專利名稱：：一種治療肝癌的中藥的制作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥，特別是一種治療肝癌的中藥。二
背景技術：
：肝癌是常見多發的惡性腫瘤之一，世界上每年約有26萬人死于肝癌，其中我國每年死于肝癌的人數約為11萬，占全世界肝癌死亡病例的42.5%，并且隨著社會的發展，肝癌的發生率呈現與日倶增之勢。由于本病病程短(多為36個月)、進展快、死亡率高，嚴重危害了人民的健康和生命。祖國醫學對肝癌的認識淵源已久，在《內經》中就已有類似肝癌的癥狀、體征和病因的記載。后經歷代醫家的補充，從而對肝癌病因和病機已有了更加深入地認識。肝癌作為一種全身性疾病，其發病是內、外因共同作用的結果。內有正氣先虛，外有邪毒侵犯，致使肝失疏泄，造成氣滯血瘀、熱蘊痰凝，日久積而成塊，聚于肝臟，形成肝癌。肝癌屬于本虛標實之證本虛即氣血不足，臟腑虛弱；標實即邪氣留戀，促成痰凝血瘀火毒內蘊。在肝癌的發生發展過程中，還明顯地呈現出階段性發病之初多為肝郁脾虛、氣血瘀滯，晚期由于邪毒耗氣傷血、正氣大損。目前治療肝癌的中西藥物很多，如維生素E、維生素C、氟尿嘧啶、多柔比星(阿霉素)、絲裂霉素(MMC)、消癌丸等，但由于種種原因，其使用和療效并不盡人意，因此，治療肝癌藥物的創新是需要認真解決的技術問題。三
發明內容針對上述情況，為克服現有技術缺陷，本發明之目的就是提供一種治療肝癌的中藥，可有效解決肝癌的治療問題，其解決的技術方案是，根據中醫藥學原理和肝癌發病機理，由前述肝癌是正氣先虛，外有邪毒侵犯，致使肝失疏泄，造成氣滯血瘀、熱蘊痰凝，日久積而成塊，聚于肝臟，形成肝癌，其治療應以扶正祛邪、固本、解毒、活血化瘀為治療根本原則，故本發明采用由重量份數計當歸14-16份、延胡索9-11份、蚤休14-16份和白頭翁14-16份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，每次加入藥物重量和的15-20倍的水，煎沸后，文火煎煮40-60分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的5-10倍的無水乙醇，浸泡7天，過濾，得濾液，兩次濃縮，第一次濃縮至無水乙醇量的1/15后，再進行第二次濃縮成相對比重為1.2-1.6(或濃縮至原藥液體積的40-70%)的稠膏，真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉，本發明組方簡單，配伍合理科學，服用效果好，療效高，是治療肝癌中藥上的創新。四具體實施例方式以下結合實施例對本發明的具體實施方式作詳細說明。實施例1本發明在具體實施時，可以下重量份數計當歸14份、延胡索9份、蚤休14份和白頭翁14份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加入藥物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分鐘，每二次加入藥物重量和15倍的水，煎沸后，文火煎40分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的5倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.2的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。實施例2本發明還可由以下重量份數計當歸15份、延胡索10份、蚤休15份和白頭翁15份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加入藥物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎55分鐘，每二次加入藥物重量和16倍的水，煎沸后，文火煎45分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的8倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.3的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。