專利名稱：一種新忍冬綠原酸酯皂苷及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物化學領域，公開了從灰氈毛忍冬花蕾中提取分離的一種新忍 冬綠原酸酯皂苷類化合物，以及該化合物的制備方法和在醫藥領域中的用途，尤其在制備 環氧化酶II抑制劑、基質金屬蛋白酶-9抑制劑或抗腫瘤藥物的用途。二、技術背景忍冬屬植物中富含綠原酸類和齊墩果酸型皂苷類成分。綠原酸具有抗菌、抗病毒、 增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經系統等作用； 近年有報道表明綠原酸有較強的抑制基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)的活性(Un-Ho，J.，et al.Life Sciences, 2005, 77 =2760-2769) 0齊墩果酸型皂苷類成分也是一種重要的生物活 性物質，這些皂苷報道有抑制環氧化酶II (C0X-2)活性(Shepo, S.，et al. J. Nat. Prod.， 2006,69 :15911595)等活性。灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.)為忍 冬科忍冬屬植物，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效，在中醫臨床及民間廣泛應用于癰腫疔 瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫熱發病等疾病的治療。2005年版《中國藥典》收載， 將其與紅腺忍冬、華南忍冬一同列入山銀花頂下。江蘇省中國科學院植物研究所在對灰 氈毛忍冬花蕾中皂苷類成分的研究過程中，得到一種新的綠原酸酯皂苷類化合物，命名為 Lonimacranthoide I，是迄今為止發現的第一個綠原酸酯皂苷；同時具有很強的抑制環氧 化酶 II (C0X-2) (IC50 = 2. 2 μ M)和基質金屬蛋白酶 9 (MMP-9) (IC50 = 11. 2 μ Μ)活性；在體 內試驗中，當Lonimacranthoide I劑量為2. 5、5和7. 5mg/kg時對小鼠Kill細胞靜脈注射 肺轉移的抑制作用分別為32. 3%,42. 5%和47. 3%。有望開發成一類新的防治腫瘤生長和 轉移的抗癌藥物。環氧化酶(cyclooxygenases，COXs)，又稱前列腺素內過氧化物合成酶(PGHS)，是 前列腺素(PGs)合成過程中一個主要的限速酶，可將花生四烯酸(AA)代謝成各種前列腺素 產物，從而參與機體的多種病理生理過程，如炎癥、發熱、出凝血機制等。研究發現COXs至 少存在2種同工酶，即C0X-1和C0X-2。C0X-1為組成型酶，被稱為管家酶，在維持人體正常 生理功能中起著重要的作用。C0X-2是一種誘導酶，除了在上述炎癥等過程中發揮重要作用 外，還通過多種途徑參與腫瘤的發生、發展和轉移，如促進細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡、誘 導侵襲性、調節免疫抑制等。因此尋找C0X-2選擇性抑制劑來防治腫瘤已成為近年腫瘤學 研究的熱點之一。由于心血管副作用使得合成性C0X-2抑制劑不能進入臨床癌癥化療。近 年從植物中發現的植物病原氧化酶與人體C0X-2有極高的同源性，植物在受到病原體(病 毒、細菌、真菌)的攻擊時，其分子的防御和應激方式與哺乳動物相似(Bergey，D. R.，et al. Proc Natl Acad Sci USA，1996，93 :12053-8)。因此，從天然植物中尋找 C0X-2 抑制劑 及其他藥物具有很大潛力。初步純化的天然C0X-2抑制劑已經廣泛用作癌癥化療中的輔助 藥物。如從車前草來的烏果酸初提取物占據美國很大市場。基質金屬蛋白酶(MMPs)是細胞外降解基質的一大類酶系，是細胞外基質(ECM)的 降解酶。MMPs是一組含鋅離子的肽鏈內切酶，每個活性部位都含有一個鋅離子，均能降解一種或幾種ECM成分，現已鑒定出約20種MMPs，根據MMPs作用底物不同，將其分為四類 膠原酶、明膠酶、溶基質素和膜MMPs。其中明膠酶(MMP-9)是重要的一組酶，可在皮膚、甲 狀腺、前列腺、結腸、肺等腫瘤組織中表達。其在腫瘤的侵襲和轉移中起著關鍵性作用，主要 通過以下幾種機制促進腫瘤的侵襲和轉移①蛋白酶作用使得腫瘤細胞周圍由基質分子形 成的物理屏障被破壞。促進癌細胞對周圍正常組織的浸潤，導致腫瘤的擴散和轉移。②可 以重塑細胞間豁附力，以便腫瘤細胞向周圍生長。③作用于基質成分后激發其它的一些潛 在的生物活性，如參與腫瘤的免疫過程等。④通過對細胞外基質的改建，促進腫瘤新血管的 形成(Shankavaram, U. Τ. , et al. J. Biol. Chem, 2001, 276 19027-32 ；Stetle Stevenson, W. G. , et al. Semin. Cancer Biol.，1996，4 :147-154 ；Roeb Ε. , et al. Med. Klin. ,2003,98 763-70)。大量研究顯示MMP-9的過度表達與人類惡性腫瘤的擴散和轉移密切相。由于目 前大部分化學合成性的第1、2代MMP抑制劑類抗癌藥物的臨床結果都令人失望，因此從天 然產物中開發有選擇性、體內穩定、不良反應小的高效第3代MMP抑制劑尤為重要。
