靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組病毒，特別涉及一種靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病
毒，還涉及該重組慢病毒的制備方法和應用。
背景技術：
軟骨損傷或缺失是臨床上的常見問題，由于軟骨的組織學和生物學特性限制了其 自身的修復能力，目前尚缺乏有效的治療措施。組織工程方法為軟骨缺損的修復提供了一 種全新的手段，利用支架材料為種子細胞的增殖和基質分泌提供空間架構，形成類似正常 軟骨組織的結構，并行使功能。種子細胞包括胚胎干細胞和多種來源的間充質干細胞如骨 髓間充質干細胞、外周血間充質干細胞、臍血間充質干細胞、脂肪間充質干細胞和臍帶間充 質干細胞等。由于較易獲得和具有誘導成軟骨分化潛能，骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)被認為是目前軟骨組織工程理想的種子細胞。但在將MSCs與可吸收性 支架材料復合構建細胞-材料復合體并進行體外軟骨分化誘導培養時，在組織工程軟骨中 會有堿性磷酸酶和骨鈣素陽性細胞出現，而且，組織工程軟骨經裸鼠皮下種植或者肌袋種 植幾個月后，在典型的軟骨陷窩樣結構中散在出現骨化灶，表明部分種子細胞進入軟骨內 骨化程序。這種由于種子細胞異質性引起的骨化現象，是目前制約組織工程軟骨構建技術 的重要瓶頸問題之一，勢必影響到軟骨的構建和在體缺損的完全修復和功能重建。因此，如 何調控MSCs定向分化成軟骨細胞并抑制其向成骨細胞分化是目前軟骨組織工程學中的重 要問題。為獲得高效特異的軟骨種子細胞，必須對組織工程軟骨種子細胞的成骨分化部分 進行處理。 在成骨細胞的轉錄調節中，0sterix(0sx，也稱為SP7)基因作為成骨細胞分化和 骨形成必需的轉錄因子日益受到重視。0sterix基因屬于Sp/XKLF家族，是一種具有鋅指 基序結構域的轉錄因子，位于核心結合因子Cbfal/Runx2的下游并受其調控，在0sterix基 因啟動子區(-713 -700bp)存在Cbfal的識別調控位點。研究發現，Osterix基因敲除 小鼠無骨骼形成但具有軟骨內骨骼結構，且Cbfal表達為陽性，而Cbfal缺陷小鼠不表達 0sterix。據此，部分學者提出了成骨細胞分化形成的模式MSCs分化為能分泌II型膠原 的軟骨前體細胞一Cbfal基因啟動一細胞向能分泌I型膠原的成骨前體細胞或肥大型軟骨 細胞轉化一0sterix基因啟動一成骨前體細胞轉化為成骨細胞一成骨細胞分泌骨鈣素、骨 唾液蛋白及骨連接蛋白等細胞外基質。根據上述模式，表達Cbfal的細胞仍有潛在雙向分 化能力，既可分化為成骨細胞，又可分化為軟骨細胞，而表達0sterix的細胞具有直接成骨 能力。 凋亡素(Apoptin)是一種來源于雞貧血病毒、由121個氨基酸組成的小蛋白，能 誘導雛雞造血母細胞和T淋巴細胞前體細胞凋亡，導致雛雞出現嚴重的貧血和免疫機能低 下。Apoptin還可以通過獨立于p53作用途徑且不被Bcl-2過量表達所抑制的方式誘導人 腫瘤細胞和轉化細胞凋亡，而對正常細胞不發揮作用。因此，Apoptin被認為是第一個真正
4意義上可選擇性誘導腫瘤細胞和轉化細胞凋亡而不損傷正常細胞的凋亡蛋白。研究發現，Apoptin誘導細胞凋亡活性與其亞細胞定位密切相關。在正常細胞中，Apoptin定位于細胞質，不能誘導細胞凋亡；而在腫瘤細胞中，Apoptin定位于細胞核中，能夠誘導腫瘤細胞凋亡。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢
病毒，可以對經過成軟骨誘導分化處理的種子細胞中殘存的成骨分化細胞進行處理，誘導
成骨分化細胞凋亡而對成軟骨分化細胞和正常軟骨細胞不發揮作用，保證種子細胞成軟骨
分化的單一路徑，從而為組織工程軟骨的構建提供一種良好的種子細胞；目的之二在于提
供所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法；目的之三在于提供所述靶向
誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的應用。 為達到上述目的，本發明采用如下技術方案 1、耙向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒，所述重組慢病毒基因組中包含一個Apoptin基因表達盒，所述Apoptin基因表達盒包含Osterix基因啟動子、Apoptin基因和終止子，所述Apoptin基因的表達由Osterix基因啟動子調控。 進一步，所述Apoptin基因表達盒還包括V5表位基因序列，所述V5表位基因序列位于Apoptin基因和終止子之間； 進一步，所述重組慢病毒是將Apoptin基因表達盒插入HIV-1病毒基因組而得到。
2、所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法，包括以下步驟