實施例3本發明還可由以下重量份數計當歸16份、延胡索11份、蚤休16份和白頭翁16份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加入藥物重量和20倍的水，煎沸后，文火煎60分鐘，每二次加入藥物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量10倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.4的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。實施例4本發明還可由重量計的當歸15g、延胡索10g、蚤休15g和白頭翁15g制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加水990ml，煎沸后，文火煎55分鐘，每二次加水880ml，煎沸后，文火煎45分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量8倍的無水乙醇(即當歸15g加無水乙醇120g，延胡索10g加無水乙醇80g，蚤休15g加無水乙醇120g，白頭翁15g加無水乙醇120g)，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.6的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。在上述藥物中，其中當歸補血活血，調經止痛，潤腸通便；延胡索(又稱元胡，玄胡)，活血、利氣、止痛；蚤休(又稱重樓)，清熱、解毒、鎮靜；白頭翁，清熱解毒，涼血止痢。當歸、延胡索組成養血活血方(B);蚤休、白頭翁組成清熱解毒方(H);兩方組合為本發明養血活血、清熱解毒合方(A)。上述藥物的有效組合，互相支持，具有養血活血、清熱解毒、消瘀血，解惡毒，益氣養陰，扶正固本，有效用于治療肝癌，并為試驗資料和臨床資料所證明，有關資料如下—、試驗資料l實驗對象H印G2細胞購自中國醫學科院細胞中心。2實驗方藥和分組實驗方藥分養血活血方、清熱解毒方和養血活血清熱解毒合方。養血活血方(B):當歸、延胡索；清熱解毒方(H):蚤休、白頭翁；養血活血清熱解毒合方(A):當歸、延胡索、蚤休和白頭翁。上述中藥均購于河南中醫學院第三附屬醫院。3實驗材料和方法3.1藥物制備3.1.1試劑無水乙醇(分析純)天津市科密歐化學試劑開發中心3.1.2主要儀器SHZ-D循環水式真空泵河南鞏義市英峪華中儀器廠RE-3000B旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠DK-S24型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司DZF-6050型真空干燥箱上海精宏實驗設備有限公司3.1.3藥物提取方法按藥物當歸、延胡索、蚤休和白頭翁各250g，分別加乙醇1500ml，冷浸一周后，濾紙過濾，旋轉蒸發器5(TC濃縮至100ml，轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成稠膏狀，5(rC真空干燥，所得提取物，稱重，分裝，置_201:冰箱保存，備用，使用時，再按相當于原生藥物當歸15g、延胡索10g、蚤休15g和白頭翁15g為一劑份量的醇提物分別組成養血活血方(B)、清熱解毒方(H)和本發明中藥養血活血清熱解毒合方(A)，并依此進行試驗。3.2細胞培養3.2.1試劑①MEM培養基(GIBC0產品)；②胰蛋白酶(SABC產品)；③特級胎牛血清(Hyclone產品)；MTT染料(Sigma產品)3.2.2主要儀器Heraeus細胞培養箱(德國Kendro公司)；倒置顯微鏡(Zeiss公司)；紫外分光光度計(Thermo公司)；SG_603生物安全柜(Bake公司)；ELx800型酶標儀(Bio-Tek公司)；蛋白電泳系統(Bio-Rad公司)；高速低溫臺式離心機(Sigma公司)。