專利名稱：一種多西他賽脂質體無菌凍干制劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于藥物制劑領域，具體涉及一種脂溶性藥物多西他賽的脂質體無菌凍干 制劑及其制備方法。
背景技術：
法國羅納普朗克 安樂公司于1986年研發成功的多西他賽(也稱多烯紫杉醇)注 射液是繼紫杉醇后又一種新型抗微管藥物，1995年4月在墨西哥首先上市，隨后在英、美、 法、意、德、日等國家上市。與紫杉醇相比，多西他賽細胞內外流較少且低劑量誘導細胞凋亡效應顯著。許多 體外和臨床研究均證實多西他賽對多種腫瘤細胞有放射增敏作用且不加重正常組織的放 射損傷。多西他賽的親和性為紫杉醇的2倍，在體外抗癌活性試驗中，多西他賽活性可達紫 杉醇的10倍，除此之外，多西他賽還具有較好的生物利用度，更高的細胞內濃度，更好的水 溶性及優異的抗癌廣譜性，它不僅對乳腺癌、肺癌有很好的療效，而且對患有頭頸癌癥、胃 癌、胰腺癌及軟組織腫瘤的患者也具有較好的治療作用。此外，多西他賽與某些抗腫瘤藥物 聯合使用時，還具有協同作用。同紫杉醇一樣，多西他賽也不溶于水，臨床用的注射用多西 他賽均為注射用濃縮溶液，為2只西林瓶包裝，其中一瓶為多西他賽的吐溫溶液，另一瓶為 乙醇水溶液，臨床應用時先將乙醇水溶液注入多西他賽的吐溫溶液中，充分搖晃，5分鐘后 觀察澄明后才能應用于患者，臨床應用非常不方便。并且用藥時多西他賽注射液一旦稀釋 就必須立即使用，并在規定時間內用完，否則放置數小時即有多西他賽析出，被在線濾器過 濾導致藥效降低。這樣就迫切需要開發出新的多西他賽劑型，以增加其水溶性，避免由于復 合溶媒帶來的過敏反應及其他毒副反應，方便臨床應用。脂質體是靶向給藥系統的一種新劑型，一直是藥劑學研究的熱點之一，它可以將 藥物選擇性地輸送到腫瘤部位，發揮治療作用，同時又不影響正常細胞、組織或器官的功 能，從而達到提高療效、減少毒副作用的目的。脂質體具有類似于細胞膜的結構，構成雙分 子層的類脂親水性的頭部形成膜的內表面，而親脂性的尾部則處于膜的中間。正由于脂質 體的這種類膜結構使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩親的物質，它們被包入脂質體內 部水相、插入類脂雙分子層或吸附連接在脂質體的表面。脂質體作為藥物載體，既起到了對藥物的保護作用，又提高了藥物對機體特定部 位的靶向性，因此在提高藥效方面具有很多優越的特性。主要表現在以下幾個方面①脂質 體對機體無毒或毒副作用小，其脂質雙分子層與生物膜有較大的相似性以及組織相溶性， 從而易于被組織吸收，提高了藥物的吸收利用率；②脂質體包裹藥物為物理過程，不改變藥 物分子結構，不會破壞藥物成分，而包裹的藥物則可以避免被體內水解酶所破壞；③包裹后 的藥物可以降低其對機體特定部位的毒性，減小藥物使用量，使藥物具有緩釋和控釋作用； ④與病毒載體不同，脂質體在宿主體內可以生物降解，無免疫原性；⑤在基因治療上易于與 基因復合，有較高的靶向性，實現特定細胞的治療；⑥材料廉價，便于大量制備。近十幾年中已經有多篇關于多西他賽脂質體的文獻報道，但至今沒有一個產品成功的進入市場。究其原因，一是因為所制備的多西他賽脂質體質量不佳、穩定性較差，無法 長期保存；二是制備的多西他賽脂質體載藥量較低，臨床使用時需要同時輸注大量的磷脂 等輔料；三是制備工藝復雜，只適合于實驗室小規模制備，不適用大規模工業化生產。目前， 常用的脂質體制備方法包括以下幾種方法(1)薄膜分散法將膜材及脂溶性藥物溶于有機溶劑中，然后將有機溶劑蒸發，使 其在容器內壁上形成干燥的薄膜，將水溶性藥物溶于緩沖液中，加入容器中不斷攪拌，即得 脂質體。