用于主動栓塞術的微球體的制作方法

專利名稱：用于主動栓塞術的微球體的制作方法
用于主動栓塞術的微球體 本申請是針對申請號為01810098. 8的申請提出的分案申請，其申請日為2001年3月23日；國際申請號為PCT/US01/09619 ;發明名稱為"用于主動栓塞術的微球體"。本申請要求US60/191, 899的優先權，優先權日為2000年3月24日。
1.發明領域 本發明涉及一些組合物和方法，用于疾病的治療，其中包括癌癥和其他多種血管
發生依賴性疾病，更明確地說，本發明涉及一些組合物，這些組合物含有生物活性治療因
子，這些治療因子與微球載體(涂有或含有這些因子)相結合，此外還涉及將這些組合物用
于主動(active)栓塞治療的方法。 2.
背景技術：
2. 1血管發生依賴性疾病 在尋求醫學治療方法的所有疾病中，血管發生依賴性疾病(即需要或誘導血管生長的疾病)是重要的一部分。例如在美國，癌癥仍然是導致死亡的第二大原因，在總死亡率中占五分之一以上。簡單地說，癌癥的特征是細胞群體的分裂不受控制，最典型的是導致一個或多個腫瘤的形成。這些腫瘤的特征還包括，由吸引循環系統中的不同因子引發脈管系統的向內生長，從而使腫瘤能夠繼續生長。 一般而言，癌癥要比以往更容易診斷，但仍有多種形式的癌癥即使在早期被檢測到也無法治愈。 目前有多種方法被用來治療癌癥，其中包括，例如，多種外科手術方法。但是若只通過外科手術進行治療，許多患者(特別是某些類型的癌癥患者，如乳腺癌患者、腦癌患者、結腸癌患者和肝癌患者)會出現癌癥復發。因而除外科手術之外，許多癌癥還要用涉及細胞毒性化療藥物(如新長春堿、阿霉素、紫杉醇、長春堿、順鉑、氨甲蝶呤、5-FU，等等)和(或)放射性治療的組合療法進行治療。但該方法的難題是放療劑和化療劑對正常組織具有毒性，并經常導致危及生命的副作用。此外，這些方法一般具有極高的失效率(緩解率)。
除手術治療、化療和放療之外，還有人嘗試利用個體自身的免疫系統來清除癌性細胞。例如，有人建議以細菌或病毒的組分為佐劑來剌激免疫系統，從而破壞腫瘤細胞。(參考《癌癥的生物治療原理》01dham(ed. )Raven Press,New York, 1987。)這些制劑已成為動物腫瘤模型中普遍有效的佐劑和非特異性剌激劑，但是仍未被證實在人體內普遍有效。
該方法的另一缺陷是，局部復發和局部疾病控制仍然是惡性腫瘤治療的主要問題。詳細地說，到目前為止，每年共有630，000名患者(美國)患有局限性疾病(沒有遠距離遷移擴散的跡象)；這在所有確診的惡性腫瘤患者中(不包括非黑素瘤皮膚癌或原位癌)占64%。對這些患者中的絕大多數而言，最可能的治愈方法是對該疾病進行手術切除，實際上有428， 000名患者可以在初次治療后痊愈。但不幸的是，有202， 000名患者(或是所有局限性疾病患者的32% )會在初次治療后復發。在復發患者中，由于該疾病的局部復發而導致復發的患者每年可達133， OOO(或是所有局限性疾病患者的21% )。由于該疾病的遠距離遷移而導致復發的患者每年為68， OOO(所有局限性疾病患者的11% )。每年還約有102， IOO名患者因該疾病的局部生長失控而直接導致死亡。以乳腺癌和肝癌作為癌癥的實例來說明患者所面臨的難題。
乳腺癌 該難題對乳腺癌而言顯得尤為突出，每年約有186,000名美國婦女患乳腺癌，而該疾病的死亡率50年來沒有發生變化。通過根治性乳房切除術、改良的根治性乳房切除術或腫塊切除術對該疾病進行手術切除仍是治療該疾病的主要方法。不幸的是，只通過腫塊切除術進行治療的患者有39%會出現疾病復發，并且奇怪的是有25%的患者會在切除邊緣出現清晰的腫瘤組織學結構。這些局部復發中的90%都出現在原切除部位的2厘米范圍內。 肝癌 1999年，死于原發性肝癌的人數在120萬以上，其中大多數處在亞洲。原發性肝癌是指肝癌的原始癌性細胞是在肝臟中形成，而不是從身體的其他癌變部位遷移到肝臟中。已知某些類型的肝炎患者極有可能產生原發性肝癌，其中包括丙型肝炎，這是一種可導致肝臟炎癥的病毒性疾病。據估計，美國的丙型肝炎陽性人數目前超過400萬，因而原發性肝癌的發病率可能會急劇增加。 70%以上的原發性肝癌患者不宜通過手術治療，但可以接受放射療法和化學療法。目前可選用的治療方法如下 化學療法化學療法試圖通過殺死快速分裂的腫瘤細胞來控制癌癥。但體內的許
多非癌性細胞，如骨髓細胞，也能夠快速分裂，從而很容易被化學療法無意中殺死。因此，足
以根除癌癥的劑量通常會由于破壞非癌性細胞而導致危及生命的副作用。
化學栓塞術以及多種仍未成熟的治療方法例如，經皮乙醇注射方法是會產生疼
痛，并且只適用于3-4cm以內的小腫瘤。 移植術移植術也是一種可使用的治療方法，但費用昂貴，并且受器官可用性的限制，而且仍可能導致腫瘤復發。此外，有創性手術也會帶來復發的危險。
此外，化學療法還可能損害人體的天然抗腫瘤屏障。
子宮纖維瘤 非癌性腫瘤的相關例子為子宮纖維瘤，也稱為平滑肌瘤。這些非癌性腫瘤由特定類型的肌纖維和纖維性結締組織構成。子宮平滑肌瘤的病因仍然未知。大多數子宮平滑肌瘤患者最初都不表現出癥狀，并且在出現異常出血、尿頻、疼痛、腫脹和性交困難之前都不接受治療。在美國，每年約有25， 000， 000名婦女患子宮平滑肌瘤，其中約有5， 500， 000名表現出明顯癥狀并尋求治療。到目前為止，患有子宮平滑肌瘤的婦女幾乎沒有什么可行的療法供選擇，這些療法包括子宮切除術、肌瘤切除術、醫學管理以及"觀望和等待"。目前可用于治療子宮平滑肌瘤的療法都帶有明顯的缺陷，其中包括使育齡婦女暫時或永遠喪失生育能力、漫長的恢復期、不良的心理影響導致更年期提前、費用昂貴，其中包括藥費、手術費以及頻繁的長期住院治療的費用，有創性手術操作和激素治療帶來的不適及副作用，和(或)平滑肌瘤復發的危險。 因此，非常需要一種統一而有效的治療方法對患者進行治療，尤其是乳腺癌、肝
癌、胰腺癌和子宮平滑肌瘤患者。 被動(passive)栓塞術 被動栓塞術是一種已嘗試用于腫瘤治療但成效有限的方法。簡單地說，是把栓塞性物質注射到為腫瘤提供營養的血管中，從而蓄意將該血管堵塞。已嘗試用于該方面的物質有很多種，其中包括自體同源物，如脂肪、血塊和切下的肌肉片段，以及人工合成物，如毛織物、棉花、鋼球、塑料或玻璃珠、鉭粉、硅化合物、放射性顆粒、可吸收的無菌明膠海綿(Sterispon， Gelfoam)、氧化纖維素(0xycel)、鋼螺管、乙醇、凍結的人腦硬膜(Lyodura)、維管膠原蛋白(Avitene)、膠原原纖維(Tachotop)、聚乙烯醇海綿(PVA ;Ivalon)、灌注有鋇的硅球(Biss)以及可拆氣球。利用這些方法可以使腫瘤暫時減小，但是腫瘤通常會因新血管的長入而繼續生長。 與腫瘤形成有關的一個問題是產生癌性阻塞物，它可阻礙膽管、氣管、食道、脈管系統或尿道等身體通道中的物質流動。目前已研制了一種支架裝置用于使腫瘤或其他物質阻塞的管道保持通暢。常用支架的典型實例包括Wallstent、Strecker支架、Gianturco支架及Palmaz支架。但使用支架的主要問題是，它們不能阻止腫瘤向內生長或炎性物質穿過支架縫隙。如果該物質到達支架內部并損害支架的內腔，將會導致其插入的身體通道被阻塞。此外，身體內的支架可能會誘導反應性組織或炎性組織(如血管、成纖維細胞、白細胞)進入支架內腔，從而導致支架的局部封閉或完全封閉。
2. 2治療性栓塞術或主動栓塞術 將細胞毒性藥物給藥至腫瘤附近可以提高腫瘤與正常組織的遞送比率。這種區域性給藥的實現方法可以是，直接通過腫瘤的供血將藥物遞送到腫瘤內或特定腫瘤所處的體腔中。局部藥物灌注的優點是能夠提高靶組織的最大藥物濃度，但靶組織暴露于藥物還只局限于血液第一次流經被灌注的器官。第一次流過時未被吸收的部分藥物將流遍全身，從而將被正常組織吸收。 治療性血管閉塞(栓塞術)是用于原位治療某些病情的技術。其實現方法一般是
采用導管，從而能夠在顯象監控的條件下將顆粒性阻塞劑(栓子)安置到循環系統中。這
些技術還涉及腫瘤、血管畸形、出血等不同過程的血管。特別是用于腫瘤時，血管閉塞能夠
在栓塞手術中緩解疼痛、減少失血，甚至可導致腫瘤壞死，從而避免手術。當用于血管畸形
時，這些技術能夠使正常組織的血流恢復正常，有助于手術進行并降低出血的危險。當用于
出血過程時，血管閉塞可導致血流量減少，從而促進動脈開口的愈合。 此外，還可根據治療的病情，將栓塞術用于暫時性目的或永久性目的。 現有技術已知的有不同類型的栓子。具體地說，可包括流體劑(丙烯酸膠、凝膠、
粘性懸液，等等)或顆粒劑(各種聚合物、硬腦膜、明膠海綿、球體、氣囊、螺旋，等等)。已知
流體栓子的主要缺點是對組織有毒性，從而可導致壞死現象，并且使導管有粘連的危險。流
體栓子的另一缺陷是只能以被動方式發揮作用，并且不能用于藥物遞送。 利用微球體可以實現對靶位點進行局部給藥以及使其損耗最小化的雙重功能。經
局部動脈引入的微球體可以被組織的脈管系統捕獲并釋放其攜帶的藥物。這種雙重作用被
稱為主動栓塞。微球體可以是固態組合物，也可以是多孔組合物，這些微球體可通過制備而
含有離散的液態或固態藥物分子(Zimmer and Kreuter， 1995)。在治療由單一輸入動脈供
血的諸如肝臟等器官內的腫瘤時，微球體具有獨特的應用價值(Chen et al. 1994)。當靶器
官中的腫瘤是唯一需要治療的區域時，微球體則具有極其重要的價值。 已知有涉及在基于栓塞藥物的治療方法中使用微球體的研究，但是在基因治療中
使用微球體的研究相對較少。例如，通常利用玻璃珠經靜電引力從異源混合物中選擇性提取DNA。也有利用羥磷灰石來純化核酸(Kumazawa et al. ， 1992)，以及在超聲的引導下直接將球形羥磷灰石植入肝臟腫瘤，從而用于持續釋放阿霉素(Kimieda et al. ， 1993)，但其他一些研究表明，這種獨特的基質可能根本不宜暴露于哺乳動物組織(Dass et al. ， 1997a，1997b)。還有將DNA保持在表面帶有二乙氨乙基(DEAE)官能團的PDB微球體上(Katz etal. ，1990 ;Maa et al. ，1990)。 因此，確實需要再研制一些用于遞送基因的微球體。所需的主要優點是能夠通過血流將抗瘤劑特異性地導向腫瘤脈管系統。此外，就破壞腫瘤細胞而言，最希望得到的效果可能是阻斷腫瘤的供血，同時破壞其營養供應和廢物排出。
3.發明概述 在一項實施方案中，本發明提供一些組合物和方法，用于以多種不同的聚合材料為載體向哺乳動物遞送藥物、疫苗、多核苷酸以及診斷劑或成像劑。在一項優選實施方案中，本發明提供用于遞送這些制劑的微顆粒，特別是微球體。在最優選的實施方案中，本發明提供由轉染劑遞送多核苷酸的微球體。 更詳細地說，在優選實施方案中，本發明使用的聚合物載體包括任何能"攜帶"或
能與本發明的生物活性治療因子和轉染劑相聯接的顆粒。優選的聚合材料是以基本上呈球形、基本上具有親水性、惰性和離子性的交聯聚合物為基礎，其大小足以導致栓塞并釋放生
物活性治療因子。在一項優選實施方案中，所述生物活性治療因子與所述轉染劑物理連接，該轉染劑則與微顆粒相連接。 在一項實施方案中，本發明提供一些生物活性治療組合物，以及用這些組合物來治療癌癥和包括癌前病癥在內的其他多種血管發生依賴性疾病的方法和裝置。作為一方面，本發明提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子、(b) —種聚合物載體和(c) 一種轉染劑。 作為另一優選方面，本發明提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子的編碼多核苷酸、(b) —種聚合物載體和(c) 一種轉染劑。 作為另一優選方面，本發明提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子的編碼多核苷酸、(b) —種聚合物載體和(c) 一種脂多胺轉染劑。 在本發明的范圍內，可以用多種不同的分子做為生物活性治療因子，例如包括，但不局限于，抗血管發生因子、抗瘤劑、肽和肽類似物、抗體或其片段、疫苗、酶、核酸、天然的或合成的RNA和DNA，其中包括重組RNA和重組DNA以及反義RNA和反義DNA ;錘頭狀RNA、核酶、反義基因核酸、單鏈和雙鏈的RNA和DNA及其類似物。 本發明的聚合材料包括，但不局限于，丙烯酸聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸酯聚合物、聚乳酸、聚丙烯酰胺、聚酐、多糖、聚硅酮，或其混合物。更優選的聚合材料是丙烯酸家族的基本親水的交聯共聚物，如聚丙烯酰胺與其衍生物、聚丙烯酸酯與其衍生物，以及聚烯丙基化合物與聚乙烯基化合物。為獲得穩定性和不可再吸收性，所有這些聚合物都可以是交聯的形式。 在本發明公開的多項實施方案中，生物活性治療因子都與轉染劑物理結合，并且生物活性治療因子-轉染劑復合物與聚合載體物理結合。優選的是通過液相吸附色譜中熟知的結合力將生物活性治療因子吸附，這些結合力包括，但不局限于，離子交換、疏水性、分子識別或其組合。在一項優選實施方案中，生物活性治療因子先與轉染劑結合成復合物，然后再與本發明的聚合載體混合或接觸。 作為本發明的一方面，可以將選定的生物活性治療因子與轉染劑相混合，從而使 生物活性治療因子與轉染劑形成一種具有特殊性質的復合物，如疏水性加強的復合物。
作為本發明的另一方面，可以將聚合物載體與充足劑量的可轉染性生物活性治療 因子相混合。導致生物活性治療因子與聚合物載體物理連接的是離子性結合力和疏水性結 合力，這些結合力可通過添加鹽來加強，例如，但不局限于，氯化鈉或諸如含鋇或含碘的鹽 等造影劑。 在本發明公開的多項實施方案中，吸附在栓塞性物質表面的生物活性治療因 子-轉染劑復合物一旦被遞送到適當部位，則會逐漸釋放并通過多種機制進入周圍細胞， 這些機制包括，例如，但不局限于，自發的內吞作用、受體介導的內吞作用、內體分解作用以 及細胞膜去穩定作用或其組合。生物體液中的天然成分可誘導生物活性治療因子釋放，這 些成分可降低栓塞性物質與生物活性治療因子之間的吸附強度，直至后者被完全釋放。還 可利用能夠在體內水解的鍵來調節生物活性治療因子的釋放，其中包括，但不局限于，酯鍵 或苷鍵。在其他多種實施方案中，還可利用與生物活性治療因子結合的肽來調節生物活性 治療因子的釋放，其中可肽鍵可以被細胞的蛋白水解酶分解。 另一方面，本發明提供一些用于使血管發生栓塞的方法，這些方法包括將治療有
效劑量的生物活性治療因子給藥于需要治療的患者的血管，從而有效地封閉該血管。在一
項實施方案中，可以同時或依次將生物活性治療因子遞送至滋養腫瘤的血管中。 另一方面，本發明提供一些方法，用于使腫瘤生成性血管發生依賴性疾病中的血
管出現栓塞，這些方法包括將治療有效劑量的一種組合物給藥于需要治療的患者的血管，
從而有效地封閉該血管，其中，該組合物含有一種編碼生物活性治療因子的多核苷酸，這種
多核苷酸與一種轉染劑結合，并且這種多核苷酸_轉染劑還與一種聚合物載體結合。 作為另一更優選的方面，本發明提供一些方法，用于使腫瘤生成性血管發生依賴
性疾病中的血管出現栓塞，這些方法包括將治療有效劑量的一種組合物給藥于需要治療的
患者的血管，從而有效地封閉該血管，其中，該組合物含有一種編碼生物活性治療因子的多
