用于改善瘤胃發(fā)酵的檸檬類黃酮混合物的制作方法

            文檔序號:988285閱讀:286來源:國知局
            專利名稱:用于改善瘤胃發(fā)酵的檸檬類黃酮混合物的制作方法
            用于改善瘤胃發(fā)酵的檸檬類黃酮混合物描述本發(fā)明涉及檸檬類黃酮混合物用于改善瘤胃發(fā)酵的用途。MMVFA揮發(fā)性脂肪酸ACt擴增循環(huán)的增加Δ Δ Ct相對于PCR中的對照樣品的擴增循環(huán)的增加DGGE變性梯度凝膠電泳Μ. elsdenii 埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)ns不顯著PCR聚合酶鏈反應(yīng)S. bovis牛鏈球菌(Streptococcus bovis)哺乳動物不具有用于消化結(jié)構(gòu)性碳水化合物,即纖維素的合適的消化酶。因此,并 且為了獲取這樣重要的營養(yǎng)素來源,草食動物已經(jīng)構(gòu)筑了容納能夠消化或發(fā)酵這樣的營養(yǎng) 素的共生菌群的發(fā)酵隔室。這些隔室位于宿主中的酶消化之前(反芻動物)或之后(胃后 發(fā)酵物質(zhì),即,馬科動物、兔子)。瘤胃的微生物僅僅部分地使用這些碳水化合物并釋放揮發(fā) 性脂肪酸(醋酸、丙酸和丁酸),作為發(fā)酵產(chǎn)物,這些是反芻動物最重要的能量來源。在瘤胃 中增殖的微生物是能夠適應(yīng)區(qū)室條件和利用所攝入食物的那些。將不同的食物級分,碳水 化合物和蛋白質(zhì)發(fā)酵,并且通過瘤胃中產(chǎn)生的過剩的生物質(zhì)(這又是十二指腸中最終吸收 的蛋白質(zhì)的主要來源)補充VFA產(chǎn)生。纖維素發(fā)酵細菌(分解纖維素的)在6. 4-7的pH下最佳地生長,并且產(chǎn)生的醋酸 多于淀粉和糖發(fā)酵物質(zhì)(分解淀粉的)。最佳PH為約5. 5,并且當這些水平下降時,存在乳 酸相對產(chǎn)生的增加。隨著反芻動物生產(chǎn)系統(tǒng)的加強,基于飼料的飼養(yǎng)已經(jīng)被給予用谷物配制的濃縮定 量食物配給替代,這提高了生長速率和降低了操作成本。然而,濃縮定量配給食物或由快速 發(fā)酵可溶性碳水化合物(淀粉)替代結(jié)構(gòu)性碳水化合物(纖維素)導致出現(xiàn)了一些消化功 能障礙,如酸中毒和timpanism。瘤胃酸中毒可以被定義為通過消化大量富含可發(fā)酵碳水化合物的食物產(chǎn)生的消 化改變,并且這是肥育的小牛中最常見的功能障礙之一。其可以通過使細菌群從革蘭氏陰 性變?yōu)楦锾m氏陽性、有利于如牛鏈球菌或埃氏巨型球菌這些物種的發(fā)育和改變VFA的比例 而導致死亡和發(fā)作。醋酸和丙酸的比例降低,而丁酸和乳酸增加。乳酸的增加影響了瘤胃 運動性,由于不能消除所產(chǎn)生的氣體產(chǎn)生了腹中積氣。急性癥狀是厭食、黃綠色水樣糞便、 瘤胃張力缺乏、跛行、腹部縮回和脫水。亞急性形式包括頻繁腹中積氣、異常毛發(fā)和出現(xiàn)在 屠宰后發(fā)現(xiàn)的肝膿腫。timpanism和腹中積氣被定義為由發(fā)酵過量產(chǎn)生和累積氣體(二氧化碳和甲烷) 所引起的消化性改變,引起蜂窩胃-瘤胃的異常膨脹。通常,加入抗生素物質(zhì)(離子載體,如莫能菌素)使上述瘤胃功能障礙以潛在狀態(tài)存在。然而,這類作為生長增強劑的物質(zhì)逐漸取消導致了這些病癥的出現(xiàn),引起高死亡率或 發(fā)病率,這對于利潤具有負面影響。這種對農(nóng)場生產(chǎn)力的影響非常重要,因此需要這些抗生 素物質(zhì)的可替換物。專利US4443471涉及M-139603的不同化學衍生物和M-139603反芻動物生長增強 劑,及其在降低由瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷量中的用途。專利US5196432涉及α _2腎上腺素受體拮抗劑在治療受乳酸酸中毒影響的反芻 動物中的用途。專利US5709894描述了用于反芻動物的食品添加劑,其含有谷氨酸和玉米發(fā)酵產(chǎn) 物,以提高瘤胃的發(fā)酵。