專利名稱：：苦碟子注射液在制備抗單純皰疹病毒的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥制劑的新用途，即苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應用。
背景技術：
：在已有技術中，市售的苦碟子注射液(又稱碟脈靈注射液)由通化華夏藥業有限責任公司生產，其主要成分為腺嘌呤核苷、總黃酮。功能與主治為擴張冠血管，改善心肌血氧供應，增加纖維蛋白溶解酶活性，抑制血栓形成，用于治療冠心病、腦血栓、心絞痛、眼底病，在制備抗病毒的藥物中的應用未見報道。
發明內容本發明的目的是針對上述不足而提供一種苦碟子注射液的新用途，即苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應用，增加其適應癥。本發明的技術解決方案是苦碟子注射液作為抗病毒藥物的應用。苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應用尤指作為抗主要呼吸道病毒和單純皰疹病毒的藥物中的應用。苦碟子注射液可直接作為治療病毒性肺炎、病毒性流感的藥物使用。本發明的優點是揭示了苦碟子注射液新的藥用用途，增加了苦碟子注射液的適應癥，對病毒性肺炎、病毒性流感有特效。下面將結合藥效學實驗對本發明作進一步詳細描述(苦碟子注射液在如下的藥效學研究報告中稱"碟脈靈")。圖l是碟脈靈濃度與細胞毒性量效關系曲線示意圖；圖2是碟脈靈對流感病毒的抑制作用示意圖；圖3是碟脈靈對腺病毒的抑制作用示意圖；圖4是碟脈靈對副流感病毒的抑制作用示意圖5是碟脈靈對柯薩奇B3病毒的抑制作用示意圖；圖6是碟脈靈對柯薩奇A16病毒的抑制作用示意圖；圖7是碟脈靈對單純皰疹病毒I型的抑制作用示意圖；圖8是碟脈靈體內治療量效曲線示意圖。具體實施例方式3本發明經吉林大學基礎醫學院所作的藥效學研究報告表明，苦碟子注射液在體內外均具有明顯的抗主要呼吸道病毒和單純皰疹病毒的作用。具體報告內容如下目的對碟脈靈體內外抗病毒作用進行藥效檢測。方法采用組織細胞培養法、血凝法和建立流行性感冒動物模型，對不同濃度的碟脈靈進行體內外抗病毒藥效學研究。結果碟脈靈體外有明顯的抑制副流感病毒、腺病毒3型和單純皰疹病毒I型的作用，對流感病毒、柯薩奇B3病毒和柯薩奇A16病毒有明顯的延緩致細胞病變作用。體內抗病毒試驗結果顯示，碟脈靈可有效抑制流行性感冒病毒所致小鼠病毒性肺炎。結論碟脈靈在體內外均具有明顯的抗主要呼吸道病毒和單純皰疹病毒的作用。一、試驗材料1.藥物1)碟脈靈注射液黃色透明針劑，批號020202，為本實驗待測藥物。由通化華夏藥業有限公司提供。調整PH為7.5，分裝，貯于4'C備用。用于體內外抗病毒試驗。2)利巴韋林注射液，100mg/支，由天津藥業集團新鄭股份有限公司，批號020205，國藥準字XF19990698號，作為本次試驗陽性對照藥物。2.細胞株H印-2(喉癌細胞)購于衛生部藥品生物制品檢定所。Hela(宮頸癌細胞)本教研室保存。3.毒株1)流感病毒FM工株購于預防醫學科學院病毒研究所2)柯薩奇病毒Bs(CVBs)株來源于美國，為本教研室保存3)單純皰疹病毒I型(HSV-1)SMm株購于衛生部藥品生物制品檢定所。4)腺病毒3型(AdV-3)來源于白求恩醫科大學一院兒科研究室。5)柯薩奇病毒A16(CVA16)株日本仙臺國立醫院贈本教研室保存。6)副流感病毒購于預防醫學科學院病毒研究所。4.主要試劑培養基頂DM為美國Sigma產品。胎牛血清長春生物制品研究所產品。200910300395.6胰蛋白酶日本生產上海化學試劑廠分裝。5.實驗動物Swiss小鼠雌雄各半，3-4W齡，16-18g，雌雄分別分組，由吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供。醫動字第10-5219號。二、方法1.細胞準備H印-2、Hela傳代細胞培養3-5d，使之成片，界線清晰，立體感及折光度強時，用胰酶消化，待細胞面出現針尖樣小孔，吸盡消化液，取數毫升培養液吹散細胞，計數，用培養液稀釋至約5X1(Z/L后，接種于96孔培養板內，待細胞長成單層。2.