3.2.3細胞培養方法(1)復蘇液氮中保存的H印G2細胞；(2)用含10%胎牛血清的MEM培養液，接種于培養瓶中置37°C、5%C02培養箱內培養；(3)鏡下觀察培養瓶內細胞匯合率達到瓶底面積的80%時，吸去舊培養液，加入適量O.25%胰蛋白酶，37°〇消化35分鐘，使其脫壁(4)加入MEM洗滌培養液洗滌細胞2次；(5)用10X胎牛血清的MEM培養液制成細胞懸液，按1X107皿的細胞密度接種于新的培養皿中繼續擴大培養。3.3MTT方法檢測細胞生長抑制率3.3.1試劑MTTSigma公司DMS0Amresco公司3.3.2儀器ELx800型酶標儀BIO-TEK公司其他儀器同細胞培養3.3.3主要試劑配制(l)5mg/mlMTT溶液配制0.5gMTT，加100mlPBS緩沖液，混勻，過濾除菌，4。C冰箱保存備用。(2)其他試劑同細胞培養3.3.4MTT測定方法(1)以IX104細胞/孔接種96孔平面培養板，在37°C、5%C02及飽和濕度的C02培養箱中培養24小時；(2)分為對照組(C)，養血活血方組(B)，清熱解毒方組(H)，合方組(A)，(？)每組設3個復孔。每味藥物的濃度梯度均為1.25iig/ml、12.5iig/ml、25iig/ml、50iig/ml、100iig/ml、200iig/ml、400yg/ml、800yg/ml;合方為養血活血方和清熱解毒方劑量之和。(3)繼續培養48小時，吸去培養上清，每孔加入0.5mg/ml的MTT100ml，繼續培養2小時，小心吸去上清，并加入100ii1/孔的DMSO，稍稍振蕩，用酶標儀在波長570nm處，測定OD值。(4)用SPSS11.0統計軟件繪制劑量_效應曲線，由此曲線擬合公式計算細胞生長半數抑制量(IC5。)。3.4.Westernblot測定mtp53、PKCa蛋白的表達以1X106細胞/皿接種①100mm細胞培養皿，在37t:、5XC02及飽和濕度的C02培養箱中培養24小時。分為對照組(C)，養血活血方組(B)，清熱解毒方組(H)，合方組(A)，()其中養血活血組、清熱解毒組藥物劑量為其1/2IC50，合方為養血活血和清熱解毒劑量之和。繼續培養48小時后，去除培養上清，加入10mlPBS，用細胞刮刀收集細胞到15ml離心管中，1000rpm離心10分鐘，收集細胞沉淀。加入0.5ml預冷的裂解緩沖液裂解細胞。超聲破碎。力口入100,1/LPMSF5ii1，10iig/mlleup印tin1iil，冰浴1小時。15000rpm離心15分鐘。取上清，用Bradford法測蛋白濃度，10yg/孔上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉至硝酸纖維素膜，封閉、洗滌30min，加入一抗反應4h、洗滌30min，加入二抗反應2h，洗滌30min，用增強化學發光(ECL)試劑曝光、顯影、定影、洗片，重復3次。3.5ELISA方法檢測AFP的含量3.5.1試劑甲胎蛋白定量檢測試劑盒鄭州博賽生物工程有限公司3.5.2儀器如同前面MTT測定所用儀器3.5.3ELISA方法檢測AFP含量6(1)在96孔細胞培養板中接種每孔1X104個細胞；(2)24小時后，分組加藥，分組及用藥情況如同MTT實驗；(3)繼續培養細胞6小時，收集上清加入酶標板；(4)加入一抗反應4小時，洗板5次；[OO72](5)加入顯色劑；(6)在酶標儀上以450nm的波長讀取0D，繪制標準曲線，計算樣本含量。4統計學處理應用聯想奔IV計算機，SPSS11.0統計軟件進行曲線擬合，F檢驗。結果1養血活血、清熱解毒及其合方對H印G2細胞形態的影響倒置顯微鏡下觀察對照組細胞較大，形態似上皮細胞，多邊形，境界清，核大圓形，細胞漿中未見透明顆粒，可檢出雙核、巨核和不規則形態核的細胞，能見到不對稱分裂現象；細胞間相互連接，密集成片生長。養血活血組細胞存在較多的圓形細胞，細胞核固縮；而清熱解毒組細胞，漿內充滿圓形、透明折光強的顆粒，懸浮細胞增多，并且體積縮小變圓，細胞散在生長，細胞間隙加大；合方組的細胞形態改變為前兩者兼而有之。