核苷酸，這種多核苷酸與一種脂多胺轉染劑結合，并且這種結合的多核苷酸_轉染劑還與
一種基本親水的微球體結合。 另一方面，本發明提供一些方法，用于使腫瘤生成性血管發生依賴性疾病中的血 管出現栓塞，這些方法包括將治療有效劑量的一種組合物給藥于需要治療的患者的血管， 從而有效地封閉該血管，其中，該組合物含有一種病毒載體或一種病毒樣顆粒，這種病毒載 體或病毒樣顆粒含有編碼生物活性治療因子的多核苷酸，并且與一種轉染劑結合，此外，這 種結合的病毒載體_轉染劑還與一種基本親水的微球體結合。 作為另一更優選的方面，本發明提供一些方法，用于使腫瘤生成性血管發生依賴
性疾病中的血管出現栓塞，這些方法包括將治療有效劑量的一種組合物給藥于需要治療
的患者的血管，從而有效地封閉該血管，其中，該組合物含有一種病毒載體或一種病毒樣顆
粒，這種病毒載體或病毒樣顆粒含有編碼生物活性治療因子的多核苷酸，并且與一種轉染
劑結合，此外，這種結合的病毒載體_轉染劑還與一種基本親水的微球體結合。 再一方面，本發明提供一些方法，用于抑制非腫瘤生成性血管發生依賴性疾病患
者的血管發生，這些方法包括將治療有效劑量的藥物與編碼生物活性治療因子的多核苷酸一同給藥于需要治療的非腫瘤生成性血管發生依賴性疾病患者，從而抑制新血管形成，其 中，所述多核苷酸與一種轉染劑結合，并且這種結合的多核苷酸_轉染劑還與一種聚合物 載體結合。作為本發明的另一方面，可以將這種藥物摻入到聚合物載體中，以避免對同時給 藥的生物活性治療因子的遞送產生干擾。 另一方面，本發明提供一些方法，用于對非腫瘤生成性非血管發生依賴性疾病患 者進行治療，這些方法包括將治療有效劑量的藥物與結合在轉染劑上的可編碼生物活性治 療因子的多核苷酸一同給藥于需要治療的患者，從而改善非腫瘤生成性非血管發生依賴性 疾病的癥狀，其中，所述藥物包含在聚合物載體中，從而避免對同時給藥的與聚合物載體結 合的生物活性治療因子的遞送產生干擾。 在其他優選實施方案中，本發明的組合物含有(a) —種編碼生物活性治療因子的 多核苷酸、(b) —種聚合物載體和(c)帶有一種較輕的d族過渡金屬(如釩系、鉬系、鎢系、 鈦系、鈮系或鉭系)的可抑制新血管形成的脂多胺轉染劑。 在其他優選實施方案中，本發明的組合物含有(a) —種編碼生物活性治療因子的 多核苷酸、(b) —種陽離子交聯的微顆粒和(c) 一種帶有轉染增強劑的脂多胺轉染劑。
在另一優選實施方案中，本發明提供一種用于將多核苷酸遞送至哺乳動物宿主的 方法，該方法包括，將一種結合有多核苷酸和轉染劑的基本親水的聚合物給藥于患有疾病 的哺乳動物。本發明還提供該方法的一些實施方案，其中包括，將結合有多核苷酸和轉染劑 的基本親水的所述聚合物給藥以用于基因治療、所用聚合物微球體的大小足以使投藥部位 的血管發生栓塞，以及所用聚合物的大小不足以使投藥部位的血管發生栓塞，但足以錨定 在腫瘤中。 在另一優選實施方案中，本發明提供一種用于使哺乳動物宿主發生主動栓塞的方 法，該方法包括，將結合有可表達抗血管發生物的生物活性治療因子的一種基本親水的聚 合物給藥于患有血管發生依賴性疾病的哺乳動物，其中的生物活性治療因子與一種轉染劑 相結合。 另一方面，本發明提供一些用于處理腫瘤切除部位的方法，這些方法包括，在腫瘤 切除之后，將上文描述的一種組合物給藥于切除邊緣，從而抑制癌癥的局部復發和該部位 的新血管形成，其中，該組合物含有一種聚合物載體和一種結合有生物活性治療因子的轉 染劑。 其他方面，本發明提供一些方法，用于使非腫瘤生成性血管發生依賴性疾病中的
血管出現栓塞，這些方法包括，將治療有效劑量的一種組合物給藥于血管，從而有效地封閉
該血管，其中的組合物含有一種與編碼生物活性治療因子的多核苷酸結合的藥物。 另一方面，本發明提供一些方法，用于使腫瘤生成性血管發生依賴性疾病中的血
管出現栓塞，這些方法包括，將治療有效劑量的一種組合物給藥于血管，從而有效地封閉該
血管，并將編碼生物活性治療因子的多核苷酸遞送到細胞內用于表達，其中的組合物含有
一種與編碼生物活性治療因子的多核苷酸相結合的藥物。 另一方面，本發明提供一種用于使哺乳動物宿主發生主動栓塞的方法，該方法包 括，將結合有生物活性治療因子的一種基本親水的聚合物給藥于患有疾病的哺乳動物，其 中的生物活性治療因子與一種轉染劑相結合。 另一方面，本發明提供一種適用于主動栓塞的微顆粒，這種微顆粒含有一種能夠使血管發生栓塞的聚合物，其中的聚合物與一種連接有遺傳物質的轉染劑相連接。
其他方面，本發明提供一些用于對器官的新生血管性疾病進行治療的方法，其中 的器官包括眼，但不局限于此，該方法包括，將治療有效劑量的生物活性治療因子給藥于需 要治療的患者，例如給藥于患者的眼部，從而抑制其新血管形成。 本發明提供一些適用于治療癌癥和其他非腫瘤生成性血管發生依賴性疾病的組 合物和方法，此外還提供其他一些相關的優勢。這些癌癥包括，但不局限于，肝癌、卵巢癌、 腎癌、胰腺癌、前列腺癌、皮膚癌、頭及頸部腫瘤、乳腺癌、Kaposi肉瘤和表淺性膀胱癌。但 是除癌癥之外，還可利用本發明的生物活性治療因子或組合物來治療其他多種以血管生長 異常為特征的非腫瘤生成性血管發生依賴性疾病。這些非腫瘤生成性血管發生依賴性疾 病的典型實例包括，但不局限于，肥厚性瘢痕及瘢痕瘤、增生型糖尿病性視網膜病變、風濕 性關節炎、動靜脈畸形、動脈粥樣硬化斑塊、延遲性創傷愈合、血友病性關節炎、非愈合性骨 折、0sier-Weber綜合癥、牛皮癬、生膿性肉芽腫、硬皮病、tracoma、月經過多和血管粘連。
在另一項實施方案中，本發明提供一些用于進行栓塞性基因治療的試劑盒，這些 試劑盒含有(a)適用于栓塞術的微球體懸液；以及(b)適用于將遺傳物質遞送至細胞的轉 染劑。在另一實施方案中，本發明還提供一些試劑盒，其中，聚合物裝在一個小瓶中，與編碼 生物活性治療因子的多核苷酸結合的轉染劑裝在另一個小瓶中，將兩個小瓶的內容物混合 即可形成藥用組合物。另一實施方案中，本發明還提供一些試劑盒，其中，聚合物裝在一個 小瓶中，轉染劑裝在另一個小瓶中，編碼生物活性治療因子的多核苷酸裝在又一單獨的小 瓶中，將所有三個小瓶的內容物混合即可形成藥用組合物。另一實施方案中，本發明還提供 一些試劑盒，其中，組分(a)適用于栓塞術的微球體懸液以及組分(b)適用于將遺傳物質遞 送至細胞的轉染劑都裝在一個小瓶中。 參考下文的詳細描述和附圖
將可以了解本發明的這些方面以及其他方面。此外， 下文列舉的多篇參考文獻都在此完整引入作為參考。
4.發明詳述
定義 文中使用的"基本為球形"通常是指接近完美球形的一種形狀，完美球形的定義是 外表面積最小的一種體積。明確地說，本發明的"基本呈球形"是指，從顆粒的任一橫截面 觀察，大直徑平均值與小直徑平均值之間的差異不超過20%。本發明的微球體表面在放大 高達1000倍時仍顯得光滑。本發明的微球體除包括顆粒之外，還包括文中描述和定義的其 他物質。 本發明中使用的"細胞粘連促進劑"是指因存在于微球體中或與微球體相結合而 能夠促進或加強細胞與微球體表面粘連的任何物質。這些物質通常是以共價鍵或相互滲透 聚合的方式結合于微球體表面的蛋白質。 本發明中使用的"治療劑"是指對血管發生依賴性疾病的進程或血管發生依賴性 疾病導致的生物學或生理學反應具有治療效果的任何物質。治療劑的實例是抗炎劑，它能 夠預防或降低與血管發生依賴性疾病相關的炎癥效應。 本發明中使用的"化學修飾"是指在微球體的產生過程中或通過微球體與多種制 劑或組織的混合或接觸而產生的微球體化學性質及特征的改變，從而使微球體一旦被注射 到體內即能夠行使腫瘤栓塞以及其他功能。
本發明中使用的"增穩物"或"增穩化合物"是指能提高文中描述的組合物、藥物前 體、耙配體和(或)其他生物活性治療因子的穩定性的任何物質，其中包括，例如，混合物、 懸浮液、乳劑、分散劑、囊泡，等等。"增穩物"的定義包括本發明的某些生物活性治療因子和 藥物前體。"增穩物"的定義還包括本發明的某些轉染劑。穩定性的增加包括，例如，維持在 相對平衡的狀態，其實例包括，例如，組合物對破壞、分解、降解等作用的抵抗能力提高。舉 例來說，轉染劑中的陽離子懸垂頭會降低轉染的效率，例如化合物C12GluPhnN^P C14GluPhnN+ 就是如此，而D0TB/D0SC等化合物具有最短的間隔區，因而可產生最高的表面電荷密度和 最佳的轉染效率。 在涉及含有生物活性治療因子、藥物前體和(或)其他生物活性劑的微球體的優 選實施方案中，增穩化合物可用于形成微球體，也可用于穩定微球體，這兩種方式都可以在 需要釋放之前基本上(包括完全地)阻止微球體釋放某些生物活性治療因子、藥物前體和 (或)生物活性劑或使其減至最少。在本發明的有關阻止微球體釋放某些生物活性治療因 子、藥物前體和(或)其他生物活性劑的描述中，使用的術語"基本上"是指，在需要釋放之 前，與微球體表面結合或包含在其中的量約保持在50%以上，而優選的是在需要釋放之前， 與微球體表面結合或是在治療性藥物制劑的情況下包含在微球體中的量約在60%以上，更 優選的則約在70%以上，再更優選的是約在80%以上，最優選的是約在90%以上。在特別 優選的實施方案中，約有95%以上的生物活性治療因子、藥物前體和(或)生物活性劑在需 要釋放之前與微球體表面保持結合，或是在治療性藥物制劑的情況下包含在微球體中。生 物活性治療因子、藥物前體和(或)生物活性劑還可以在需要釋放之前完全與微球體表面 保持結合或包含在微球體中(即與微球體表面保持結合或包含在其中的量為約100% )。
典型的增穩物包括，例如，脂類、蛋白質、聚合體、糖類和表面活性劑。所得的混合 物、懸浮液、乳劑等可含有包裹生物活性治療因子或生物活性劑的壁(即薄膜、膜，等等)， 如果需要，也可以基本上不含壁或膜。增穩物還可以在需要的情況下形成微滴。增穩物還 可含有鹽和(或)糖。在某些實施方案中，增穩物可以是基本上(包括完全)交聯的形式。 增穩物可以是中性的，也可以帶有正電荷或負電荷。 文中使用的"交聯"、"交聯的"、"交聯性"通常是指兩種或多種增穩物通過一種或 多種橋相連接，這些增穩物包括脂類、蛋白質、聚合體、糖類、表面活性劑增穩物、生物活性 治療因子和(或)生物活性劑。這種橋可由一種或多種元素、基團或化合物組成，并且通常 可用于將第一增穩物分子的原子與第二增穩物分子的原子相連接。交聯橋可包括共價連接 和(或)非共價連接。交聯物中的橋可由多種元素、基團和(或)化合物中的任何一種來形 成，增穩物的交聯可以是天然形成的，也可以通過合成方法產生。舉例來說，交聯可以在角 質素、胰島素和其他蛋白質等由肽鏈構成的物質中天然產生，這些肽鏈可通過胱氨酸殘基 上的二硫鍵相連接。作為選擇，還可通過適當的化學修飾來影響交聯，例如，可以通過加熱、 高能輻射等方式使增穩物等化合物與充當交聯劑的一種化學物質相結合。其實例包括，使 硫形成二硫鍵而實現交聯、利用有機過氧化物實現交聯、利用高能輻射實現不飽和物的交 聯，與二羥甲替氨基甲酸酯交聯，等等。如果需要，增穩化合物、生物活性治療因子和(或) 生物活性劑也可以是基本交聯的。 文中使用的術語"基本上"是指約50%以上的增穩化合物含有交聯橋。如果需要， 也可以是約60 % 、70 % 、80 % 、90 % 、95 %以上甚至100 %的增穩化合物含有這些交聯橋。作為選擇，增穩物還可以是非交聯的，即約50%以上的增穩化合物不含交聯橋，如果需要，也
可以是約60 % 、70 % 、80 % 、90 % 、95 %以上甚至100 %的增穩化合物不含交聯橋。 文中使用的"結合"是指本發明的生物活性治療劑、轉染劑和微球體之間的連接。
生物活性治療劑與轉染劑之間的結合可以導致一種復合物形成，也可以不導致復合物形
成。這種結合可包括，但不局限于，共價結合、非共價結合，以及離子相互作用、靜電相互作
用、范得華力、氫鍵、親水相互作用和疏水相互作用，其定義將在下文做進一步說明。 文中使用的"共價結合"是指涉及兩個原子共用結合軌道中的電子的一種分子間
結合或鍵。 文中使用的"非共價結合"是指兩個或多個獨立分子之間的不涉及共價鍵的分子 間相互作用。分子間的相互作用取決于多種因素，其中包括相關分子的極性，如果存在的 話，則還包括相關分子的電荷(正電荷或負電荷)。非共價結合可選自離子相互作用、偶 極_偶極相互作用、范得華力及其組合。 文中使用的"離子相互作用"或"靜電相互作用"是指帶有正電荷或負電荷的兩種 或多種分子之間的一種相互作用。此時，"離子相互作用"或"靜電相互作用"是指，例如， 帶正電荷的第一分子與帶負電荷的第二分子之間的吸引。離子相互作用或靜電相互作用包 括，例如，帶有負電荷的增穩物，如遺傳物質，與帶有正電荷的脂類，如溴化十二烷基三甲銨 等陽離子脂，之間的吸引。 文中使用的"范得華力"是指非極性分子之間的吸引力，這種吸引力可以用量子力 學來解釋。范得華力通常與瞬時偶極矩有關，這種瞬時偶極矩由鄰近的分子誘導產生，并且 涉及電子排布的改變。 文中使用的"氫鍵"是指可以在共價連接于氧、硫或氮等負電性原子的氫原子與另 一個負電性原子之間產生的吸引力或橋。氫鍵可以在第一分子的氫原子與第二分子的負電 性原子之間產生(分子間氫鍵)。氫鍵還可以在單個分子中同時包含的氫原子與負電性原 子之間產生(分子內氫鍵)。 文中使用的"親水相互作用"是指基本上能結合、吸收和(或)溶解于水的分子或 其部分。這種相互作用能夠導致可逆型凝膠的膨脹和(或)形成。 文中使用的"疏水相互作用"是指基本上不能結合、吸收和(或)溶解于水的分子 或其部分。 為了闡明本發明的公開內容，發明詳述部分將分為以下幾個小節，但這并不作為 限制。 本發明提供一些安全有效的栓塞性基因治療方法，這些方法適用于癌癥和其他多 種血管發生依賴性疾病的治療。因此，這些栓塞性基因療法可以使內科和(或)外科醫生 受益，其中包括，但不局限于，介入性放射學家。外科醫生可以在手術前、手術中或手術后使 用本發明的方法和組合物。 簡單地說，基因治療是將基因以DNA或RNA分子的形式遞送到患者的細胞內。這 些基因可作為核酸表達構建體盒的一部分，構建體盒可含有目的基因和能夠指導該基因在 靶細胞內高水平表達的啟動子/增強子元件。細胞內的酶使該DNA轉錄成信使RNA分子， 這些分子可作為模板將基因序列翻譯成蛋白產物。然后該蛋白在靶細胞內或周圍組織中執 行某種功能，以校正細胞缺陷或殺死腫瘤細胞等細胞。
因此，基因療法和細胞療法包括將遺傳信息引入細胞或受影響的組織，從而校正 缺陷或異常(突變、異常表達，等等)，或確保治療性目的蛋白的表達。可以在體外將這種 遺傳信息引入由器官提取的細胞，然后把改良的細胞重新引入體內，也可以直接在體內將 遺傳信息引入適當的組織。目前已描述了多種用于轉移這種遺傳信息的技術，其中包括涉 及DNA與DEAE-葡聚糖(Pagano et al. ， J. Virol. 1 (1967)891) 、DNA與核蛋白(Kaneda et al.'Science. 243(1989)375) 、DNA與脂類(Felgneret al. ，PNAS 84 (1987) 7413) 、DNA與聚 賴氨酸、脂質轉染法(Fraleyet al. ， J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431)，等等，的多種轉染技 術。 栓塞術是將血液流經的血管部分封閉或完全封閉。治療性栓塞術是一種用來封閉 動脈或靜脈的方法，可用于糾正動靜脈畸形等機能障礙，或阻止血液流動以中止對實性腫 瘤(癌瘤)的營養供給。最常用的治療性栓塞術不將任何活性分子運載和(或)遞送到栓 塞物質沉積的部位，因而是一種"被動"操作。 本發明涉及一種在減少血流的同時局限性遞送可轉染性遺傳物質的"主動"栓塞 術，這兩種操作的目的相同，即減少或消除癌細胞。 —方面，本發明提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子、(b) —種微球體載 體和(c) 一種轉染劑。在一項優選實施方案中，本發明提供一些通過將可注射組合物給藥 于需要治療的腫瘤及其他多種血管發生依賴性疾病患者來進行基因治療的方法，所述可注 射組合物含有(a) —種生物活性治療因子、(b) —種微球體載體和(c) 一種轉染劑。