藥物毒性測定細胞毒性試驗將碟脈靈稀釋為0.125g/L，0.0625g/L，0.0312g/L，0.0156g/L，0.00781g/L，0.0039g/L，0.00195g/L，0.00097g/L等濃度，陽性藥病毒唑稀釋為O.125g/L，0.0625g/L，0.03125g/L等濃度。將上述用培養液稀釋好的不同濃度的藥品滴加于H印-2、Hela單層細胞上，每孔0.2ml，37。C5XC02孵箱培養，每天鏡下觀察細胞病變(CPE)，求出藥液致細胞毒性，計算藥物對細胞毒性濃度，最大無毒濃度(TCo)，50X中毒濃度(TC50)。藥物對動物毒性實驗將不同劑量藥物分組給藥，觀察急性毒性，根據最大耐受量(MTD)和LDo計算出碟脈靈小鼠體內試驗藥物用量為6ml/kg，12ml/kg，24ml/kg，相當于0.0015g/kg、0.003g/kg、0.006g/kg三個濃度。分別連續給藥6天。記錄發病或死亡日期和數量，取標本進一步檢測。陽性對照藥利巴韋林用量為O.13g/kg。3.藥物對病毒致細胞病變作用的影響在H印-2和Hela細胞上分別加入10—Ll0—6不同濃度的6種病毒液，吸附lh后洗去病毒液，加入無毒界限藥液，每一病毒稀釋度各加3復孔，同時設病毒對照，細胞對照，陽性藥物對照組。置37'CC02培養箱內培養，每天在倒置顯微鏡下觀察病變，連續7d，記錄各孔病變情況。計算出抑制細胞病毒的感染量，細胞病變抑制率，最小有效濃度(MTC)，半數有效濃度(IC50)，90X有效濃度(IC9o)和治療指數(TI)。實驗重復三次。Th半數中毒濃度/半數有效濃度4.各種病毒TCID5o的測定將各種病毒進行10倍稀釋10—、10—2，10—3……10—6不同稀釋度，并將各種稀釋度的病毒感染H印-2和Hela細胞，用96孔塑膠板單層培養。觀察細胞病變，測定各病毒半數致細胞病變劑量(TCID50)。55.結果判定及計算方法以能使50X細胞孔發生CPE的最高稀釋度作為終點，用karber法計算病毒滴度。公式LogTCIDs(^XM+(l/2)d-d(Epi/100)TCID5o:50%組織細胞感染量XM:病毒最高濃度稀釋度的對數d:稀釋度系數(倍數)的對數EPi:每個稀釋度病變首分數的總和6.體內抗病毒試驗1)病毒毒力測定乙醚麻醉小鼠，滴鼻感染，每鼻孔不同稀釋度病毒0.3ml，記錄死亡百分數，計算LDso。2)藥物毒性測定小鼠急性毒性和亞急性毒性，計算LD5o及LDo。3)抗病毒試驗小鼠隨機分組，10只/組，于感染前一天開始腹腔注射給藥，連續5d，對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水，在乙醚淺麻醉下滴鼻感染流感病毒鼠肺適應株FMh15LD5o，感染后96h解剖，取肺稱重，逐個算出肺指數值，與對照組比較，進行組間t檢驗。統計學處理，計算t值和P值。4)肺病變組織學和病理學檢査取各試驗組鼠肺、固定、包埋、切片染色、鏡檢等，具體方法略。5)血凝試驗檢測鼠肺流感病毒增殖和抗原滴度動物分組、藥物劑量、給藥方法、病毒感染同前，感染病毒72h后，脫頸處死小鼠，解剖取肺，組織勻漿器研磨，生理鹽水制成10%的肺組織懸液，離心取上清，倍比稀釋，按0.2ml/孔滴于滴定板上后，每孔加入0.2ml1%雞紅細胞懸液，混勻，置室溫30min，觀察記錄血凝滴度。以紅細胞凝集(++)時為終點，并以懸液稀釋倍數表示其滴度。三、試驗結果1.各種病毒的TCID50流感病毒FM!:LogTCID5Q=-2+0.5-(100+100+50)/100=-4CVB3:LogTCID5o=-2+0.5-(100+100+100+50)/100=-5副流感病毒LogTCID50=-2+0.5-(100+100+50)/100=-4HSV-1SM44:LogTCID50=-2+0.5-(100+100+100+30)/100=-4.8AdV-3:LogTCID5o=-2+0.5-(100+100+50)/100=-4CVA16:LogTCID50=-2+0.5-(100+100+100+30)/100=-4.82、藥物毒性測定1)藥物對細胞毒性測定結果碟脈靈對H印-2和Hela細胞最大無毒濃度(TC0)為O.0039g/L，半數毒性濃度(TC50)為0.016g/L，具體量效關系見下圖。病毒唑稀釋為O.0625g/L以上稀釋時對H印-2和Hela細胞均無毒性作用。碟脈靈濃度與細胞毒性量效關系曲線見圖l2).