a、 Osterix基因啟動子片段的克隆根據Osterix基因啟動子片段的核苷酸序列和慢病毒載體pLenti6/V5-D-T0P0的引物設計要求設計并合成引物，以小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的基因組DNA為模板，PCR擴增Osterix基因啟動子片段，克隆至pGEM-T載體，得重組載體pGEM-T/0sxp ; b、Apoptin基因片段的克隆根據Apoptin基因的核苷酸序列設計并合成引物，以雞法氏囊組織中提取的基因組DNA為模板，PCR擴增Apoptin基因片段，克隆至pGEM-T載體，得重組載體pGEM-T/Apo ;自pGEM-T/Apo中用EcoRV和Xbal雙酶切出Apoptin基因片段，與同樣經EcoRV和Xbal雙酶切的pcDNA3. 1 (+)載體在T4DNA連接酶的作用下連接，得重組載體pcDNA3. 1-Apo ; c、 0sxp-Apoptin重組慢病毒載體的構建自pGEM-T/0sxp中用Kpnl和EcoRI雙酶切出0sxp片段，與同樣經Kpnl和EcoRI雙酶切的pcDNA3. 1-Apo在T4DNA連接酶的作用下連接，得重組載體pcDNA3. l-0sxp-Apo ;再自pcDNA3. 1-Osxp-Apo中用Kpnl和Xbal雙酶切出0sxp-Apoptin片段，與pLenti6/V5-D-T0P0載體連接，得重組載體pLenti6/V5_0sxp_Apo ; d、 0sxp-Apoptin重組慢病毒的包裝采用Lipofectamine 2000試劑將pLenti6/V5-0s鄧-Apo以及慢病毒包裝質粒混合物共轉染293FT細胞，待細胞出現明顯病變后，收集含病毒的培養上清液，即得0s鄧-Apoptin重組慢病毒。
進一步，步驟a中所述引物序列為 上游弓l物5， -ggggtacccccacccagggaagcaagatgat-3，；
5
下游弓l物5， -cggaattccgggtcccaaggagtcaggcagat-3，； 進一步，步驟a中所述PCR擴增條件為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、
59t:退火1分鐘，72t:延伸2分鐘，共35個循環，最后72。C延伸10分鐘； 進一步，步驟b中所述引物序列為 上坊,弓l物5， -cggatatccgagtaatttcaaatgaacgct-3，； 下坊,弓l物5， -gctctagagccagtcttatacgccttcttgc-3，； 進一步，步驟b中所述PCR擴增條件為94t:預變性5分鐘，然后94t:變性1分鐘、
6(TC退火1分鐘，72。C延伸1. 5分鐘，共30個循環，最后72。C延伸5分鐘。 3、所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒在制備誘導成骨分化細胞凋亡
的藥物中的應用。 本發明的靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒主要由三部分組成①以泛成 骨細胞特異表達基因0sterix的啟動子作為啟動元件；②在細胞內表達并自殺成骨分化細 胞的基因Apoptin ;③高感染率和穩定整合性兼顧的慢病毒載體。各部分的選擇依據如下 ①啟動元件的選擇利用特異性啟動子調控目的基因在靶細胞中表達是實現靶向性基因治 療的重要手段。Osterix在成骨細胞中特異性表達，一方面，Osterix可以使表達Cbfal的 成骨前體細胞定向分化為成骨細胞，在軟骨內成骨過程中具有分離成骨細胞系和軟骨細胞 系的作用；另一方面，0sterix是Sox9(在軟骨細胞和軟骨組織分化中具有重要作用)表達 和軟骨細胞表型的負調節因子；這些均使Osterix基因啟動子成為驅動自殺基因表達的理 想啟動元件；②自殺基因的選擇Apoptin基因是一個較佳的自殺基因，外源性Apoptin表 達后，在靶細胞中逐漸發生核轉位，而在正常細胞中則滯留在細胞質中，即使Apoptin表達 于正常細胞的細胞核中，也不會誘導細胞凋亡。在Osterix基因啟動子的引導下，Apoptin 可以特異性地殺傷成骨分化細胞，而不會傷及成軟骨分化細胞及正常軟骨細胞。③外源基 因導入載體的選擇非病毒學的基因轉移方法效率較低，已用于人體試驗的基因治療方案 絕大多數是以病毒學方法進行基因轉移的，其中以逆轉錄病毒載體和腺病毒載體最為成 熟。理想的病毒載體應能同時提供高效的基因轉移、長期穩定的基因表達及生物安全性。 逆轉錄病毒載體雖可使目的基因整合至靶細胞基因組實現穩定表達，但只能轉導分裂期細 胞，不能轉導非分裂期細胞。腺病毒載體雖能轉導分裂期細胞和靜止期細胞，轉導效率也較 高，但目的基因不整合至靶細胞基因組，僅能短暫表達，而且腺病毒蛋白可引起人體免疫反 應及炎癥反應。慢病毒載體因其具有可感染非分裂期細胞、目的基因整合至靶細胞基因組 長期表達、免疫反應小等優點，有望成為理想的基因轉移載體。常用的以l型人類免疫缺陷 病毒(HIV-1)為基礎構建的慢病毒載體是把HIV-1基因中與病毒包裝、逆轉錄和整合有關 的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列分離，分別改造成載體成分和包裝成分，通常 將包裝成分分別獨立放置在2個質粒上(包裝質粒和包膜質粒)。現在使用的慢病毒載體 大多是四質粒系統，包括載體質粒、包裝質粒、包膜質粒和pVSV-G質粒，以VSV-G (皰疹性口 腔炎病毒糖蛋白G基因)取代HIV的Env基因，產生的假HIV病毒顆粒安全性高、宿主細胞 廣、穩定性強、滴度高。 