在另一項優選實施方案中，本發明提供一些通過將可注射組合物給藥于需要治療 的腫瘤及其他多種血管發生依賴性疾病患者來進行基因治療的方法，所述可注射組合物含 有(a) —種生物活性治療因子、(b) —種微球體載體和(c) 一種轉染劑，其中的可注射組合 物借助于適當號的針頭被直接給藥于腫瘤或患病組織。 在又一項優選實施方案中，本發明提供一些通過將可注射組合物給藥于需要治療 的腫瘤及其他多種血管發生依賴性疾病患者來進行基因治療的方法，所述可注射組合物含 有(a) —種生物活性治療因子、(b) —種微球體載體和(c) 一種轉染劑，其中的可注射組合 物通過脈管系統注射被直接遞送至腫瘤或患病組織。 另一方面，本發明提供一些用于處理腫瘤切除部位的方法，這些方法包括，在腫瘤 切除之后，將一種組合物給藥于切除邊緣，從而抑制癌癥的局部復發和該部位的新血管形 成，其中的組合物含有一種抗腫瘤藥，如紫杉酚、阿霉素、順鉑、紫杉醇，但不局限于此。
還可以對本發明的聚合物載體或優選微球體進行化學修飾，使其具有治療作用、 血管發生作用、抗血管發生作用、生血管特性或其組合。在一項實施方案中，本發明的微球 體含有由交聯聚合物制成的顆粒，從而在其結構內可能含有不同性質的化學物質，此外，本 發明的微球體的特性在于具有表面共價鍵，因此，可以對本發明的微球體進行化學修飾。此 外，還可以通過微球體在給藥后與鄰近細胞和組織之間的相互作用來對本發明的微球體進 行化學修飾。 本發明的方法具有以下優點(l)被注射物在最初注射的組織中不容易轉移，因 而可以在無需反復給藥或不對患者產生副作用的情況下實現基因治療，(2)被注射物不容 易因生物化學作用或免疫系統或淋巴系統而被降解、轉移或清除，因而該方法更為有效和 持久，(3)被注射物的大小適合用18-26號(gauge)或30或更小號的針頭進行注射，因而該方法更為精確和有效，并且對患者的干擾最小，(4)被注射顆粒具有柔性，不易碎，這有助 于在不破裂的情況下進行方便的注射，因而可用于簡便而安全的注射，以及(5)被注射顆 粒具有不規則的形狀，并且不會結塊，因而可同樣用于簡便而精確的注射。這些優點，無論 是單獨或是組合來看，都可以提高治療的有效性，并且使患者感覺更安全、方便和舒適。
4. 1聚合物
4. 1. 1微顆粒 能夠與本發明的多核苷酸或其他遺傳物質以及轉染劑結合并且能定向于作用部 位的任何聚合物都可用于遞送本發明的多核苷酸或其他遺傳物質。在一項優選實施方案 中，使用的聚合物應能夠攜帶多核苷酸或其他遺傳物質，以及能引起栓塞。優選的是在本發 明中使用 一種微顆粒，最優選的是使用 一種微球體。 有非常多種聚合性載體可用于本發明，這些聚合性載體的典型實例包括，但不局 限于，聚乙烯乙酸乙烯酯(40%交聯)、聚(D，L-乳酸)寡聚物及聚合物、聚(L-乳酸)寡聚 物及聚合物、聚乙二醇酸、乳酸與乙二醇酸的共聚物、聚己內酯、聚戊內酯、聚酐、聚己內酯 或聚乳酸與聚乙二醇的共聚物、多糖、聚硅酮，及其混合物。
4. 1. 2微球體 在本發明所述藥物的遞送方面，優選的聚合物是微球體。在藥物遞送實施方案中， 可以選擇性使用轉染劑。 用于在本發明中使用的優選微珠或微球體(文中統稱為微球體)應基于具有生物 相容性和親水性的基本上呈球形的無毒聚合物。這些微球體可以用18或更小號的針頭進 行注射，并且不會被免疫系統或淋巴系統清除。優選的是用能夠促進細胞粘連的制劑包被 聚合物。還可以將活細胞連接于微球體，以形成能夠與周圍組織相連結的細胞層，從而加強 微球體的長期穩定性。 本發明的微球體包含彈料，優選的彈料選自丙烯酸聚合物、乙烯醇聚合物、丙烯酸 酯聚合物、多糖、聚硅酮，及其混合物。更優選而言，適用于該申請書的親水性共聚物為丙烯 酸家族的共聚物，如聚丙烯酰胺及其衍生物、聚丙烯酸酯及其衍生物，以及聚烯丙基化合物 和聚乙烯基化合物。在另一項實施方案中，本發明的微球體還可基于聚乙酸乙烯酯與一種 疏水性陽離子聚合物結合的組合。為獲得穩定性和不可再吸收性，所有這些聚合物都可以 是交聯的形式，并且其結構中還可含有其他化學物質，這些化學物質可具有諸如趨化作用、 促進細胞與細胞或組織粘連等特性。 本發明的一些微球體可用于植入身體的不同部位，優選是通過注射植入，這些微 球體由一種不可再吸收的親水性聚合物構成，該聚合物中含有適當的細胞粘連物，此外還 可含有不透射線的分子或其他標記制劑，從而有助于在干預之前或在干預過程中利用放射 學方法進行定位。 本發明使用的微球體對組織和細胞不產生毒性，并且具有生物相容性，此外還可 通過促進細胞生長而粘連于植入部位的多種細胞和組織。此外，這些微球體具有不可再吸 收性和生物不可降解性，因而在被植入所需部位之后能夠保持穩定和持久，并且能維持其 一般形狀和位置。在一項可選實施方案中，本發明的微球體可以被再吸收，因而可以被生物 降解。這種能夠被再吸收和生物降解的微球體可基于，例如，多糖及多糖衍生物，但不局限 于此。
—般而言，本發明使用的微球體可以是任意的形狀，優選的是基本上呈球形的微 球體。本發明所用微球體的直徑可為約10iim-2000iim。本發明優選使用的能夠使細胞粘 連于表面的微球體的直徑為約40 ii m-1000 ii m。 本發明優選的微球體能夠用18號或更小的針頭進行注射，并且可以被免疫系統 和淋巴系統的巨噬細胞或其他成分清除。此時，微球體的優選平均直徑為約40 ii m-400 ii m， 更優選的則為約50 ii m-200 ii m。在最優選的實施方案中，可注射微球體的平均直徑為約 70um-120um。 作為本發明的另一方面，本發明使用的一類微球體是基于一些含有多種聚合物的 顆粒，這些顆粒是無毒的、生物相容的、可膨脹性的和親水的，并且基本上為球形。可膨脹型 微球體是一些高度吸水的交聯聚合物，因而在某些條件下， 一旦與水性介質接觸就能夠膨 脹。該領域的技術人員都了解，交聯聚合物的膨脹程度通常取決于聚合材料的性質和交聯 的程度。用于懸浮微球體或與微球體接觸的溶劑的鹽濃度、離子濃度或PH等性質也可影響 膨脹的程度。 通過精細控制某些可膨脹型交聯聚合物的大小和膨脹程度，就可利用這些微球體 實現栓塞和基因遞送。本發明首選的是具有高度吸水性的聚合材料。該領域的技術人員都 了解，可以用化學方法或放射學方法來調節聚合物的交聯程度，從而進一步控制這些聚合 物的膨脹性。 對含有這些聚合物的微球體而言，更重要的是通過控制用于懸浮微球體的溶劑來 進一步調節這些微球體的膨脹。這可通過本文公開的兩個步驟來實現。首先，可根據所用的 特定微球體，在注射之前利用適當的溶劑、鹽濃度和pH水平來精細調節微球體的大小。注 射前的微球體可以保持其原始大小，也可將其與溶劑接觸而使其膨脹至特定程度。控制注 射前的膨脹程度，以使微球體易于用30號或更小的針頭進行注射。其次，可在注射后以及 在注射部位與組織接觸時，將微球體進一步膨脹至預定大小或保持其注射前大小，這兩種 情況下的大小都能夠使微球體穩定在注射部位，并且能實現所需的栓塞性基因治療效果。 注射前的膨脹程度以及注射后的膨脹程度取決于使用的特定微球體以及所治療的皮膚缺 陷的性質和部位。 本發明所用微球體的膨脹前直徑為約10 ii m-400 i！ m。膨脹前微球體的優選直徑為 約10 ii m-200 ii m，最優選的則為約10 y m_120 y m。注射和膨脹之后的微球體平均直徑為約 40 i！ m以上，優選的是為約50 i！ m以上，更優選的則為約70 y m以上。本發明的微球體可膨 脹至原始大小的約15倍。利用上述方法可以調節注射后微球體的充分膨脹尺寸，從而使其 穩定在注射部位，同時不會對組織造成潛在傷害。另外，還可根據注射部位的生理狀況、微 球體的原始大小、使用的溶劑以及微球體的注射前膨脹程度等因素來預先確定注射后微球 體的充分膨脹尺寸。因此，可以根據特定病情的栓塞性基因治療要求來設計特定的注射策 略。微球體的這些尺寸和性質的優勢在于，能夠使微球體易于用30號或更小的針頭進行注 射，同時微球體的大小足以使其穩定在注射部位，并且不會被免疫系統的巨噬細胞或其他 成分清除。 對本發明的微球體而言，可能存在的變化包括將這些微球體替換成經過促細胞粘 著劑處理的任何具有生物相容性、無毒性和不可再吸收性的聚合物顆粒、膜、纖維或其他固 體基質。本發明還包括美國專利5， 925， 683公開的可膠凝流體溶液型栓塞性物質的應用，該專利的整個內容在此引入作為參考。本發明還包括能夠在注射后進行原位交聯并形成促 細胞粘連性固體填充劑的可溶性線型聚合物。本發明還涉及空微球體(微泡)的制備和 (或)注射方法，這些空微球體可以是預先制成的，也可以是通過使用適當導管而在適當位 置產生的。 本發明使用的微球體或其他固體基質具有柔性，因而能夠在不被永久改變的條件 下很容易地進入和穿過注射裝置及小導管，但本發明的微球體還對植入過程中及植入后產 生的肌肉收縮力具有抵抗性。此外還具有熱穩定性，因而能夠簡單方便地進行滅菌和冷凍 保存。 本發明使用的微球體或其他固體基質還可以在懸浮液中保持穩定，因而可以在懸 浮液中配制和保存微球體或其他固體基質，并且可以用不同的流體進行注射。更具體地說， 微球體的親水特性允許將其置于懸浮液中，特別是高熱產生的(無熱原的)可注射無菌溶 液，并且可避免產生聚集或與儲存容器以及導管、注射器、針頭等植入裝置的壁粘連。
在一項實施方案中，本發明的優選微球體同時具有親水性和陽離子性。優選的是， 這些微球體含有一種由中性親水性單體、雙功能單體、一種或多種帶正電的單體，以及可選 的能夠使微球體被檢測的功能化單體形成的共聚物。這些微球體還可含有一種或多種細胞 粘連促進劑和一種標記制劑。優選的是該共聚物為親水性丙烯酸類共聚物，其中含有共聚 合形式的占重量約25-98%的中性親水性丙烯酸單體、占重量約2_50%的雙功能單體以及 占重量約0-50%的一種或多種帶正電的單體。舉例來說，可按照本發明的描述，利用法國專 利2， 378， 808描述的共聚物來制備基本的微球體共聚物，該專利在此引入作為參考。與親 水性丙烯酸單體相同，丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酰胺及其衍生物或羥甲基甲基丙烯 酸酯也可以使用。雙功能單體的實例包括，但不局限于，N'， N'-亞甲基-雙-丙烯酰胺、 N'， N' -二烯丙基酒石酰胺或乙二醛-雙-丙烯酰胺。此外，帶正電的單體包括，但不局限 于，具有叔胺或季胺功能的單體，優選的是二乙氨乙基乙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺基丙基 三甲銨或丙烯酰胺基乙基三乙銨。在一項特別優選的實施方案中，使用的共聚物含有占重 量約25-98%的甲基丙烯酰胺以及占重量約2-50 %的N'，N'-亞甲基-雙-丙烯酰胺。
作為本發明另一相關方面，可以在認為必要的情況下對栓塞性物質的疏水性或離 子特性進行修飾，方法是，例如，引入烴鏈和(或)可電離的親水性化學基團，但不局限于 此。對栓塞性物質進行的這些修飾可導致生物活性治療因子與轉染劑之間的吸附力增強， 使其足以用來調節生物活性治療因子的遞送時間。還可通過調節生物活性治療因子與轉染 劑之間的吸附力來控制與栓塞性物質結合的生物活性治療因子的絕對量。
在本發明的一項特別有利的實施方案中，可以通過粘著劑的網狀化來提高微球體 的穩定性。以明膠為例，可以在能夠作用于明膠胺的雙功能化學劑中挑選網狀化制劑(如 戊二醛、甲醛、乙二醛，等等)。 本發明的另一實施方案是使微球體在光下和體內可見。例如，還可以在微球體 合成之后對其進行標記。其實現方法可以是，例如，與熒光標記衍生物相連接(其中包 括，例如，異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明異硫氰酸鹽(RITC)，等等)。獲得功能化單體的 方法一般是將單體與一種標記物耦聯，以使微球體可以直接顯象，所述標記物可以是一種 化學染料，如Cibacron藍和普施安紅HE-3B(Boschetti， J. Biochem-Biophys. Meth. ，19 : 21-36(1989))。可用于此類標記的功能化單體的實例包括N-丙烯酰環六亞甲基Cibacron藍或N-丙烯酰環六亞甲基普施安紅HE-3B;磁共振成像劑(鉺、禮或磁石)；造影劑，如鋇鹽或碘鹽，其中包括，例如，可按照Boschetti et al.描述的條件(Bull. Soc. Chim.，No.4France， (1986))加以制備的酰氨基_鄰_丙酰基_氨基_3_三碘-2， 4， 6-苯甲酸。當使用鋇鹽或磁石時，可直接以粉末形式將其添加到原始單體溶液中。 該領域熟知的多種細胞粘連促進劑都可以在本發明中使用。詳細地說，細胞粘連促進劑可選自膠原、明膠、葡糖胺聚糖、纖連蛋白、植物凝集素、聚陽離子(如聚賴氨酸、殼多糖等)，或其他任何天然的或合成的生物細胞粘著劑。 優選的是，細胞粘連促進劑以每毫升沉積微球體中含有約0. l-lg的劑量存在于微球體或其他固體基質中。 微球體的制備方法包括懸液聚合、逐滴聚合或該領域技術人員已知的其他任何方法。選擇的微球體制備方法通常取決于所得微球體的預期特性，如微球體的直徑和化學組成。本發明的微球體還可以用該領域描述的標準聚合方法來加以制備(如參考《微球體、微囊和脂質體》John& Wiley Sons, Arshady R. ， Ed. ， vol. 2， p. 171-189(1999)中的E. Boschetti，用于生物層析和生物醫學的微球體，第一篇，微珠的制備，在此引入作為參考)。微球體的制備是從含有膠原(明膠是一種變性膠原)等粘著劑的單體水溶液開始。然后將該溶液與一種非水相容性溶劑混合，以產生一種微滴懸液，再用適當的催化劑經過單體聚合作用使其轉變成固體凝膠。然后用過濾或離心方法收集微球體并清洗。
將細胞粘連促進劑或標記制劑引入微球體的方法可以是親和層析技術中眾所周知的化學耦聯法，該方法被稱為"配體固定化法"。另一種引入方法是在組成微球體的凝膠網絡中進行擴散，然后用沉淀或化學交聯法原位捕獲擴散的分子。 本發明的微球體還可以用該領域描述的標準聚合方法來加以制備，如法國專利2， 378， 808以及美國專利5， 648， 100、5， 635， 215和5， 648， 100，這些專利均在此引入作為參考。 一般而言，在含有聚合反應引發劑的條件下，溶液中的單體聚合是在約Ot: -IO(TC以及約40°C -6(TC溫度下進行的。 選自氧化還原系統的聚合反應引發劑具有其自身的優勢。值得注意的是，還可以使用N， N， N'， N' _四甲基乙二胺或二甲氨基丙烯腈、有機過氧化物如芐基過氧化物或者甚至2，2'-偶氮-雙-異丁腈，與堿金屬過硫酸鹽的組合物。該領域的技術人員可根據單體量和設定的聚合速率來調整引發劑的使用量。聚合反應可以在團塊或乳劑中進行。
