專利名稱：橋梁分子1的小rna干擾片段的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體是用于抑制惡性膠質瘤細胞的增殖和促進膠質 瘤細胞凋亡的橋梁分子1的小RNA干擾片段。
背景技術：
RNA干擾是由雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默，是真核生物中一種非常 保守的機制，它與協同抑制、轉錄子沉默以及發育等許多重要的生物學過程密切相關。
RNA干擾依賴于小干擾RNA(Small interference RNA， siRNA)與耙序列之間嚴格 的堿基配對，具有很強的特異性，涉及眾多基因和蛋白復合物，構成了一個以小RNA為 核心的真核基因表達調控系統，它可以在染色質水平、轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水 平參與基因表達的調節。RNA干擾技術為人們迅速、準確的剖析基因的功能，分析基因 之間錯綜復雜的聯系和相互作用提供了極為有用的工具，同時也為人們預防和治療癌癥 和病毒疾病提供了新的思路，例如研究信號傳導通路和基因功能RNAi能夠在哺乳動物 中降低特異性基因的表達，制作多種表型，而且抑制基因表達的時間，控制基因表達的 部位，以開展基因治療的新途徑。 惡性膠質瘤是一類惡性程度極高的惡性腫瘤，占顱內原發腫瘤的40%和中樞神 經系統惡性腫瘤78%。惡性膠質瘤向周圍正常腦組織侵襲浸潤是其致死的主要原因，盡 管現代的診斷和治療技術已經有了長足的發展，其中位生存時間仍然不超過15個月。迄 今為止惡性膠質瘤侵襲浸潤的分子機制，尚未完全明確。 橋梁分子l(Intersectinl)是一種在進化上高度保守的具有多個功能域的蛋白，基 因位于人類的第21條染色體，橋梁分子1借助自身的各種功能域可以與多種蛋白結合從 而發生相互作用的特性。目前的研究表明橋梁分子1既能夠參與胞吞胞吐作用又參與細 胞內信號傳導通路的調節。
發明內容
本發明是為了解決惡性膠質瘤病人腫瘤惡性增殖的問題，提供一種橋梁分子1 的小RNA干擾序列。 本發明是按以下技術方案實現的。 —段橋梁分子1的小RNA干擾片段，該片段降低橋梁分子1蛋白的表達，并對 橋梁分子1參與的細胞增殖和凋亡產生抑制作用，該片段的RNA序列為
5' -UUUCAGUACAACUAUGUCCUU-3'。 所述橋梁分子1的小RNA干擾片段，轉染入人膠質瘤細胞系后，特異的降解與 其互補的橋梁分子1的信使RNA，具有抑制惡性膠質瘤LN-229細胞的增殖和促進凋亡的 作用。 鑒于在細胞內信號傳導方面，橋梁分子1能夠調控惡性膠質瘤細胞的增殖和凋 亡，因此通過小RNA干擾片斷進行基因敲除可以靶向抑制橋梁分子1的表達，并對橋梁分子l參與的細胞增殖和凋亡功能產生抑制作用。將其制成藥物，為腫瘤的基因治療提 供一種可行的技術手段，用于治療腫瘤病人。
圖1是人惡性膠質瘤細胞轉染橋梁分子1后的橋梁分子1蛋白表達水平； 圖2是體外細胞增殖轉染小RNA組的細胞增殖能力； 圖3是細胞MTT分析實驗結果； 圖4A是用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒對照組檢測結果； 圖4B是用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒干擾組檢測結果； 圖5是流式細胞儀檢測細胞色素C的釋放情況。
具體實施例方式
—.實驗材料來源 人惡性膠質瘤細胞LN-229細胞株由美國德克薩斯大學MD Anderson癌癥中心提 供，所使用的流式細胞儀為天津市腫瘤醫院購置的EPICS XL型儀器(Coulter Inco.USA)， 橋梁分子1抗體來自于Abeam公司，MTT購自Sigma公司，Annexin V-FITC凋亡檢測試 劑盒購自Biovision公司，細胞色素C抗體購自Biolegend公司，細胞培養耗材購自coming 公司。 二 .橋梁分子1小RNA干擾序列的設計與合成 依據Ambion公司在網上提供的小RNA設計軟件設計特異的小RNA干擾片段， 并由上海英俊生物公司合成。 小RNA干擾片段序列為5' -UUUCAGUACAACUAUGUCCUU-3'。
三.橋梁分子1小RNA干擾序列轉染惡性膠質瘤細胞 轉染前一天，先將l()5膠質瘤細胞LN-229接種于細胞培養板中，每孔中加入500 微升無抗生素的培養液，使轉染時的細胞密度能夠達到30%-80%。轉染時采用脂質體 2000(Invitrogen)進行稀釋，然后與2微升的小RNA混合并加入到細胞中，24小時后進行 各種細胞功能學實驗。 四.檢測轉然后的細胞中橋梁分子1的表達水平 免疫印跡方法檢測橋梁分子1的表達水平將對照細胞和intersectinl-siRNA轉