若想得到粒徑更小的脂質體，則需要配合適當的后處理手段，如超聲、高壓均質以 及擠壓等。(2)注入法將磷脂等類脂質及脂溶性藥物溶于有機溶劑中，然后將此藥液經注 射器緩緩注入一定溫度的緩沖液(或含有水溶性藥物)中，邊加邊攪拌，不斷攪拌至溶劑除 盡，即得。此法制備工藝簡單，易于操作，但脂質體質量不穩定。(3)跨膜梯度主動載藥法跨膜梯度主動載藥法包括PH梯度法和硫酸銨梯度法。 PH梯度法是通過調節脂質體內外水相的pH，使之形成一定的pH梯度差，利用藥物在不同pH 溶液中解離狀態的差異，以分子型透過外水相在內水相中形成離子型藥物而被包封。硫酸 銨梯度法是先將硫酸銨包于脂質體內水相，然后通過透析、凝膠色譜或超濾的方法除去外 水相的硫酸銨。它是通過游離氨擴散到脂質體外，形成PH梯度，使藥物集聚到脂質體內的。 跨膜梯度主動載藥法適合于某些弱酸性及弱堿性藥物，不適于難溶性藥物及中性藥物。(4)超聲波分散法在薄膜分散法的基礎上，再經超聲波處理，可得到單室脂質體 (SUV)。超聲技術有兩種一種是將超聲儀的探頭浸入脂質體分散體中，此方法是小規模制 備SUV應用最廣泛的方法；另外一種是將樣品放在試管或燒杯內，再置于水浴式超聲儀中。 由于超聲探頭處能量的釋放會導致局部過熱，因此必須有降溫或散熱措施。(5)冷凍干燥法(凍干再水化法)冷凍干燥法即將類脂高度分散于在水溶液中， 冷凍干燥，然后再分散到含藥的水性遞質中，形成脂質體。在一定范圍內，脂質體的包封率 和粒度隨凍融次數的增加而略有增大；凍融后攪拌或超聲均可使聚集的脂質體解聚，從不 影響包封率的角度考慮，攪拌比超聲處理更好。凍干再水化囊泡亦稱為凍干再水化脂質體 (FRV)是由預制囊泡制備而成。此法包封率很高，甚至對于大分子也可實現較高的包封率。 干燥工藝使脂質雙分子層和待包藥物緊密接觸，重新溶脹時對附著于脂質上的分子包封機 會較大。(6)逆向蒸發法(REV) =Szoka等于1978年提出了“REV脂質體”的制備工藝，即通 過逆向蒸發法制得內水相體積大且包封率高的脂質體。該方法是脂質體技術的一個突破， 因為其首次考慮到制備具有高內水相體積-脂質比特性的脂質體，且能夠包封現有的大部 分水溶性物質。REV脂質體可由各種脂質和脂質混合物制得，其內水相體積-脂質比SUV高 約30倍，比多層脂質體或手搖法制得的囊泡高4倍。在低鹽濃度和最佳條件下，有65%的 水相包封在囊泡中，甚至對大分子物質的包封率也很高。此法的基礎是“反膠束”的形成， 即被磷脂單分子層穩定的小水滴分散于大量有機溶劑中。這種反膠束是由緩沖水相和有機 相的混合物經超聲形成的，其中緩沖水相含有待包封入脂質體的水溶性分子，而有機相溶 有兩親性磷脂。緩慢除去有機相使反膠束轉變形成黏稠凝膠狀。在此過程的臨界點，凝膠 塌陷，部分反膠束破裂。反膠束破裂而產生的過量磷脂，反過來在余下的膠束周圍形成完整 的雙分子層，形成囊泡即REV脂質體。REV脂質體主要是單室的，但是每個REV制劑中都有
4一些囊泡是由幾個同心雙分子層構成，從而組成寡層囊泡。REV脂質體的大小與磷脂類型及 其在有機溶劑中的溶解度、水相緩沖液和有機溶劑之間的表面張力以及水相、有機溶劑和 脂質的相對量等因素有關。目前，關于多西他賽脂質體的研究報道較多，處方組成及制備工藝多種多樣。 如MariaL. I.等報道的多西他賽脂質體含藥量較低，穩定性差，無法長期保存，不適合
