 例如美國專利號7，261，544(在此以其整體引入作為參考)所述制備基本上無空病毒殼體 的病毒體。可以通過本領域已知的方法測量空病毒殼體，例如Progen病毒殼體酶聯免疫吸 附測定法。基因遞送載體可以是可攜帶插入的多核苷酸進入宿主細胞的任意分子。基因遞送 載體的實例是脂質體；生物相容性聚合物類，包含天然聚合物類和合成聚合物類；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工病毒包膜；金屬顆粒；細菌；病毒，如桿狀病毒、腺病毒和反轉錄 病毒；噬菌體；黏端質粒；質粒；真菌載體；和已描述了其在多種真核和原核宿主中的表達， 且可以用于基因治療以及簡單的蛋白質表達的本領域常用的其他重組載體。如本文所用，基因遞送、基因轉移等術語是指不考慮用于引入的方法，將外源多核 苷酸(有時稱為“轉基因”)引入宿主細胞。這類方法包括多種公知的技術，如載體介導的 基因轉移(通過例如病毒感染/轉染，或多種其他基于蛋白質或基于脂質的基因遞送復合 物)以及促進“裸”多核苷酸遞送的技術(如電穿孔、“基因槍”遞送和多種用于多核苷酸引 入的其他技術)。引入的多核苷酸可以穩定地或瞬時地保持在宿主細胞中。穩定保持通常 需要所引入的多核苷酸包含與宿主細胞相容的復制起點或整合入宿主細胞的復制子，如染 色體外復制子(例如質粒)或核染色體或線粒體染色體。如本領域已知和本文所述，已知 許多載體能夠介導基因轉移至哺乳動物細胞。為通過靜脈內、肌內、門靜脈內(intraportal)或其他給藥途徑遞送，將外源多核 苷酸插入載體，如腺病毒、部分刪除的腺病毒、完全刪除的腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、反轉 錄病毒、慢病毒、裸質粒、質粒/脂質體復合物等。可以在本發明的方法和組合物中使用的 表達載體包含例如病毒載體。在體內和離體條件下，最常用的基因治療給藥方法之一是用 病毒載體遞送基因。已知許多病毒物種，并已為基因治療的目的研究了許多病毒物種。最 常用的病毒載體包含衍生自腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)和反轉錄病毒(包含慢病毒，如人免 疫缺陷病毒(HIV))的病毒載體。腺病毒是無包膜的核DNA病毒，具有約36 kb的基因組，已通過經典遺傳學和 分子生物學中的研究良好地對其進行了表征(Hurwitz，Μ. S.，Adenoviruses Virology, 第 3 版，Fields 等編輯，Raven Press,紐約，1996 ；Hitt, Μ. M.等，Adenovirus Vectors, The Development of Human Gene Therapy, Friedman, T.編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約1999)。病毒基因分為涉及兩類時序病毒蛋白質產生的早期(命名 為E1-E4)和晚期(命名為L1-L5)轉錄單位。這些事件的分界是病毒DNA復制。根據包含 紅血細胞凝集、致癌性、DNA和蛋白質氨基酸的組成和同源性，以及抗原關系的性質，將人腺 病毒劃分為許多血清型(約47種，相應地編號并劃分為6個組:A、B、C、D、E和F)。重組腺病毒載體用作基因遞送載體具有幾個優勢，包含對分裂和非分裂細胞都具 有向性、最小的致病潛力、復制達到高效價用于載體貯存物制備的能力和攜帶大的插入片 段的潛力(Berkner, K. L.，Curr. Top. Micro. Immunol. 158 :39_66，1992 Jolly, D.，Cancer Gene Therapy 1 :51_64 1994)。已將多種腺病毒基因序列缺失的腺病毒載體設計為利用所 希望的腺病毒特征，這些特征使其成為遞送核酸至受體細胞的適合載體。具體而言,假腺病毒載體(pseudoadenoviral vectors) (PAV)(也稱為 “gutless 腺病毒”或微型腺病毒載體)是衍生自腺病毒基因組的腺病毒載體，其包含病毒基因組復 制和包裝所需的最少限度的順式作用核苷酸序列，且其可以包含一個或多個轉基因(參 見涉及假腺病毒載體(PAV)和產生PAV的方法的美國專利號5，882，877，其在此引入作為 參考)。已將PAV設計為利用所希望的腺病毒特征，這些特征使其成為基因遞送的適合載 體。雖然通過缺失對病毒生長可有可無的區域，腺病毒載體一般可以攜帶大小至多為8kb 的插入片段，但是用包含大部分病毒編碼序列缺失的腺病毒載體(包含PAV)可以達到最 大載量。見 Gregory 等的美國專利號 5，882，877 ；Kochanek 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA93 :5731-5736，1996 ；Parks 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 13565-13570，1996 ；Lieber 等，J. Virol. 