在進行團塊聚合反應時，可以使引發劑與含有不同溶解成分的水基溶液在均質介質中發生聚合。這樣可獲得塊狀水樣凝膠，然后可將其分割成微球體，方法是，例如，使其穿過網篩。 優選的制備方法是進行乳劑或懸液聚合，因為該方法可直接獲得所需尺寸的微球體。其實施方法如下將含有不同溶解成分(如不同單體、細胞粘著劑)的水基溶液與一種不與水互溶的液態有機相攪拌混合，此外還可以選擇性地在乳化劑存在的條件下進行。調節攪拌速率，以使水相乳劑在有機相中形成所需直徑的微滴。然后加入引發劑以啟動聚合反應。該反應伴隨有放熱反應，因而可通過測量反應介質的溫度來跟蹤反應的進展情況。
還可以用植物油或礦物油、特定石油蒸餾產物、氯化烴或其混合物作為有機相。此外，當聚合引發劑包含多種成分(氧化還原系統)時，可以在乳化之前將其中的一種添加到水相中。
由此獲得的微球體可通過冷卻、傾析和過濾方法加以回收。然后按尺寸類別將其進行分離，并進行清洗，以去除任何痕量的副產物。 聚合反應期的跟蹤方法可以是跟蹤細胞粘著劑的網狀形成期，對合成之后再通過接合而獲得可識別性的微球體而言，也可根據標記制劑期進行跟蹤。
4. 2生物活性治療因子 本發明的生物活性治療因子至少包括以下的一種或多種抗瘤劑、抗血管發生劑、激素和類固醇、維生素、肽和肽類似物、抗體或其片段、抗有絲分裂因子、疫苗、酶、抗過敏劑、循環系統藥物、抗結核劑、抗病毒劑、抗心絞痛劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗炎劑、抗原生動物劑、抗風濕劑、麻醉劑、強心苷、鎮靜劑、局部麻醉劑、抗組胺藥、輻射敏感劑、全身麻醉劑，或其組合。 4.3用于在基因療法中使用的生物活性治療因子 對基于多核苷酸的栓塞性基因療法而言，使用的多核苷酸可以編碼本發明的任一種生物活性治療因子，其中，這些多核苷酸與本發明的一種轉染劑相結合。編碼本發明所述生物活性治療因子的遺傳物質包括，例如，但不局限于，天然的或合成的核酸、多核苷酸、RNA和DNA，其中包括重組RNA和重組DNA以及反義RNA和反義DNA ;錘頭狀RNA、核酶、反義核酸，單鏈和雙鏈的RNA和DNA，及其類似物，如脫氧核苷酸硫代磷酸酯和脫氧核苷酸二硫代磷酸酯。可使用的遺傳物質的類型包括，例如，質粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色體、缺陷型病毒或"輔助"病毒等表達載體上攜帶的基因，以及帶有遺傳物質的病毒樣顆粒。這些多核苷酸還可以與其他元件結合使用，其中包括，例如，組織特異性增強子、核定位信號等，但不局限于此。 此外，這些遺傳物質還可結合于，例如，蛋白或其他聚合物。例如在一項實施方案中，本發明還提供將定向多克隆抗體和定向單克隆抗體與聚合物載體、生物活性治療因子和轉染劑結合使用的方法。適用于本發明所述微球體的基因治療劑的實例包括，至少編碼部分HLA基因的DNA、至少編碼部分營養障礙基因的DNA、至少編碼部分囊性纖維化穿膜調節基因的DNA、至少編碼部分IL-2基因的DNA、至少編碼部分TNF的DNA、能夠與至少編碼部分Ras的DNA結合的反義寡核苷酸。在多種不同類型疾病的治療中都可以使用編碼特定蛋白的DNA。例如，腫瘤壞死因子和(或)白介素-2可用于治療早發癌癥；HDL受體可用于治療肝臟疾病；胸腺嘧啶激酶可用于治療卵巢癌、腦癌或HIV感染；HLA-B7可用于治療惡性黑素瘤；白介素-2可用于治療成神經細胞瘤、惡性黑素瘤或腎癌、白介素-4可用于治療癌癥；HIV包膜蛋白可用于治療HIV感染；反義ras/p53可用于治療肺癌；腺苷脫氨酶可用于治療ADA缺陷；而因子VIII可用于治療B型血友病。可參閱，例如，Science 258,744-746。
4. 4用于在藥物療法中使用的生物活性治療因子 對本發明的基于藥物的栓塞治療而言，可使用的生物活性治療因子包括一種或多種與微球體結合的下述制劑。 抗瘤劑，其中包括，例如，但不局限于，鉬化合物(如螺鉑、順鉑和卡鉑)、阿霉素、絲裂霉素C、ansamitocin、博來霉素、硫酸博來霉素、阿糖胞苷、阿糖腺苷、硫酸酰聚賴氨酸、長春新堿、白消安、苯丁酸氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥(如PAM、L-PAM或苯丙氨酸氮芥)、巰基嘌呤、米托坦、鹽酸丙卡巴肼、放線菌素(放線菌素D)、鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、紫杉醇、絲裂霉素、普卡霉素(光輝霉素)、氨魯米特、雌莫司汀磷酸鹽、氟他胺、亮丙瑞林醋酸鹽、甲地孕酮醋酸鹽、他莫昔芬枸櫞酸鹽、睪內酯、曲洛司坦、安吖啶(m-AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)、Erwina天冬酰胺酶、依托泊苷(VP-16) 、 a -2a干擾素、a -2b干擾素、替尼泊苷(VM-26)、長春堿硫酸鹽(VLB)、長春新堿硫酸鹽、氨甲蝶呤，以及carzelesin 。
血液產物，其中包括，例如，但不局限于，促紅細胞生成素、胃腸外離子、氯高鐵血紅素和血嚇啉，及其衍生物。 生物學應答調節物，其中包括，例如，但不局限于，胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、淋巴
因子(如脂多糖、巨噬細胞活化因子等細菌內毒素)、細菌亞單位(如分支桿菌、棒狀桿
菌)、合成的二肽、N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺，以及前列腺素。 抗真菌劑，其中包括，例如，但不局限于，酮康唑、制霉菌素、灰黃霉素、氟胞嘧啶
(5-fc)、雙氯苯咪唑、兩性霉素B、蓖蔴毒素，以及13 _內酰胺類抗生素(如磺胺凈素)。 激素和類固醇，其中包括，例如，但不局限于，生長激素、促黑素細胞激素、促腎上
腺皮質激素、地塞米松、醋酸地塞米松、磷酸鈉地塞米松、可的松、醋酸可的松、氫化可的松、
醋酸氫化可的松、氫化可的松環戊丙酸酯、磷酸鈉氫化可的松、氫化可的松琥珀酸鈉、強的
松、強的松龍、醋酸強的松龍、磷酸鈉強的松龍、強的松龍叔丁乙酯、強的松龍特戊酸酯、曲
安西龍、曲安奈德、己曲安西龍、曲安西龍雙醋酸酯、甲基強的松、醋酸甲基強的松、甲基強
的松琥珀酸鈉、氟尼縮松、二丙酸氯地米松、磷酸鈉氯地米松、倍他米松、磷酸二鈉維他米
松、磷酸鈉維他米松、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸二鈉、醋酸氯潑尼松、皮質酮、去氧皮質
酮、醋酸去氧皮質酮、去氧皮質酮特戊酸酯、去氧米松、雌二醇、氟甲松龍、醋酸氟甲松龍、醋
酸二氯松、氟氫可的松、氟米龍、氟潑尼龍、帕拉米松、對氟米松醋酸酯、雄甾酮、氟甲睪酮、
醛甾酮、去氫甲睪酮、甲雄烯二醇、甲睪酮、諾乙雄龍、睪酮、庚酸睪酮、丙酸睪酮、去氫馬烯
雌酮、馬烯雌酮、雌二醇苯甲酸酯、雙丙酸雌二醇、雌三醇、雌酮、雌酮苯甲酸酯、乙酰氧基孕
烯醇酮、醋酸阿那孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸氟孕酮、羥甲基孕酮、醋酸羥甲基孕酮、羥基孕
酮、醋酸羥基孕酮、羥基孕酮己酸酯、醋酸美侖孕酮、炔諾酮、孕烯醇酮、孕酮、乙炔雌二醇、
美雌醇、二甲炔睪酮、炔孕酮、雙醋炔諾醇、炔諾酮、炔諾酮醋酸酯、炔諾酮、氟西奈德、氟氫
縮松、氟尼縮松、氫化可的松琥珀酸鈉、琥鈉甲強龍、強的松龍磷酸鈉、曲安奈德、羥二酮琥
鈉螺內酯、氧雄龍、羥甲烯龍、丙甲松龍、環戊丙酸睪酮、苯乙酸睪酮、環戊丙酸雌二醇，以及
異炔諾酮。 維生素，其中包括，例如，但不局限于，維生素B12 neinoic acid、視黃醛及其衍生物，如維生素A棕櫚酸酯、a -維生素E、萘醌、維生素D3、維生素B及四氫葉酸。
肽和肽類似物，其中包括，例如， 不局限于，錳超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)、谷胱甘肽、胰島素、多巴胺、包含RGD、 AGD、 RGE、 KGD、 KGE或KQAGDV的肽類配基(與GPIIBIIIa受體具有親和性的肽)、鴉片肽、腦啡肽、內啡肽及其類似物、人類絨毛膜促性腺激素(HCG)、促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)、膽囊收縮素及其類似物、緩激肽及其類似物和促進劑及抑制劑、彈力蛋白、加壓素、胃蛋白酶、胰高血糖素、P物質、整合蛋白、硫甲丙脯酸、依那普利、賴諾普利及其他ACE抑制劑、促腎上腺皮質激素(ACTH)、催產素、降鈣素、IgG或其片段、IgA或其片段、IgM或其片段、效應細胞蛋白酶受體的配基(所有亞類)、凝血酶、鏈激酶、尿激酶、t-PA及其所有活性片段或類似物、蛋白激酶C及其結合配基、干擾素(a-干擾素、P-干擾素、Y-干擾素)、集落剌激因子(CSF)、粒細胞集落剌激因子(GCSF)、粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、神經生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子、淋巴毒素、上皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、促紅細胞素、轉化生長因子、制瘤素M、白介素(1，2，3，4，5，6，7，S，9，10，ll和12)、金屬蛋白激酶配基、膠原酶，及其激動劑和拮抗劑。 文中使用的抗體包括，例如，但不局限于，基本純化的抗體或其片段，其中包括非人類抗體或其片段。在多項實施方案中，本發明的基本純化的抗體或其片段可以是人類抗體、非人類抗體、嵌合抗體和(或)人源化抗體。其中的非人類抗體可以是山羊抗體、小鼠抗體、綿羊抗體、馬抗體、雞抗體、兔抗體，或鼠抗體。作為選擇，本發明的非人類抗體還可以是嵌合抗體和(或)人源化抗體。在治療人類患者時，尤其需要完全的人類抗體。嵌合抗體是一種分子，其中的不同部分來自不同種動物，如含有鼠mAb可變區和人免疫球蛋白穩定區的嵌合抗體(Cabilly etal.，美國專利4， 816， 567 ;和Boss et al.，美國專利4， 816397，在此完整引入作為參考。)此外，在本發明范圍內的非人類抗體還可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明的任一種抗體都可以與一種治療性部分或可檢測物質相結合。能與本發明的抗體結合的可檢測物質的非限制性實例包括酶、輔基、熒光物質、發光物質、生物發光物質和放射性物質。 本發明提供與聚合物載體、生物活性治療因子和轉染劑結合的定向多克隆抗體及定向單克隆抗體的應用。這些抗體可有效地在本發明的方法中使用，并能夠將結合于轉染劑的聚合物和生物活性治療因子定向遞送至作用部位。文中使用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指一類抗體分子，這些抗體分子只含有一種能夠與特定表位發生免疫反應的抗原結合部位。多克隆抗體的制備方法可以是，按照上文的描述用本發明的一種多肽作為免疫原對適當的主體進行免疫。優選的多克隆抗體組合物選自針對本發明的一種或多種多肽的抗體，這些多肽包括，例如，用本發明的組合物進行治療的腫瘤的癌細胞表面的一種受體。 抗有絲分裂因子，其中包括，但不局限于，雌莫司汀及其磷酸化衍生物、雌莫司汀磷酸鹽、阿霉素、amphethinile、 combretastatin A4，以及秋水仙素。 疫苗，其中包括，例如，但不局限于，肺炎球菌疫苗、脊髓灰質炎疫苗、炭疽熱疫苗、
結核(BCG)疫苗、甲型肝炎疫苗、霍亂疫苗、腦膜炎球菌A、C、Y疫苗、W135疫苗、鼠疫疫苗、狂
犬病(人類二倍體)疫苗、黃熱病疫苗、日本腦炎疫苗、傷寒(苯酚滅活和熱滅活的)疫苗、
乙肝疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、灰質炎疫苗、麻疹疫
苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、水痘疫苗、肺炎鏈球菌Ty (活體突變菌)疫苗、Vi (Vi莢膜多糖)
疫苗、DT(類毒素)疫苗、Td(類毒素)疫苗、aP(滅活的細菌抗原/非細胞的(accelular)
(DtaP))疫苗、Hib(細菌多糖-蛋白結合物)疫苗、乙肝病毒(來自病毒抗原/重組抗原
的滅活血清)疫苗、流感疫苗、輪狀病毒疫苗、呼吸道合胞體病毒(RSV)疫苗、人星狀病毒疫
苗、輪狀病毒疫苗、人類A型及B型流感病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、減毒的活體3型副流感病
毒疫苗、腸道病毒疫苗、逆轉錄病毒疫苗，以及細小核糖核酸病毒疫苗。 能夠用本發明的組合物和方法進行治療的疾病包括，例如，但不局限于，與肝、腎
有關的腫瘤、急性淋巴細胞白血病、急性髓樣白血病、尤因肉瘤、妊娠滋養層癌、霍奇金氏
病、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、彌散性大細胞淋巴瘤、卵泡性混合淋巴瘤、淋巴細胞
淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、睪丸癌、腎母細胞瘤、肛門癌、膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、
慢性骨髓性白血病、毛細胞白血病、頭頸癌 肺(小細胞性)癌、多發性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵泡性淋巴瘤、卵巢癌、腦瘤(星細胞瘤)、頸癌、結腸癌、肝細胞癌、卡波西肉瘤、肺(非小細胞性)癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、乳腺癌、結腸癌(第III期)、骨源性肉瘤、卵巢癌(第III期)、睪丸癌，或其組合。 酶，其中包括，例如，但不局限于，堿性磷酸酶、I型環加氧酶，及其激動劑和拮抗劑。 抗過敏劑，其中包括，例如，但不局限于，氨氯地平。
抗凝劑，其中包括，例如，但不局限于，苯丙香豆醇和肝素。
循環系統藥物，其中包括，例如，但不局限于，心得安。 抗結核劑，其中包括，例如，但不局限于，對氨基水楊酸、異煙肼、巻曲霉素硫酸鹽、
環絲氨酸、乙胺丁醇鹽酸鹽、乙硫異煙胺、吡嗪酰胺、利福平，以及鏈霉素硫酸鹽。 抗病毒劑，其中包括，例如，但不局限于，阿昔洛韋、金剛烷胺、疊氮胸苷(AZT或
Zidovudine)、三唑核苷，以及一水阿糖腺苷(腺嘌呤阿糖腺苷，ara-A)。 抗心絞痛劑，其中包括，例如，但不局限于，硫氮卓酮、利心平、異搏停、丁四硝酯、