2養血活血、清熱解毒及其合方對H印G2細胞生長的影響養血活血、清熱解毒及其合方均可抑制H印G2細胞的生長，并且隨藥物濃度的增加，細胞抑制率逐漸上升，呈現劑量_效應依賴關系，以合方抑制作用最強。由藥物對肝癌細胞的抑制作用經SPSS擬合曲線回歸公式如下養血活血方Y=-0.8068+0.26481n(x)其中Rsq=0.948，F=72.62，Sigf=0.001清熱解毒方Y=-0.5397+0.2406ln(x)其中Rsq=0.797，F=15.66，Sigf=0.017合方Y=-0.4725+0.23761n(x)其中Rsq=0.796，F=15.65，Sigf=0.017由上述擬合曲線分別得到養血活血方對H印G2細胞的IC5。為139.08yg/ml，清熱解毒方對H印G2細胞的IC5。為75.28yg/ml，合方對H印G2細胞的IC5。為59.92yg/ml(見表1)。表1養血活血、清熱解毒及合方對H印G2細胞生長的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3養血活血方(B)、清熱解毒方(H)及其合方(A)對H印G2細胞mtp53蛋白表達的影響養血活血方、清熱解毒方及其合方分別對H印G2細胞mtp53蛋白的表達有明顯抑制作用，而合方作用最強。這顯示養血活血方及清熱解毒方具有協同作用。4養血活血方(B)、清熱解毒方(H)及其合方(A)對H印G2細胞PKCa蛋白表達的影響同對照組(C)相比，養血活血方、清熱解毒方及其合方分別對H印G2細胞PKCa蛋白的表達有明顯抑制作用，而合方作用最強。這顯示養血活血方及清熱解毒方具有協同作用。5養血活血、清熱解毒及其合方對H印G2細胞AFP蛋白表達的影響各藥物組對H印G2細胞AFP蛋白表達有明顯抑制作用，隨藥物濃度的增加，抑制率逐漸上升，呈現劑量-效應依賴關系。(見表2)表2各藥物組對H印G2細胞AFP蛋白表達抑制作用表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上述情況表明PKCa、p53和AFP在肝癌病變中的作用1.lp53與肝癌發生的關系p53基因是一種腫瘤抑制基因，全長20kb，位于人染色體17p13.1，由11個外顯子和間隔的10個內含子組成，編碼393個氨基酸組成的53kD的核內磷酸化蛋白，具有蛋白質-DNA和蛋白質_蛋白質結合的功能[11]。現已明確，p53基因是一個比較特殊的基因，野生型p53(wtp53)基因作為抑癌基因行使功能，成為細胞生長周期的負調控因子，與細胞周期的調控、基因組的穩定、DNA的修復、細胞分化和細胞凋亡等重要的生物學功能密切相關[12]。作為一種腫瘤抑制基因，人類各種組織中均有wtp53mRNA的表達，盡管在正常細胞中其表達產物水平很低，但扮演著一個十分重要的角色一方面，p53基因與DNA相結合，起轉錄因子作用，能活化CDK抑制劑、p21WAFl和GADD45基因的轉錄，使細胞生長停滯在^關卡，可以和TATA結合蛋白(TBP)結合，抑制c-fos、c-j皿、RB、PCNA及p53基因自身的轉錄，還可以與復制因子A(RPA)相互作用，參與DNA的復制及修復，抑制細胞增殖；另一方面，它作為"基因衛士"監視著細胞基因組的完整性，在細胞受到某種射線或藥物的作用而發生DNA損傷的情況下，能使細胞分裂終止在G乂S期，以便細胞有足夠的時間修復損傷以恢復正常狀態，若損傷不能修復就啟動細胞的凋亡。大量研究表明p53基因在許多腫瘤中都有很高的突變率，是迄今為止發現的突變率最高、涉及范圍最廣泛并被廣泛研究的抑癌基因之一[14]。對于突變p53蛋白的功能，目前有兩種解釋一是顯性失活機制，當p53等位基因位點有一個發生突變時，p53突變體(mtp53)可通過干擾wtp53蛋白的功能而影響細胞的生長，為細胞的癌變提供了條件，但并不直接致癌。二是功能獲得機制，即mtp53蛋白不僅失去負調控能力，而且獲得了轉化能力，具有癌蛋白的功能，能與細胞內wtp53相結合，抑制其正常功能，并可競爭性結合p53的正常底物而起到干擾作用，從而剌激細胞異常增殖，最終導致細胞的惡性轉化形成癌[15]。