染的細胞用細胞裂解液進行細胞裂解，并應用超聲破碎儀輔助裂解，然后置于沸水中靜 置IO分鐘。處理后的樣本進行離心以取出沉淀。隨后應用蛋白定量檢測試劑盒對樣本 進行蛋白定量檢測，然后進行蛋白電泳，并將樣本蛋白傳遞至硝酸纖維素薄膜上，用5% 煉乳溶液進行室溫封閉1小時，然后加入intersectinl抗體，在4oC冰箱中靜置過夜，第 二天用二抗進行室溫孵育l小時，然后應用ECL方法進行X光片曝光處理，以得到蛋 白條帶。根據曝光條帶的深淺判斷蛋白的表達量。通過此方法檢測結果，證實了經過 intersectinl-siRNA轉染后的細胞，其橋梁分子1的表達量有顯著降低，見圖1。
五.檢測轉染后的惡性膠質瘤細胞的增殖能力 實驗前一天將對照組細胞和轉染組細胞接種于24孔細胞板中，實驗過程中每一 天將細胞用胰蛋白酶進行消化，顯微鏡下計數，連續計數一周。將每一天計數的結果進行比較分析，發現小RNA干擾組的細胞其增殖能力有顯著下降。siintersectinl/LN229為 轉染小RNA組，scr/LN229為對照組，見圖2。
六.MTT方法分析細胞的凋亡情況 實驗前一天將對照組細胞和轉染組細胞接種于96孔細胞板中，實驗過程中每天 用MTT方法檢測每組細胞的凋亡情況，具體是每孔加入20微升MTT溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續培養4h。終止培養，小心吸去孔內培養液，每孔加入150微升二甲基 亞砜，置搖床http:〃www.hudong.com/wiki/% E6 % 91 % 87 % E5 % BA% 8A上低速振蕩 IO分鐘，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫javascript:linkredwin('酶聯免疫')；檢測儀 OD490納米處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔(培養基、MTT、 二甲基亞砜)。結 果表明轉染組的細胞更趨向于凋亡。siintersectinl/LN229為轉染小RNA組，scr/LN229為 對照組，見圖3。 七.應用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡 轉染組細胞和對照組各收集5X 105個細胞，用500微升的PBS液體進行重懸。 每組加入5微升的Annexin V-FITC和1微升的SYTOX染料，室溫孵育10分鐘。然后應 用流式細胞儀進行檢測。結果表明轉染組凋亡細胞顯著多于對照組，見圖4。
八.應用流式細胞儀檢測細胞色素C的釋放情況。 實驗前一天將對照組細胞和轉染組細胞接種于35mm細胞培養皿中，實驗當天 轉染組細胞和對照組各收集105個細胞，離心1000rpm 5分鐘，然后用500微升的PBS液 體進行重懸，再分別用綠色熒光標記的細胞色素C抗體進行孵育1小時(避光)，最后應 用流式細胞儀檢測兩組細胞中的細胞色素C的分泌情況。結果表明干擾組的細胞色素C 的表達顯著高于對照組，表明干擾后的細胞更趨向于凋亡，見圖5。SEQUENCE LISTING<110>天津醫科大學附屬腫瘤醫院<120>橋梁分子1的小RNA干擾片段<130>人<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>RNA<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum<220><221>RNA<222>(1)..(21)<223><400>1uuucaguaca acuauguccu u 2權利要求
一段橋梁分子1的小RNA干擾片段，其特征在于該片段降低橋梁分子1蛋白的表達，并對橋梁分子1參與的細胞增殖和凋亡產生抑制作用，該片段的RNA序列為5’-UUUCAGUACAACUAUGUCCUU -3’。
2. 根據權利要求1所述橋梁分子1的小RNA干擾片段，其特征在于該小RNA干擾片段，轉染入人膠質瘤細胞系后，特異的降解與其互補的橋梁分子l的信使RNA，具有抑制惡性膠質瘤LN-229細胞的增殖和促進凋亡的作用。
全文摘要
本發明公開了一段橋梁分子1的小RNA干擾片段，屬于生物技術領域。本發明合成一段橋梁分子1的小RNA干擾片段，該片段能夠降低橋梁分子1蛋白的表達，并能夠促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。橋梁分子1的小RNA干擾片段轉染入人膠質瘤細胞系后，特異的降解與其互補的橋梁分子1的信使RNA，具有抑制惡性膠質瘤LN-229細胞的增殖和促進凋亡的作用，為腫瘤的基因治療提供一種可行的技術手段。
文檔編號A61P35/00GK101691571SQ20091030731
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月18日 優先權日2009年9月18日
發明者付麗, 牛瑞芳, 王冰冰, 谷峰, 馬勇杰 申請人:天津醫科大學附屬腫瘤醫院