IS M (preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing docetaxel.Journal of controlled release 91(2003), 417-429.)CN200510029634.0公開了一種多烯紫杉醇脂質體及其制備方法。但此方法制備的 液態脂質體室溫下放置穩定性較差。而且制備工藝較為復雜，需要長時間蒸除有機溶劑，此 過程容易導致磷脂氧化產生溶血磷脂，不適合于工業化生產。CN200510110973. 1公開了一種紫杉烷脂質體凍干組合物及其制備方法，解決了低 成本地提高紫杉烷脂質體藥物組合物的復溶后的穩定性問題。但其制備的脂質體處方中添 加了環糊精，在臨床應用中存在一定風險。CN1846692A和CN101057831A公開了多烯紫杉醇長循環脂質體劑型及其制備方 法，顯著提高了脂質體在體內的循環時間，降低了藥物的毒性。但其未對凍干復溶后的脂質 體制劑的穩定性進行考察，特別是復溶后藥物的包封率及粒徑變化情況。另外，本發明曾按 照其公開的方法用外加法以蔗糖、葡萄糖以及甘露醇作為凍干保護劑，但無法得到外觀較 佳的凍干產品，且復溶后脂質體無法重建，藥物泄漏嚴重。CN101015M7A公開了一種多烯紫杉醇脂質體新劑型及其制備方法，但其滅菌方式 采用121攝氏度高壓滅菌，這無疑會導致磷脂的大量氧化，藥物在此劇烈的條件下穩定性 難以保證。另外，也未對滅菌后的制劑的穩定性進行考察。CN101317816A公開了一種多西他賽長循環制劑，以氯仿作為溶劑，毒性較大，另外 需要長時間旋蒸以去除殘留溶劑，這在工業化生產中難以實施。并且未對凍干前后的脂質 體進行穩定性考察。CN101322699A和CN101322689A公開了一種多西他賽長循環脂質體及其凍干粉針 的制備方法。采用了帶電荷的合成磷脂作為膜材，這些磷脂均為進口產品，價格昂貴且多數 不是注射級藥用輔料。處方中添加抗氧化劑以保護磷脂不被氧化。另外，制備工藝復雜不適 合工業化生產，特別是以氯仿甲醇作為溶劑，毒性較大難以完全去除，安全性得不到保證。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的主要目的是提供一種能夠明顯降低現有多西他賽 注射液毒副作用、制備工藝簡單、易于工業化放大生產的多西他賽脂質體無菌凍干制劑。該 制劑藥物包封率高、操作簡單，是一種在溶液中能夠穩定放置的納米膠體系統，此制劑經冷 凍干燥后能夠長期穩定放置，而且凍干制劑復溶后主要性狀維持不變。本發明所制備的多西他賽脂質體制劑中選用的磷脂為天然磷脂，價格低廉、易于 獲取。更重要的是所選擇的天然磷脂中磷脂酰膽堿的含量適中，這對于最終脂質體制劑的 穩定性及藥物的包封都是非常有利的。膽固醇對于脂質體制劑來說具有重要意義，其含量的多少一方面決定了脂質體在
5體內的穩定性，另一方面對藥物在體內的釋放行為具有重要影響。本發明在現有文獻報道 的基礎上適當降低了膽固醇的含量，這對于本發明具有重要意義。一方面通過減少膽固醇 的含量提高了脂溶性藥物在脂質雙分子層中的載藥量，另一方面保證了脂質體制劑在體外 及體內的穩定性。本發明所制備的脂質體制劑其平均粒徑在100納米左右，這一方面保證了脂質體 制劑在體內不會被網狀內皮系統迅速清除，另一方面有利于抗腫瘤藥物在腫瘤部位的聚 集、釋放。本發明的另一目的是提供上述多西他賽脂質體無菌凍干制劑的制備方法。此制備 方法最大的優點是將各種膜材在一定溫度下溶于適量的乙醇或叔丁醇等有機溶劑中之后 無需另外的步驟去除有機溶劑即可進入下一步操作。之所以選擇乙醇或叔丁醇是因為這些 溶劑毒性較小，無需刻意蒸除，只需要凍干步驟即可達到溶劑殘留的要求。另外本發明所選 用的膜材在乙醇或叔丁醇中很容易溶解。此制備方法簡單易行且適合于規模化生產。術語說明PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，是一種長循環膜材；mPEG2000-DSPE 甲氧基聚乙二醇2000 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；以上原料可市場購得，也可按現有技術自行制備。