另外，DNA腫瘤病毒蛋白還可以和wtp53蛋白相結合形成復合物，使wtp53蛋白抗癌功能的喪失及半衰期的延長而在細胞內大量積聚，增強了細胞的分裂和增殖能力。對中國南部地區的70例HCC患者的嗜肝病毒感染和病理資料與p53基因變化的關系分析的結果顯示，p53基因的密碼子249的突變與AFP陽性、HCC分化程度、HCC高度流行區、嗜肝病毒感染以及HBVDNA在癌組織中存在等因素密切相關^。盡管流行病學研究表明肝癌的發生是多因素、多階段和多個基因改變協同作用的結果，但是環境因素(如HBV感染、黃曲霉毒素B工攝入以及飲用水污染等)較遺傳因素更為重要，它可以引起p53的變異而促進肝癌的發生。(1)黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)，尤其是AFBjAF的一種，它在薄層層析中顯示藍色熒光，故名)作為肝癌的致癌物已經確認，但其確切機制尚未明了。在ShenHM的研究報告中，p53基因突變主要發生在第249密碼子的的第三堿基G:T—T:A顛換，導致精氨酸一絲氨酸的變化，并認為這可能是AFB工的攻擊靶點，其后的大量研究也支持這一結果來自于歐美、中東及其他AFB工低含量區的肝癌，雖然也存在較高的突變頻率，但是第249位密碼子的突變率卻非常低，這表明p53基因的突變差異與不同的致癌因素作用有關^。同時由AFB工引起實驗動物的p53基因突變位置也發生在第249密碼子，這也間接地支持了AFB1的致癌作用[19]。(2)乙型肝炎病毒(HBV)是肝癌的另一個主要的環境致癌因子，它與肝癌的密切關系早已被流行病學資料所證實。實驗研究發現，絕大多數源于HBV感染的肝癌存在HBVDNA的整合^。據推測第17號染色體長臂由較多的HBVDNA的整合，其中有些靠近p53基因的位置，而HBVDNA的整合則有可能直接引起p53基因結構的改變。另外，也有研究表明HBVX蛋白可能與野生型p53蛋白結合形成復合物，不僅阻遏了wtp53的功能，而且使p53蛋白在細胞內地積聚，并可激活HBV在細胞內的復制，形成惡性循環，導致肝癌的發生。1.2PKCa和肝癌發生的關系蛋白激酶C(PKC)是一組磷脂依賴性&2+激活的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶。它由單一多肽鏈組成，相對分子質量為7783KD，包括兩個功能區，即與磷脂、二酰甘油(DAG)及TPA(佛波脂)結合的疏水性調節區和與ATP及底物相結合的親水性催化區。9PKC廣泛分布在機體的各種組織中，主要以無活性的形式存在于胞質中，在無剌激條件下對Ca2+不敏感，當外界剌激引起4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)分解使細胞內甘油二酯(DG)和IP3增加以及繼發的Ca2+的水平升高時，PKC則從胞質移位結合到質膜上而被激活。PKC的激活方式有兩種途徑一是靠調節催化區而實現的。某些因子，如磷脂、Ca2+、TPA等，與調節區結合則可誘發其構象變化，啟動催化區從而活化PKC;另一種途徑是通過某些受體激動劑或激素來增強磷脂酰肌醇代謝周轉率，不斷產生DAG和三磷酸肌醇(IP3)而活化PKC。PKC被激活后，可以將細胞質中的某些結合有基因表達調控因子的抑制蛋白磷酸化，使抑制蛋白釋放出基因表達調控蛋白，進入細胞核促進特異基因的表達；或者激活一個級聯系統的蛋白激酶，讓激活的蛋白激酶再通過磷酸化的方式激活下游特定基因表達的調控蛋白，從而影響細胞的生長、分化、增殖甚至癌變等。PKC不僅是細胞信號傳導系統中的一個關鍵酶，而且它還一直被認為有促癌作用。近年研究發現，PKCa的表達參與細胞的惡性轉化及腫瘤細胞多藥耐藥性的形成。在肝癌組織中，PKCa的蛋白表達水平明顯高于正常組織及良性病變；并且，癌組織和邊緣癌組織PKCa表達的陽性率明顯高于其相應的癌旁組織和非肝癌組織，中心癌組織則又明顯高于邊緣癌組織[27]。這提示肝癌細胞內PKCa蛋白表達量的上升，提高了它在細胞信息傳遞中的反應性，從而促進細胞的增殖與或惡性病變。