專利名稱：：5′-酰化尿苷的制備方法及在制備治療心臟病、肝病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種5’-酰化尿苷的制備方法，尤其是一種操作簡單、產出率高，適應于大規模工業化生產的5’-酰化尿苷的制備方法及5’-酰化尿苷在制備治療心臟病、肝病藥物中的應用。
背景技術：
：核苷酸是生物體內重要的低分子化合物，具有許多生理功能，除作為DNA、RNA的前體，也作為生理、生化過程的調節物質參與體內蛋白質、糖類和脂肪的代謝；核苷酸可維持免疫系統的正常功能，如提高機體對細菌、真菌感染的抵抗力，增加抗體產生、增強細胞及體液免疫能力，刺激淋巴細胞增生作用等；研究表明，核苷酸還可維持胃腸道正常功能、參與調節肝的蛋白質合成；同時，核苷酸還具有抗氧化作用，核苷酸堿基的氮氧原子能夠捕獲氧化過程中形成的自由基，減少由脂質過氧化引起的細胞膜及各種DNA的損傷。一般情況下，機體能夠由內源小分子物質合成各種核苷酸，但近年來的許多研究表明，當機體迅速生長、受到細菌、病毒感染時，一些器官、組織(如腸、淋巴、骨髓細胞，包括肝臟、心臟等)內的核苷酸就不能滿足機體組織和細胞代謝的需要，需補充外源核苷酸用以改善和促進受影響細胞的自然修復，以保證其組織生長和正常功能及達到治療疾病的目的。但是直接補充的外源核苷酸，有時可能會因胃腸道、血腦屏障或他生物膜輸送的限速，或者被核苷酶降解而不能被高劑量持續性的輸送給組織。5’_酰化尿苷是一種已知的嘧啶核糖核苷，但是迄今為止還沒有關于其制備方法及可用于制備治療心臟病、肝病藥物的相關報道。
發明內容本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、產出率高，適應于大規模工業化生產的5’-酰化尿苷的制備方法及5’-酰化尿苷在制備治療心臟病、肝病藥物中的應用。本發明的技術解決方案是一種5’-酰化尿苷的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.將核糖核酸RNA粉置于60°C水中溶解并控制PH值5.05.5，完全溶解后，升溫至9095°C，保持1小時后冷卻降溫至70°C；b.加入RP1酶，保持溫度至6870°C酶解12小時，升溫至9095°C使酶失活；c.酶解液冷卻降溫至30°C35°C，將酶解液進行超濾純化，得到超濾液；d.將超濾液進行陰離子樹脂柱交換分離，先用純水透洗樹脂柱，直至流出液紫外吸收值0D26(iX稀釋倍數<20時，結束水洗；再用0.8M甲酸溶液清洗，當流出液紫外吸收值0D254X稀釋倍數彡30且0D25Q/0D26Q大于0.72小于0.78時，開始收集流出液，直至流出液紫外吸收值0D279X稀釋倍數<20，結束收集；e.將收集液調pH值5.06.0,通過納濾濃縮至濃度120g/L，用NaOH溶液調PH值6.87.0，加2倍乙醇靜置2小時后，離心得到5’-尿苷；f.將5’-尿苷懸浮于吡啶與N.N二甲基甲酰胺按體積比為11比例的溶液中，冰浴降溫至o°c；g.向混合液中逐漸加入等當量的酸酐，于0°C攪拌1224小時，然后加入純水，5°C真空蒸發溶劑；h.用90%甲醇溶解殘留物，吸附至硅膠粒中，蒸發掉多余溶劑；i.再將剩余混合樣液上的內有氯仿液的硅膠漿柱內，用氯仿-甲醇氯仿(2080)的洗脫液進行梯度線性洗脫，用薄板層析確定階段洗脫液，收集所確定的階段洗脫液，既得到所要的5’-酰化尿苷溶液，可重結晶或真空干燥，得到5’-酰化尿苷。5’_酰化尿苷在制備治療心臟病、肝病藥物中的應用。用本發明方法制備5’_酰化尿苷，操作簡單、產出率高，適應于大規模工業化生產。當5’-酰化尿苷服用于動物或人體后，尿苷的生物利用性大大提高，降低了被核苷酶降解的速度，尿苷可通過胃腸道、血腦屏障及其他生物膜而被高劑量持續性的輸送給動物或人體心臟及肝臟，血漿中尿苷濃度顯著增高，比給予相同克分子劑量尿苷高510倍，有助于恢復心室肌的泵血功能、治療肝病及肝臟損傷。圖1是本發明實施例與對比組的血漿中磺溴鈦納濃度示意圖。具體實施例方式實施例一種5’-酰化尿苷的制備方法，按如下步驟進行a.