本發明的有益效果在于針對目前在組織工程軟骨構建中由于種子細胞中殘存成 骨分化細胞引起骨化灶形成的難題，本發明建立了一種靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組 慢病毒，以泛成骨細胞特異表達基因0sterix的啟動子作為啟動元件，在成骨分化細胞中表達誘導成骨分化細胞凋亡的Apoptin，而對成軟骨分化細胞和正常軟骨細胞不發揮作用， 可以制成誘導成骨分化細胞凋亡的藥物，對經過成軟骨誘導分化處理的種子細胞(包括胚 胎干細胞和多種來源的間充質干細胞如骨髓間充質干細胞、外周血間充質干細胞、臍血間 充質干細胞、脂肪間充質干細胞和臍帶間充質干細胞等)中殘存的成骨分化細胞進行處 理，保證種子細胞成軟骨分化的單一路徑，從而為組織工程軟骨的構建提供一種良好的種 子細胞。該重組慢病毒的制備方法簡便、快速、成本低。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進 一步的詳細描述，其中 圖1為0sterix基因啟動子調控Apoptin基因(Osxp-Apoptin)重組慢病毒的構 建示意圖； 圖2為PCR擴增0sterix基因啟動子(0s鄧)片段的瓊脂糖凝膠電泳結果，其中泳 道1為DNA分子量標準，泳道2和3為0s鄧片段的PCR產物； 圖3為經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的骨骺軟骨細胞的阿爾辛藍染色結果；
圖4為經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的骨骺軟骨細胞增殖實驗結果；
圖5為經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的MSCs的II型膠原免疫熒光染色結果；
圖6為經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的MSCs成軟骨分化的阿爾辛藍染色結 果； 圖7為經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的MSCs成軟骨分化的堿性磷酸酶染色結 果； 圖8為在體觀察Os鄧-Apoptin重組慢病毒對軟骨形成的影響。
具體實施例方式
以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明 具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除 另有說明外，優選實施例中的各種限制性內切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶和試劑盒等均購 自上海生工生物工程技術服務有限公司和北京博大泰克生物基因技術有限公司。
—、 Osxp-Apoptin重組慢病毒的制備 Os鄧-Apoptin重組慢病毒的構建示意圖如圖1所示，其制備方法包括以下步驟
1、0s鄧片段的克隆 根據GenBank NT_039621. 7中Osxp片段的核苷酸序列和慢病毒載體pLenti6/ V5-D-T0P0的引物設計要求，設計并合成如下引物 Fl :5， _gggg^￡￡￡c ctfCC cagggaagcaagatgat-3， (SEQ ID No.l)，下劃線部分為 限制性內切酶KpnI酶切位點，粗斜體部分為拓撲異構酶(T0P0)連接位點；
Rl :5，-cggaattccgggtcccaaggagtcaggcagat-3， (SEQ ID No. 2)，下劃線部分為限 制性內切酶EcoRI酶切位點。 采用基因組DNA提取試劑盒從小鼠胚胎成骨細胞株MC3T3-E1中提取基因組DNA，按照試劑盒說明書操作。 以MC3T3-E1細胞基因組DNA為模板，以F1和R1為上下游引物，采用PCR試劑盒擴增Os鄧片段，按照試劑盒說明書操作。PCR擴增體系為10XPCR緩沖液5ii L，dNTPs 5 y L，上下游引物各2 ii L，模板4 ii L，MgCl24 ii L， T叫DNA聚合酶1 y L，用無DNA酶水稀釋至總體積50 ii L。 PCR擴增條件為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、59。C退火1分鐘，72°C延伸2分鐘，共35個循環，最后72t:延伸10分鐘。PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見PCR產物在約2. lkb處出現特異性條帶(如圖2所示)，與目標片段的分子量大小一致。采用PCR產物回收試劑盒切膠回收純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作。
將純化后的PCR產物與克隆載體pGEM-T (Promega公司)在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，抽提質粒，進行測序鑒定，結果顯示，所得陽性克隆質粒中插入片段的序列(SEQ ID No. 3)與0s鄧片段的序列一致，將其命名為pGEM-T/0sxp。
2、Apoptin基因片段的克隆 根據GenBank AF313470中Apoptin基因的核苷酸序列，設計并合成如下引物