硝異梨醇、硝酸甘油(三硝酸甘油酯)，以及季戊四醇四硝酸酯。 抗生素，其中包括，例如，氨苯砜、氯霉素、新霉素、頭孢氯氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢氨芐、頭孢拉定、紅霉素、氯林可霉素、林可霉素、阿莫西林、氨芐青霉素、巴氨西林、羧芐青霉素、雙氯青霉素、環青霉素、哌氯青霉素、縮酮氨芐青霉素、甲氧苯青霉素、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、青霉素G、青霉素V、羥噻吩青霉素、利福平，以及四環素。 抗炎劑和鎮痛劑，其中包括，例如，二氟苯水楊酸、布洛芬、噴哚美辛、甲氯滅酸鹽、甲滅酸、萘普生、羥基保泰松、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、阿司匹林及其水楊酸鹽。
抗原生動物劑，其中包括，例如，但不局限于，氯喹、甲消唑、羥基氯喹、奎寧，以及
銻酸葡胺。 抗風濕劑，其中包括，例如，但不局限于，青霉胺。 麻醉劑，其中包括，例如，但不局限于，復方樟腦酊及鴉片制劑，如可待因、海洛因、非那酮、嗎啡和鴉片。 強心苷，其中包括，例如，但不局限于，去乙酰毛花苷、洋地黃毒苷、地高辛、洋地黃苷和洋地黃。 神經肌肉阻斷劑，其中包括，例如，但不局限于，阿曲庫銨甲磺酸鹽、三碘季銨酚、己芴溴銨、碘甲箭毒、泮庫溴銨、氯化琥珀酰膽堿(氯琥珀膽堿)、氯化筒箭毒堿，以及維庫溴銨。 鎮靜劑(催眠劑)，其中包括，例如，但不局限于，異戊巴比妥、異戊巴比妥鈉、烯丙異丙巴比妥、仲丁巴比妥鈉、水合氯醛、乙氯叔醇、炔己蟻胺、鹽酸氟安定、導眠能、鹽酸甲氧異丁嗪、甲乙哌啶酮、咪達唑侖鹽酸鹽、三聚乙醛、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、苯巴比妥鈉、司可巴比妥鈉、甲丙巴比妥、替馬西泮，以及三唑侖。 局部麻醉劑，其中包括，例如，但不局限于，雅布必卡因鹽酸鹽、氯普魯卡因鹽酸鹽、依替卡因鹽酸鹽、鹽酸利多卡因、甲哌卡因鹽酸鹽、普魯卡因鹽酸鹽，以及丁卡因鹽酸
^! . o 全身麻醉劑，其中包括，例如，但不局限于，氟哌利多、甲芐咪唑、含氟哌利多的枸櫞酸芬太尼、鹽酸氯胺酮、美索比妥鈉，以及硫噴妥鈉。
放射性顆粒或放射性離子，其中包括，例如，但不局限于，鍶、錸、釔、锝和鈷。
優選的生物活性治療因子是一種抗瘤劑、激素、類固醇、抗真菌劑、肽或肽類似物。 更優選的生物活性治療因子為氟美松、兩性霉素B、阿德里亞霉素、絲裂霉素C、紫杉酚、阿 霉素或組織纖溶酶原激活劑(t-PA)。優選的是本發明的生物活性治療因子在低濃度下具 有高活性。此外，本發明提供的涉及定向的方面還能夠使體內治療部位的有效濃度不被稀 釋，因而可以在治療中使用更低的劑量。將本發明所述生物活性治療因子向患者給藥的劑 量取決于，例如，采用的特定生物活性治療因子及其給藥方法，以及患者的年齡、性別、體重 和生理狀況。 一般而言，可以在治療初期采用小劑量，然后再小量增加，直到在特定情況下 獲得所需的效果。此外，該領域的技術人員還可以根據參考文獻，如《Physician' sDesk Reference》，Medical Economics Company, Montvale， N. Y. 07645-1742，來確定特定生物活 性治療因子的適當劑量，以及在通過本發明的方法組合使用治療藥物和基因療法時，將本 發明的相應藥物前體給藥于患者的劑量。根據本發明，還可以將藥物前體給藥于患者(如 患者的某個區域)，從而用于，例如，治療患者的病情(即病態、疾病、病癥，等等)。藥物前 體可以按上述方法使用，也可以組合到其他實施方案中，如乳劑。
4. 5用于遞送多核苷酸的轉染劑 通過傳統的轉化或轉染技術可以在真核細胞內弓|入含有天然的或合成的核酸、多 核苷酸、RNA和DNA的遺傳物質，其中包括重組RNA和重組DNA以及反義RNA和反義DNA ;錘 頭狀RNA、核酶、反義基因核酸，單鏈和雙鏈的RNA和DNA，及其類似物，這些遺傳物質可以與 其他元件結合或不結合，其中包括，例如，組織特異性增強子以及核定位信號，但不局限于 此。此處使用的術語"轉化"和"轉染"是指該領域已知的用于將外源核酸導入宿主細胞的 多種技術，其中包括，例如，但不局限于，磷酸鈣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖介導的轉 染、脂質轉染或電穿孔。在Sambrook，et al.(見上文)和其他實驗室手冊中可以查閱到轉 化或轉染宿主細胞的適當方法。 已知對哺乳動物細胞進行穩定轉染時，只有小部分細胞能夠將外源DNA整合到基 因組中，具體的量將取決于使用的表達載體和轉染技術。為了鑒定和篩選這些整合體，通常 是將一種編碼選擇性標記的基因(如抗生素抗性基因)與目的基因一同引入到宿主細胞 內。優選的選擇性標記包括能夠賦予抗藥性的標記，如G418抗性、潮霉素抗性和氨甲蝶呤 抗性。通過藥物篩選可以鑒定出被引入核苷酸穩定轉染的細胞(例如，帶有選擇性標記基 因的細胞將會存活，其他細胞則會死亡)。 為了在體內有效地遞送本發明的生物活性治療組合物，可以采用多種轉染劑。 適于在本發明的方法中使用的轉染劑的代表性實例包括，但不局限于，磷酸鈣或氯化鈣 共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、季胺兩親性DOTMA((二油酰氧丙基)溴化三甲銨，由 GIBC0-BRL公司生產，商品名為Lipofectin) (Feigner et al， (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84,7413-7417 ;Malone et al. (1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA86, 6077—6081)); 帶有三甲銨懸垂頭的親脂性谷氨酸二酯(Ito et al. (1990)Biochem,Biophys.Acta 1023,124-132);可代謝的母體脂，如陽離子脂雙-十八烷基氨基甘氨酰精胺(D0GS， Trandf ectam， Promega)和二棕櫚酰磷酯酰乙醇戊基精胺(DPPES) (J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27，5861—5864 ;J.P.Behr et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86， 6982-6986);可代謝的季銨鹽(D0TB，甲基硫酸N_(l_[2， 3-二油酰氧]丙基)-N， N， N_三甲銨(DOTAP) (Boehringer Mannheim)、聚乙烯亞胺(PEI) 、 二油酯、ChoTB、 ChoSC、 DOSC) (Leventis etal. (1990) Biochim. Inter. 22， 235-241) ;3P [N_ (N'， N'-二甲氨基乙烷)-氨 基甲酰]膽固醇(DC-Chol)、二油酰磷脂酰乙醇胺(D0PE)/3P [N-(N'， N' -二甲氨基乙 烷)-氨基甲酰]膽固醇(DC-Choi)的l : l混合物(Gao et al. ， (1991)Biochem. Biophys. Acta 1065,8-14)，精胺、亞精胺、脂多胺(Behr et al. ， Bioconj卿te Chem，1994，5: 382-389)，親脂性聚賴氨酸(LPLL) (Zhou et al. ， (1991) Biochem. Biophys. Acta939， 8-18)，含有過量磷酯酰膽堿/膽固醇的[[(1，1，3，3-四甲基丁基)甲苯氧基]乙氧基]乙 基)二甲基節基氫氧化銨(DEBDA氫氧化物)(Ballas et al. ， (1988)Biochem. Biophys. Acta 939,8-18)，溴化鯨蠟基三甲銨(CTAB)/D0PE的混合物(Pinnaduwage et al. ， (1989) Biochem. Biophys. Acta985， 33-37)，谷氨酸(TMAG)與D0PE、 CTAB、 DEBDA的親脂性二酯、 雙十二烷基溴化銨(DDAB)以及硬酯胺與磷酯酰乙醇胺的混合物(Rose et al. ， (1991) Biotechnique 10,520-525) ， DDAB/D0PE (TransfectACE， GIBC0 BRL)，以及帶有脂質的寡聚 半乳糖(Remy etal.，待發表)。 本發明還包括利用多種轉染促進劑來提高將生物活性治療因子遞送至細胞的效 率。適當的轉染促進劑包括，例如，但不局限于，DEAE-葡聚糖、polybrene、溶酶體-分裂性 妝(0hmori N I et al. ， Biochem. Biophys. Res. Commun 1997 Jun 27,235(3) :726-9)，基 于軟骨素的蛋白多糖、硫酸蛋白多糖、聚氮丙啶、聚賴氨酸(Pollard H et al. J Biol Chem， 1998273(13) :7507-11)、整合蛋白結合肽CYGGRGDTP、非糖類線性葡聚糖、甘油、連接寡核 苷酸3'-端的核苷間膽固醇基團(Letsinger， R. L. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: (17) :6553-6)、溶血磷酯、溶血磷酯酰膽堿、溶血磷酯酰乙醇胺，以及1-油基溶血磷酯酰膽 堿。 適當轉染劑的優選實例包括，但不局限于，在1992年12月15日授予Behr， et al.的美國專利5， 171，678、1995年12月19日授予Behr， etal.的美國專利5， 476， 962以 及1997年4月1日授予Behr，et al.的美國專利5， 616， 745中公開的脂多胺，這些專利的 全部公開內容均在此完整引入作為參考。 本發明的特別優選的轉染劑包括在1992年12月15日授予Behr， etal.的美國專 利5， 171， 678、 1995年12月19日授予Behr，et al.的美國專利5， 476， 962以及1997年4 月1日授予Behr，et al.的美國專利5， 616， 745中公開的通式(I)的脂多胺。
通式(I)的脂多胺尤其適用于作為轉染真核細胞的載體。當通式(I)的脂多胺分 散在水中時可以形成單層超微顆粒，這些顆粒在離子介質中不穩定，并且可通過其陽離子 部分與質粒或寡核苷酸DNA緊密結合，從而壓縮質粒或寡核苷酸DNA并將其包裹在脂質層 中。通過使用相對于核苷酸過量的正電荷可以使脂質/DNA復合物吸附在細胞膜上，從而使 DNA易于被細胞攝取。 此外，通式(I)的這些脂多胺還可用于轉染脆弱細胞(其中包括，例如，但不局限 于，中間垂體細胞或前垂體細胞、嗜鉻細胞、周圍或中樞神經元)，這些細胞不能用傳統方法
(磷酸鈣共沉淀或葡聚糖技術)進行轉染。
4. 6重組表達載體 另一方面，本發明涉及遞送具有或不具有栓塞作用的載體。優選的是這些表達載 體含有一種編碼本發明所述生物活性治療因子或多肽(或其部分)的核酸。此處使用的術語"載體"是指一種核酸分子，這種核酸分子能夠轉運與其連接的另一種核酸。 一類載體為 "質粒"，它是指能夠連接附加DNA片段的一種雙鏈環狀DNA袢。另一類載體為病毒載體，其 中的附加DNA片段可結合到病毒基因組中。病毒載體的具體實例包括，但不局限于，用于通 過本發明的微球體和轉染劑進行基因治療的腺病毒和逆轉錄病毒。本發明還涉及含有生物 活性治療因子的病毒樣顆粒的應用，其中的病毒樣顆粒與轉染劑物理連接，轉染劑又連接 于微顆粒。本發明還涉及含有生物活性治療因子的病毒樣顆粒的應用，其中的病毒樣顆粒 與轉染劑物理連接，轉染劑又連接于微顆粒。這些病毒樣顆粒可以用聚氮丙啶(PEI)經二 硫鍵形成而連接于整合蛋白結合肽CYGGRGDTP。這些PEI/RGD包含肽/復合物具有腺病毒 的結構特性，如大小和以及受保護的中心核，此外還具有腺病毒的"早期"特性，例如由整合 蛋白介導的細胞進入以及酸觸發的內體逃逸(Erbacher et al.，待發表)。
某些載體能夠在導入的宿主細胞中自主復制(如具有細菌復制起始點的細菌載 體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(如非附加型哺乳動物載體)則能夠在導入宿主細 胞后整合到細胞的基因組中，從而與宿主基因組共同復制。此外，某些載體，即表達載體，能 夠指導與其有效連接的基因的表達。 一般而言，重組DNA技術通常是以質粒(載體)作為 表達載體。但本發明還應包括其他形式的具有類似功能的表達載體，如病毒載體(如復制 缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。 本發明的重組表達載體含有本發明的一種適于在宿主細胞內表達的核酸。這說明 該重組表達載體含有一種或多種根據用于表達的宿主細胞而選定的調控序列，這些序列有 效連接于待表達的核酸序列。在重組表達載體中，"有效連接"是指目的核苷酸序列連接于 調控序列，其連接方式能夠使該核苷酸序列表達(例如在體外轉錄/翻譯系統中，或將載體 引入到宿主細胞中)。術語"調控序列"應包括啟動子、增強子和其他表達調控元件(如多 腺苷酸化信號)。有關這些調控序列的描述可參考，例如，Goeddel，《基因表達技術酶學方 法》185，Academic Press, SanDiego， CA (1990)。調控序列包括在多種類型的宿主細胞中指 導核苷酸序列組成型表達的調控序列，以及只在特定宿主細胞中指導核苷酸序列表達的調 控序列(如組織特異性調控序列)。該領域的技術人員都會了解，表達載體的設計取決于某 些因素，如選擇用于轉化的宿主細胞、預期的蛋白表達水平，等等。本發明的表達載體可以 被引入宿主細胞，并由此產生上述核苷酸所編碼的蛋白或肽，其中包括融合蛋白或肽。
本發明的重組表達載體經過設計可用于在原核細胞(如E. coli)或真核細胞(如