70 =8944-8960,1996 ；Fisher 等，Virology 217 11~22,1996 ；美國專利號 5，670, 488 ； 1996年10月24日公開的PCT公開號W096/33280 ； 1996年12月19日公開的 PCT公開號W096/40955 ； 1997年7月19日公開的PCT公開號W097/25446 ； 1995年11月9 日公開的PCT公開號W095/29993 ； 1997年1月3日公開的PCT公開號W097/00326 ；Morral 等，Hum. Gene Ther. 10 :2709_2716，1998。這類可以容納至多約36kb外源核酸的PAV是有 利的，因為優化了載體的載量，而降低了宿主對載體產生免疫應答或產生復制型病毒的潛 力。PAV載體包含5'反向末端重復(ITR)和3' ITR核苷酸序列，其包含復制起點、PAV基 因組包裝所需的順式作用核苷酸序列，且可以容納一個或多個具有適當調節元件(例如啟 動子、增強子等)的轉基因。另外，部分刪除的腺病毒載體提供了部分刪除的腺病毒(稱為“DeAd”)載體，其中 從載體上刪除病毒復制所需的大部分腺病毒早期基因，并將這些基因在條件啟動子的控制 下置于生產者細胞的染色體內。置于生產者細胞中的可刪除的腺病毒基因可以包含ElA/ E1B、E2、E4(只需將0RF6和0RF6/7置入細胞)、pIX和pIVa2。還可以從載體刪除E3，但 由于其不是載體產生所需的，所以在生產者細胞中可以省略。載體中存在腺病毒晚期基因 (通常在主要晚期啟動子(MLP)的控制下)，但可以用條件啟動子替換MLP。適用于DeAd載體和生產者細胞系的條件啟動子包含具有以下特征的條件啟動 子非誘導狀態下低的基礎表達，以使細胞毒性的或抑制細胞的病毒基因不以對細胞有害 的水平表達；誘導狀態下高水平表達，以產生足夠量的病毒蛋白質來支持載體的復制和組 裝。適用于DeAd載體和生產者細胞系的優選的條件啟動子包含基于免疫抑制劑Π(506和 瑞帕霉素的二聚體劑(dimerizer)基因控制系統、蛻皮素基因控制系統和四環素基因控 制系統。Abruzzese 等，Hum. Gene Ther. 1999 10 1499-507 中所述的 GeneSwitch 技術 (Valentis,Inc. ,Woodlands,TX)也可以用于本發明，其公開內容在此引入作為參考。部分 刪除的腺病毒表達系統進一步描述于W099/57296中，其公開內容在此引入作為參考。腺伴隨病毒(AAV)是單鏈人DNA細小病毒，其基因組大小為4. 6kb。AAV基因組包 含兩個主要的基因r印基因，其編碼r印蛋白質(Itep 76, Rep 68, Rep 52和R印40)；和 cap基因，其編碼AAV復制、拯救、轉錄和整合，而cap蛋白質形成AAV病毒顆粒。AAV因其依 賴于腺病毒或其他輔助病毒(例如皰疹病毒)供給允許AAV進行生產性感染(即在宿主細 胞中繁殖其自身)的必需基因產物而得名。在無輔助病毒的情況下，AAV作為原病毒整合入 宿主細胞的染色體，直至為輔助病毒(通常是腺病毒)超感染宿主細胞所拯救(Muzyczka， Curr. Top. Micor. Immunol. 158 :97_127，1992)。對AAV作為基因轉移載體的興趣產生自其幾種獨特的生物學特征。AAV基因組的 兩端都是稱為反向末端重復(ITR)的核苷酸序列，其包含病毒復制、拯救、包裝和整合所需 的順式作用核苷酸序列。由rep蛋白質反向介導的ITR的整合功能允許AAV基因組感染 后在無輔助病毒的情況下整合入細胞染色體。病毒的這一獨特特性與在基因轉移中的AAV 使用相關，因為其允許包含目的基因的重組AAV整合入細胞基因組。因此，通過使用rAAV 載體可以達到穩定的遺傳轉化，這是許多基因轉移目標的理想結果。此外，很好地確定了 AAV的整合位點并已將其定位于人的19號染色體(Kotin等，Proc. Natl. Acad. Sci. 87 2211-2215，1990)。整合位點的這種可預測性降低了隨機插入細胞基因組的事件的危險，這些事件可以激活或失活宿主基因或間斷編碼序列，這是可以限制整合AAV的載體的使用的 結果，在rAAV載體的設計中去除這個基因可以產生已用rAAV載體觀察到的改變的整合模 式(Ponnazhagan 等，Hum Gene Ther. 8 :275_284，1997)。用AAV進行基因轉移有其他優勢。AAV的宿主范圍廣。此外，不同于反轉錄病毒， AAV可以感染休眠細胞和分裂細胞。同時AAV尚未與人類疾病相關聯，消除了反轉錄病毒衍 生的基因轉移載體已出現的許多顧慮。