F2 :5，-cggatatccgagtaatttcaaatgaacgct-3， (SEQ ID No. 4)，下劃線部分為限制性內切酶EcoRV酶切位點； R2 :5， -gctctagagccagtcttatacgccttcttgc_3， (SEQ ID No. 5)，下劃線部分為限制性內切酶Xbal酶切位；為了作Apoptin同V5表位的融合表達，在3'端刪除了終止子。
將雞頸靜脈放血處死，立即分離法氏囊，采用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，按照試劑盒說明書操作。 以雞法氏囊組織中提取的基因組DNA為模板，以F2和R2為上下游引物，采用PCR試劑盒擴增Apoptin基因片段，按照試劑盒說明書操作。PCR擴增體系為10XPCR緩沖液5iiL， dNTPs 5iiL，上下游引物各2iiL，模板4iiL， MgCl24iiL， Taq DNA聚合酶1 y L，用無DNA酶水稀釋至總體積50 ii L。 PCR擴增條件為94。C預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、6(TC退火l分鐘，72t:延伸1.5分鐘，共30個循環，最后72t:延伸5分鐘。PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，可見PCR產物在約O. 4kb處出現特異性條帶，與目標片段的分子量大小一致。采用PCR產物回收試劑盒切膠回收純化PCR產物，按照試劑盒說明書操作。
將純化后的PCR產物與克隆載體pGEM-T (Promega公司)在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，抽提質粒，進行測序鑒定，結果顯示，所得陽性克隆質粒中插入片段的序列(SEQ ID No. 6)與Apoptin基因片段的序列一致，將其命名為pGEM-T/Apo。 自陽性克隆質粒pGEM-T/Apo中用EcoRV和Xbal雙酶切出Apoptin基因片段，與同樣經EcoRV和Xbal雙酶切的真核表達載體pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen公司)在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，抽提質粒，進行EcoRV和Xbal雙酶切鑒定及測序鑒定，測序結果顯示，所得陽性克隆質粒中插入片段的序列與Apoptin基因片段的序列一致，將其命名為pcDNA3. l-Apo。
3、 0sxp-Apoptin重組慢病毒載體的構建 自陽性克隆質粒pGEM-T/0sxp中用Kpnl和EcoRI雙酶切出0sxp片段，再與同樣經Kpnl和EcoRI雙酶切的陽性克隆質粒pcDNA3. l-Apo在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產
8物轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，藍白斑篩選陽性克隆，抽提質粒，進行Kpnl和EcoRI雙 酶切鑒定及測序鑒定，測序結果顯示，所得陽性克隆質粒中0s鄧片段定向插入至Apoptin 基因片段上游，將其命名為pcDNA3. l-0sxp-Apo。 自陽性克隆質粒pcDNA3. l-0sxp-Apo中用Kpnl和Xbal雙酶切出Osxp-Apoptin 片段，與慢病毒載體pLenti6/V5-D-T0P0(Invitrogen公司)按體積比為1 : l混合，加入 6X連接緩沖液(Invitrogen公司)1 y L，用滅菌蒸餾水補充至總體積6 y L，溫度22。C孵育 5分鐘，使Os鄧-Apoptin片段和慢病毒載體連接；連接產物轉化大腸桿菌Stbl3感受態細 胞，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，挑取單菌落擴增，取菌液進行PCR鑒定，同 時抽提質粒進行測序鑒定，測序結果顯示，所得陽性克隆質粒中插入片段的序列與預期序 列完全相符，將其命名為pLenti6/V5-0sxp-Apo 。
4、 Osxp-Apoptin重組慢病毒的包裝 將3 ii g陽性克隆質粒pLenti6/V5-0sxp-Apo和9 ii g慢病毒包裝質粒混合物溶 于1. 5mL無血清0pti-MEMI培養基中，命名為A液；將36 ii L Lipofectamine 2000稀釋于 1. 5mL無血清0pti-MEMI培養基中，命名為B液；將A液和B液混勻，室溫孵育20分鐘使形 成DNA-脂質體復合物；將DNA-脂質體復合物轉移至含有5mL 0pti-MEMI生長培養基和血 清的培養皿中，加入含有6X 106個細胞的293FT細胞懸液，在溫度為37°C、 C02氣體體積分 數為5%的條件下培養，6小時后將培養基更換為5mL含有濃度為lmmol/L的丙酮酸鈉和體 積分數為10X的胎牛血清的DMEM培養基，2天后可見細胞發生病變，表現為貼壁細胞變圓， 3天后可見圓形細胞呈葡萄串狀叢集分布于正常的293FT細胞上，出現病毒空斑，收集含病 毒的培養上清液，溫度4°C、3000r/min離心15分鐘，收集上清液，用孔徑為0. 