1.3AFP與肝癌發生的關系甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是第一個用于診斷肝癌的腫瘤標志物，其診斷陽性率為6070%。研究發現，人AFP基因位于第四號染色體短臂4ql112區，和血清白蛋白及維生素D結構蛋白基因都位于相同染色體區，AFP基因大約有20kb，含有15個外顯子，14個內含子，在轉錄起始點的上游有44個核苷酸的5端帽子結構，具有2個ALU家族序列和2個Poly(dT-dG)重復序列。AFP基因編碼一分子量約為69kD的糖蛋白，通過相應的mRNA推測其大約含591個氨基酸殘基，并與血清白蛋白在遺傳特征和結構上相近，在氨基酸順序上也廣泛同源。AFP是一種癌胚蛋白。在胚胎早期，AFP是胎兒血液循環中的主要蛋白之一，約為白蛋白水平的1/10;而在嬰兒出生后18個月后其血清中的AFP含量就已接近正常成年人的水平(<20ug/L)。研究發現，[28]在胚胎發育過程中，AFP的增強子始終處于激活狀態，而沉默子則處于抑制狀態，因此增強子的信號可以順利到達啟動子區而啟動AFP基因的大量表達。胎兒出生后，沉默子活化，阻礙了增強子的啟動效應，使AFP表達受到抑制。當HCC發生時，沉默子再次受到抑制，得以使AFP的基因轉錄又一次被激活并在HCC中大量表達。研究表明，肝癌細胞所表達的AFP具有既能抑制機體免疫系統使肝癌細胞能避開機體的免疫攻擊、又能反過來直接促進肝癌細胞生長的雙重作用。1.4肝癌的發生和發展過程中，mtp53、PKCa及AFP三者之間的關系早已發現PKCa氨基酸序列中的絞鏈區(C3)可轉位進入核內而發揮其對核基因及轉錄因子表達的調節能力。研究發現，人癌細胞在PKC抑制劑Staurosporine和Sphingsine或大劑量TPA(佛波酯)作用降低PKCa含量后，p53蛋白的表達明顯降低，這表明PKCa可調節p53蛋白含量^。而且p53的DNA結合位點和啟動位點與PKCa磷酸化位點非常相似，在p53蛋白的357381位氨基酸序列上存在能被PKCa結合并磷酸化的多個絲氨酸和蘇氨酸殘基^^，這提示p53可能是PKCa的底物。NakamuraK研究認為，wtp53的磷酸化依賴于PKCa的激活^，而wtp53蛋白的磷酸化作用就是其作為轉錄因子的前提。wtp53蛋白可使受損細胞阻滯于Gl期，讓細胞有足夠時間得以修復受損DNA或阻止不能修復的細胞進入G2/M期而出現凋亡，從而起到抗腫瘤作用，但當wtp53突變為mtp53而在細胞內大量積聚，繼而被PKCa的磷酸化作用而激活后就會通過多種機制促進細胞的惡性增殖。李孟森等研究表明，在一定劑量范圍(0.0lmg/L0.08mg/L)，AFP能夠促使胞外Ca2+內流和胞內&2+池的Ca2+外溢，引起胞漿Ca2+升高，這為PKCa的活化提供了條件；同時檢測細胞周期、細胞DNA合成等指標，均證明AFP能加快細胞從Gl期進入S期，顯著促進了DNA的合成，并發現AFP作用于細胞后也能促進p53、c-fos、c-j皿、N-ras等原癌基因的表達而引起細胞的惡性增殖。可見，AFP，mtp53及PKCa三者之間相互影響，相互作用，共同導致了肝癌的發生和發展。2養血活血、清熱解毒方對H印G2細胞生長mtp53、PKCa和AFP的抑制作用從中醫藥角度出發，結合mtp53、PKCa及AFP的基因表達情況來研究肝癌的發生與發展，國內尚未有過報道。本研究中我們通過觀察肝癌細胞中mtp53、PKCa及AFP三者在藥物作用前后表達情況的變化，探求肝癌的發展規律及中醫藥的作用機理，進而根據藥效反證探討腫瘤病機。我們已對古今文獻中治療腫瘤的方藥進行了系統整理和分析，初步從300余種中藥中篩選出一些能有效抑制肝癌細胞生長的中藥，并根據祖國醫學對肝癌的病因病機的認識，通過一系列的實驗研究組建了治療肝癌的養血活血、清熱解毒方。養血活血清熱解毒方由當歸、延胡索、蚤休、白頭翁等四味中藥組成。其中，當歸，甘溫質潤，功專補血、活血、調經、止痛，為補血之要藥；延胡索辛散溫通，具有活血、行氣和止痛的作用；蚤休具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚之功效，為治癰腫疔毒的要藥；白頭翁具有清熱解毒和涼血止痢的功效，尤善于清理胃腸的濕熱和血分熱毒等。