產生重組rAAV載體的標準方法需要協調一系列細胞內事件用包含兩側有AAV ITR序列的目的轉基因的rAAV載體基因組轉染宿主細胞、通過編碼反向所需的AAV rep和 cap蛋白質基因的質粒轉染宿主細胞和用輔助病毒感染轉染的細胞來供給反向所需的非 AAV 輔助病毒功能(Muzyczka, N.，Curr. Top. Micor. Immunol. 158 :97_129，1992)。腺病毒 (或其他輔助病毒)的蛋白質激活AAV r印基因的轉錄，然后r印蛋白質激活AAV cap基因 的轉錄。然后cap蛋白質利用ITR序列來將rAAV基因組包裝入rAAV病毒顆粒。因此，包 裝的效率部分地由足量結構蛋白質的可獲得性，以及rAAV載體基因組中所需的任意順式 作用包裝序列的可接近性決定。反轉錄病毒是常見的基因遞送工具(Miller，Nature (1992) 357 :455_460)。反轉 錄病毒載體遞送非重排的單拷貝基因進入廣泛的嚙齒類動物、靈長類動物和人的體細胞的 能力使反轉錄病毒載體非常適合用于轉移基因至細胞。反轉錄病毒是其中病毒基因組是RNA的RNA病毒。當用反轉錄病毒感染宿主細胞 時，基因組RNA反轉錄為非常有效地整合入所感染細胞染色體DNA的DNA中間體。這種整 合的DNA中間體稱為原病毒。原病毒的轉錄和組裝為感染性病毒發生在存在適合的輔助病 毒的情況下，或發生在包含能夠在無污染輔助病毒同時產生的情況下殼體化的適當序列的 細胞系中。若用適當的載體通過共轉染提供用于殼體化的序列，則重組反轉錄病毒的產生 不需要輔助病毒。反轉錄病毒基因組和原病毒DNA具有3個基因gag、pol和env，其兩側是兩個長 末端重復(LTR)序列。gag基因編碼內部的結構(基質、病毒殼體和核病毒殼體)蛋白質； pol基因編碼RNA指導的DNA聚合酶(反轉錄酶)；env基因編碼病毒的包膜糖蛋白。5' LTR 和3' LTR促進病毒體RNA的轉錄和多聚腺苷化。LTR包含病毒復制必需的所有其他順式作 用序列。慢病毒具有包含vit vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx (在HIV-I、HIV-2和/或SIV 中)的其他基因。與5' LTR相鄰的是基因組反轉錄必需的序列(tRNA引物結合位點)和 病毒RNA有效病毒殼體化進入顆粒必需的序列(Psi位點)。若病毒殼體化(或將反轉錄病 毒RNA包裝入感染性病毒體)必需的序列從病毒基因組缺失，則結果是阻止基因組RNA病 毒殼體化的順式缺陷。但是，產生的突變體仍然能夠指導所有病毒體蛋白質的合成。慢病毒是復雜的反轉錄病毒，除共有的反轉錄病毒基因gag、pol和env外，其還 包含具有調節或結構功能的其他基因。如在潛伏性感染的過程中，較高的復雜性使慢病毒 能夠調節其生活周期。人免疫缺陷病毒(HIV) (AIDS的致病因子)是典型的慢病毒。在體 內，HIV可以感染幾乎不分裂的終端分化細胞，如淋巴細胞和巨噬細胞。在體外，HIV可以 感染單核細胞源性巨噬細胞(monocyte-derived macrophag, MDM)的原代培養物，以及通 過用阿非科林(aphidicolin)或γ輻射處理阻斷在細胞周期中的HeLa-CcM或淋巴細胞。 細胞的感染依賴于HIV預整合復合物通過靶細胞核孔的活躍核轉運。用靶細胞的核轉運裝置，通過復合物中多個部分冗余的分子決定因素的相互作用發生轉運。已鑒定的決定因素 包含gag基質(MA)蛋白質中的功能性核定位信號(NLS)、親核的病毒體相關蛋白質、vpr和 gag MA蛋白質C端的磷酸酪氨酸殘基。反轉錄病毒對基因治療的用途描述于例如美國專利 6，013，516和美國專利5，994，136，其公開內容在此引入作為參考。遞送DNA至細胞的其他方法不使用病毒進行遞送。例如，可以用陽離子型兩親性 化合物遞送本發明的核酸。因為設計用來促進生物學活性分子的細胞內遞送的化合物必須 與非極性和極性環境二者相互作用(例如在質膜、組織液、細胞內區室和生物學活性分子 自身之內或之上)，所以一般將這類化合物設計為包含極性和非極性結構域二者。這兩類結 構域都具有的化合物可以稱為兩親物，已公開用于促進這種細胞內遞送(無論用于體外或 體內應用)的許多脂質和合成脂質符合這一定義。這類兩親物中尤其重要一類是陽離子型 兩親物。一般而言，陽離子型兩親物具有能夠在生理PH或生理pH附近成為帶正電荷的極 性基團，本領域將這一特性理解為在確定兩性物如何與多種類型的生物學活性(治療性) 分子(包含例如帶負電荷的多核苷酸，如DNA)相互作用中很重要。包含陽離子型兩親性化合物的組合物對基因遞送的用途描述于例如美國專 利 5，049，386、美國 5，279，833、美國 5，650，096、美國 5，747，471、美國 5，767，099、美 國 5，910，487、美國 5，719，131、美國 5，840，710、美國 5，783，565、美國 5，925，628、美 國 5，912，239、美國 5，942，634、美國 5，948，925、美國 6，022，874、美國 5，994，317、美國 5，861，397、美國 5，952，916、美國 5，948，767、美國 5，939，401 和美國 5，935，936 中，其公開 內容在此引入作為參考。