專利名稱：一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及到一種乳腺癌抑癌蛋白PIASl (proteininhibitor of activated STAT 1)的鑒定，及其在乳腺癌基因治療中的應用。
背景技術：
乳腺癌是發生于乳腺腺體及導管的惡性腫瘤，是女性發病率最高的癌癥，是當今 世界人類疾病中最常見的發病和死亡原因之一，嚴重威脅著人類的生命和健康。因此乳腺 癌的防治已是世界性的保健問題，是世界衛生組織重點防治的疾病。根據美國癌癥協會ACS 的數據，在美國，10萬人中乳腺癌發病率約為113. 3人，在我國，乳腺癌的發病率正逐年上 升，在許多大城市已高居女性腫瘤的首位，給社會和家庭帶來巨大的財產損失和精神痛苦。目前，乳腺癌的發病機理還不完全清楚，尚無有效預防措施。眾所周知，大多數癌 癥包括乳腺癌的發生、發展是一個長時間的，慢性的病理變化過程，目前所用乳腺癌的診斷 方法只能診斷出瘤體已長到一定體積的癌癥，這在許多情況下，已為時過晚。當前乳腺癌的 治療仍以藥物治療、放療以及手術切除為主，但至今還沒有一種行之有效的診斷和治療方 法。手術雖然切除了腫瘤病灶，但也部分甚至全部切除了相應的組織器官，喪失了其正常的 功能；而放療在放射線殺傷腫瘤細胞的同時，也對機體正常組織細胞產生了損傷作用，很大 程度限制了腫瘤治療；藥物治療由于療效不強和具有較強的毒副作用，而給患者遭成極大 的身體和心里創傷。和其他癌癥一樣，乳腺癌的有效預防和治療也有待于弄清和闡明乳腺 癌的發病機理，因此基因療法就顯得尤為重要。AIB “amplified in breast cancer 1)是一種癌蛋白，它的 mRNA 的高水平往往 伴隨著乳腺癌的發生、發展，并導致病人存活率的下降；人類AIBl轉基因過表達的小鼠，則 伴隨著乳腺的異常增生和乳腺癌的發生；AIBl和表皮生長因子受體酪氨酸激酶HER2的過 表達會伴隨著對藥物它莫西芬(Tamoxifen)治療抗性的產生，導致治療失效。此外，AIBl作 為轉錄輔激活因子，促進了轉錄因子如雌激素受體(ERa)等的轉錄激活，進一步促進乳腺 癌的發生、發展。癌蛋白AIBl能增強乳腺癌多條信號轉導通路的能力表明，AIBl是乳腺癌 治療的一個潛在靶標。針對乳腺癌細胞，通過一定的方式抑制AIBl的活性，是預防和治療乳腺癌的一 種策略。而蛋白質的活性是受蛋白質的化學修飾所調控的，其中蛋白質的SUM0(Small ubiquitin-like modifier)化修飾是重要的調控方式之一。SUMO化修飾是SUMO小分子在 ATP存在的情況下，經一系列酶如SUMO活化酶(El) ,SUMO結合酶(E2)、SUM0連接酶(E3)的 催化作用，最終與靶蛋白底物結合。SUMO化修飾在信號轉導、核質運輸、轉錄活性抑制等方 面均發揮著重要的作用。我們研究證明AIBl的SUMO化修飾可以抑制AIBl的轉錄活性，并 鑒定出 PIASl (protein inhibitor of activated STAT 1)蛋白是 AIBl 發生 SUMO 化修飾 的E3連接酶。以前對PIAS蛋白家族的研究，大多表明其作為蛋白質之間相互作用的構架 蛋白，參與包括 STAT (Signal transducer and activator oftranscription)、Wnt、TGF β、 NF- κ B等在內的細胞信號轉導通路，而PIASl作為AIBl發生SUMO化修飾的Ε3連接酶還沒有報道。因此，通過蛋白質的SUMO化修飾來調控癌蛋白AIBl的活性，將對乳腺癌的抑制產 生良好的效果，可應用于乳腺癌的基因治療當中。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種乳腺癌的抑癌蛋白PIASl的鑒定方法。 PIASl蛋白能和癌蛋白AIBl發生相互作用，PIASl蛋白是癌蛋白AIBl發生SUMO化修飾的 E3連接酶，并能有效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖。本發明的技術方案是從研究癌蛋白AIBl的SUMO化修飾入手，采用生物技術，首 先證明出PIASl蛋白和癌蛋白AIBl發生相互作用；進而鑒定出PIASl蛋白是AIBl發生 SUMO化修飾的E3連接酶，并使癌蛋白AIBl的轉錄活性得到抑制；最后通過動物實驗證明， 將表達PIASl蛋白的質粒pcMV5-Flag-PIASl轉入MCF-7細胞，再將這種過表達PIASl的 MCF-7細胞注射入裸鼠(BALB/c，Charles River,Beijing,China)雙側乳房的脂肪中，能有 效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖。