一種含有Wnt蛋白的生發劑的制作方法

專利名稱：一種含有Wnt蛋白的生發劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生發劑，尤其涉及一種通過Wnt/ {3 -catenin信號通路發揮作用的Wnt蛋 白的促進毛囊生長的生發劑，尤其涉及一種含有Wnt3a蛋白的促進毛囊生長的生發劑。
背景技術：
毛和發為哺乳動物所特有，是長在全身皮膚表面的角化的絲狀結構，為表皮衍生的附屬 器。獸皮膚的毛極多，對保持體溫和對抗機械性損害起重要作用。人類的毛已相當退化，但 毛囊有豐富的神經末梢，是靈敏的觸覺感受器。同時，人類的毛影響著人的外表，具有重要 的社會意義。
伸出皮膚外的毛稱毛干，埋在皮膚內的稱毛根，毛根包在由上皮和結締組織組成的鞘狀 毛囊內。毛根和毛囊的下端結合在一起，形成膨大的毛球。毛球的地面內凹，其內容納毛乳 頭，也叫真皮乳頭。
毛囊是具有周期性生長特性的一個特殊的亞器官，由呈同心圓排列的三層結構(毛干、 內根鞘、外根鞘)組成，包含十多種細胞類群(見圖l)。毛囊位于真皮和皮下組織中，較 短的毛囊位于真皮中。在縱切面上，生長期的毛囊可分為三段①漏斗部，其上端為毛囊的 開口，下端到皮脂腺開口；②峽部，此段較短，上端至皮脂腺開口，下端至立毛肌附著處； ③下段，由立毛肌附著處到毛囊底部，包括內根鞘、外根鞘和毛球。整個毛囊由結締組織鞘
所包繞。結締組織鞘也稱纖維鞘，其中富含m型膠原和彈性纖維，并有豐富的感覺神經末梢
和血管。
毛囊干細胞位于毛囊上段與立毛肌連接處的隆突區，在形態學和生物化學上表現為原始 細胞，細胞動力學特征是標記保留細胞，并有若干明確的分子標記物。毛囊干細胞具有三向 分化潛能下行分化為毛囊的各種類群的細胞，向上迀移分化為皮脂腺細胞以及在特定情況下分化為皮膚的表皮細胞。目前，隆突區是毛囊干細胞棲息地的學說已經得到普遍認同。
哺乳動物的毛囊呈周期性生長，在哺乳動物的整個生命期間循環往復(見圖2)。毛囊 周期分為三個期生長期的毛囊和毛活躍生長；退化期的毛停止生長，毛囊和毛球發生退化 ;靜止期的毛囊和毛球萎縮，毛易脫落。
在生長期末，毛球發生一系列退化性變化。在退化期開始時，毛母質細胞停止增殖，同 時，外根鞘上皮退縮成角化的上皮管，包過毛干的球形下端，形成杵狀毛。
在靜止期，杵狀毛下方的上皮細胞柱萎縮并向上方移動，游離的毛乳頭伴隨在上皮柱下 端，并有結締組織尾隨在退縮的上皮柱后面。最后，杵狀毛上移到立毛肌附著毛囊處。在靜 止期中，某些因素如激素、藥物等激活毛囊干細胞，則毛囊進入下一個生長期。
生長期開始時，毛乳頭與一部分圍繞它的未分化細胞發生重建。毛芽生成新的毛母質， 并增大和變長，沿遺留的結締組織鞘與毛乳頭一起向下移，同時分化形成內根鞘和毛干。新 生的毛干向上生長，將原有的杵狀毛推出。
人體的毛脫落不明顯，也不規則，因為相鄰的毛處于生長周期的不同時期，不利于研究 。而小鼠的毛囊呈波浪形生長，即同一橫截面的毛囊處于同一周期，且整個背部的周期頭尾 相差僅約2天，給毛囊的研究提供了便利的模型。
Wnt基因是鼠類乳腺癌病毒(MMTV)誘導的小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因，由 Nusse等人于1982能發現并報道，當時稱為int基因。后來的研究發現int基因與Sharma 報道的果蠅的無翅基因wingless (wg)為同源基因，因而將兩者合稱為Wnt。近十年來對果 蠅、兩棲類、哺乳類到人類Wnt族基因，編碼產物及其生物學效應的研究表明，Wnt信號途 徑參與了從胚胎到成體的一系列控制細胞生長發育及分化的調控，特別是在干細胞和腫瘤生 物學研究中越來越突出了其潛在的價值。
Wnt蛋白家族是一系列高度保守的分泌性的糖蛋白。動物體早期發育中，Wnt信號決定 背腹軸的形成、胚層建立、體節分化、組織或器官形成等一系列重要事件，并直接控制著增 殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等細胞的命運。同時，Wnt信號途徑也與腫瘤發生密切相關 。許多Wnt蛋白分子發揮作用都是通過其經典信號途徑，經典Wnt信號途徑也稱為Wnt/{3 -catenin信號途徑。在不同物種中Wnt/{3 -catenin信號轉導的分子機制具有極高的保守性