此外，可以用“裸DNA”遞送本發明的核酸。遞送非感染性、非整合DNA序列的方法 描述于美國專利5，580，859、美國5，963，622、美國5，910，488，其公開內容在此引入作為參 考，所述DNA序列編碼有效連接至啟動子的所希望的多肽或肽，不結合促進轉染的蛋白質、 病毒顆粒、脂質體制劑、帶電脂質和磷酸鈣沉淀劑。已報道了組合病毒和非病毒成分的基因轉移系統。Cristiano等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 11548 ；Wu 等(1994) J. Biol. Chem. 269 11542 ；Wagner 等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 6099 ；Yoshimura等(1993) J. Biol. Chem. 268 2300 ；Curiel 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :8850 ;Kupfer 等(1994)Human Gene Ther. 5 1437 ；和Gottschalk等(1994) Gene Ther. 1 :185。在大多數情況下，已將腺病毒整合入基 因遞送系統以利用其內體水解(endosomolytic)特性。已報道的病毒和非病毒成分的組合 一般涉及共價連接腺病毒至基因遞送復合物或未結合的腺病毒與陽離子脂(DNA復合物) 的共內化。對于遞送DNA和蛋白質至眼部，一般是局部施用。這具有限制所需施用的DNA量 和限制系統性副作用的優勢。可以使用許多可能的遞送模式，其包含但不限于通過基因 槍在角膜上局部施用、結膜下注射、前房內注射、經滴眼液滴至角膜、經termporal Iimbus 注射入前房、基質內注射、與電脈沖組合的角膜應用、角膜內注射、視網膜下注射、玻璃體內 注射(例如前部、中央或后部玻璃體注射)和眼內注射。備選地，可以在離體條件下轉染 或轉導細胞并通過眼內移植遞送。見Auricchio，Mol. Ther. 6 =490-494,2002 ；Bennett, Nature Med. 2 649-654,1996 ；Borras, Experimental Eye Research 76:643-652,2003; Chaum, Survey of Ophthalmology 47 449-469,2002 ；Campochiaro, Expert Opinions inBiological Therapy 2 537-544(2002) ；Lai, Gene Therapy 9:804 813,2002 ；Pleyer, Progress inRetinal and Eye Research,22 :277_293,2003。可以在具體疾病的適合的動物模型中測試多種已提出的治療劑和給藥法的效果。 例如，可以按 Smith，Investigative Ophthalmology & VisualScience，35 :101_111，1994 中所述，在小鼠的氧誘導視網膜病變模型中測試早產兒視網膜病變。小鼠中激光誘導的 脈絡膜新血管形成可以用作發生于如年齡相關性黃斑變性的疾病的人脈絡膜新血管形成 (CNV)的模型。已在靈長類、大鼠類、小型豬類和兔類中發展了 CNV的其他模型。已在遺傳缺 陷小鼠中發展了年齡相關性黃斑變性的小鼠模型。單核細胞趨化蛋白-1或C-C趨化因子受 體-2缺陷的小鼠發展出年齡相關性黃斑變性的特征。Ambati，Nature Med. 9 :1390_1397， 2003。對于疾病的預防或治療，本發明VEGF拮抗劑(蛋白質或基因治療)的適合劑量將 取決于待治療疾病的類型、疾病的嚴重度和進程，施用VEGF拮抗劑是為了預防性目的或治 療性目的、既往治療、臨床病史和對VEGF拮抗劑的應答和主治醫生的判斷。VEGF拮抗劑適 合于一次或在一系列治療中對病人施用。在組合治療方案中，按治療有效量或協同量施用 本發明的組合物。如本文所用，治療有效量是這樣的量，VEGF拮抗劑和一種或多種其他治 療劑共同施用、或施用本發明的組合物，導致目標疾病或病癥的降低或抑制。治療協同量是 協同地或顯著地降低或消除與具體疾病相關的狀態或癥狀必需的VEGF拮抗劑和一種或多 種其他治療劑的量。