本發明的效果和益處是將PIASl基因在乳腺癌細胞中過表達，從而起到預防和 治療乳腺癌的作用，這種基因治療的新方法將克服傳統的藥物治療、放療以及手術切除等 方法所給病人帶來的精神上和肉體上的痛苦，使乳腺癌的防治更為安全有效。惡性腫瘤如 乳腺癌是世界衛生組織重點防治的疾病，它給社會和每個家庭帶來巨大的財產損失和精神 痛苦，攻克乳腺癌這一難題必將會帶來巨大的社會效益和經濟效益。
圖1是證明抑癌蛋白PIASl和癌蛋白AIBl在體內存在相互作用的免疫共沉淀 實驗結果圖。圖1中A和B實驗均采用人乳腺癌MCF-7細胞系。圖1中A實驗采用兔源 anti-AIBl抗體，圖左是陰性對照，首先沉降內源性的AIBl蛋白，用鼠源anti-PIASl抗 體檢測內源PIASl蛋白，箭頭指示的是目的條帶PIASl蛋白，其分子量約75kDa。圖1中 B實驗采用兔源anti-PIASl抗體，圖左作為陰性對照，同樣首先沉降PIASl蛋白，再用鼠 源anti-AIBl檢測內源AIBl蛋白，箭頭指示的是目的條帶AIBl蛋白的位置，其分子量約 160kDao實驗結果證明了抑癌蛋白PIASl與癌蛋白AIBl在MCF-7細胞內存在著相互作用。圖2是證明抑癌蛋白PIASl的過表達能促進癌蛋白AIBl的SUMO化修飾的實驗 結果圖。實驗采用的是乳腺癌MCF-7細胞系，圖中自左向右依次轉入pcMV5空載體(陰 性對照)、pcMV5-Flag-PIASl、喪失E3連接酶活性的pcMV5_Flag_PIASl (M)突變體，即 PIASl的351位的半胱氨酸(C)突變成絲氨酸(S)。經過兔源anti-AIB 1抗體沉降，鼠源 anti-SUMO-Ι抗體檢測，我們在相應位置，箭頭指示處，可以看到SUM0-1化修飾的AIBl條 帶，并且發現過表達野生型PIASl蛋白能增強癌蛋白AIBl的SUMO化修飾，而過表達SUMO 連接酶E3功能喪失的PIASl (C351S)突變體則沒有這種現象。圖3是證明抑癌PIASl抑制癌蛋白AIBl轉錄活性的熒光素酶報告基因的 實驗結果圖。圖3中縱軸表示熒光素酶活性的相對值，橫軸表示轉入5組不同質粒 的細胞樣品。將Gal4-Luc質粒分別和pcDNA3. 1空載體、pcDNA3. l-Gal4_DBD_AIBl、 pcMV5-Flag-PIASl按照一定比例轉入C0S-7細胞系。測定報告基因的活性，可以看出，過表 達pcDNA3. 1-Gal4-DBD-AIB1能增強報告基因的轉錄活性，但AIBl的轉錄活性受PIASl的抑制，并且這種抑制作用隨著PIASl表達量的增加，呈現出一定的劑量依賴性。圖4是動物實驗證明過表達抑癌蛋白PIASl能抑制乳腺癌的結果圖。圖4中A 是轉染pcMV5空載體的乳腺癌MCF-7細胞注射入雌性裸鼠的實驗結果；而圖4中B是轉染 pcMV5-Flag-PIASl質粒的乳腺癌MCF-7細胞注射入雌性裸鼠的實驗結果，橢圓線的部分， 圖中B和圖中A相比，過表達PIAS1蛋白的裸鼠腫塊明顯被抑制了。
具體實施例方式以下結合技術方案和附圖詳細敘述本發明的具體實施方式
。1.證明抑癌蛋白PIASl和癌蛋白AIBl在體內存在相互作用的免疫共沉淀實驗IOcm培養板接種人類乳腺癌MCF-7細胞系，于37°C 5% CO2條件下，采用含10% 胎牛血清(Hyclone公司)的DMEM細胞培養液(Gibco公司)培養48小時后，冰冷PBS緩 沖液清洗細胞后，加裂解液(50mM Tris-HCl, pH 8. 0,150mM NaCl, 1% Nonidet P-40 和 0. 5% sodium deoxycholate，以及 1 100稀釋的蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science, Indianapolis, IN))裂解細胞，4°C 12000轉，離心10分鐘后取上清。圖1中A實驗是上清加兔源anti-AIBl抗體；B實驗是上清加兔源anti_PIASl 抗體(santa cruz 公司)，于 4°C孵育過夜后，加 Protein A-Sepharose 4B 50ul 于 4°C孵 育 4 小時。