本發明技術方案的詳細描述如下本發明的技術方案是首先選擇一種或多種適合于多西他賽藥物本身性質的磷脂 并將藥物與磷脂溶于適量水溶性有機溶劑中，在適當的溫度及攪拌條件下充分溶解。向上 述溶液中添加適量的含有賦形劑及凍干保護劑的緩沖鹽溶液，在適當的溫度及攪拌條件下 充分混合后即可得到粗制的脂質體混懸液。此混懸液中的脂質顆粒具有較大的粒徑分布， 粒子的粒徑介于幾十納米到幾十微米之間。之后選擇適當的工藝可以將粒子的粒徑降低至 Ium以下，優選地，平均粒徑控制在200nm以下。通過上述步驟，即可得到多西他賽脂質體制 劑，此制劑經無菌過濾后可在室溫下穩定的放置90天以上而不發生聚集、沉淀，2-8°C條件 下可穩定放置12個月以上。為進一步提高制劑的穩定性、便于保存及臨床應用，可以選擇 冷凍干燥的方式對上述制劑進行處理。經冷凍干燥后的多西他賽脂質體制劑可長期穩定放 置，并且復溶后性質無明顯改變。脂質體的制備過程中所用到的主要輔料是磷脂，包括天然磷脂如大豆磷脂、蛋 黃磷脂、心磷脂以及鞘磷脂等；也包括各種合成或半合成磷脂如氫化大豆磷脂、氫化蛋黃 磷脂、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿 (DPPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)等；還可以是帶有電荷 的磷脂如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰絲氨酸(D0PQ、二肉豆蔻酰磷脂酰甘 油(DMPG)等。本發明所使用的磷脂可以是上述磷脂中的一種或幾種的組合物，其中優選 地使用天然磷脂，這些天然磷脂其磷脂酰膽堿的含量大于50%以上，優選地大于70%以 上。本發明所選用的磷脂與抗腫瘤藥物多西他賽具有一定的比例，此比例介于1 100到 1 10(重量比)之間，優選地介于1 50到1 10之間。本發明所述脂質體中還加入了膽固醇，脂質體中膽固醇的加入可以使脂質雙分子 層更加穩定，在高于相變溫度的情況下可以減少脂質體膜的流動性，而在低于相變溫度的前提下又可以增加膜的流動性。在體內環境中，膽固醇的存在一方面可以降低脂質體的清 除速度，另一方面還有利于藥物的緩慢釋放。不僅如此，膽固醇在脂質體中還能夠減少自由 基的生成，從而降低了氧化水平，防止溶血性磷脂的產生。但是，對于脂溶性藥物來說，膽固 醇的加入會降低藥物嵌入脂質體雙分子層的能力，從而降低脂質體的載藥量。故而，膽固醇 的加入量需要精心設計。本發明通過多次實驗發現，當膽固醇的加入量超過磷脂重量的5% (重量比)時，制備的脂質體制劑在短時間內就會出現沉淀。因此本發明中膽固醇的加入量 為磷脂重量的0-5% (重量比)之間。為了提高脂質體的穩定性，特別是在體內的循環時間，增加藥物的半衰期，向脂質 體中添加適量的長循環材料如鞘磷脂、神經節苷脂(GMl)以及聚乙二醇(PEG)衍生化的磷 脂也是適宜的。本發明采用了向脂質體中添加PEG化的磷脂如(PEG-DSPE，聚乙二醇化的 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的方式來延長脂質體的體內半衰期，提高腫瘤治療效果。其中， PEG-DSPE的添加量需要與磷脂的量保持一定的比例，此比例可以是0-50 % (重量比)，優選 地選擇0-30%。如果選擇0，則意味著此脂質體為普通脂質體，不具有長循環功能。脂質體的制備方法也是多種多樣的，包括薄膜蒸發法、注入法、超聲分散法、冷凍 干燥法、逆向蒸發法等方式在內的各種制備方法均適于本發明。