專利申請US2003165487描述了基于米曲霉(Aspergillusoryzae)淀粉酶的方法 和組合物,以提高瘤胃的發(fā)酵效率和防止瘤胃乳酸濃度的有害增加,促進有益的瘤胃微生 物的生長。專利申請US2004009209涵蓋了保持反芻動物的瘤胃健康的方法,由低濕度糖蜜 和緩沖劑的混合物組成。PCT申請W09119489描述了通過將琥珀酸和其他羧酸鹽給予喂養(yǎng)高能量配給的反 芻動物來調(diào)控瘤胃PH水平的方法。PCT申請W09325616涉及包膠于源自可溶性異源蛋白和還原糖的美拉德反應(yīng)的基 質(zhì)中的淀粉產(chǎn)品,以改善反芻動物瘤胃中的微生物發(fā)酵效率。PCT申請W02004009104涉及埃氏巨型球菌(M. elsdenii)的新菌株及其用途,包括 反芻動物的乳酸酸中毒的預(yù)防和治療。PCT申請W02005000035涉及改善瘤胃發(fā)酵的方法,特別是降低甲烷產(chǎn)生,其包括
            給予獲自新鮮苜蓿的可溶性苜蓿提取物。EP1323354描述了一種基于植物材料的天然飼料添加劑。已知將作物和食品加工工業(yè)的副產(chǎn)物飼喂給家畜。例如,柑橘副產(chǎn)物飼料可以用 作反芻動物飼料系統(tǒng)的成分。它們含有各種用于瘤胃微生物的能量物質(zhì)(Bampidis等, Animal Feed Science andTechnology (動物飼料科學技術(shù)),Elsevier,vol. 128,2006, 175-217)。JP-52 028922描述了其中含有苦味桔皮的藥物。將該藥物飼喂給馬、牛或家禽。本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了檸檬類黃酮(尤其是柚皮苷)、苦味的柑桔提取物和 海泡石的混合物能夠調(diào)節(jié)得自給予濃縮定量配給的微生物發(fā)酵過程、提高微生物發(fā)酵過程 的效率和限制某些直接涉及瘤胃酸中毒過程的物種,尤其是牛鏈球菌。因此,本發(fā)明涉及包含柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的混合物在改善反芻 動物中瘤胃發(fā)酵的用途。在本申請中,“反芻動物”包括牛、綿羊、山羊和駱駝(camelide)物種。該混合物相對于現(xiàn)有技術(shù)的狀況呈現(xiàn)出一系列優(yōu)勢,使其在反芻動物營養(yǎng)領(lǐng)域中 具有高價值。該優(yōu)勢是混合物中的所有成分是天然來源的產(chǎn)物,并且容易獲得。另一方面, 混合物易于操作并且可以根據(jù)本領(lǐng)域?qū)<乙阎墓I(yè)配制方法來制備。該混合物還具有限 制涉及瘤胃酸中毒出現(xiàn)的某些物種(尤其是牛鏈球菌)生長的附加優(yōu)勢。因此,特別地,本 發(fā)明涉及所述混合物用于改善反芻動物發(fā)酵的用途,該反芻動物發(fā)酵受到瘤胃中天然細菌 叢不平衡的損害。本發(fā)明還涉及所述混合物用于防止瘤胃發(fā)酵損害的用途,這種瘤胃發(fā)酵損傷可能是由于瘤胃中天然細菌叢不平衡所引起的。特別的目的是使用本發(fā)明的混合物 來限制引起瘤胃酸中毒的細菌的生長,如乳桿菌屬(Lactobacillusspp),例如嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus),以及尤其是牛鏈球菌。將混合物以100至300ppm濃度(100至300g/噸)的固體形式加入飼料中時是有 活性的。這是基于體外研究,其中在100至300ppm的劑量范圍下分析了天然混合物的作用。根據(jù)一個方面,本發(fā)明混合物中的柚皮苷含量為10%至25%重量,優(yōu)選15%至 25%重量,更優(yōu)選約20%重量。根據(jù)第二個方面,本發(fā)明混合物中的苦味柑桔提取物含量為10%至65%重量,優(yōu) 選20%至60%重量,更優(yōu)選約40%重量。注意到苦味的柑桔提取物包括柚皮苷,因此本發(fā) 明混合物中的柚皮苷總含量將高于以上所示的含量。