發明內容
本發明公開了一種綠原酸酯皂苷類化合物，簡稱Lonimacranthoide I，分子式為 C81H122O4tl,分子量:1734,化學名為3-0- β -D-glucopyranosyl- (1 — 4) - β -D-glucopyranosyl- (1 — 3) - α -L-rhamnopyranosyl-(1 2) - α -L-arabinopyranosyl hederagenin 23-0-chlorogenic a cyl-28-0-β -D-glucopyranosyl-(1 — 6)-β -D-glucopyranosyl ester,化學結構式為
上述化合物的制備方法，其特征在于以灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.)花蕾為原料，經水、甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶液或乙醇-水混合溶液提取； 水提取液直接過大孔樹脂吸附，甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶液或乙醇-水混合溶液的提取 液濃縮后加水溶解過大孔樹脂吸附；大孔樹脂吸附物經柱層析分離而得。其中，大孔樹脂包 括D101、AB-8或HP-20 ；柱層析用擔體選自硅膠、凝膠和反相硅膠中的一種或幾種制得。本發明的新綠原酸酯皂苷Lonimacranthoide I與醫學上可接受的藥用輔料組成 藥物組合物及其制劑。如，片劑、膠囊劑、以及注射劑。本發明提供了新綠原酸酯皂苷Lonimacranthoide I制備環氧化酶II抑制劑、 基質金屬蛋白酶-9抑制劑或抗腫瘤藥物的用途。在體外，Lonimacranthoide I抑制環氧 化酶II(C0X-2)的IC5tl為2.2 μ M，抑制基質金屬蛋白酶-9的IC5tl為11.2μΜ。體內，當LonimacranthoideI劑量為2. 5、5和7. 5mg/kg時對小鼠Kill細胞靜脈注射肺轉移的抑制 作用分別為32. 3%、42. 5%和47. 3%。四
以下圖可作為附件材料上報。圖1、新忍冬綠原酸酯皂苷Lonimacranthoide I的結構式圖2、化合物(I)的主要HMBC相關關系圖3、化合物(I)的HR-ESI-MS譜圖4、化合物⑴的1H-NMR譜圖5、化合物(I)的13C-NMR譜圖6、化合物(I)的HMQC譜圖7、化合物(I)的HMBC譜圖8、化合物(I)的HPLC圖五具體實施例方式結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，但本發明的內容并不僅僅限于所列舉 的實施方式。實施例1.從灰氈毛忍冬中分離和鑒定化合物Lonimacranthoide I將灰氈毛忍冬干燥花蕾10kg，用100kg95% (體積比)乙醇-水溶液回流提取3 次，每次2小時，濃縮至無醇味得浸膏(干重Ukg)；所得浸膏加10倍體積的水溶解，濾紙 過濾除去水不溶物，濾液用大孔樹脂HP-20進行吸附，再以水，20%, 70%乙醇溶液洗脫，合 并70 %乙醇溶液洗脫液，濃縮得灰氈毛忍冬總皂苷860g。所得灰氈毛忍冬總皂苷進行硅膠 柱層析，洗脫劑依次為氯仿-甲醇-水(17 3 0.2 — 4 1 0.1 — 7 3 0.5 — 3 3 0. 5 )、甲醇；其中氯仿-甲醇-水(3 3 0.5)部分進行反復反相硅膠C-18柱層析(洗脫劑 為40%乙醇-水溶液)分離及凝膠kphdex LH-20柱層析純化(洗脫劑為35%乙醇-水 溶液)得到化合物Lonimacranthoide I 1. 4g，得率為0. 014%，純度為96. 99% (HPLC面積 歸一化法)。化合物Lonimacranthoide I的鑒定，白色粉末，TLC香草醛-濃硫酸試液加熱顯 紫紅色，放置后變藍。Molish反應和Liebermarm-Burchard反應陽性。難溶于氯仿，易溶 于水-甲醇混合溶液。以上信息提示該化合物為皂苷類化合物。由HR-ESI-MS :[M+Na]+at m/z 1757. 7274(calculated m/z 1757. 7404)(見附圖 3)以及 DEPT 譜確定其分子式為 C81H122O4tl,分子量 1734。由 1H^13C-NMRif (C5D5N, 500MHz)(見附圖 4、5)以及完全酸水解后 co-TLC實驗結果表明其皂苷元為常春藤皂苷元。13C-NMR :C-3 ( δ 81. 7)和C-28 ( δ 176. 5) 表明該化合物在(>3、觀位都接有糖鏈。1H-NMR譜及HMQC譜(見附圖6)中六個糖端基信 號δ 4. 82 (1Η, d, J = 6. 6Hz)，4. 99 (1H, d, J = 7. 6Hz)，5. 15 (1H, d, J = 7. 7Hz)，5. 58 (1H, d, J = 7. 1Hz)，6. 20 (1H, d, J = 8. 4Hz)，and6. 23 (1H, br s)；以及 13C-NMR δ 95. 6，101. 5， 105. 0，105. 3，105. 4和106. 6顯示化合物在C-28與C-3位上共有六個糖取代。