45 y m的濾膜 過濾，即得0s鄧-Apoptin重組慢病毒懸液，溫度-8(TC凍存，備用。 在6孔培養板中培養MC3T3-E1細胞，待細胞達50 %融合時，加入不同稀釋 度(10—7 10—2)的0s鄧-Apoptin重組慢病毒懸液，以及終濃度為6 ii g/mL的聚凝胺 (polybrene)和終濃度為4. 0 y g/mL的殺稻瘟素(blasticidin)，篩選感染細胞，經10 12 天，所得殺稻瘟素抗性集落用PBS漂洗2次，加入lmL質量分數為1 %的結晶紫染色液，室溫 放置10分鐘，再用PBS漂洗2次，計算藍染克隆，測得0s鄧-Apoptin重組慢病毒的滴度為 2 5X106TU/mL。 以所得0s鄧-Apoptin重組慢病毒的基因組DNA為模板，以F3和R3為上下游 弓l物[F3 :5， -actccgagtcaagagtaggattgtagg-3， (SEQ ID No. 7) ;R3 :5， -agaatgggagaa tgggagagaag-3' (SEQ ID No. 8) ]PCR擴增0sxp片段，以F4和R4為上下游引物[F4 : 5， _atctgcaactgcggacaa_3， (SEQ ID No. 9) ;R4 :5， _gctgggagtagtggtaatcaa_3， (SEQ ID No. 10)]PCR擴增Apo片段，結果顯示，采用上述引物可以擴增出565bp的0s鄧片段和157bp 的Apo片段。 取1Xl(f個經Osxp-Apoptin重組慢病毒感染24小時后的C3H10T1/2細胞，用 溫度4t:預冷的PBS洗滌1次，再用1ml質量分數為4%的多聚甲醛室溫固定40分鐘，用 PBS洗滌1次，再用1ml含有體積分數為5%的人血清的PBS重懸細胞，冰上孵育10分鐘， 800rpm離心5分鐘，棄上清，加入200 含有質量分數為0. 5%的牛血清白蛋白和飽和劑 量的FITC標記的抗V5表位抗體(Invitrogen公司)的PBS，冰上避光放置30分鐘，離心 棄上清，再加入200 1質量分數為1 %的多聚甲醛固定，用流式細胞儀檢測熒光值，每管計數10000個細胞。結果顯示，當感染復數(MOI) = 10時，85X以上的C3H10Tl/2細胞表達
Apoptin ;當MOI = 40時，幾乎所有C3H10T1/2細胞均表達Apoptin。 二、 Os鄧-Apoptin重組慢病毒靶向誘導成骨分化細胞凋亡能力的檢測 1、對軟骨細胞的影響 將新生1周的SD大鼠脫頸處死，無菌條件下切取雙側髖膝關節軟骨，用DMEM培養 基漂洗2次，剪成ImmX 1mm大小，加入濃度為0. 3U/mL的膠原酶溶液，溫度37t:消化4小 時，吹打成單細胞懸液，150目不銹鋼濾網過濾，濾液1000r/min離心5分鐘，棄去上清液， 用含有體積分數為10%的胎牛血清、濃度為100U/mL的青霉素和濃度為100U/mL的鏈霉素 的DMEM培養基重懸細胞，以細胞密度為105個/mL接種于培養瓶中，在溫度為37°C、 C02氣 體體積分數為5%的條件下培養，48小時后視細胞貼壁情況更換新鮮培養基，以后每2 3 天更換1次新鮮培養基，當在倒置顯微鏡下觀察到軟骨細胞匯合成片長滿大部分培養瓶壁 后，棄去培養基，加入質量分數為O. 25%的胰蛋白酶溶液和質量分數為0. 02%的乙二胺四 乙酸溶液進行消化傳代，將5 X 105個軟骨細胞傳代入24孔板，待細胞融合達50%時，按MOI =40感染Os鄧-Apoptin重組慢病毒并加入終濃度為8mg/L的聚凝胺，感染后24小時更 換為含有體積分數為10%的胎牛血清、濃度為100U/mL的青霉素和濃度為100U/mL的鏈霉 素的匿EM培養基，感染后72小時將細胞以1 X 104個/孔接種于96孔培養板，次日豐度達 90%后，按MOI = 40感染Os鄧-Apoptin重組慢病毒，感染后24小時更換為含有體積分數 為10%的胎牛血清、濃度為100U/mL的青霉素和濃度為100U/mL的鏈霉素的DMEM培養基， 感染后72小時進行細胞增殖實驗(WST-8染色法)，同時進行軟骨細胞的阿爾辛藍染色觀察 基質蛋白多糖含量。 結果經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的骨骺軟骨細胞，阿爾辛藍染色可見大量 陽性染色細胞存在(圖3)。經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的骨骺軟骨細胞與空病毒 處理細胞和正常軟骨細胞相比，三者的增殖和存活率無明顯差異(P > 0. 05)(圖4)，表明 Os鄧-Apoptin重組慢病毒對軟骨細胞具有規避作用。
2、對間充質干細胞成軟骨分化的影響 取1月齡小鼠雙下肢長骨，充分沖洗骨髓腔，將沖洗液與淋巴細胞分離液以體積 比為5 : 3混勻，1500r/min離心30分鐘，吸取單核細胞層，用含有體積分數為10%的胎牛 血清、濃度為100U/mL的青霉素和濃度為100U/mL的鏈霉素的低糖DMEM培養基進行原代培 養，每3天更換1次新鮮培養基，12天后進行第1次傳代，之后每3 5天傳代1次，取第三 代MSCs，調整細胞密度為5. 0Xl()S個/ci^，按M01 = 40感染Osxp-Apoptin重組慢病毒并 加入終濃度為8mg/L的聚凝胺，感染后24小時更換為含有體積分數為10%的胎牛血清、濃 度為100U/mL的青霉素和濃度為100U/mL的鏈霉素的DMEM培養基，感染后48小時進行成 軟骨誘導分化加入無血清軟骨誘導液(含有濃度為10ng/mL的轉化生長因子13 1、濃度為 0. 1 ii mol/L的地塞米松、濃度為50 ii g/mL的抗壞血酸和1 X ITS+1)進行單層細胞誘導培 養，分別于誘導后7天和14天進行細胞增殖實驗(WST-8染色法)、II型膠原檢測(SP法)、 阿爾辛藍染色以及堿性磷酸酶染色，同時采用流式細胞術檢測MSCs成軟骨分化效率。