將核糖核酸(RNA)粉(購于福建珍奧核酸有限公司)，來源置于60°C水中溶解并控制PH值5.05.5，完全溶解后，升溫至9095°C，保持1小時后冷卻降溫至70°C；b.加入RP1酶(購自阿瑪諾天野酶制劑商貿(上海)有限公司)，保持溫度至6870°C酶解12小時，升溫至9095°C使酶失活；c.酶解液冷卻降溫至30°C35°C，將酶解液進行超濾純化，得到超濾液；d.將超濾液進行陰離子樹脂柱交換分離，先用純水透洗樹脂柱，直至流出液紫外吸收值0D26(iX稀釋倍數<20時，結束水洗；再用0.8M甲酸溶液清洗，當流出液紫外吸收值0D254X稀釋倍數彡30且0D25Q/0D26Q大于0.72小于0.78時，開始收集流出液，直至流出液紫外吸收值0D279X稀釋倍數<20，結束收集；e.將收集液調pH值5.06.0，通過納濾濃縮至濃度120g/L，用NaOH溶液調PH值6.87.0，加2倍乙醇靜置2小時后，離心得到5’-尿苷；f.將5’-尿苷懸浮于吡啶與N.N二甲基甲酰胺按體積比為11比例的溶液中，冰浴降溫至o°c；g.向混合液中逐漸加入等當量的酸酐，酸酐上的酰化取代基團可以任意選擇，于0°C攪拌1224小時，然后加入純水，5°C真空蒸發溶劑；h.用90%甲醇溶解殘留物，吸附至硅膠粒中，蒸發掉多余溶劑；i.再將剩余混合樣液上的內有氯仿液的硅膠漿柱內，用氯仿-甲醇氯仿(2080)的洗脫液進行梯度線性洗脫，用薄板層析確定階段洗脫液，收集所確定的階段洗脫液，既得到所要的5’-酰化尿苷溶液，可重結晶或真空干燥，得到5’-酰化尿苷。檢測方法取少量樣品，于高壓液相層析儀中，與標準5’-酰化尿苷進行參比，以確證酰化。5’_酰化尿苷可在制備治療心臟病或肝病藥物中應用，可制成各種劑型，采用口服或腸外給藥而無副作用。實驗例1鼠給予尿苷、胞苷和5’-酰化尿苷、5’_酰化胞苷其生物效力的比較給F44雄鼠(重450克500克)麻醉后在頸靜脈植入硅化橡膠導管，三天后取血并不驚擾老鼠。鼠分為4組，每組含4只鼠。每一組鼠以導管插入胃內給予以下化合物尿苷、5’-酰化尿苷、胞苷、5’-酰化胞苷，都是相等克分子劑量，即都是0.28克分子/公斤。給于化合物后在0.5、1、2、3及4小時取血并用高效液相方法測定血液中胞苷或尿苷的含量。在給予5’-酰化尿苷或5’-酰化胞苷后至少4小時鼠血漿中尿苷或胞苷濃度顯著增高，比給予相同克分子劑量尿苷或胞苷的鼠高510倍。實驗例2服用5’-酰化尿苷恢復低下的鼠心肌功能在本實驗中，對實驗性心室功能低下動物給予5’-酰化尿苷，確定了這種5’-酰化尿苷有助于恢復心室肌的泵血功能。用戊巴比妥將雄性F344鼠(250克)麻醉，戊巴比妥采用腹膜注射，劑量為50毫克/公斤。然后阻塞式結扎部分腹主動脈，使內徑達0.67毫米，并于皮下注射異丙基腎上腺素一次，劑量為5毫克/公斤以造成實驗性心肌損傷。在動脈狹窄及給予異丙基腎上腺素后及20小時給予5’-酰化尿苷，劑量各為1180毫克/公斤。未經處治鼠注射給予異丙基腎上腺素及代替5’-酰化尿苷的鹽水，對照鼠則只注射鹽水，既不造成腹主動脈狹窄，也不給予異丙基腎上腺素。在老鼠主動脈造成狹窄后24小時測定心室功能用腹膜內注射戊巴比妥鈉(50毫克/公斤)麻醉老鼠，并在右頸靜脈植入導管以給予去甲腎上腺素。延右頸靜脈插入第二根導管至心臟左室，連有stoelting生理記錄II多道記錄儀直接經第二根導管測定，左心室收縮壓(LVSP)，左心室最大收縮速率(+dp/dt)及其最大舒張速率(-dp/dt)以及心率(HR)。再靜脈給予0.1毫升的重酒石酸去甲腎上腺素，濃度為10_6、10_5、及10_4克分子濃度，在給予重石酸去甲腎上腺素前后測定并記錄以上參數值。用生理記錄多道記錄儀將不銹鋼電極連于鼠前肢皮下測定心電圖，依據心室收縮壓及心率數據計算出心輸出量。與對照鼠相比，造成動脈狹窄并給予異丙基腎上腺素的鼠心肌效能大大降低。其左心室收縮壓、心室最大收縮速率，最大舒張速率及心率均顯著減小。和只給予異丙基腎上腺素的鼠相比，給予5’-酰化尿苷的并造成心肌功能低下的鼠，以上參數得到明顯恢復并趨于正常。