取決于疾病的類型和嚴重度，可以如此施用VEGF拮抗劑，使所提供的局部濃度為 約 100pg/ml 至約 100 μ g/ml、lng/ml 至約 95 μ g/ml、lOng/ml 至約 85 μ g/ml、lOOng/ml 至約 75 μ g/ml、約 lOOng/ml 至約 50 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 25 μ g/ml、約 1 μ g/ml 至約 15 μ g/ ml、約1 μ g/ml至約10 μ g/ml或約1 μ g/ml至約4 μ g/ml。當通過病毒體通過基因治療遞 送VEGF拮抗劑時，劑量可以是每單位劑量約2xl06至約2xl012、約2xl07至約ZxIO11cIrP或 約2xl08至約ZxliTdrp。當通過蛋白質治療施用VEGF拮抗劑時，劑量可以是每單位劑量約 0. Img 至約 50mg、約 0. Img 至約 25mg、約 0. Img 至約 IOmgJA 0. Img 至約 5mg、約 0. Img 至 約 4mg、約 0. Img 至約 3mg、約 0. Img 至約 2. 5mg、約 0. Img 至約 2mg、約 0. Img 至約 1. 5mg、 約 0. Img 至約 lmg、約 0. Img 至約 0. 75mg、約 0. Img 至約 0. 5mg、約 0. Img 至約 0. 25mg、約 0. 25mg至約5mg、約0. 5mg至約5mg、約Img至約5mg、約1. 5mg至約5mg、約2mg至約5mg、 約2. 5mg至約5mg、約0. 5mg至約5mg或約0. 5mg至約2. 5mg。本發明的VEGF拮抗劑可以作為單劑量施用或反復施用。對于數天或更長時間內 反復施用，取決于病癥，治療持續至發生所希望的疾病癥狀的抑制。通過常規技術和測定法 監測本發明治療的進展。動物或病人對VEGF拮抗劑發生免疫應答時，必要時，可嘗試通過例如使用可獲得 的免疫抑制劑來降低免疫應答(炎癥和/或渾濁或抗體)。當根據本發明的一些實施方案 使用基因治療時，降低空病毒病毒殼體的數目有助于降低免疫應答。根據一些實施方案，降 低針對病毒載體的免疫應答有助于提高VEGF拮抗劑(例如D29GLYFC)的表達，并因此增強 VEGF拮抗劑的治療效果。盡管已就具體實施例(包含當前優選的實施本發明的模式)描述了本發明，但是 本領域技術人員應理解，存在上述系統和技術的多種變化和變換，如所附權利要求中所闡明，這些變化和變換也在本發明的精神和范圍內。本文公開的所有參考文獻明確引入作為參考。
實施例實施例1產生兩個構建體第一個是D2-9Gly_Fc，包含聚甘氨酸九聚體(9Gly)接頭；第二 個是D2-Fc，除9Gly接頭外具有相同的序列(圖1)。我們用序列分析程序MacVector 6. 5. 1. (IBI，New Haven, CT)的 Protein Analysis Toolbox分析了 D2_9Gly_Fc和D2_Fc蛋白質的氨基酸序列。通過Karpus和 Schultz (1985) Naturwiss, 72 212~213的柔性預測方法，將D2_9Gly-Fc序列中的聚甘氨酸 九聚體接頭鑒定為具有高于平均值的柔性。在D2-Fc序列中未檢測到這種區域(圖1)。實施例2我們通過柔性聚甘氨酸九聚體接頭測試了分離的連接至IgGl Fc區的Flt-I Flt-I Ig-樣結構域2(D2-9Gly-Fc)。D2_9Gly-Fc融合蛋白質能夠有效地結合VEGF和抑 制VEGF依賴的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)增殖。見圖2。相反，當Flt-I Ig-樣結構域2 直接連接至IgGl重鏈(Fe)形成D2-Fc時，僅觀察到最小限度的VEGF結合。見圖2。通過 IgGl Fc的二聚化和柔性接頭的插入都顯示促進VEGF結合至Flt-I結構域2。通過蛋白質 印跡分析確認了二聚體形式在D2-9Gly-Fc和D2_Fc 二者中的存在。見圖3。實施例3通過玻璃體內注射對新生(PO)或1日齡(Pl)C57BL/6小鼠施用AAV載體(lx IO8 至Ix IO9顆粒于0.0005mL體積中)。通過將P7仔鼠和它們的哺育母鼠暴露于高氧條件 5天，降低了 C57BL/6小鼠中的視網膜新血管形成(NV)。仔鼠在P12回到室內空氣并在 P17(峰值 NV 的時間)進行安樂死。(Smith LEH, Weslowski Ε、McLellan A、Kostyk SK、 D'AmatoR、Sullivan 禾口 D'Amore PA. Oxygen-Induced Retinopathy in the Mouse. Invest Opth Vis Sci. 1994;35:101-111)。按5微米間隔對整個石蠟包埋的眼部進行連續橫切。 通過計數每100微米采集的切片中內界膜內部的內皮細胞核數目來確定NV的程度。將編碼抗血管發生劑的AAV載體處理的動物群體與編碼無關轉基因的載體或不 編碼轉基因的載體處理的動物群體進行比較。將每只處理的眼中內皮細胞核的平均數與每 一動物的未處理的對側眼進行比較。