Wnt/e-catenin信號通路對毛囊的生長和發育都起了非常重要的作用。胚胎發育時持續 過表達Wnt通路的抑制劑DKKl，毛囊完全不能生成，出生后過表達DKK1抑制毛囊的生長。相
4反，持續表達穩定形式的e-catenin，小鼠毛囊生成的數量增多。
Wnt3a是wnt家族成員之一，Wnt3a參與肺、牙、毛囊等器官的早期形成，調節造血干細 胞的自我更新。體外培養發現，wnt3a能夠促進表皮干細胞和間充質干細胞的增殖，抑制其 分化。毛囊中的真皮乳頭細胞能夠誘導表皮干細胞的分化，體外培養研究發現，Wnt3a能夠 維持真皮乳頭細胞的這種誘導作用。
隨著社會競爭加劇，各種壓力增大，高脂性飲食增多，現代生活導致睡眠減少，都會使 脫發的發病率呈逐漸上升以及愈來愈年輕化的趨勢。近年來，在我國城市醫院(特別是大城 市醫院)中脫發患者的門診量在不斷上升。
早期的生發劑，從來自民間醫學的藥方、偏方為主，以改善微循環達到促進生發作用， 后來發展為以臨床研究方法為主，根據脫發的生理病理原因有針對性地研制產品，如應用擴 張血管藥促進微循環，調節激素及抗炎殺菌藥劑等。
目前，我國市場上各種各樣的生發劑品種繁多，以中藥品種為主，大多為外用藥。西藥 及內服藥較少。市場上大部分產品的療效不盡如意，患者使用后癥狀改善不明顯。有關調査 還顯示，有98%左右的脫發患者認為市場上傳統的治療脫發藥物不能帶來滿意療效，大多數 患者在試用生發劑半年無效時會選擇棄用。即便如此，由于人們生活水平不斷提高，越來越 注重外表美的問題，因此購買生發劑的人不斷增多。因此，如何能有效地治療脫發，是廣大 患者更為關心的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種含有Wnt蛋白的生發劑。它使毛囊呈現生長期表型，毛囊從靜 止期向生長期轉化，具有起效快，效果明顯，機制清楚等優點，對開發促毛發生長藥物具有 重要的社會和經濟意義。
本發明的技術方案是
所述生發劑包含通過Wnt/{3 -catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白。 所述通過Wnt/e -catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白為Wnt3a蛋白。 通過Wnt/e-catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白在制備治療脫發藥物中的應用。 毛囊的周期性生長受復雜機制的調控。Wnt信號通路在毛囊發育和再生中都發揮重要作 用，可以篩選到有明顯促毛作用的wnt蛋白為基礎，開發促進毛囊生長的生發劑。作為皮膚 的附屬器官，毛發具有重要的生理學與社會學功能。毛發缺失給患者帶來很大的心理負擔，開發促毛發生長藥物具有重要的社會和經濟意義。
Wnt3a蛋白通過直接激活wnt經典信號通路，使毛囊從靜止期迅速進入生長期，從而促進 毛囊生長。以此為基礎開發的生發劑，具有效果明顯，起效快，機制清楚等優點，為臨床脫 發患者帶來福音。
下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。


圖l是生長期毛囊結構圖； 圖2是毛囊周期圖； 圖3為AdWnt3a感染293細胞的情況； 圖4為小鼠注射AdWnt3a后14天的整體照相；
圖5A和5B為分別注射AdGFP組和注射AdWnt3a組經HE染色的毛囊生長圖示； 圖6A和圖6B為AdWnt3a處理后毛囊器官培養l天和4天對照圖示；加入AdWnt3a組毛囊生長 明顯加快。
圖7為小鼠注射AdWntl0b后14d的整體照相；
圖8A和圖8B分別為注射AdWntl0b和注射AdGFP組經HE染色的毛囊生長的圖示。
具體實施例方式