40C 5000 轉離心 10 分鐘，用洗液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5,800mM NaCl,0. 5% Nonidet P_40，and 0. 05% sodium deoxycholate)清洗 4 次后，去除上清。加 6XSDS 上樣 緩沖液和DDT后煮沸5分鐘，跑8% SDS-聚丙烯酰胺電泳，將蛋白采用電轉儀(Pall Corp) 在100V條件下電轉90分鐘到醋酸纖維素膜(Millipore公司)上。10%的脫脂牛奶封閉 膜2小時后，依次用一抗圖1中A實驗加鼠源anti-PIASl抗體；B實驗加鼠源anti-AIBl 抗體(santa cruz公司)，和二抗HRP標記的羊抗鼠抗體(Roch公司)孵育，再用化學發光 試劑(Amersham Biosciences)發光，并在膠片上曝光，相顯色出條帶。2.證明PIASl過表達促進AIBl的SUMO化修飾實驗IOcm培養板接種人乳腺癌MCF-7細胞，培養40小時后，用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)按照產品說明，分別將pcMV5空載體、 pcMV5-Flag-PIASl、喪失E3連接酶活性的pcMV5_Flag_PIASl (M)突變體質粒，各24 μ g轉 染進細胞中。轉染4小時后，換10%胎牛血清的DMEM培養24小時。冰冷PBS緩沖液清洗 細胞3次后，加裂解液裂解細胞，4°C 12000轉離心10分鐘，取上清。上清加兔源anti-AIB 1抗體于4°C孵育過夜后加Protein A-Sepharose 4B 50ul于4°C孵育2-4小時。4°C 5000 轉離心 10 分鐘，用洗液(20mM Tris-HCl, pH 7. 5,800mMNaCl,0. 5 % Nonidet P-40，and 0. 05% sodium deoxycholate)清洗4次后去除上清。加6XSDS上樣緩沖液和DDT后煮沸 5分鐘，用8% SDS-聚丙烯酰胺電泳，將蛋白電轉到醋酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉膜 2小時后，依次用一抗鼠源anti-SUMO-Ι抗體(santa cruz公司)，和二抗HRP標記的羊 抗鼠抗體(Roch公司)孵育，再用化學發光試劑發光，并在膠片上曝光顯出條帶。3.證明PIASl抑制AIBl轉錄活性的熒光素酶報告基因實驗24孔培養板接種C0S-7細胞系，于37°C 5% CO2條件下采用含10%胎牛血清 (Hyclone公司)的DMEM細胞培養液(Gibco公司)在37 °C 5 % CO2條件下培養14小 時后，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)按照產品說明進行哺乳動物瞬時轉染實驗，將 pcDNA3. 1 空載體、pcDNA3. l-Gal4_DBD_AIBl、pcMV5_Flag_PIASl 分別和 pcDNA3. 1-Gal4-Luc按照一定比例轉入C0S-7細胞系中。轉染4小時后，細胞的培養液由 無酚紅無血清的培養液轉換為含10%胎牛血清的DMEM培養液，培養24小時后，用冰冷PBS 清洗，收集裂解細胞，再用熒光素酶報告基因試劑盒(Promega公司)來檢測轉錄活性。4.證明過表達PIASl能抑制乳腺癌的實驗IOcm培養板接種人乳腺癌MCF-7細胞，培養40小時后，用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)按照產品說明，將 pcMV5 空載體和 pcMV5_Flag_PIASl 分 別轉染進不同的MCF-7細胞中，4小時后，換10%胎牛血清的DMEM培養24小時。收獲生 長狀態良好的細胞，按約110個細胞/0. Iml注射入4周大小的雌性裸鼠(BALB/c，Charles River, Beijing, China)雙側乳房的脂肪中。第21周處死裸鼠，并用游標卡尺測量腫瘤的
大小。
序列表
<110>大連理工大學環境與生命學院
<120> 一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用
<130> 一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用
<160>2
<170>Patent in version 3. 3