以上諸藥合用，共奏養血活血、清熱解毒之功，以達到治療肝癌的目的。實驗結果顯示，養血活血清熱解毒方對肝癌細胞H印G2的生長具有一定的抑制作用，并且隨藥物濃度的增加，對肝癌細胞的生長抑制率逐漸升高，呈現出劑量-效應依賴關系。養血活血方和清熱解毒方與合方相比，以合方的作用最強，表明養血活血方和清熱解毒方之間具有協同作用，根據藥效反證說明在肝癌的發生發展過程中，具有血虛、血瘀和熱毒等多因素并存的復雜的病機。在本項研究中，我們用Westernblot及ELISA技術檢測了用藥前后肝癌細胞中mtp53、PKCa及AFP蛋白表達的變化。發現與對照組相比，養血活血、清熱解毒方及合方能明顯下調mtp53、PKCa及AFP蛋白的表達，提示養血活血、清熱解毒方可通過抑制mtp53、PKCa及AFP蛋白的表達來抑制肝癌細胞增殖，也說明中醫肝癌血虛、血瘀和熱毒病機與mtp53、PKCa及AFP蛋白的表達異常密切相關。3.血虛、血瘀及熱毒內蘊和肝癌發生的關系血虛、血瘀及熱毒蘊結是肝癌發生發展的重要病理機制。血虛不濡脈道，可致血流不暢，瘀血又可致新血不生；瘀血日久化為熱毒、血虛也易生熱，反之熱毒又使陰血耗傷，灼血為瘀，三者相互促進，互為影響，共同導致了肝癌的發生和發展。我們的研究表明，在肝癌的發生和發展過程中，存在著mtp53、PKCa和AFP蛋白表達的異常。應用養血活血、清熱解毒方可以抑制肝癌細胞的生長和mtp53、PKCa和AFP蛋白表達，這提示mtp53、PKCa和AFP蛋白的異常表達可能就是肝癌發生過程中血虛、血瘀和熱毒內蘊狀態的分子機理。結論1、養血活血方、清熱解毒方及其合方能抑制肝癌細胞H印G2的生長，其中養血活血藥和清熱解毒藥的配伍具有協同作用。2、養血活血方、清熱解毒方及合方均能通過抑制AFP、wtp53及PKCa蛋白的表達而抑制細胞的增殖。3、通過藥效反證反映在肝癌發生發展過程中，血虛、血瘀、熱毒內蘊與mtp53、、PKCa及AFP蛋白過度表達密切相關。二、臨床資料除上述試驗證明本發明具有防止肝癌的發生和發展，抑制肝癌的機理外，并經臨床資料得到了有治療肝癌作用的充分證明，有關臨床資料如下在臨床中，對118人原發性肝癌進行治療，在減輕癥狀、改善生活質量和延長生存期方面有顯著效果，對肝癌產生一定作用，具體情況見下列各表臨床組服用本發明中藥，對照組60例服用西藥氟尿嘧啶、阿霉素、絲裂霉素。治后生存期(生存率)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>生活質量改善情況，采用Karnofsky評分標準<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>病灶客觀指標改善情況<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上述資料可以看出，本發明是治療肝癌的有效藥物，可大大延長患者的生命，特別是緩解癥狀方面比其它藥物有絕對的優勢，臨床意義是中藥上的一大創造。權利要求一種治療肝癌的中藥，其特征在于，重量份數計當歸14-16份、延胡索9-11份、蚤休14-16份和白頭翁14-16份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，每次加入藥物重量和的15-20倍的水，煎沸后，文火煎煮40-60分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的5-10倍的無水乙醇，浸泡7天，過濾，得濾液，兩次濃縮，第一次濃縮至無水乙醇量的1/15后，再進行第二次濃縮成相對比重為1.2-1.6的稠膏，真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。2.