昆蟲細胞(采用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞)中表達本發明的多肽。有 關適當宿主細胞的進一步論述可參考Goeddel，見上文。作為選擇，還可以將重組表達載體 進行體外轉錄和翻譯，如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。 在另一項實施方案中，本發明的核酸是通過哺乳動物表達載體在哺乳動物 細胞中表達。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329 :840)和 pMT2PC(Kaufman et al. (1987)EMB0 J. 6 :187-195)。當在哺乳動物細胞中使用時，對這些 表達載體的調控功能通常可以用病毒調控元件來實現。例如，常用的啟動子是來自多瘤病 毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿病毒40的啟動子。有關適用于原核及真核細胞的其他適當表 達載體，可參閱上文Sambrook et al.的第16和第17章。 在另一項實施方案中，哺乳動物重組表達載體能夠指導核酸的表達，優選的是在 特定細胞類型中指導核酸的表達(例如用組織特異性調控元件來表達核酸)。組織特異性調控元件已為該領域所了解。適當的組織特異性啟動子的實例包括，但不局限于，白蛋 白啟動子(肝特異性；Pinkert et al. (1987)Genes Dev. 1 :268-277)、淋巴特異性啟動子 (Calame和Eaton (1988) Adv. I匪mol. 43 :235-275)，特別是T細胞受體的啟動子(Winoto and Baltimore (1989)EMBO J. 8 :729-733)和免疫球蛋白的啟動子(Baner ji et al. (1983) Cell 33 :729-740 ;Queen andBaltimore (1983) Cell 33 :741-748)，神經元特異性啟動子 (如神經纖維啟動子；Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :5473-5477)、 胰特異性啟動子(Edlund et al. (1985) Science230 :912-916)、前列腺特異性啟動子和 (或)增強子(美國專利5， 830， 686和5， 871， 726，其全部內容在此完整引入作為參考)， 以及乳腺特異性啟動子(如乳清啟動子；美國專利4， 873， 316和歐洲專利申請264， 166)。 此外還包括發育調控啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379)和a-胎蛋白啟動子(Campes and Tilghman(1989)Genes Dev. 3 :537-546)。
本發明還提供一種包含本發明所述DNA分子的重組表達載體，其中的DNA分子以 反義方向被克隆到表達載體中。也就是說，該DNA分子與一種調控序列有效連接，其連接方 式可用于表達一種與編碼指定多肽的mRNA反義的RNA分子(通過DNA分子的轉錄)。
與反義核酸有效連接的調控序列可選自能夠在多種細胞類型中指導反義RNA分 子持續表達的調控序列，如病毒啟動子和(或)增強子，這些調控序列還可以選自能夠指導 反義RNA進行組成型表達、組織特異性表達或細胞類型特異性表達的調控序列。反義表達 載體可以是重組質粒、噬菌粒或減毒病毒，其中，反義核酸的產生是在高效調控區的控制下 進行，該調控區的活性是由引入載體的細胞類型所決定。關于利用反義基因來調控基因表 達的論述可參閱Weintraub et al. (Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986)。
作為本發明的一方面，對多種癌癥進行治療的方法可以是，在帶有組織特異性增 強子和(或)啟動子的DNA模板上提供一種毒素基因，從而使該基因在腫瘤細胞內集中表 達。毒素基因包括，例如，但不局限于，白喉毒素基因。白喉毒素在細胞內的表達可以殺死細 胞。可以使用一些組織特異性啟動子，如針對胰腺癌使用胰特異性啟動子。而遞送到胰腺 細胞內的功能性白喉毒素基因理論上可以清除整個胰腺。這種策略可用于治療胰腺癌。該 組織特異性增強子可確保白喉毒素只在胰腺細胞中表達。含有受組織特異性增強子調控的 白喉毒素基因的DNA/脂多胺/微球體復合物可以通過插管直接引入滋養胰腺的動脈。在 需要根除胰腺組織的情況下，可按照一些給藥計劃表進行灌注。白喉毒素以外的其他一些 致死基因也具有類似的效應，如蓖蔴毒素基因、眼鏡蛇毒素因子基因或腸毒素基因。
另一具體實例是用前列腺特異性抗原啟動子/增強子來指導本發明的生物活性 治療因子在需要治療的前列腺癌患者的前列腺中表達。此外還可以對特化癌癥進行治療， 方法是遞送一些能夠抑制特定癌癥的癌性狀的基因，例如，但不局限于，p53基因、視網膜母
細胞瘤基因(以及該基因家族的其他基因)。
4.7腺病毒介導的基因導入 帶有缺失的腺病毒被認為是用于基因治療的適當載體。腺病毒屬于無包膜DNA病 毒。源于腺病毒的基因導入載體(稱為腺病毒載體)具有許多使其特別適用于這種基因導 入的特性。例如，已詳細了解了腺病毒的生物學特性，腺病毒不涉及嚴重的人類疾病，該病 毒能夠非常高效地將其DAN導入宿主細胞，該病毒可感染多種細胞，并且有廣泛的宿主范 圍，能夠較容易地大量制備該病毒，尤其是可通過病毒基因組中早期區l(El)的缺失使該病毒成為復制缺陷型。 腺病毒基因組是一種約36， 000個堿基對的線性雙鏈DNA分子，每條DNA鏈的5' 末端與55-kDa的末端蛋白共價結合。Ad DNA含有相同的末端反向重復序列(ITRs)，該序 列為約IOO個堿基對，其確切程度則取決于血清型。病毒的復制起始點精確定位在基因組 末端的ITRs中。DNA的合成分為兩個階段。首先是通過鏈置換進行復制，并產生一條子代 雙鏈分子和一條親本置換鏈。置換鏈為單鏈，并且可形成所謂的"鍋柄狀"中間體，該中間 體能起始復制并產生子代雙鏈分子。此外，復制也可以從基因組的兩頭同時進行，從而無需 形成鍋柄結構。 在生產性感染周期中，病毒基因的表達分為兩個時期早期和晚期，早期是指病毒 DNA復制之前的時期，晚期則始于病毒DAN復制。在早期只表達由El、 E2、 E3和E4區編碼 的早期基因產物，這些產物具有使細胞準備合成病毒結構蛋白的多種功能(Berk， 1986)。在 晚期，除早期基因產物之外還可以表達晚期病毒基因產物，并且宿主細胞的DNA合成和蛋 白合成都被關閉。其結果是使細胞致力于生產病毒DNA和病毒結構蛋白(Tooze，1981)。
腺病毒有多種血清型，其結構和性質略有差異。在這些血清型中，優選的是在本發 明的范圍內使用2型或5型人類腺病毒(Ad2或Ad5)，或動物源性腺病毒(參考專利申請 W094/26914，其公開內容在此完整引入作為參考)。在能夠用于本發明的動物源性腺病毒 中，可以考慮來源于犬、牛、鼠(例如Mavl， Beard et al. ， Virology 75 (1990) 81)、綿羊、 豬或鳥的腺病毒，也可以選擇來源于猴的腺病毒(例如SAV)。優選的動物源性腺病毒為犬 腺病毒，更優選的為CAV-2腺病毒〔如Manhattan或A26/61毒株(ATCC VR-800)〕。優選的 是在本發明的方法中使用來源于人或犬或混合來源的腺病毒。 用于在本發明的方法中使用的缺陷型重組腺病毒可通過該領域技術人員已知的 任一種技術加以制備(Levrero et al. ， Gene 101(1991) 195， EP 185573 ;Graham， EMB0 J. 3(1984)2917)。具體的說，其制備方法可以是在腺病毒和一種質粒，尤其是帶有一種包含 目的基因的序列盒的質粒，之間進行同源重組。將腺病毒和質粒共轉染到適當細胞系內，之 后即可發生同源重組。優選的細胞系應該(i)能被上述元件轉化，并且(ii)含有能補充腺 病毒基因組缺陷部分的序列，優選的是整合形式的序列，以避免重組的危險。細胞系的實例 包括人胚胎腎細胞系293 (Graham et al. ， J. Gen. Virol. 36 (1977) 59)，該細胞系的獨特之 處是其基因組中整合了 Ad5腺病毒基因組的左側部分(12% )。在專利申請W094/26914和 FR 2，707，664中描述了腺病毒載體的構建策略，這些專利均在此完整引入作為參考。
4.8逆轉錄病毒顆粒介導的基因導入 逆轉錄病毒載體是哺乳動物的基因導入工具，這些載體充分利用了逆轉錄病毒復 制周期的特性，如高感染效率以及能夠把病毒傳遞的信息穩定地共線性整合到靶細胞的染 色體中。逆轉錄病毒載體日益成為基礎研究、生物技術和基因治療領域中的重要工具。
目前使用的大多數逆轉錄病毒載體都來源于鼠白血病病毒(MLVs)。由于MLVs在 不同細胞類型中的轉錄模式都有詳細的記載，并且其組合式遺傳結構相對簡單，因而尤其 適合作為載體。 逆轉錄病毒的結構逆轉錄病毒屬于包膜病毒。其雙脂層包膜來源于宿主的細胞 膜，并且可通過病毒表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)的插入而被修飾。基質蛋白(MA)直接 位于包裹內核的外膜之下。該內核含有衣殼蛋白(CA)。衣殼內部有兩個拷貝的逆轉錄病毒基因組，其5'末端通過氫鍵彼此聯接。病毒核心顆粒還含有病毒酶逆轉錄酶(RT)、蛋白 酶(PR)和整合酶(IN)，以及結合在病毒基因組上的核衣殼蛋白(NC)。除了病毒編碼的這 些蛋白外，病毒體還包含大量來自宿主細胞總tRNA的tRNA分子。 鼠白血病病毒(MLV)屬于簡單逆轉錄病毒。逆轉錄病毒具有特征性的遺傳圖譜 在三個結構基因gag、 pol和env兩側具有兩條長末端重復序列(LTRs) 。 LTRs可以進一步 分為三個區U3區含有能被細胞轉錄機識別的增強子和啟動子元件，R區在逆轉錄過程中 具有重要作用，并且還包含多腺苷酸化信號，U5區含有在逆轉錄過程中所需的重要序列，并 且可包裝逆轉錄病毒基因組。此外，LTRs還包含順式元件以及在整合過程中具有重要作用 的反向重復序列。 整合的原病毒可產生兩種mRNA轉錄體，一種是編碼gag蛋白和gag-pol多蛋白的 全長mRNA，另一種是編碼包膜糖蛋白的經過剪接的mRNA。其中的全長mRNA還可充當基因 組RNA，該mRNA含有已描述的LTR部分組件，此外還在5'非翻譯序列中含有三種重要的順 式元件。位于U5區下游的引物結合位點(PBS)含有與引物tRNA分子3'末端互補的18個 核苷酸。包裝信號(PSI)也位于5'非翻譯區內，它定位在PBS與gag基因可讀框起始位點 之間。5'非翻譯區還包含一種負責病毒體中兩套病毒基因組二聚化的二聚體連鎖域。聚嘌 呤片段(PP)是直接位于U3區上游的另一種重要的順式元件，該元件含有一段由A和G殘 基組成的序列。它可作為逆轉錄過程中正鏈DNA合成的引發位點。 逆轉錄病毒的生活周期目前已提出兩種不同的用于解釋病毒顆粒進入宿主細胞 質的機制。據推測，大多數逆轉錄病毒，其中包括MLV，是通過受體介導的內吞作用進入宿主 細胞的，該過程使整個包膜病毒顆粒被內化到內體中。目前已克隆出同向性鼠白血病病毒 的受體分子，通過鑒定，發現該分子是一種陽離子氨基酸轉運蛋白。 當病毒核心顆粒進入宿主細胞的細胞質之后，在以前的宿主細胞中合成并由病毒 體攜帶的病毒蛋白將控制所有導致雙鏈DNA原病毒整合的酶功能。核心顆粒進入后的病毒 蛋白命運仍不清楚，但逆轉錄酶、整合酶和衣殼蛋白仍與RNA基因組形成核蛋白復合物，并 在該復合物中進行逆轉錄。最近還發現，基質蛋白也與這種核蛋白復合物結合。
逆轉錄完成后，核蛋白復合物遷移至宿主細胞核。負責這種核定位的機制仍不清 楚，但是由Rous肉瘤病毒(RSV)獲得的證據表明IN蛋白具有重要的作用，因為在哺乳動物 細胞中表達的RSV IN蛋白定位于核內。有絲分裂是核蛋白復合物進入核內所必需的，這可 能是因為核蛋白復合物不能穿過核膜。IN蛋白一旦進入核內即可介導整合作用。該蛋白可 識別LTRs末端的保守反向重復序列，并且可以從兩條鏈的3'羥基末端去除兩個堿基。IN 蛋白還可催化降解宿主DNA，并可介導原病毒DNA與宿主DNA之間的連接。在整合的專一性 方面，有報道認為整合傾向于發生在DNase I超敏感位點附近，但至今仍未發現宿主DNA的 共有耙序列。 簡單逆轉錄病毒(其中包括MLV)的轉錄和翻譯是通過宿主細胞的裝置來進行。復 合病毒(其中包括HIV和HTLV)可編碼一些反式激活蛋白，這些蛋白可參與轉錄調控。MLV 顆粒的組裝發生在宿主的細胞膜上，該過程與出芽過程同時發生。在哺乳動物B型和C型 病毒(分別為匪TV和HTLV)中，病毒核心顆粒是在宿主細胞質中組裝的。順式作用被囊化 信號與Gga-或Gag-Pol前體蛋白的結合可介導病毒基因組RNA的被囊化。
出芽結束后，Gga-和Gag-Pol多蛋白被病毒蛋白酶(PR)剪切。病毒蛋白的成熟使病毒體的形態發生徹底改變。除了病毒多蛋白在病毒顆粒出芽后被蛋白酶剪切之外，基
因組RNA也將經歷一個成熟過程，該過程可導致形成致密的二倍體基因組。
逆轉錄病毒載體用于產生逆轉錄病毒質粒載體的逆轉錄病毒包括，但不局限于，
Moloney鼠白血病病毒、脾壞死病毒、逆轉錄病毒，如Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、鳥造
白細胞組織增生病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤
病毒，以及乳腺腫瘤病毒。在一項實施方案中，使用的逆轉錄病毒質粒載體來自Moloney鼠
白血病病毒。 該載體可包含一種或多種啟動子。可使用的適當啟動子包括，但不局限于，逆轉錄 病毒LTR;SV40啟動子;以及Miller，et al. ， Biotechniques， Vol. 7， No. 9， 980-990 (1989) 中描述的人類巨細胞病毒(CMV)啟動子；或其他任何一種啟動子(例如細胞啟動子，如真 核細胞啟動子，其中包括，但不局限于，組蛋白啟動子、polIII啟動子和P-肌動蛋白啟動 子)。可使用的其他病毒啟動子包括，但不局限于，腺病毒啟動子、胸腺嘧啶激酶(TK)啟動 子，以及B19細小病毒啟動子。根據本文講述的內容，該領域的技術人員將會了解適當啟動 子的選擇方法。 編碼所需生物活性治療因子的核酸序列可以受適當啟動子的調控。可使用的適當 啟動子包括，但不局限于，腺病毒啟動子，如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子，如巨細 胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞體病毒(RSV)啟動子；誘導型啟動子，如匪T啟動子、金屬 硫蛋白啟動子；熱休克啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人珠蛋白啟動子；病毒胸腺 嘧啶激酶啟動子，如單純皰疹性胸腺嘧啶激酶啟動子；逆轉錄病毒的LTRs(其中包括上文 描述的經過修飾的逆轉錄病毒LTRs) ;P-肌動蛋白的啟動子；以及人生長激素啟動子。此 外，還可以使用能夠調節所需生物活性治療因子編碼基因的天然啟動子。
逆轉錄病毒質粒載體可用于將包裝細胞系轉換成生產性細胞系。可被轉染 的包裝細胞的實例包括，但不局限于，PE501、 PA317psi-2、 psi-AM、 PA12、 T19-14X、 VT-19-17-H2、psiCRE、psiCRIP、GP+E-86、GP+envAm12，以及Miller，《人類基因療法》Vo1. 1， pgs. 5-14(1990)中描述的DNA細胞系，其內容在此完整引入作為參考。載體對包裝細胞的 轉換可采用該領域已知的任一種方法。這些方法包括，但不局限于，電穿孔法、脂質體法，以 及磷酸鈣沉淀法。 生產性細胞系可產生感染性逆轉錄病毒載體顆粒，這些載體顆粒含有編碼所需生 物活性治療因子的多核苷酸序列。然后可以在體外或體內利用這些逆轉錄病毒載體顆粒轉 換真核細胞。經轉換的真核細胞將表達編碼所需生物活性治療因子的多核苷酸序列。可被 轉換的真核細胞包括，但不局限于，胚胎干細胞、胚性癌細胞，以及造血干細胞、肝細胞、成 纖維細胞、成肌細胞、角質細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。 在一項實施方案中，可以將含有編碼所需生物活性治療因子的多核苷酸序列的逆 轉錄病毒質粒載體與上文描述的一種脂質相連接，然后再給藥于宿主。在一項優選實施方 案中，可以將所述逆轉錄病毒質粒載體與本發明的一種脂多胺轉染劑結合，以形成一種復 合物，再把該復合物與本發明的微球體混合，然后給藥于需要進行栓塞性基因治療的患者。