實施例4D2-9Gly_Ex3/CH3 的產生已顯示Flt-I的結構域2是VEGF165結合必需的。但是，已表明Flt-I結構域2不 能單獨結合VEGFA。(Davis-Smyth等，1996)。當作為二聚體存在時，VEGF A通過允許配體 誘導的受體二聚化的可能機制的酸性殘基(成熟蛋白質的氨基酸63-67)結合Flt-I (Keyt 等，1996)。因此，將Flt-I結構域2的二聚化用作恢復Flt-I結構域2與VEGFA結合的策略。 與IgG重鏈片段融合可以用于蛋白質的二聚化(Davis-Smyth等，1996)。我們在此表明， VEGF A (SEQ ID NO 12)的氨基酸75-88 (即 PSCVPLMRCGGCCN ;SEQ ID NO 13)提高了 sFlt-1 雜合蛋白質的生物學活性。
首先，改造了三種雜合蛋白質D2-9Gly-Fc、D2-Fc和 D2-9Gly_Ex3/CH3(圖 4)。三 種雜合蛋白質都包含與D2-9Gly-Fc相同的Flt_l結構域2。用不含聚甘氨酸九聚體(9Gly) 接頭的D2-Fc未觀察到VEGF結合。第三種蛋白質D2-9Gly-Ex3/CH3包含聚甘氨酸九聚體 (9Gly)接頭和 VEGF 的多聚化結構域(氨基酸 PSCVPLMRCGGCCN ；SEQ IDNO 13 ；VEGF Ex3)， 但其還包含人IgGl重鏈Fc的CH3區(SEQ ID NO 10的氨基酸371-477)。蛋白質D2-Fc在HUVEC增殖測定中不顯示有效的抑制活性(圖5)，暗示其不能有 效地結合VEGF165。但是，第三種蛋白質D2-9Gly-Ex3/CH3 (其包含通過9Gly接頭和VEGF165 的二聚化區(Ex 3) 二者融合至CH3區的Flt-I結構域2)在VEGF依賴的HUVEC增殖測定 中確實表現抑制活性(圖5)。這暗示這種雜合蛋白質能有效地結合VEGF165。實施例5在Flt-I D2構建體中使用接頭(Gly4Ser)3之前已描述了使用幾種聚甘氨酸接頭來改進蛋白質特征(Mouz等， 1996 ；Qiu等，1998)。對下一種構建體，我們使用了另一種類型的接頭，十五聚體 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3(Huston 等，1988)。產生了 D2-(Gly4Ser) 3_Fc 蛋白質，其包含 Flt-I結構域2、(Gly4Ser) 3接頭和人IgGl重鏈的Fc區。進一步在HUVEC增殖測定中表征了 D2-(Gly4Ser)3-Fct5如通過HUVEC增殖的抑制 所測量，D2-(Gly4Ser)3-Fc 的生物學活性類似于 D2_9Gly-Fc 和 D2-9Gly-Ex3/CH3 (圖 6)。通過蛋白質印跡和與D2-9Gly_Fc比較進一步表征了 D2_ (Gly4Ser) 3_Fc構建體 (圖9)。兩種構建體都是大部分以二聚體形式存在，分離還原樣品后檢測了單體形式。實施例69Gly或VEGF Ex3在Flt_l (D2)構建體中的作用為了研究9Gly接頭或VEGF 二聚化序列Ex3對可溶性受體VEGF結合的作用，產生 了另外三種構建體D2-9Gly-CH3、D2-CH3和D2_Ex3/CH3 (圖8)。產生了所有三種構建體， 且與之前的所有構建體一樣，也將它們置于CMV啟動子的控制下。在HUVEC增殖測定中評 估它們的VEGF封閉活性(圖9)。包含IgGl CH3區的蛋白質的HUVEC增殖測定已顯示，與親本D2-9Gly_Ex3/CH3蛋 白質相比，D2-9Gly-CH3 (無Ex3)和蛋白質D2_Ex3/CH3 (無9Gly接頭)具有相似的VEGF阻 斷潛能。但是，蛋白質D2-CH3顯示為它們中最弱的VEGF抑制物(圖9)。對D2-9Gly-Ex3/CH3、D2_9Gly_CH3 和 D2_Ex3/CH3 和 D2-CH3，來自轉染 293 細胞 的條件培養基的Flt-I酶聯免疫吸附測定數據已顯示相似的Flt-I水平(70-90ng/ml)，活 性最低的D2-CH3形式略高( 150ng/ml)。D2_9Gly-CH3和D2-CH3構建體的蛋白質印跡 (圖10)顯示非還原條件下以二聚體形式為主。實施例7D2-9Gly-Fc比所有構建體更好地結合VEGFVEGF結合測定允許我們在無細胞系統中比較我們的可溶性VEGF受體的相對VEGF 結合親和力。簡言之，將包含已知濃度的可溶性受體(濃度在0.29_150pM的范圍內)的條件培 養基連續稀釋并與IOpM VEGF混合。然后通過ELISA測量未結合的VEGF的量。在0. 001 至約0. 2pM的受體濃度，D2-9Gly-Fc以高于其他所有構建體結合VEGF的親和力結合VEGF。D2-CH3具有最低的結合VEGF的親和力(圖11)。實施例8AAV2-SFLT1D29GLYFC基因組成分由兩個 AAV2 ITR和 SFLT1D29GLYFC表達盒組成。 