糖的種類和 比例由GC和2D-NMR確定為阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖(1 1 4)。糖鏈的連接順序由HMBC 譜(見附圖 2、7)確定由 Glc II 的 H-I (δ 5. 15)與 Glc I 的。_4(δ81·3)相關，Glc I 的H-I ( δ 5. 58)與 Rha 的 C-3 ( δ 84. 1)相關，Rha 的 H-I ( δ 6. 23)與 Ara 的 C-2 ( δ 75. 1)相關， Ara 的 H-I ( δ 4. 82)與苷元的 C-3 (5 81.7)相關，確定 C-3 的糖鏈 3_0_ β -D-glucopyranosy 1- (1 — 4) - β -D-glucopyranosy 1- (1 — 3) - α -L-rhamnopyranosyl - (1 — 2) - α -L-arabinopyra nosyl;由 Glc IV 的 H_1 ( δ 4· 99)與 Glc III 的 C_6 ( δ 69. 4)相關，Glc III 的 H_1 ( δ 6· 20) 與 C-28( δ 176. 5)相關，確定 C-28 的糖鏈沘-0_ β -D-glucopyranosyl-(1 — 6)-β -D-glu copyranosyl。1H-NMR中除了苷元和糖的氫信號還有反式雙鍵氫信號[δ 6. 50(lH，d，J = 15.9Hz，H-8" ),7. 91 (1H, d, J = 15. 9Hz, H_7" ) ]，1、3、4_ 三取代苯氫信號[δ 7. 01 (1Η, dd, J = 2. 3,8. 3Ηζ, Η_6" )，7· 15 (1Η, d, J = 8. 3Ηζ, Η_5")和 7. 54 (1Η, d, J = 2. 3Ηζ, Η-2〃)]，三個接氧甲基質子[δ 4· 65(lH，m，H-3' )，δ 4· 17 (1Η，m，Η_4')和 δ6·21(1Η， m，H-5')]，四個亞甲基質子[δ 2· 68，2· 9Κ2Η，m，Η-2')和 2. 70，2. 91 QH，m，H_6 ‘)]， 這些信號結合碳譜信號表明該皂苷結構存在綠原酸酯。由HMBC譜確定綠原酸酯接在苷元 的C-23位。綜合各數據及與文獻對比鑒定化合物Lonimacranthoide I為3_0_β-D_glu copyranosyl- (1 — 4) - β -D-glucopyranosyl-(1 — 3) - α -L-rhamnopyranosyl- (1 — 2) - α -L_a rabinopyranosyl hederagenin 23-0-chlorogenic acyl-28-Ο-β -D-glucopyranosyl-(1 —6)-β-D-glucopyranosyl ester。經CA網絡版檢索為新化合物。
Table 1化合物Lonimacranthoide I的苷元與糖鏈部分的NMR數據(δ，ppm，0 = TMS，C5D5N)
權利要求
1. 一種綠原酸酯皂苷類化合物Lonimacranthoide I，其特征在于化學名為3_0_ β-D-glucopyranosyl- (1 — 4) - β -D-glucopyranosyl- (1 — 3) - α -L-rhamnopyranosy 1 - (1 — 2) - α -L-arabinopyranosyl hederagenin 23-0-chlorogenic acyl-28-Ο-β -D-glucopyranosyl-(1 — 6) - β -D-glucopyranosyl ester,化學結構式為
2.制備權利要求1所述化合物的方法，其特征在于以灰氈毛忍冬花蕾為原料，經水、甲 醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液提取；水提取液直接過大孔樹脂吸附，甲醇、乙 醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液的提取液濃縮后加水溶解過大孔樹脂吸附；大孔樹脂 吸附物經柱層析分離而得。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂為D101、AB-8、HP-20 中的一種；柱層析用擔體選自硅膠、凝膠、反相硅膠中的一種或幾種。
4.權利要求1所述的化合物與醫學上可接受的藥用輔料組成藥物制劑。
5.根據權利要求4所述的制劑劑型是片劑、膠囊劑和注射劑。
6.權利要求1所述的化合物在制備環氧化酶II抑制劑、基質金屬蛋白酶-9抑制劑或 抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及天然藥物化學領域，公開了從灰氈毛忍冬花蕾中提取分離的一種新忍冬綠原酸酯皂苷類化合物的化學結構，該化合物具有右式結構。以及該化合物的制備方法和在醫藥領域中的用途，尤其在制備環氧化酶II抑制劑、基質金屬蛋白酶-9抑制劑或抗腫瘤藥物的用途。
文檔編號A61P35/00GK102050862SQ200910213159
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者馮煦, 單宇, 印敏, 孫浩, 王鳴, 管福琴, 董云發, 趙興增, 趙友誼, 陳雨 申請人:江蘇省中國科學院植物研究所