本實施例所采用的試劑均為用于細胞實驗的市售產品。 WilliamE無血清培養基自配，配方見實施例2。 C57BL/6小鼠購自第三軍醫大學實驗動物中心。 實施例l AdWnt3a的構建與擴增
采用何通川等的AdEasy系統，獲得AdWnt3a的滴度為10、fu/ml 。參考基因序列 NM—011718.1。(具體方法見文獻1. He TC， Zhou S， da Costa LT， et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A， 1998， 95:2509-14 2. Luo丄Deng ZL， Luo X， et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc， 2007， 2:1236-47.)實施例2 Wnt3a促進毛發生長試驗 (1)動物實驗
1) 注射取8周齡雌性C57BL/6小鼠，此時小鼠背毛處于靜止期，分組如下重組腺病毒 AdWnt3a注射組36只，AdGFP對照組(空載體)36只，PBS對照組36只。
腹腔注射100yl 1%戊巴比妥。約5分鐘后，小鼠處于麻醉狀態，用剃毛器小心剃除小鼠 背部被毛，注意不要剃傷皮膚和拔動毛囊。
剃毛后，沿背中線中間取一點，皮內注射25yl AdWnt3a，病毒滴度l()Spfu/ml，注意不 要注射到皮下。注射后，注射部位產生一個直徑約5mm的皮丘，用3%苦味酸沿皮丘邊緣標記 注射部位。
2) 觀察注射后每天觀察并照相，注意注射部位皮膚顏色變化和毛囊生長情況。
3) 取材注射后3天、5天、7天、9天、14天、28天分別處死6只小鼠，取注射部位皮膚 ，4%多聚甲醛固定過夜后，常規石蠟包埋，5ym厚度切片，進行HE染色觀察。
HE染色步驟
① 切片梯度水合二甲苯I15分鐘一二甲苯II15分鐘一100%乙醇13分鐘一95%的乙醇11 3分鐘一85%乙醇3分鐘一75%乙醇3分鐘一50%乙醇3分鐘一蒸餾水洗3分鐘。
② 蘇木素染色2分鐘，自來水沖洗，至切片發藍。
③ 分色1%鹽酸乙醇分色3-5秒(提插數下)，且切片變紅，顏色較淺即可。
④ 返藍自來水浸泡15分鐘或溫水(約5(TC) 5分鐘。(顯微鏡下見細胞核藍色，細胞 質和結締組織無色為宜)
復染伊紅液2分鐘。
⑥ 梯度脫水50%乙醇3分鐘一75%乙醇3分鐘一85%乙醇3分鐘一95%的乙醇3分鐘一 100%乙醇I3分鐘一100%乙醇II 3分鐘用吸水紙吸干多余乙醇，二甲苯I3分鐘一二甲苯II 3分鐘。
⑦ 封片將玻片從二甲苯中取出，用吸水紙搽去組織片周圍的二甲苯，迅速滴一滴中性 樹脂于組織上，取清潔的蓋玻片，在酒精燈上烘一下去濕，以未烘的一面輕輕蓋在樹膠上， 應避免產生氣泡。
⑧ 觀察顯微鏡下觀察，照相。(2)器官培養
1) 取新生7天健康C57BL/6小鼠一只，此時毛囊處于生長期，易于分離。頸椎脫臼處死 ，酒精棉球消毒觸須部位。眼科剪垂直皮膚剪下小鼠兩邊觸須皮膚，放入裝有D-Hank' s液 的培養皿中。用鑷子夾著皮膚稍做清洗，吸去多余D-Hank' s液；
2) 解剖顯微鏡下(X3.2)用27號針頭將毛囊連同結締組織鞘一起分出來，D-Hank' s液 洗凈，移入24孔板中，每孔5根毛囊，加入lml WilliamE無血清培養基；
3) 分別加入AdWnt3a、 AdGFP和等量PBS，使病毒終濃度達到10、fu/ml滴度，放入孵箱 培養。
4) 每2天換液，所有孔都加入相同的培養基。
5) 觀察每天在顯微鏡下觀察，用測微尺測量毛囊長度并照相。 WilliamE無血清培養基配方
WilliamE: 100ml 氫化可的松10ng/ml 胰島素10ug/ml 谷氨酰胺2mmol/L 青霉素/鏈霉素100U/ml 實施例3結果分析
1. AdWnt3a的獲得
經過多次擴增，獲得AdWnt3a的滴度為109 pfu/ml。圖3為AdWnt3a感染293細胞2天的情 況。可見，感染后2天，293細胞感染率達100%。
2. Adwnt3a促進毛發生長