用雜合雞β -肌動蛋白啟動子驅動SFLT1D29GLYFC的表達，該啟動子由CMV IE增強子、雞 β-肌動蛋白啟動子和部分屬于β-肌動蛋白轉錄本的94bp的外顯子1的片段組成。雜合 雞肌動蛋白/兔球蛋白內含子也是CBA啟動子的部分，其包含許多隱藏的轉錄因 子結合位點。多聚腺苷化區域獲自SV40病毒基因組。分別將測試樣AAV2-SFLT1D29GLYFC 和 AAV2 載體對照、含 0. 014%Tween 20 的 磷酸緩沖鹽溶液(批號NBR 15045-108)配制為聚丙烯管中的貯存冷凍液和預先配置的水 溶液。制備測試樣和載體樣，以產生處于適合濃度的給藥溶液，以在所希望的劑量體積達到 預定劑量。當將其通過玻璃體內注射進入食蟹猴(cynomolgus monkey)眼部時，我們發現，如 在房水和玻璃體液中所測量，AAV2-sFLT1D29GLYFC(2x108、2x109和2xl01Q于50ul劑量體積 中)產生劑量依賴的SFLT1D29GLYFC表達，且這些水平在施用AAV載體后持續至少一年。我們在非人靈長類動物(NHP)中進行了激光-CNV實驗，并顯示在這種NHP模型 中，SFLT1D29GLYFC非常有效地抑制脈絡膜新血管形成。在一組實驗中，將2xl08和2xl09載 體顆粒注射入前部/中央玻璃體腔導致劑量依賴的表達，但未在這組實驗中觀察到功效。 當將2X101(lsFLTlD29GLYFC注射入中央玻璃體腔(中央玻璃體注射)時，其在所注射的眼內 表達(例如，顯示mRNA表達的變移上皮細胞和視網膜神經節細胞)，且在房水中測量到治療 有效量lllng/ml、277ng/ml、885ng/ml、967ng/ml、l，057ng/ml 和 1，584ng/ml。玻璃體液中 的水平約比房水中高三倍。這些濃度在抑制激光誘導的脈絡膜新血管形成(CNV)中有效。 圖15顯示另一組接受2X101QSFLT1D29GLYFC的動物中表達的定位。在高劑量組中觀察到了輕度或中度玻璃體混濁，其在大部分動物中隨時間流逝 而消除。雖然在一些動物中觀察到存在抗AAV的T細胞應答，但沒有檢測到抗轉基因 的T細胞應答。接受對照AAV2病毒體的動物也在高劑量下出現渾濁，這表明混濁不是 由轉基因sFLT引起，而是由病毒病毒殼體引起。對玻璃體混濁評分，并與Nussenblatt 等(1985，0pthalmology92 467)開發的系統比較。在一些帶有玻璃體混濁的動物(用 AAV2-SFLT1D29GLYFC或用對照病毒體)中觀察到了炎癥變化，其由trabeclar meshwork和 前房角中的淋巴細胞或漿細胞、玻璃體中的炎癥細胞或視網膜中的血管周淋巴管組成。未 觀察到組織破壞或重建。炎癥持續時間最長的動物具有最低的轉基因表達。在另一組動物中，沒有動物在房水或血清中具有預存的AAV效價。針對sFLTOl蛋 白質，以及抗sFLTOl抗體和載體AAV2的抗體，對血清和房水和玻璃體液進行評估。使用這 種測定法，在此研究的整個過程中，在一些動物(包含載體對照組中的一些動物)中觀察到 時斷時續的不一致的陽性。血清中未發現針對sFLTOl的抗體。血清中具有抗AAV2效價的 動物存在劑量和時間依賴的增加。房水效價最高的動物具有最低的表達，房水效價最低的 動物具有最高的表達。針對其他臨床指征、定性的食物消耗、體檢、體重、眼科檢查、熒光素血管造影術、 視網膜電描記術、張力測量法中的變化，對一些動物進行評估。結束后，對動物進行全面尸 體剖檢，收集和保存組織。處理來自對照和高劑量猴的組織并進行鏡檢。未觀察到對視網膜電活性的影響。對一些動物，在AAV2-SFLT1D29GLYFC后 11 周施用蘭尼單抗(2xl08、2xl09和 2xl01Q 的劑量)，未觀察到不良反應。參考文獻Davis-Smyth 等 EMBO J. ，15，1996,4919Huston，J. S.等(1991)Methods Enzymol. 203,46-88Huston, J. S.等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，85，5879-5883.Johnson，S.等(1991)Methods Enzymol. 203,88-98Karpus, P. A.等(1985) Naturwiss.，72，212—213.Keyt，B. A.等(1996) J.Biol· Chem. 271 :5638_5646.Kortt, A.A.等(1997)Protein Engng，10，423-433.Lee，Y_L.等(1998)Human Gene Therapy，9，457-465Mouz N.等(1996) Proc. Natl Acad. Sci. USA，93，9414—9419.Nielsen 等(1997)Protein Eng. ，10，1Qiu, H.等(1998) J. Biol. Chem. 273 :11173_11176.