結果經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的MSCs增殖正常，II型膠原表達正常(圖 5)，阿爾辛藍染色正常(圖6)，未見堿性磷酸酶陽性細胞存在(圖7)，表明Os鄧-Apoptin 重組慢病毒對MSCs成軟骨分化具有較好的規避作用。流式細胞術檢測Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的MSCs成軟骨分化效率高達85% 。
3、對成骨細胞的影響 取24小時內胎鼠頭蓋骨，在PBS中去除血液和周圍結締組織，用剪刀剪成泥狀，加入質量分數為0. 25%的胰蛋白酶溶液，溫度37t:消化30分鐘，吸棄胰蛋白酶溶液，用PBS洗滌1次，再加入濃度為0. 3U/mL的膠原酶溶液，溫度37t:振蕩消化1小時，吸棄膠原酶溶液，再加入DMEM培養基，反復吹打骨片使細胞從骨片上脫落下來，所得細胞懸液接種于培養瓶中，在溫度為37°C、 C02氣體體積分數為5%的條件下培養，24小時后更換新鮮培養基，之后每48小時更換1次新鮮培養基，待原代成骨細胞融合達60X時，按M01 = 40感染Os鄧-Apoptin重組慢病毒并加入終濃度為8mg/L的聚凝胺，感染后24小時更換為含有體積分數為10%的胎牛血清、濃度為100U/mL的青霉素和濃度為100U/mL的鏈霉素的DMEM培養基，分別于感染后24小時和48小時收集細胞，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測Apoptin的表達，同時采用激光共聚焦法檢測Apoptin在成骨細胞中的亞細胞定位，感染后72小時采用臺盼藍染色法測定細胞生長抑制率。 結果分別以感染后24小時和48小時的細胞總RNA為模板，經RT-PCR均可擴增出Apoptin cDNA，表明Apoptin已在感染細胞中表達；且感染后細胞出現典型的細胞凋亡所具有的DNA梯狀條帶，表明有細胞凋亡發生。激光共聚焦檢測可見Apoptin定位于細胞核。感染后72小時，幾乎所有成骨細胞死亡，表明Os鄧-Apoptin重組慢病毒對成骨細胞具有較強的清除作用。 此外，本發明還利用細胞株如小鼠胚胎成骨細胞株MC3T3-E1、顱骨成骨細胞株HCO和人成骨肉瘤細胞株MG-63進行了上述檢測，均獲得類似結果，證實Os鄧-Apoptin重組慢病毒對成骨細胞具有較強的清除作用。
4、對間充質干細胞成骨分化的影響 取原代MSCs進行成骨誘導分化調整細胞密度為1. 0 X 105個/cm2，接種于6孔板中，加入含有成骨補充成分(濃度為10—8mol/L的地塞米松、濃度為10—3mol/L的P -甘油磷酸和濃度為50mg/L的抗壞血酸)的培養基進行誘導培養，分別于誘導后1、3、7和14天按MOI = 40感染Os鄧-Apoptin重組慢病毒，并于感染后24小時收集細胞，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測Osterix和Caspase-3的表達，觀察不同成骨分化程度的細胞系對Osterix的反應性。 結果隨著感染后MSCs的成骨分化，Osterix和Caspase-3的表達逐漸增加，表明Osxp-Apoptin重組慢病毒具有良好的針對Osterix的反應性。
5、在體觀察對軟骨形成的影響 以第三代MSCs作為種子細胞，按MOI = 40感染Osxp-Apoptin重組慢病毒，感染后24小時，胰蛋白酶消化，離心收集細胞，調整細胞密度為2X 107個/mL，再與殼聚糖-甘油磷酸鈉(C/GP)凝膠混合，充分吹打使混合均勻，用lmL注射器進行裸鼠皮下種植，分別于種植后4、8和12周取出標本，按常規方法進行福爾馬林固定、稀硝酸脫鈣、石蠟包埋切片，并進行伊紅_蘇木精(HE)染色、甲苯胺藍(TB)染色和免疫組化II型膠原染色。
結果組織學切片上可見類軟骨形成并分泌甲苯胺藍異染的軟骨基質和軟骨特異性II型膠原，未見明顯的骨化灶出現(圖8)，表明經Os鄧-Apoptin重組慢病毒處理的MSCs在體內成軟骨環境下具有良好的成軟骨能力，不會產生骨化灶。
11
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過參 照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可 以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明