根據(jù)第三個方面,柚皮苷、苦味的柑桔提取物和海泡石的含量為混合物重量的 100%。在第一個實施方案中,本發(fā)明涉及包含10%至25%重量柚皮苷、10%至65%重量 苦味柑桔提取物和補足量至100% (混合物的補足)重量海泡石的混合物在改善反芻動物 中瘤胃發(fā)酵的用途。在源自以上的實施方案中,混合物包含15%至25%重量柚皮苷、20%至60%重量 的苦味柑桔提取物和補足量至100%的海泡石,更特別地為,20%重量的柚皮苷、40%重量 的苦味柑桔提取物和40%重量的海泡石。以上所示的比例(%重量)是相對于混合物的總重。在另一個實施方案中,使用以上混合物調(diào)節(jié)由給予濃縮食品定量產(chǎn)生的微生物發(fā) 酵過程。在另一個實施方案中,使用以上混合物限制引起瘤胃酸中毒的細菌(尤其是牛鏈 球菌)的生長。因此,本發(fā)明還涉及以上的混合物用于防止或治療瘤胃酸中毒的用途,包括 在此所述的急性和亞急性形式。在另一個實施方案中,使用以上混合物優(yōu)化反芻動物(尤其是牛)集約肥育中的 生產(chǎn)力。在另一個實施方案中,以上混合物的使用包括將其以重量計的10至2000ppm濃度 的固體形式加入飼料中,尤其是50至lOOOppm,更優(yōu)選100至300ppm。類黃酮是一類水溶性的植物色素,對其的醫(yī)學關(guān)注正在增長中。柚皮苷是一種獲 自柑桔類水果(葡萄柚(Citrus paradisi)和苦橙(Citrus aurantium)皮并在很大程度 上引起其苦味的類黃酮,特別是一種糖基化的黃烷酮。在果漿以及植物的葉、花和種子中也 發(fā)現(xiàn)了該物質(zhì)。一些研究表明和其他類黃酮相同,柚皮苷的生物合成受到環(huán)境和遺傳因素的影 響,這些因素決定了這些化合物濃度水平的不同,估算15至18g/kg新鮮葡萄柚皮為常見的 濃度值。皮中的含量也是不同的,未成熟的水果中高于成熟的水果。柚皮苷用于香料中以及給糖果、飲料和焙烤制品增加風味,柚皮苷還因為其抗氧 化和抗誘變特性而得到使用,并且作為油穩(wěn)定劑??辔兜母探厶崛∥锟梢酝ㄟ^本領(lǐng)域的常規(guī)操作(如提取、過濾、濃縮、沉淀、澄清 和最終的干燥)獲自碾碎的柑桔類水果(尤其是苦橙)。可以在二元的鏈烷醇/水系統(tǒng)中進行提取處理,其中鏈烷醇選自甲醇、乙醇、丙醇等。優(yōu)選使用甲醇。典型的苦味柑桔提取物 將包含31. 5至71. 5%重量的總類黃酮,例如45至55%重量(如果通過HPLC測定)。特別 地,類黃酮包括柚皮苷、新桔皮苷和枸桔苷。通常,總類黃酮含量將包括(a)17.5至35. 重量的柚皮苷,例如,25至27%重量,(b)7. 7至16. 9%重量的新桔皮苷,例如,11至13%重 量和(c) 2. 1至6. 5%重量的枸桔苷,例如,3至5%重量。隨后,海泡石是天然的含水硅酸鎂,其來源歸功于海洋化石的石灰質(zhì)沉積。其是白 色或淡黃色的粘土礦物。從遠古時代開始就將其用作粉末狀牙膏。將本發(fā)明的組合物應(yīng)用于遭受瘤胃發(fā)酵下降或處于遭受瘤胃發(fā)酵下降風險中的 反芻動物。特別地,這些反芻動物包括1)飼喂高濃度(谷物)膳食的反芻動物,例如,用于改善飼料轉(zhuǎn)化率和避免酮癥過 程的出現(xiàn),尤其是如果反芻動物為a)在加強體系下肥育的動物;b)當濃縮物供給達到最高比例時,處于泌乳高峰期的高泌乳產(chǎn)量的雌性;或c)帶有超過一只小羊的沉重懷孕的母羊或山羊,其攝入能力已經(jīng)受到限制。2)接受突然的膳食變化的反芻動物,尤其是該變化為a)從牧場(高_粗糧)改變至高濃縮定量;或b)從可消化性低的淀粉(高粱或玉米)改變至消耗性高的(小麥或大麥)。為了說明的目的,提供以下的實施例為更好地理解本發(fā)明。實施例1 :100和300ppm劑量的混合物在牛中的效果基 于 Theodorou M K 等,Animal Feed Science and Technology, 48 (3), p. 185-197,1994年8月提出的實驗方案,分析了發(fā)酵動力學。所用的接種物是來自商業(yè)強 化育肥操作的牛的瘤胃液體。