<210>1
<211>516
<212>DNA
<223>pcMV5-Flag-PIASl 質粒中 PIASl 的基因序列
PIASl 的基因編號NCBI Reference Sequence :NM_019663. 3
SEQ ID NO 1
atggcggacagtgcggaactaaagcaaatggttatgagccttagagtttctgaactccaagtactgttg
ggctacgctgggaggaacaagcacggacgcaaacacgaacttcttacaaaagccctgcatttgttaaaggctggctgtagtcctgctgtacaaatgaaaattaaag aactctacaggaggcggttccctcagaaaattatgacgcctgcggacttgtctatccccaacgtacattcaagtcctatgcctccgactctttctccatccaccattccac agetcacttatgatggccaccctgcatcatccccactactccctgtttctcttctgggacccaaacatgaactggaactcccacatctcacgtcagcgctgcacccagtccac ccggacataaagctgcagaagctaccattctatgacctgttggatgaactgatcaagcccaccagtctagcttcagacaacagccagcgctttcgggaaacctgttttgc atttgccttgacaccacaacaggtgcagcagatcagcagctccatggatatttctgggaccaaatgtgacttcacagtgcaggtccaattaaggttttgtttatcaga aaccagttgtccacaagaagatcacttcccacccaacctttgtgtaaaagtgaatacaaaaccttgcagccttccaggttaccttccacctactaaaaacggtgtggaaccaa agcgacctagccgaccaattaatatcacctcacttgtccgattgtccacgacagtaccaaataccattgttgtttcttggactgcagaaattggaagaacctattccatg gcagtatatcttgtaaaacagttgtcctcaacagttcttcttcag
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權利要求
一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定，其特征在于在乳腺癌MCF 7細胞系中，PIAS1蛋白和AIB1發生相互作用，PIAS1蛋白是癌蛋白AIB1發生SUMO化修飾的E3連接酶，并且能使癌蛋白AIB1的轉錄活性得到抑制。
2.一種乳腺癌抑癌蛋白的應用，其特征還在于將表達PIASl蛋白的質粒 pcMV5-Flag-PIASl轉入MCF-7細胞中，能有效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖，用于 乳腺癌的基因治療。
全文摘要
一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定及其應用，屬于生物技術領域。提供一種乳腺癌抑癌蛋白的鑒定，其特征在于篩選出PIAS1(protein inhibitor of activated STAT 1)蛋白和AIB1(amplified in breast cancer 1)發生相互作用，PIAS1蛋白是癌蛋白AIB1發生SUMO化修飾的E3連接酶，并且能使癌蛋白AIB1的轉錄活性得到抑制；其特征還在于將表達PIAS1蛋白的質粒pcMV5-Flag-PIAS1轉入MCF-7細胞中，動物實驗證明能有效地抑制乳腺癌細胞MCF-7的生長和增殖。本發明的效果和益處是這種基因治療的新方法用于乳腺癌患者，將克服傳統的藥物治療、放療以及手術切除等方法所給病人帶來的精神上和肉體上的痛苦，并將帶來巨大的社會效益和經濟效益。
文檔編號A61P15/14GK101923095SQ200910220338
公開日2010年12月22日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者伍會健, 劉文棟, 洪永德, 過倩萍 申請人:大連理工大學