鼠在造成實驗性心肌損傷后其心率也應降低，當給予5’-酰化尿苷后心率得以恢復正常。在同樣接受了0.1毫升的濃度為10-4克分子酒石酸去甲腎上腺素的鼠同樣檢測了這些反映心肌效能的參數(見表1、表2)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1、表2中*與對照組相比有顯著差異AC主動脈狹窄+異丙基腎上腺素；5，AU:5，-酰化尿苷；LVSP左心室收縮壓；+dp/dt最大心室收縮速率；-dp/dt最大心室舒張速率。實驗例3用5’_酰化尿苷治療肝損傷給20只雄性F344鼠(重200克)注射50%濃度的四氯化碳(0.2毫克/公斤)，四氯化碳液溶劑為玉米油，每周注射2次，共注射8個星期。在給予四氯化碳2周后，10只鼠于后6周經飼管口服5’-酰化尿苷，按100毫克/公斤劑量口服，5’-酰化尿苷溶于1毫升水中，每天給2次；另10只鼠作為對照經飼管口服等量的水。在第8周末時，用從血液中清除磺溴鈦納檢驗肝臟功能用氯胺酮(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(13毫克/公斤)麻醉老鼠并在頸動脈安置導管以給予磺溴酞酚并取血樣，磺溴鈦納溶于0.5毫升鹽水中，按50毫克/公斤的劑量以大藥丸形式給鼠服用。定期取血樣每次取0.2毫升，取20微升血漿加到1毫升0.1克分子濃度的氫氧化鈉溶液中，于575nm處測紫外線吸收值以此確定血漿中磺溴鈦納的濃度(見圖1)。由圖1可以看出，服用5’-酰化尿苷(AU)老鼠血漿中磺溴鈦納的濃度明顯低于對照組，說明5’-酰化尿苷可治療肝損傷。權利要求一種5’-酰化尿苷的制備方法，其特征在于按如下步驟進行a.將核糖核酸RNA粉置于60℃水中溶解并控制PH值5.0～5.5，完全溶解后，升溫至90～95℃，保持1小時后冷卻降溫至70℃；b.加入RP1酶，保持溫度至68～70℃酶解12小時，升溫至90～95℃使酶失活；c.酶解液冷卻降溫至30℃～35℃，將酶解液進行超濾純化，得到超濾液；d.將超濾液進行陰離子樹脂柱交換分離，先用純水透洗樹脂柱，直至流出液紫外吸收值OD260×稀釋倍數＜20時，結束水洗；再用0.8M甲酸溶液清洗，當流出液紫外吸收值OD254×稀釋倍數≥30且OD250/OD260大于0.72小于0.78時，開始收集流出液，直至流出液紫外吸收值OD279×稀釋倍數＜20，結束收集；e.將收集液調pH值5.0～6.0，通過納濾濃縮至濃度120g/L，用NaOH溶液調PH值6.8～7.0，加2倍乙醇靜置2小時后，離心得到5’-尿苷；f.將5’-尿苷懸浮于吡啶與N.N二甲基甲酰胺按體積比為1∶1比例的溶液中，冰浴降溫至0℃；g.向混合液中逐漸加入等當量的酸酐，于0℃攪拌12～24小時，然后加入純水，5℃真空蒸發溶劑；h.用90％甲醇溶解殘留物，吸附至硅膠粒中，蒸發多余溶劑；i.再將剩余混合樣液上內有氯仿液硅膠漿柱內，用氯仿-甲醇∶氯仿(20∶80)的洗脫液進行梯度線性洗脫，用薄板層析確定階段洗脫液，收集所確定的階段洗脫液。2.5’-酰化尿苷在制備治療心臟病、肝病藥物中的應用。全文摘要本發明公開一種5′-酰化尿苷的制備方法及在制備治療心臟病、肝病藥物中的應用，具體制備方法是將核糖核酸(RNA)粉溶解、酶解，并將酶解液進行超濾純化并進行陰離子樹脂柱交換分離、納濾、離心得到5′-尿苷；將5′-尿苷懸浮于吡啶與N,N二甲基甲酰胺的混合溶液中并逐漸加入等當量的酸酐，蒸發溶劑；用90％甲醇溶解殘留物，吸附至硅膠粒中，再蒸發掉多余溶劑；從再將剩余混合樣液上的內有氯仿液的硅膠漿柱內，用氯仿-甲醇∶氯仿(20∶80)的洗脫液進行梯度線性洗脫，用薄板層析確定階段洗脫液，收集所確定的階段洗脫液，既得到所要的5′-酰化尿苷溶液，可重結晶或真空干燥，得到5′-酰化尿苷。文檔編號A61K31/7072GK101831478SQ200910220260公開日2010年9月15日申請日期2009年11月30日優先權日2009年11月30日發明者劉慶瑩,李恕,石維,陳玉松申請人:珍奧集團股份有限公司