但是由于這些方法所制備 的脂質體在穩定性、包封率、載藥量等方面差異較大，因此制備的脂質體質量差異較大，有 時甚至出現質量較差的情況。為了能夠制備出質量較高的脂質體，同時簡化制備工藝使其 適用于工業化規模生產，本發明采用了一種改良的制備工藝。具體來說，首先將適量的磷 月旨、膽固醇、多西他賽共同溶于與水互溶的有機溶劑中，此有機溶劑可以是乙醇、叔丁醇、甲 醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等中的一種或多種的組合物。由于本發明不需要去除有機溶劑，因 此選擇毒性較小的乙醇及叔丁醇是較佳的選擇。為了更好的溶解，可以通過升高溫度以及 攪拌或超聲的方式。另外，有機溶劑的添加量也是需要精心選擇的，本發明有機溶劑的添 加量與最終的制備體積具有相關性，具體來說有機溶劑的添加量不宜超過最終制備體積的 20%，其中又以不超過10%為佳，例如制備體積若為1000ml，則有機溶劑的添加量以不大 于IOOml為佳。上述步驟之后，可以象現有技術報道的那樣選擇旋轉蒸發或其他合適的工藝將有 機溶劑去除。但本發明中卻無需此步驟，這大大簡化了制備工藝、縮短了制備周期，特別適 合于大規模制備。然后，可以直接將配制好的緩沖鹽溶液加入至溶解有藥物和磷脂的溶劑 中進行孵育。此時的孵育溫度為30-70°C之間，以40-60°C為最佳，孵育時間為10-60分鐘。 上述緩沖鹽溶液有多種選擇，可以是磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖夜等等，PH 介于3. 0-8. 0之間，優選4. 0-7. 0之間。另外，為了便于冷凍干燥的進行，緩沖鹽溶液中添 加適量的凍干保護劑也是必需的。這些凍干保護劑可以是一種或多種糖類物質，其中以單 糖及雙糖為佳，如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、半乳糖等；也可以是其他非糖類物質 如甘露醇、白蛋白、甘氨酸等。本發明中選擇了上述凍干保護劑中的一種或多種物質。凍干 保護劑在緩沖液中的重量體積比以2-20%為佳，優選地介于5-15%之間。經上述孵育步驟之后形成的混懸液即為脂質體粗混懸液，此混懸液中的脂質體多 為多室脂質體或多層脂質體，粒徑也較大，一般介于幾十納米到幾十微米之間。此混懸液 不適于作為靜脈注射液用脂質體，也不穩定。因此需要進一步加工，具體來說可以通過高 壓擠出、超聲、高速攪拌等方式將此混懸液進一步降低粒徑提高穩定性。本發明采用了微射流設備對粗混懸液進行加工，壓力選擇介于1000-20000psi之間，循環次數介于2-20個 之間。優選地工藝是先經過低壓O000-6000psi)進行2-10個微射流循環，再經過高壓 (7000-20000psi)進行2-10個微射流循環。如此工藝之后，制備的脂質體的平均粒徑可降 低至微米以下，如果工藝選擇合適，平均粒徑可降低至50-500nm之間。經上述步驟之后制備的脂質體經逐級過濾除菌后室溫下可以穩定的放置90天以 上而不會發生明顯的質量改變。上述脂質體溶液經除菌過濾后可直接用于靜脈注射。為了進一步提高穩定性，可 選擇冷凍干燥或噴霧干燥的方式去除水分。將最終制劑的水分含量控制在3%以下。優選的，本發明所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑中，每100克多西他賽脂質 體無菌凍干制劑中含有如下組分
權利要求
1. 一種多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于每100克多西他賽脂質體無菌凍干 制劑中含有如下組分