權利要求
治療哺乳動物眼部疾病的方法，所述方法包括以約2x108至約2x1010drp的治療有效量對所述哺乳動物的患病眼施用編碼VEGF拮抗劑的病毒載體。
2.權利要求1的方法，其中所述病毒載體是AAV載體。
3.權利要求2的方法，其中所述AAV載體是AAV2。
4.權利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重鏈分子 的VEGF受體。
5.權利要求4的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl(FLT-I)。
6.權利要求4的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl的IgG-樣結構域2(FLT-1D2)。
7.權利要求4的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的Fc部分。
8.權利要求4的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的CH3部分。
9.權利要求4的方法，其中所述VEGF受體通過氨基酸接頭融合至所述IgG重鏈分子。
10.權利要求9的方法，其中所述氨基酸接頭是9Gly接頭。
11.權利要求4的方法，其中所述融合多肽是FLT-1D2-9GLY-FC或FLT-1D2-9GLY-CH3。
12.權利要求1的方法，其中通過玻璃體內注射對患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
13.權利要求12的方法，其中通過中央玻璃體注射對患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
14.權利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗劑表達于患病眼的變移上皮細胞中。
15.權利要求1的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達至少6個月。
16.權利要求15的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達至少1年。
17.權利要求1的方法，其中所述眼部疾病選自濕性年齡相關性黃斑變性(濕性AMD)、 黃斑水腫、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變和糖尿病性視網膜病變。
18.權利要求1的方法，其進一步包含施用第二VEGF拮抗劑。
19.權利要求18的方法，其中所述第二VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重 鏈分子的VEGF受體。
20.權利要求18的方法，其中所述蛋白質是VEGF抗體。
21.權利要求20的方法，其中所述VEGF抗體是貝伐單抗或蘭尼單抗。
22.治療哺乳動物眼部疾病的方法，所述方法包括對所述哺乳動物的患病眼施用編碼 VEGF拮抗劑的核酸，其中所述VEGF拮抗劑以約lOOng/ml至約1，500ng/ml的治療有效量表 達，以治療所述眼部疾病。
23.權利要求22的方法，其中所述病毒載體是AAV載體。
24.權利要求23的方法，其中所述AAV載體是AAV2。
25.權利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重鏈分 子的VEGF受體。
26.權利要求25的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl(FLT-I)。
27.權利要求25的方法，其中所述VEGF受體包含VEGF-Rl的IgG-樣結構域 2(FLT-1D2)。
28.權利要求25的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的Fc部分。
29.權利要求25的方法，其中所述IgG重鏈分子包含重鏈的CH3部分。
30.權利要求25的方法，其中所述VEGF受體通過氨基酸接頭融合至所述IgG重鏈分
31.權利要求30的方法，其中所述氨基酸接頭是9Gly接頭。
32.權利要求25的方法，其中所述融合多肽是FLT-1D2-9GLY-FC或 FLT-1D2-9GLY-CH3。
33.權利要求22的方法，其中通過玻璃體內注射對患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
34.權利要求33的方法，其中通過中央玻璃體注射對患病眼施用所述VEGF拮抗劑。
35.權利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗劑表達于患病眼的變移上皮細胞中。
36.權利要求22的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達至少6個月。
37.權利要求36的方法，其中所述VEGF拮抗劑在患病眼中表達至少1年。
38.權利要求22的方法，其中所述眼部疾病選自濕性年齡相關性黃斑變性(濕性 AMD)、黃斑水腫、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變和糖尿病性視網膜病變。
39.權利要求22的方法，其進一步包含施用第二VEGF拮抗劑。
40.權利要求39的方法，其中所述第二VEGF拮抗劑是融合多肽，其包含融合至IgG重 鏈分子的VEGF受體。
41.權利要求39的方法，其中所述蛋白質是VEGF抗體。
42.權利要求41的方法，其中所述VEGF抗體是貝伐單抗或蘭尼單抗。
43.降低接受用于眼部的AAV基因治療的哺乳動物眼內渾濁的方法，所述方法包括對 所述哺乳動物施用基因治療AAV病毒體，其包含不超過總病毒殼體90%的空病毒殼體。
44.權利要求43的方法，其中所述基因治療AAV病毒體包含不超過總病毒殼體80%、 70 %、60 %或50 %的空病毒殼體。
45.權利要求44的方法，其中所述基因治療AAV病毒體基本上無空病毒殼體。
46.權利要求43的方法，其中所述AAV是AAV2。
全文摘要
本發明提供包含功能性多肽、接頭和IgG重鏈分子的融合蛋白質，以及編碼此類蛋白質的載體，用于抑制具有與新血管形成相關的病理病癥的個體中的血管發生。具體而言，本發明提供編碼融合VEGF拮抗劑的載體來治療哺乳動物眼部疾病，所述VEGF拮抗劑包含融合至IgG重鏈分子的VEGF受體。
文檔編號A61K31/7088GK101951925SQ200980105936
公開日2011年1月19日 申請日期2009年2月20日 優先權日2008年2月20日
發明者A·斯卡里, S·沃茲沃思 申請人:建新公司