的精神和范圍。序列表〈110〉中國人民解放軍第三軍醫大學〈120〉靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒及其制備方法和應用〈160>10〈210>1〈211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物F1〈400>1ggggtaccccC3CCC3ggg3 3gC33g3tg3t31〈210>2〈211>32〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物Rl〈400>2cggaattccgggtcccaagg agtcaggcagat32〈210>3〈211>2188〈212>DNA〈213〉小鼠(Mus musculus)〈400>3ccacccaggg朋gc33gatg 3tttetgag3ggagctactt3ttg朋g朋t60tccctagcca卿gggC3tC gggg3tggC3cctggtgactC3g朋gg朋tg3t卿ggCt120agagcattccctttgggggc aattaatccc33g3gCCt朋gtgtgggcat3朋tgagttg180ctctgtccctcagtcctgct tgcctteaatcatctcaggttccaggttctgtcctgcaaa240ccg鄉tgggcctaggtctc attccctaac3gtg朋3tCCagtatgctctgC3朋CC3C3300gcaagcttttcccactctct accacttgctccaggctgcctctagattgtaactcattga3603tgacattgc agteg朋g朋3gc3cacttggcacatcatccccctactcc420acgcacatacatacatgatc480atgcatgcac3C3C3tecac 3ggc3C3朋cacatatatgc540acatgcacac acacataccttgcatacaca6000114]tacacacatccatacacatcatatacactc3ggC3C3C3Cattcacatatccacacaggc660
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2188 〈210>4 〈211>30 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈223〉引物F2 〈400>4 cggatatccg agtaatttca aatgaacgct 30 〈210>5 〈211>31 〈212>DNA
374
〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉引物R2 〈400>5
gctctagagc cagtcttata cgccttcttg c 31
〈210>6
<211>374
〈212>DNA
〈213〉雞(Gallus gallus) 〈400>6
agt朋tttca aatgaacgct ctccaagaag atectccacc cggaccatca acggtgttca 60 ggccaccaac aagttcacgg ccgttggaaa cccctcactg cagagagatc cggattggte 120 tcgctggaat tecaatcact ctatcgctgt gtggctgcgc gaatgctcgc gctcccacgc 180 t朋gatctgc朋ctgcggac旭ttc3g朋3 gcactggttt c朋g朋tgtg ccggacttga 240 ggaccgatca acccaagcct ccctcgaaga agcgatcctg cgacccctcc gagtecaggg 300 t朋gcgagct朋朋g朋agc ttgattecca ctectcccag ccgaccccga 3ccgc朋g朋 360 ggtgtataag actg
〈210>7 〈211〉27 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223〉引物F3 〈400>7
actccgagtc aagagtagga ttgtagg 27
〈210>8
〈211>23
〈212>DNA
<213>人工序列
〈220〉
〈223〉引物R 3 〈400>8
卿3tgggag Euatggg卿g aag 23
〈210>9
〈211>18
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈220〉
14〈223〉引物F4〈400>93tctgc朋ct gcggac朋〈210>10〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物R4〈400>10gctgggagta gtggt肌tca a
1權利要求
靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒，其特征在于所述重組慢病毒基因組中包含一個Apoptin基因表達盒，所述Apoptin基因表達盒包含Osterix基因啟動子、Apoptin基因和終止子，所述Apoptin基因的表達由Osterix基因啟動子調控。
2. 根據權利要求1所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒，其特征在于所述 Apoptin基因表達盒還包括V5表位基因序列，所述V5表位基因序列位于Apoptin基因和終 止子之間。