2.如權利要求1所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于制備方法包括如下 步驟(1)稱取天然卵磷脂、PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和膽固醇溶于有機 溶劑中，于40-60°C條件下攪拌溶解得磷脂溶液；(2)稱取多西他賽并加入上述磷脂溶液中；(3)采用注射用水配制含有凍干保護劑的緩沖鹽溶液，調節pH至4.0-7.0之間；并 將其加入至上述步驟( 制得的磷脂溶液中，保持溫度40-60°C，攪拌或超聲條件下孵育 10-60分鐘得混懸液；(4)將步驟C3)得到的混懸液加入至微射流儀中，調節壓力為2000-6000psi，循環2-10 次之后，調節壓力為7000-20000psi，循環2-10次；得到脂質體溶液；(5)將步驟(4)得到的脂質體溶液依次經0.8um、0. 45um、0. 22um濾膜逐級過濾、得多西 他賽脂質體；在無菌條件下分裝，冷凍干燥即得多西他賽脂質體無菌凍干制劑。
3.如權利要求1或2所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于所述的天然磷 脂為天然的大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂。
4.如權利要求3所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于在所述的大豆卵磷 脂或蛋黃卵磷脂中，磷脂酰膽堿的含量大于70wt%，溶血性磷脂的含量小于3wt%。
5.如權利要求1或2所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于所述的凍干保 護劑為麥芽糖、甘露醇、半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一種或幾種的組合物。
6.如權利要求1或2所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于所述的緩沖鹽 選自磷酸鹽、醋酸鹽或甘氨酸鹽。
7.如權利要求1或2所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于制備過程中所 用的有機溶劑選自乙醇、叔丁醇中的一種或兩種的組合物，有機溶劑的用量不超過最終制 備的液體制劑體積的20%，優選為不超過10%。
8.如權利要求1或2所述的多西他賽脂質體無菌凍干制劑，其特征在于多西他賽脂質 體無菌凍干制劑加入生理鹽水、葡萄糖注射液或注射用水復溶后平均粒徑在50-200nm之 間，藥物包封率大于95%, pH介于4. 0-7. 0之間。
全文摘要
本發明涉及一種多西他賽脂質體無菌凍干制劑及其制備方法，多西他賽脂質體無菌凍干制劑由多西他賽、天然卵磷脂、PEG-DSPE、膽固醇、凍干保護劑、緩沖鹽組成。將天然卵磷脂、PEG-DSPE、膽固醇以及多西他賽溶于有機溶劑中，加入含有凍干保護劑的緩沖液，孵育10-60分鐘，將脂質體的平均粒徑降至50-200nm，除菌過濾后冷凍干燥即得。本發明制備的多西他賽脂質體與目前市售普通注射液相比，具有毒副作用小、療效高的優點。本發明的制備方法簡單易行、適合工業化生產，所制備的多西他賽脂質體包封率高、穩定性好。
文檔編號A61P35/00GK102085189SQ200910230758
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月3日 優先權日2009年12月3日
發明者張明會, 李伯濤, 楊光麗, 楊清敏, 王晶翼, 王棟海, 王琳琳 申請人:齊魯制藥有限公司