4.9反義基因療法 本發明還包括遞送具有或不具有栓塞作用的反義核酸分子。反義核酸分子是指與 編碼本發明所述多肽的有義核酸互補的分子，例如與雙鏈cDNA分子中的編碼鏈互補或與mRNA序列互補的分子。因此，反義核酸能夠與有義核酸形成氫鍵。反義核酸可以與整條編 碼鏈互補，也可以只與其部分互補，例如與所有的或部分的蛋白編碼區(或可讀框)互補。 反義核酸分子可以與本發明所述多肽編碼核苷酸序列的編碼鏈的所有或部分非編碼區互 補。非編碼區("5'和3'非翻譯區")是指位于編碼區側翼并且不翻譯成氨基酸的5'及 3'序列。 反義寡核苷酸的長度可以是，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷
酸。本發明的反義核酸可通過該領域已知的方法由化學合成和酶催連接反應來加以構建。
舉例來說，反義核酸(如反義寡核苷酸)的化學合成可采用天然的核苷酸，也可采 用經過多種修飾的核苷酸，這些核苷酸可用于提高分子的生物穩定性，或用于提高反義核 酸與有義核酸形成的雙螺旋的物理穩定性，例如可使用偶磷硫代衍生物和吖啶取代的核苷酸。 可用于產生反義核酸的經過修飾的核苷酸的實例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧 啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)-尿 嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、 P-D-galactosylqueosine、次黃苷、恥-異戊烯基腺嘌呤、1_甲基鳥嘌呤、1_甲基次黃 苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2_甲基腺嘌呤、2_甲基鳥嘌呤、3_甲基胞嘧啶、5_甲基胞嘧啶、 恥-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、 P-D-mannosylqueosine、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5_甲氧基尿嘧啶、2-甲硫-N6-異戊 烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v) 、 wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、 5-甲基_2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶_5-羥基乙酸甲基 酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基_3-^2-羧丙基)尿嘧啶、 (acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。 作為選擇，還可以將核酸以反義方向亞克隆到一種表達載體中，并通過生物學方 法用該表達載體產生反義核酸(也就是說，由插入核酸轉錄出的RNA將與所需靶核酸呈反 義方向，這將在下文做進一步描述)。 通常可以將本發明的反義核酸分子給藥于主體，也可使其原位產生，以使這些分 子能夠與編碼本發明的特定多肽的細胞mRNA和(或)基因組DNA雜交或結合，從而通過， 例如，抑制轉錄和(或)翻譯來抑制其表達。這種雜交可以是通過傳統的核苷酸互補性而 形成穩定的雙螺旋，也可以是，例如在反義核酸分子能夠與DNA雙螺旋結合的情況下，在雙 螺旋的大溝中進行特定的相互作用。本發明所述反義核酸分子的給藥途徑的實例包括，直 接將反義核酸分子/脂多胺轉染劑復合物/微球體注射到特定的組織部位。
作為選擇，還可以對反義核酸分子進行修飾，使其能被定向遞送至特定的靶細胞， 然后再利用本發明的微球體和轉染劑進行系統性給藥。例如，可以對用于系統性給藥的反 義分子進行修飾，使其能夠與特定細胞表面的受體或抗原產生特異性結合，修飾方法可以 是，例如，將反義核酸分子與能夠結合細胞表面受體或抗原的肽或抗體相連接。這些肽或抗 體可以使遞送效率在因使用本發明所述微球體和轉染劑而提高的基礎上進一步提高。還可 利用上文描述的載體將反義核酸分子遞送至細胞。為了使細胞內的反義分子達到足夠的濃 度，優選的是用pol II或pol III強啟動子來調控載體構建體中的反義核酸分子。本發明 的反義核酸分子可以是a-異構體核酸分子。
a-異構體核酸分子可以與互補RNA形成特殊的雙鏈雜交體，其中的兩條鏈彼 此平行，這與通常的P _結合體相反(Gaultier et al. (1987)Nucleic Acids Res. 15 : 6625-6641)。反義核酸分子還可包括2'-鄰-甲基核糖核苷酸(Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15 :6131-6148)或RNA-DNA嵌合性類似物(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215 :327-330)。 此外，本發明還包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能剪 切具有互補區域的單鏈核酸，如mRNA。因此，可以用核酶(如錘頭狀核酶(見Haselhiff and Gerlach(1988)Nature334 :585-591中描述))來催化剪切mRNA轉錄體，從而抑制由該 mRNA編碼的蛋白的翻譯。根據所需靶基因的核苷酸序列可以設計出對編碼本發明所述多肽 的核酸分子具有特異性的核酶。例如，在Cech et al.的美國專利4， 987， 071和Cech et al.的美國專利5， 116，742中，可以構建四膜蟲L-19IVS RNA的一種衍生物，其中，活性部位 的核苷酸序列與待剪切的核苷酸序列互補。作為選擇，還可以用編碼本發明所述生物活性 治療因子的mRNA從RNA分子庫中篩選具有特定核糖核酸酶活性的催化性RNA。可參閱，例 如，Bartel and Szostak (1993) Science 261:1411—1418。 本發明還包括能夠形成三螺旋結構的核酸分子。例如，對本發明所述生物活性 治療因子的表達進行抑制的方法可以是，利用與這種多肽的編碼基因調控區(如啟動子 和(或)增強子)互補的核苷酸序列來形成三螺旋結構，從而抑制該基因在靶細胞內的轉 錄。通常可參閱Helene(1991) Anticancer Drug Des.6(6) :569-84 ;Helene (1992) Ann. N. Y.Acad. Sci. 660 :27-36 ;以及Mahet (1992) Bioassays 14(12) :807-15。
在不同的實施方案中，可以對本發明所述核酸分子的堿基部分、糖基部分或磷酸 骨架進行修飾，以提高，例如，該分子的穩定性、雜交性或可溶性。舉例來說，可以對該核酸 的脫氧核糖磷酸骨架進行修飾，以產生肽核酸(可參閱Hyrup et al. (1996)Bioorganic & MedicinalChemistry 4(1) :5-23)。此處使用的術語"肽核酸"或"PNAs"是指利用假肽骨 架替換脫氧核糖磷酸骨架并且只保留四種天然堿基的核酸類似物，如DNA類似物。研究表 明，PNAs的中性骨架使其能夠在低離子強度的條件下與DNA和RNA產生特殊的雜交。PNA寡 聚體可通過Hyrup et al. (1996)，見上文；Perry-0，Keefe et al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci.USA93 :14670-675中描述的標準固相肽合成方法來加以合成。 PNAs可用于本發明的治療性及診斷性應用。例如，PNAs可作為反義制劑或抗基 因制劑，用于通過，例如，抑制轉錄或翻譯或抑制復制而對基因的表達進行序列特異性調 節。PNAs還可用于，例如，基因的單堿基對突變分析，方法是，例如，進行PNA定向的PCR定 位；與S1核酸酶等其他酶組合使用時充當人工限制性酶(Hyrup(1996)，見上文)；或充當 DNA序列或雜交的探針或引物(Hyrup(1996)，見上文；Perry-0'Keefe et al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :14670-675)。 在另一項實施方案中，可以對PNAs進行修飾，以提高其穩定性或被細胞攝取的能 力，修飾方法包括，將PNA與親脂性基團或其他輔助基團相連接，形成PNA-DNA嵌合體，或最 優選的是用脂多胺作為轉染劑與PNA復合，然后再與本發明的微球體結合。例如，可以產生 同時具有PNA有利特性及DNA有利特性的PNA-DNA嵌合體。這種嵌合體允許RNAse H或 DNA聚合酶等DNA識別酶與其DNA部分相互作用，而PNA部分可提供高結合力和高特異性。 PNA-DNA嵌合體的連接可采用適當長度的連接物，這些連接物可根據堿基堆積、核苷堿基之間的結合鍵數量以及方向來加以選擇(Hyrup(1996)，見上文)。PNA-DNA嵌合體的合成可按 照Hyrup(1996)，見上文，以及Finn et al. (1996)NucleicAcids Res. 24(17) :3357-63的描 述來進行。例如，可以用標準的亞磷酰胺偶聯化學物和經過修飾的核苷類似物在固體支持 物上合成一條DNA鏈。并用5'-(4-甲氧三苯)氨基-5'-脫氧-胸腺嘧啶phosphoramidit 等化合物作為PNA與DNA 5'末端之間的連接物(Mag et al. (1989)Nucleic AcidsRes. 17 : 5973-88)。然后使PNA單體逐步偶聯，以產生一種帶有5' PNA段和3' DNA段的嵌合分子 (Finn et al. (1996)Nucleic Acids Res.24(17) :3357-63)。作為選擇，也可以合成帶有 5，DNA段和3，PNA段的嵌合分子(Peterset et al. (1975) Bioorganic Med， Chem. Lett. 5 : 1119-11124)。 在其他實施方案中，使用的寡核苷酸可含有其他附加基團，例如肽(如用于在體 內定向于宿主細胞受體)或促進跨細胞膜運輸的制劑(如參閱Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :6553-6556 ;Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :648-652 ;PCT專利W088/09810)或促進跨血腦屏障運輸的制劑(如參閱PCT專 利W089/10134)。此外，還可以用雜交觸發性剪切劑(如參閱Krol et al. (1988)Bio/ Techniques 6 :958-976)或嵌入劑(如參閱Zon (1988)Pharm. Res. 5 :539-549)對寡核苷酸 進行修飾。因此，在與脂多胺轉染劑和本發明的微球體結合之前或結合之后，可以將寡核苷 酸與另一種分子結合，例如肽、雜交觸發性交聯劑、轉運劑、雜交觸發性剪切劑，等等。
4. IO用于藥物遞送和基因治療的主動栓塞術 本發明的一個方面是利用微球體將藥物、疫苗、診斷劑或顯象劑給藥于哺乳動物 的方法。該實施方案并非必需使用轉染劑。但也可選擇使用轉染劑，因為該轉染劑能夠與 微球體和生物活性劑結合，即能夠充當連接物，或能夠促進內吞作用。 作為一方面，本發明提供一些用于使血管發生栓塞的方法，該方法的步驟包括，將 治療有效劑量的生物活性治療因子轉染劑微球體組合物遞送到血管內，從而有效地阻塞血 管。根據上文提供的公開內容可以很容易地確定適用于阻塞血管的治療有效劑量。在一項 特別優選的實施方案中，可以將生物活性治療因子轉染劑微球體組合物遞送到滋養腫瘤的 血管內。 簡單地說，有多種臨床表現(如出血、腫瘤發生)都需要減少或切斷對某個器官或 區域的血液供給。其實現方法可以是，將本發明的生物活性治療因子轉染劑微球體組合物 通過選擇性定位的針頭或導管注射到所需血管中，該方法將在下文做更詳細的描述。該組 合物可通過血流進行傳輸，直到在血管內形成楔狀物并物理性(或化學性)阻塞血管。該 選定區域的血流減少或被切斷，從而可導致梗塞(由于氧和營養物的供給不足而導致細胞 死亡)或減少受損血管的血液流失。 用于栓塞療法的本發明優選的生物活性治療因子轉染劑微球體組合物沒有毒性， 具有生血栓性，易于經導管注射，不透射線，效應快而持久，無菌，并且在使用時易于形成不 同的形狀或大小。此外，優選的是這些組合物能夠緩慢地(理想的是能夠持續幾周至幾個 月)釋放生物活性治療因子。特別優選的生物活性治療因子組合物在被注射至血管系統之 后應具有15-200 ii m的預定大小。優選的是這些組合物在溶液中或被注射后不會凝集成較 大的顆粒。此外，優選的組合物在使用前的儲存期間不應出現物理特性的改變。