3. 根據權利要求1或2所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒，其特征在于 所述重組慢病毒是將Apoptin基因表達盒插入HIV-1病毒基因組而得到。
4. 權利要求1所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法，其特征在于包括以下步驟a、 Osterix基因啟動子片段的克隆根據Osterix基因啟動子片段的核苷酸序列和 慢病毒載體pLenti6/V5-D-T0P0的引物設計要求設計并合成引物，以小鼠胚胎成骨細胞 MC3T3-E1的基因組DNA為模板，PCR擴增Osterix基因啟動子片段，克隆至pGEM-T載體，得 重組載體pGEM-T/0sxp ;b、 Apoptin基因片段的克隆根據Apoptin基因的核苷酸序列設計并合成引物，以雞法 氏囊組織中提取的基因組DNA為模板，PCR擴增Apoptin基因片段，克隆至pGEM-T載體，得 重組載體pGEM-T/Apo ;自pGEM-T/Apo中用EcoRV和Xbal雙酶切出Apoptin基因片段，與 同樣經EcoRV和Xbal雙酶切的pcDNA3. 1 (+)載體在T4DNA連接酶的作用下連接，得重組載 體pcDNA3. l_Apo ;c、 Osxp-Apoptin重組慢病毒載體的構建自pGEM-T/0sxp中用Kpnl和EcoRI雙酶切 出0sxp片段，與同樣經Kpnl和EcoRI雙酶切的pcDNA3. 1-Apo在T4DNA連接酶的作用下連 接，得重組載體pcDNA3. l-0sxp-Apo ;再自pcDNA3. 1-Osxp-Apo中用Kpnl和Xbal雙酶切出 Osxp-Apoptin片段，與pLenti6/V5_D_T0P0載體連接，得重組載體pLenti6/V5_0sxp_Apo ;d、 Osxp-Apoptin重組慢病毒的包裝采用Lipofectamine 2000試劑將pLenti6/ V5-0s鄧-Apo以及慢病毒包裝質粒混合物共轉染293FT細胞，待細胞出現明顯病變后，收集 含病毒的培養上清液，即得Os鄧-Apoptin重組慢病毒。
5. 根據權利要求4所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法，其特征 在于步驟a中所述引物序列為上游弓l物5， -ggggtacccccacccagggaagcaagatgat-3，； 下游弓l物5， -cggaattccgggtcccaaggagtcaggcagat-3，。
6. 根據權利要求5所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法，其特征 在于步驟a中所述PCR擴增條件為94t:預變性5分鐘，然后94。C變性1分鐘、59。C退火 1分鐘，72t:延伸2分鐘，共35個循環，最后72t:延伸10分鐘。
7. 根據權利要求4所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法，其特征 在于步驟b中所述引物序列為上游弓l物5， -cggatatccgagtaatttcaaatgaacgct-3，； 下游弓l物5， -gctctagagccagtcttatacgccttcttgc-3，。
8. 根據權利要求7所述靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒的制備方法，其特征 在于步驟b中所述PCR擴增條件為94t:預變性5分鐘，然后94t:變性1分鐘、6(TC退火1分鐘，72。C延伸1. 5分鐘，共30個循環，最后72t:延伸5分鐘。
9.權利要求1所述的靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒在制備誘導成骨分化細胞凋亡的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種靶向誘導成骨分化細胞凋亡的重組慢病毒及其制備方法和應用，該重組慢病毒基因組中包含一個Apoptin基因表達盒，Apoptin基因表達盒包含Osterix基因啟動子、Apoptin基因和終止子，Apoptin基因的表達由Osterix基因啟動子調控；該重組慢病毒以泛成骨細胞特異表達基因Osterix的啟動子作為啟動元件，在成骨分化細胞中表達誘導成骨分化細胞凋亡的Apoptin，而對成軟骨分化細胞和正常軟骨細胞不發揮作用，可以制成誘導成骨分化細胞凋亡的藥物，對經過成軟骨誘導分化處理的種子細胞中殘存的成骨分化細胞進行處理，保證種子細胞成軟骨分化的單一路徑，從而為組織工程軟骨的構建提供一種良好的種子細胞；該重組慢病毒的制備方法簡便、快速、成本低。
文檔編號A61P19/08GK101787359SQ20091025094
公開日2010年7月28日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者應大君, 楊波, 董世武, 謝肈, 鄧均, 鄒仲敏 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學