將本發(fā)明的混合物(20 %重量柚皮苷、40 %重量苦味柑桔提取 物和40%重量海泡石)接種接種物和以常用比例(80 20濃縮物秸稈)補充谷物秸稈 的商業(yè)牛飼料(600mg)。在含有800ml接種物稀釋物的密封瓶子中以兩批(2頭牛)重復三 份培養(yǎng)該混合物劑量。測試持續(xù)48小時,在2、4、6、12、24、36和48h時記錄瓶內(nèi)的壓力。從壓力值建立 氣體的產(chǎn)生。在培養(yǎng)10小時后,將一個瓶子分開,并將其內(nèi)含物取樣,用于測定VFA和DNA 分離,用于分子遺傳測試。通過QIAamp DNAStool Mini 試劑盒(Qiagen Ltd,Carwley,West Sussex,UK)
            進行DNA提取。通過分光光度計(NanoDrop )測定dna濃度和純度(總dna),在260和 280nm處測量吸光度。通過實時PCR使用ABI PRISM 7000序列檢測系統(tǒng)將細菌和牛鏈球菌DNA定量, Ir (Maeda H^, FEMS Immunology andMedicalMicrobiology, 39 (1), p. 81-86, 2003
            年 10 月)和牛鏈球菌(TajimaK 等,Applied and Environmental Microbiology, 67 (6), p. 2766-2774,2001年6月)使用了特定的引物。作為用于計算培養(yǎng)基中總細菌濃度的參 考,我們使用了通過瘤胃液體的差速離心(500g,10分鐘,接著20.000g,20分鐘)獲得的 細菌樣品的DNA濃縮物。使用Livak K J等,Methods (圣地亞哥,加利福尼亞),25 (4), p. 402-408,2001年12月所述的Δ Δ Ct表達,相對于總細菌的來表示牛鏈球菌的豐度。通過DGGE 使用特定的引物(NUbel U 等,Journal ofBacteriology, 178(19),p. 5636-5643,1996年10月)進行了細菌生物多樣性。電泳使用了 8%丙烯酰胺凝膠,其具 有50% -65%變性脲/甲酰胺梯度,在80V下持續(xù)16小時。使用Amersham Biosciences (瑞 典)試劑盒將凝膠染色,并且在掃描后,使用UPGMA (UnweightedPair-Group Method Arithmetic averages)程序分析條帶模式。根據(jù)2X2(混合物X劑量)因子設(shè)計分析混合物對瘤胃發(fā)酵的效果,考慮了將動 物認為是實驗?zāi)K。MM1.-氣體產(chǎn)牛在之前所述的體外條件下,培養(yǎng)基中包含混合物對VFA產(chǎn)生或總VFA產(chǎn)生的動力 學沒有效果。實驗處理也沒有影響最重要的VFA的摩爾比例,其顯示出60%醋酸、29%丙酸 和9%丁酸的平均比例。2.-通過PCR的實時細菌定量表1顯示了通過分光光度測定(260nm)獲得的總DNA濃度,并且我們可以看到培 養(yǎng)基中的DNA濃度是怎樣沒有受到包含混合物改變的。然而,通過更特異性的程序(實時 PCR)的細菌DNA量的測定表明混合物的包含使得細菌DNA明顯增加,表明細菌生長增加。 由于混合物的存在引起的微生物生長的明顯差異的存在(在氣體(C02+NH3)產(chǎn)生或更高的 VFA釋放中沒有發(fā)現(xiàn)所述差異)表明混合物對微生物合成效率具有積極作用。同一表格還顯示了牛鏈球菌的特定DNA序列拷貝的濃度,已經(jīng)鑒定該細菌為乳酸 的主要生產(chǎn)者之一,并因此涉及由瘤胃酸中毒引起的狀況。加入混合物使得培養(yǎng)基中該 物種濃度得到非常明顯的限制,所述濃度表示為相對于細菌DNA拷貝總數(shù)的對應(yīng)于牛鏈 球菌(2(ACt)*1000)的DNA拷貝的數(shù)量或相對于對照培養(yǎng)基的拷貝數(shù)量的百分比減少 (2(Δ ACt))。表1 通過實時PCR計算的培養(yǎng)基中的不同DNA類型的濃度;作為細菌生物多樣性指標的培養(yǎng)基中的DNA 16S拷貝數(shù)量 當我們分析混合物的劑量對以上參數(shù)的作用時,我們發(fā)現(xiàn)使用該濃度的混合物沒 有顯著的差異。因此,所獲得的結(jié)果表明100和300ppm的初始濃度超過了所述化合物對瘤 胃發(fā)酵過程的活性極限。另一方面,盡管研究混合物改變了牛鏈球菌的濃度,但其沒有改變 群體的生物多樣性。這證實了所述物質(zhì)對某些微生物群的選擇性作用。3. ~結(jié)論和優(yōu)點