根據權利要求l所述的治療肝癌的中藥，其特征在于，由以下重量份數計當歸14份、延胡索9份、蚤休14份和白頭翁14份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加入藥物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分鐘，每二次加入藥物重量和15倍的水，煎沸后，文火煎40分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的5倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.2的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。3.根據權利要求l所述的治療肝癌的中藥，其特征在于，由以下重量份數計當歸15份、延胡索10份、蚤休15份和白頭翁15份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加入藥物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎55分鐘，每二次加入藥物重量和16倍的水，煎沸后，文火煎45分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的8倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.3的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。4.根據權利要求1所述的治療肝癌的中藥，其特征在于，由以下重量份數計當歸16份、延胡索11份、蚤休16份和白頭翁16份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加入藥物重量和20倍的水，煎沸后，文火煎60分鐘，每二次加入藥物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量10倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.4的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。5.根據權利要求1所述的治療肝癌的中藥，其特征在于，由重量計的當歸15g、延胡索10g、蚤休15g和白頭翁15g制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，煎煮兩次，第一次加水990ml，煎沸后，文火煎55分鐘，每二次加水880ml，煎沸后，文火煎45分鐘，合并濾液，即成；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量8倍的無水乙醇，浸泡7天，濾紙過濾，得濾液，用旋轉蒸發器5(TC濃縮，濃縮至無水乙醇量的1/15，再轉移至蒸發皿，8(TC水浴濃縮成相對比重為1.6的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，將醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中藥粉。全文摘要本發明涉及治療肝癌的中藥，可有效解決肝癌的治療問題，其解決的技術方案是，由重量份數計當歸14-16份、延胡索9-11份、蚤休14-16份和白頭翁14-16份制成的湯劑或醇提粉劑，所說的湯劑是將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁混合在一起，加入藥物重量和15-20倍的水煎煮兩次，煎沸后，文火煎煮40-60分鐘，合并濾液；所說的醇提粉劑是分別將當歸、延胡索、蚤休和白頭翁置于醇提罐內，加入每份藥物重量的5-10倍的無水乙醇，浸泡7天，過濾，得濾液，兩次濃縮，第一次濃縮至無水乙醇量的1/15后，再進行第二次濃縮成相對比重為1.2-1.6的稠膏，真空干燥，得醇提物，粉碎成醇提物中藥粉，本發明組方簡單，配伍合理科學，服用效果好，療效高，是治療肝癌中藥上的創新。文檔編號A61K36/896GK101708272SQ20091022775公開日2010年5月19日申請日期2009年12月30日優先權日2009年12月30日發明者司富春申請人:河南中醫學院