(1)動物實驗。在注射AdWnt3a后9d，注射部位皮膚開始變黑(18只中有15只出現)； ll天，有毛干長出表皮(12只中有10只出現)；14天，毛干全長出(12只中有11只出現)。而整 個期間，注射AdGFP和注射PBS組，注射部位仍處于靜止期，與注射周邊無明顯變化。見圖4 ，其中，左邊2只分別為PBS對照組和空載體對照組，右邊3只為AdWnt3a注射組。可見，注射 AdWnt3a部位長出新的被毛(生長期)，而其他部位仍處于靜止期。
HE染色觀察，AdWnt3a注射后3天，注射部位毛囊開始出現生長期早期結構(6只中有4只出現)；注射后5天，注射后部位毛囊呈生長期表型(6只中6只出現)；注射后7天、9天、 14天、28天毛囊均呈生長期表型。整個期間，AdWnt3a注射組(圖5B)毛囊處于典型生長期 ，而AdGFP組(圖5A)毛囊仍處于靜止期。 (2)器官培養
毛囊在分離后培養，繼續生長(包括內根鞘、外根鞘和毛干)。在加入AdWnt3a后，毛 囊生長明顯加快。見圖6A和圖6B，實驗組為加入AdWnt3a組，對照組為加入AdGFP組。培養毛 囊加入AdWnt3a后，毛囊生長明顯加快。在體動物實驗和體外器官培養實驗都證實，AdWnt3a 作用后，毛囊呈現生長期表型，使毛囊從靜止期向生長期轉化。
用上述相同方法獲得AdWntlOb，并采用上述同樣的方法進行處理。結果顯示，AdWntl0b 同樣具有促進毛囊生長的作用。圖7為AdWntl0b處理后14d，左邊2只小鼠為AdWntl0b處理組 (注射部位沿背中線選取2點)，右邊l只為對照組，可見，AdWntlOb處理組部位處于典型生 長期，而未處理部位仍處于靜止期，S卩AdWntlOb促進了毛囊的生長。圖8A為AdWntl0b處理后 14d后HE染色結果，圖8B為AdGFP (對照)處理后14d后HE染色結果，與大體照相結果一致。
本實施例對小鼠的處理方法為皮內注射給藥，通過涂抹、口服等給藥途徑可以達到同樣 的效果。
結論Wntl0b和Wnt3a同樣具有促進毛囊生長的作用，它們都是通過激活Wnt/{3 -catenin信號通路而發揮促進毛囊生長的作用。因此，其他通過該通路發揮作用的Wnt蛋白 同樣具有促進毛囊生長的作用。
本實施例對小鼠的處理方法為皮內注射給藥，本發明所述生發劑采用其他給藥方式如涂 抹、口服等均可以達到本發明所述同樣的效果。
雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發明，任何所屬技術領域的 技術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作些許的更動與改進，因此本發明的保護 范圍當視權利要求所界定者為準。
權利要求
1.一種生發劑，其特征在于所述生發劑包含通過Wnt/β-catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白。
2.根據權利要求l所述的生發劑，其特征在于所述通過Wnt/{3 -catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白為Wnt3a蛋白。
3.通過Wnt/e-catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白在制備治療 脫發藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種含有Wnt蛋白的生發劑，所述生發劑包含通過Wnt/β-catenin信號通路促進毛囊生長的Wnt蛋白。本發明所述生發劑使毛囊呈現生長期表型，毛囊從靜止期向生長期轉化，具有效果明顯，起效快，機制清楚等優點，對開發促毛發生長藥物具有重要的社會和經濟意義。
文檔編號A61K38/17GK101642563SQ20091030658
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月4日 優先權日2009年9月4日
發明者何通川, 李玉紅, 恬 楊, 連小華 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學