            給研究混合物補充來自在商業(yè)強化育肥條件下給予的濃縮食物定量的接種物使 得瘤胃發(fā)酵過程產(chǎn)生了顯著變化?;旌衔锏拇嬖跊]有改變氣體或VFA產(chǎn)生水平。然而,其對接種物中的不同微生物 群具有顯著的作用。盡管促進了種群合成水平的顯著提高,但其顯著抑制了牛鏈球菌生長。
            權(quán)利要求
            包含10%至25%重量的柚皮苷、10%至65%重量的苦味柑桔提取物和補足量至100%重量的海泡石的混合物在改善反芻動物瘤胃發(fā)酵中的用途。
            2.權(quán)利要求1的用途,其中混合物包含15%至25%重量的柚皮苷、20%至60%重量的 苦味柑桔提取物和補足量至100%的海泡石。
            3.權(quán)利要求2的用途,其中混合物包含20%重量的柚皮苷、40%重量的苦味柑桔提取 物和40%重量的海泡石。
            4.權(quán)利要求1至3任一項的用途,其中苦味柑桔提取物包含31.5%至71. 5%重量的總 類黃酮。
            5.權(quán)利要求1至3任一項的用途,其中苦味柑桔提取物包含44至55%重量的總類黃酮。
            6.權(quán)利要求4或5的用途,其中總類黃酮包含(a)17. 5至35. 重量的柚皮苷,(b) 7. 7 至16. 9%重量的新桔皮苷和(c) 2. 1至6. 5%重量的枸桔苷。
            7.權(quán)利要求4或5的用途,其中總類黃酮包含(a)25至27%重量的柚皮苷,(b)ll至 13%重量的新桔皮苷和(c) 3至5%重量的枸桔苷。
            8.權(quán)利要求1至7任一項的用途,其中所述改善調(diào)節(jié)了給予濃縮食物定量的反芻動物 中的微生物發(fā)酵過程。
            9.權(quán)利要求1至7任一項的用途,其中所述改善包括限制引起瘤胃酸中毒的細菌的生長。
            10.權(quán)利要求9的用途,其中引起瘤胃酸中毒的細菌是牛鏈球菌(Streptococcus bovis)ο
            11.權(quán)利要求1至7任一項的用途,其中所述改善優(yōu)化了反芻動物在強化育肥中的生產(chǎn)力。
            12.權(quán)利要求11的用途,其中反芻動物是牛。
            13.權(quán)利要求1至8任一項的用途,其包括以10至2000ppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
            14.權(quán)利要求1至8任一項的用途,其包括以50至IOOOppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
            15.權(quán)利要求1至8任一項的用途,其包括以100至300ppm重量濃度的固體形式將混 合物加入到飼料中。
            全文摘要
            本發(fā)明涉及柚皮苷、苦味柑桔提取物和海泡石的混合物用于改善反芻動物瘤胃發(fā)酵的用途。
            文檔編號A61K31/35GK101909616SQ200980102006
            公開日2010年12月8日 申請日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日
            發(fā)明者F·J·克雷斯波, F·埃雷迪亞, J·巴爾塞爾斯, M·D·M·塞拉 申請人:艾克斯奎姆股份有限公司
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