動物毒性測定結果該藥的半數致死量按最大給藥濃度和小鼠的最大靜脈注射容積無法求出半數致死劑量(LD5o)，求得最大耐受量(MTD)大于1000g生藥/kg。3.碟脈靈對病毒致細胞病變保護作用結果在感染30-100TClD5o的6種病毒的情況下，碟脈靈使用濃度為O.0039g/L，碟脈靈對病毒的抑制其致細胞病變作用結果見表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>1/4-1/2的細胞有病變；+++示1/2-3/4的細胞有病變；++++示3/4以上的細胞有病變。碟脈靈對流感病毒的抑制作用見圖2，IC50=0.000564g/L，碟脈靈對流感病毒的治療指數TI=TC50/IC50=28.36碟脈靈對腺病毒的抑制作用見圖3，IC50=0.000261g/L，碟脈靈對腺病毒的治療指數TI=TC50/IC50=61.30碟脈靈對副流感病毒的抑制作用見圖4，IC50=0.000273g/L，碟脈靈對副流感病毒的治療指數TI=TC50/IC50=58.60碟脈靈對柯薩奇B3病毒的抑制作用見圖5，IC50=0.000597g/L，碟脈靈對柯薩奇B3的治療指數TI=TC50/IC50=26.8碟脈靈對柯薩奇A16病毒的抑制作用見圖6，IC50=0.001002g/L，碟脈靈對柯薩奇A16的治療指數TI=TC50/IC50=15.96碟脈靈對單純皰疹病毒I型的抑制作用見圖7，IC50=0.000256g/L，碟脈靈對單純皰疹病毒I型的治療指數TI=TC50/IC50=62.54.對小鼠流感病毒性肺炎的影響l)碟脈靈對小鼠肺炎的影響結果，采用EXCEL統計軟件，進行兩組均數T檢驗，詳見表2。在0.013g/kg/d及以上計量，均有顯著的治療作用。表2碟脈靈對小鼠流感病毒性肺炎的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2).肺病變組織學和病理學檢測結果病毒性肺炎模型組鏡下可見支氣管、細支氣管壁、肺泡壁等肺間質充血、水腫以及淋巴細胞、單核細胞浸潤，肺泡壁增寬，肺泡呈炎癥反應。碟脈靈治療各組鼠肺病變明顯減輕，部分肺組織形態結構正常，最佳治療劑量為0.006g/kg。3).小鼠肺組織中病毒抗原滴度測定一-血凝試驗結果血凝試驗結果詳見表3。表3碟脈靈對流感病毒性肺炎小鼠肺組織血凝滴度的影響組別劑量(g/kg/d)動物(只)肺指數值(i+s)肺病變減輕(%)P病毒對照—1031.5±1.715正常對照100.000利巴韋林.13001021.0±2.10833.33<0.01碟脈靈0.00601022.3±1.49429.20<0.010.00301026.2±0.63216.82<0.050.00151030.0±1.3294.76〉0.05從上表可見，碟脈靈治療(0.0068g/kg、0.003g/kg、0.0015g/kg)組，鼠肺中流感病毒滴度明顯低于病毒對照組。最佳治療劑量為O.006g/kg、0.003g/kg。碟脈靈體內治療量效曲線見圖8，EC50=0.0196g/kg，碟脈靈對流感病毒的體內治療指數為TI=MTD/EC50=10204結論碟脈靈在體外有明顯的抑制副流感病毒、腺病毒3型和單純皰疹病毒I型的作用，對流感病毒、柯薩奇B3病毒和柯薩奇A16病毒有明顯的延緩細胞病變作用。碟脈靈體內抗病毒試驗結果顯示，在一定濃度范圍可有效的抑制流行性感冒病毒所致的病毒性肺炎，與模型對照組比較，差異顯著。關于碟脈靈的抗病毒的作用機理有待進一步深入研究。實施例苦碟子注射液主治用于治療冠心病、腦血栓、心絞痛、眼底病，病毒性肺炎，病毒性流感。權利要求1.苦碟子注射液在制備抗單純皰疹病毒的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種中藥制劑的新用途，即苦碟子注射液作為制備抗病毒藥物的應用。揭示了苦碟子注射液新的藥用用途，增加了苦碟子注射液的適應癥，使其不僅用于治療冠心病、腦血栓、心絞痛、眼底病，同時對病毒性肺炎、病毒性流感也有特效。文檔編號A61P11/00GK101491564SQ20091030039公開日2009年7月29日申請日期2003年9月25日優先權日2003年9月25日發明者劉東輝,華玉強,季淑霞申請人:華玉強