用本發明的栓塞療法來協助腫瘤治療的主要方式至少有三種(1)對腫瘤(通常為良性腫瘤)進行確定性治療；(2)用于術前栓塞術；以及(3)用于姑息性栓塞術。簡單地 說，有時只用栓塞療法就可以成功地治療良性腫瘤。這些腫瘤的實例包括血管源性單純性 腫瘤(如血管瘤)、甲狀旁腺瘤等內分泌腫瘤，以及良性骨腫瘤。 對其他腫瘤(如腎腺癌)而言，可以在切除手術的幾小時或幾天之前進行術前栓 塞術，以減少手術性失血，縮短手術時間，以及降低因手術操作而導致腫瘤的存活惡性細胞 擴散的危險。術前栓塞術可成功地用于多種腫瘤，其中包括，例如，鼻咽瘤、頸靜脈血管球 瘤、腦膜瘤、化學受體瘤和迷走神經瘤。 此外，還可以將栓塞術作為不宜通過手術治療的惡性腫瘤的主要治療方法，以延 長晚期患者的存活時間。栓塞術可減輕失血、靜脈梗阻和氣管壓迫等不良癥狀，從而可明顯 改善惡性腫瘤患者的生活質量。但是，最受益于姑息性腫瘤檢塞術的是因惡性內分泌性腫 瘤的體液效應而受苦的患者，在這些患者體內，轉移自良性腫瘤和其他內分泌性腫瘤，如胰 島素瘤和胰高血糖素瘤，的次生腫瘤可能會生長緩慢，但仍可通過其導致的內分泌癥狀而 帶來巨大的痛苦。 —般而言，采用本發明所述生物活性治療因子轉染劑微球體組合物的栓塞療法通 常可以不考慮部位而以類似的方式來實施。簡單地說，首先是對需要栓塞的部位實施造影 術，方法是在X射線照射的條件下通過動脈或靜脈插管注射一種不透射線的造影劑。所述 導管可以經皮膚插入，也可通過手術插入。然后是阻塞血管，方法是通過導管灌流本發明的 生物活性治療因子轉染劑微球體組合物，直到發現血流停止。最后可通過反復的血管造影 來確證發生了阻塞。 栓塞療法通常可以使包含生物活性治療因子的組合物遍布于需要治療的腫瘤或 血管腫塊的空隙之間。栓塞顆粒的物理沉積可以阻塞動脈腔，從而可阻斷血液供給。除這 種效應外，生物活性治療因子還可抑制滋養腫瘤或血管腫塊的新血管的形成，從而加強因 切斷血液供給而產生的促老效應。 因此，很顯然，通過使用本發明的生物活性治療因子轉染劑微球體組合物可以使 大多數腫瘤發生栓塞。簡單地說，通常將腫瘤分為兩類良性腫瘤和惡性腫瘤。良性腫瘤中 的細胞能保持其分化特性，并且不會以完全失控的方式進行分裂。此外，這類腫瘤是局部化 的和非轉移性的腫瘤。惡性腫瘤中的細胞變成未分化的細胞，這些細胞不會對身體的生長 信號和激素信號產生反應，并且會以不受控制的方式增殖；這類腫瘤具有侵襲性，并且能擴 散至遠處部位(轉移性)。 作為本發明的一方面，可以用栓塞療法對肝轉移瘤(繼發性腫瘤)進行治療。簡 單地說，是將導管經由股動脈或臂動脈插入，然后在熒光鏡的引導下使其穿過動脈系統，進 而插入肝動脈。將該導管盡可能地推至肝動脈網中，以使滋養腫瘤的血管能夠被完全阻塞， 同時也要盡可能地保護滋養正常組織的動脈分支。理想的是只需阻塞肝動脈的一條節段性 分支，但也可能要阻塞遠離胃十二指腸動脈起始部的整個肝動脈，甚至多個獨立的動脈，這 將取決于腫瘤及其單獨供血的范圍。在導管到達所需位置之后即可阻塞動脈，方法是經由 動脈導管注射抗血管發生性治療組合物，直到需要阻塞的動脈中的血流停止，優選的是到 發現血流停止5分鐘后為止。確證動脈阻塞的方法可以是，經由導管注射不透射線的造影 劑，再用熒光鏡或X射線膠片證明先前充滿造影劑的血管不再含有造影劑。該方法可重復 用于需要阻塞的每條滋養動脈。
作為本發明的另一方面，還可以在手術過程中利用主動治療性栓塞療法來切除腫瘤或血管腫塊或癌變器官。此外，本發明的另一方面還涉及利用主動治療性栓塞療法來抑制或改良轉移腫瘤。 如上所述，良性腫瘤和惡性腫瘤都可以用本發明的抗血管發生性治療組合物進行栓塞。良性肝腫瘤的典型實例包括肝細胞腺瘤、海綿狀血管瘤和灶性結節狀增生。此外還可以對更少見的以及通常不具有臨床表現的其他良性腫瘤進行腫瘤。這些腫瘤包括膽管腺瘤、膽管囊腺瘤、纖維瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、間皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤和結節再生性增生。
惡性肝腫瘤通常可再分為兩類原發性惡性肝腫瘤和繼發性惡性肝腫瘤。原發性腫瘤直接在其被發現的組織中產生。因此，原發性肝腫瘤最初來源于組成肝組織的細胞(如肝細胞和膽細胞)。可利用動脈栓塞術進行治療的原發性肝惡性瘤的典型實例包括肝細胞癌、肝膽管細胞癌、血管肉瘤、囊腺癌、鱗狀細胞癌及肝胚細胞瘤。 繼發性腫瘤或轉移瘤是指起源于身體其他部位但隨后擴散至遠處器官的腫瘤。腫瘤轉移的常規路線包括直接進入相鄰結構中生長，經血管系統或淋巴系統擴散，以及循組織平面和身體間隙(腹膜液、腦脊液等)而行。繼發性肝腫瘤是癌癥患者中最常見的致死疾病之一，在目前以及將來都是肝腫瘤中最常見的形式。實際上，任何惡性腫瘤都能轉移到肝臟，但極可能擴散到肝臟的腫瘤包括胃癌、結腸癌和胰腺癌；黑素瘤；肺腫瘤、口咽瘤和膀胱瘤；霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。上述的每種原發性腫瘤都具有多種能夠用動脈栓塞術進行治療的不同腫瘤類型(例如，但不局限于，據報道，卵巢癌有32種以上的不同類型)。 如上所述，采用本發明所述生物活性治療因子轉染劑微球體組合物的栓塞療法還可用于其他多種需要封閉血管的臨床表現。作為本發明的一方面，可以對動靜脈畸形進行治療，方法是將上述的一種生物活性治療因子轉染劑微球體組合物進行給藥。簡單地說，動靜脈畸形(血管畸形)是指一組疾病，其中，動脈與靜脈間的交通至少有一處(通常情況下是多處)出現異常，從而產生一種主要由血管構成的局部瘤樣腫塊。這種疾病可以是先天的，也可以是后天的。 在本發明的一項實施方案中，對動靜脈畸形進行治療的方法可以是，經由股動脈或臂動脈插入導管，并在熒光鏡引導下進而插入滋養動脈中。優選的是盡可能地推進該導管，以使血管畸形的滋養性血管完全被阻塞，同時也要盡可能地保護正常結構的滋養性動脈分支(理想的是只需阻塞單一動脈，但通常是要阻塞多個獨立的動脈，這將取決于血管畸形及其單獨供血的范圍)。在導管到達所需位置之后，即可利用本發明的生物活性治療因
子轉染劑微球體組合物使每條動脈發生栓塞。 作為本發明的另一方面，可以用栓塞術來治療出血過多性病情。例如，用子宮動脈栓塞術可以容易地對月經過多(經期出血過多)進行治療。簡單地說，子宮動脈是雙側髂內動脈的分支。在本發明的一項實施方案中，可以經由股動脈或臂動脈插入導管，并在熒光鏡引導下穿過動脈系統進而插入每條子宮動脈中。應盡可能地推進該導管，以使子宮的血管完全被阻塞，同時也要盡可能地保護源自子宮動脈和滋養正常結構的動脈分支。理想的是將雙側的單一子宮動脈都阻塞，但根據單獨供血的情況，有時需要阻塞多條獨立動脈。在導管到達所需位置之后，即可以按上文所述將生物活性治療因子轉染劑微球體組合物給藥，以使每條動脈都發生栓塞。
還可利用類似的方法將動脈栓塞術用于其他多種病情，其中包括，例如，但不局限
于，急性出血、血管異常、中樞神經系統紊亂及脾功能亢進。 4. 10. 1主動栓塞術與基因療法的結合使用 如上所述，采用本發明所述生物活性治療因子轉染劑微球體組合物的栓塞療法還可用于其他多種希望在封閉血管的同時對需要治療的患者進行基因治療的臨床表現。
作為本發明優選的一方面，所提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子、(b)一種聚合物載體和(c) 一種轉染劑。 作為本發明優選的另一方面，所提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子的編碼多核苷酸、(b) —種聚合物載體和(c) 一種轉染劑。 作為本發明最優選的一方面，所提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子的編碼多核苷酸、(b) —種陽離子交聯微球體和(c) 一種脂多胺轉染劑。 在本發明最優選的該方面中，所提供的組合物含有(a) —種生物活性治療因子的編碼多核苷酸、(b) —種陽離子交聯微球體和(c) 一種脂多胺轉染劑，其中的多核苷酸包括天然的或合成的RNA和DNA，其中包括重組RNA和重組DNA以及反義RNA和反義DNA ;錘頭狀RNA、核酶、反義核酸、單鏈或雙鏈的RNA和DNA，及其類似物；其中的生物活性治療因子包括抗瘤劑、激素和類固醇、維生素、肽和肽類似物、抗體或其片段、疫苗、酶、抗過敏劑、循環系統藥物、抗結核劑、抗病毒劑、抗心絞痛劑、抗原生動物劑、抗風濕劑、麻醉劑、強心苷、鎮靜劑、局部麻醉劑和全身麻醉劑；其中的陽離子交聯微球體基于一些具有無毒性、生物相容性、可膨脹性或非膨脹性、基本上呈球形、親水性、惰性和離子性的交聯聚合物，這些聚合物的大小足以引起栓塞，并且可釋放生物活性治療因子，其中，優選的陽離子交聯微球體是選自丙烯酸鈉聚合物、丙烯酰胺聚合物及丙烯酰胺衍生物聚合物、丙烯酸鈉與乙烯醇的共聚物、乙酸乙烯酯與丙烯酸酯的共聚物的皂化產物、乙酸乙烯酯與丙烯酸酯的共聚物、異丁烯_馬來酸酐交聯共聚物、淀粉_丙烯腈接枝共聚物及其皂化產物、交聯的聚丙烯酸鈉聚合物以及交聯的聚環氧乙烷的聚合物；其中的適當轉染劑的優選實例包括，但不局限于，脂多胺和聚氮丙啶(PEI)。本發明的特別優選的轉染劑包括在1992年12月15日授予Behr，etal.的美國專利5， 171，678、1995年12月19日授予Behr，et al.的美國專利5， 476， 962以及1997年4月1日授予Behr，et al.的美國專利5， 616， 745中公開的通式(I)的脂多胺，這些專利的全部內容均在此引入作為參考。 在本發明公開的優選實施方案及最優選實施方案中，生物活性治療因子都是與轉染劑物理連接成一種復合物，這種生物活性治療因子_轉染劑復合物再與聚合物載體物理連接。優選的是通過液相吸附色譜中熟知的結合力將生物活性治療因子吸附，這些結合力包括，但不局限于，離子交換、疏水性、分子識別，或其組合。可以將選定的生物活性治療因子與轉染劑相混合，這種轉染劑可以使生物活性治療因子_轉染劑復合物具有獨特的性質，如疏水性加強。然后可將含有栓塞性物質(如Embosphere⑧)的微球體與充足劑量的可轉染性生物活性治療因子相混合，導致生物活性治療因子與聚合物載體物理連接的是離子性結合力和疏水性結合力，這些結合力可通過添加鹽而進一步加強，如添加氯化鈉，但不局限于此。 在本發明公開的優選實施方案及最優選實施方案中，吸附或結合在栓塞性物質表面的生物活性治療因子-轉染劑復合物可以逐漸釋放，并通過多種機制進入周圍細胞，這些機制包括，例如，但不局限于，自發的內吞作用、受體介導的內吞作用、內體分解作用以及
細胞膜去穩定作用或其組合。生物體液中的天然成分可誘導生物活性治療因子釋放，這些
成分可降低栓塞性物質與生物活性治療因子之間的吸附強度，直至后者被完全釋放。 另一方面，本發明提供一些方法，用于使腫瘤生成性血管發生依賴性疾病中的血
管出現栓塞，這些方法包括將治療有效劑量的一種組合物給藥于需要治療的患者的血管，
從而有效地封閉該血管，并改善這種腫瘤生成性血管發生依賴性疾病，其中的組合物含有
一種與轉染劑相結合的生物活性因子編碼多核苷酸，這種與轉染劑結合的生物活性因子編
碼多核苷酸還與一種微球體相結合。 4.11診斷成像 如上所述，本發明的生物活性治療因子轉染劑微球體組合物可以與診斷成像、治療成像以及治療藥遞送結合使用，其中包括，例如，超聲(US)、磁共振成像(1)、核磁共振(NMR)、計算機體層攝影術(CT)、電子順磁共振(ESR)、核醫學成像、光學成像、彈性描計術、用超聲遞送藥物、射頻(RF)以及微波激光。本發明的遞送載體和增穩物可以與多種造影劑結合使用，其中包括常規的造影劑，當用于診斷成像和治療成像時，這些造影劑可提高成像的效率。 可與本發明的增穩物結合使用的適當造影劑的實例包括，例如，穩定的自由基，如穩定的硝基氧，以及含有過渡元素、鑭系元素和錒系元素的化合物，這些元素可以在需要的情況下以鹽的形式存在，也可以共價或非共價結合于絡合劑，其中包括絡合劑的親脂性衍生物，此外還可以與蛋白質大分子結合。優選的過渡元素、鑭系元素和錒系元素包括，例如，Gd(III) 、Mn(11) 、Cu(11) 、Cr(ni) 、Fe(11) 、Fe(m) 、Co(I工)、Er(11) 、Ni(11) 、Eu(ni)和Dy(III)。更優選的元素為Gd(III) 、Mn(11) 、Cu(11) 、Fe(11) 、Fe(IH) 、Eu(111)和Dy(III)，最優選的為Mn(II)和Gd(III)。上述元素可采用鹽的形式，其中包括無機物，如錳鹽，例如，氯化錳、碳酸錳、乙酸錳，此外還包括有機鹽，如葡糖酸錳和羥基磷灰石錳。其他典型的鹽包括鐵鹽，如硫化鐵，以及三價鐵鹽，如氯化鐵。 上述元素還可通過，例如，共價或非共價結合力而與絡合劑結合，其中包括絡合劑的親脂性衍生物，此外還可以與蛋白質大分子結合。優選的絡合劑包括，例如，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N， N'， N'， N'"-四乙酸(D0TA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N， N'， N"-三乙酸(D0TA) 、3， 6， 9-三氮雜-12-氧雜-3，6，9-三羧亞甲基-10-羧基-13-苯基十三烷酸(B-19036)、羥芐乙二胺二乙酸(HBED) 、N，N'-雙(pyridoxyl-5-磷酸)乙二胺、N，N'-二乙酸(DPDP) 、 1， 4， 7-三氮雜環壬烷-N，N'，N"-三乙酸(N0TA)、1，4，8，11-四氮雜環十四烷-N，N'，N'，N'"-四乙酸(TETA)、kryptands (大環類絡合物)，以及去鐵銨。更優選的絡合物為EDTA、 DTPA、 D0TA、 D03A和kryptands，最為優選的為DTPA。優選的親脂性絡合物包括絡合劑EDTA與D0TA的烷基化衍生物，如N， N'-雙-(羧基癸基氨甲基^-2，3-二羥基丙基)乙二胺-N， N' -二乙酸酯(EDTA-DDP) ;N，N'-雙-(羧基十八烷基氨甲基-^2，3-二羥基丙基)乙二胺-N，N'-二乙酸酯(EDTA-0DP);以及N，N'-雙(羧基十二烷基氨甲基_N_2， 3-二羥基丙基)乙二胺_N，N'-二乙酸酯(EDTA-LDP);此外還包括美國專利5， 312， 617中描述的親脂性絡合劑，其公開內容在此完整引入作為參考。優選的蛋白質大分子包括，例如，白蛋白、膠原、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚組氨酸、Y-球蛋白和P-球蛋白，更優選的是白蛋白、聚精氨酸、聚賴氨酸和聚組氨酸。因此，適當的絡合物包括Mn (II) -DTPA、Mn (II) -EDTA、Mn (II) -D0TA、Mn (II) -D03A、Mn(II)-krytands、 Gd (III)-DTPA、 Gd (III) _D0TA、 Gd (III)-D03A、 Gd (III)-krytands、Cr (111) EDTA 、 Cu (11) -EDTA ，或鐵-去鐵銨，更優選的是Mn (11) -DTPA或Gd (111) -DTPA 。
硝基氧屬于順磁性造影劑，由于硝基氧中存在未配對電子，因而能增強MRI的Tl和T2弛豫率。該領域的普通技術人員都將了解，用特定化合物作為MRI造影劑的順磁效率至少在某種程度上與順磁性核或順磁性分子中的未配對電子數有關，明確地說，是與未配對電子數的平方相關。例如，禮具有七個未配對電子，而硝基氧具有一個未配對電子。因此，禮通常是一種比硝基氧強得多的MRI造影劑。但有效相關時間是評定造影劑效率的另一個重要參數，該參數使硝基氧可能具有更強的弛豫。當轉動速率減小時，例如把順磁造影劑與一種大分子連接時，其轉動將更加緩慢，從而能更有效地傳遞能量，以加速水質子的弛豫。而釓的電子自旋弛豫時間很短，這將限制慢速旋轉相關時間使弛豫增強的程度。但硝基氧的電子自旋相關時間更加有利，這些分子的旋轉相關時間的減緩可導致弛豫的極大增強。盡管不受任何特定操作原理的約束，但可以考慮將硝基氧包被在微球體的外周，從而對所得的相關時間進行優化，包被的方法可以是，例如，制備其烷基化衍生物。此外，還可以將所得的本發明的對比性介質看成一種磁性球體，即馳豫最大化的一種幾何構型。
適用于本發明所述組合物的超順磁造影劑的實例包括經磁疇作用的金屬氧化物和金屬硫化物、亞鐵類或鐵類磁性化合物，如純鐵，磁性氧化鐵，如磁石、Y _Fe203、 Fe304、M鐵鹽、鈷鐵鹽以及鎳鐵鹽。然后可利用MR整體顯象法進行身體快速成像，例如，用于檢查血栓形成，如果需要，還可以用超聲來輔助血栓溶解。 造影劑，如上文描述的順磁性造影劑和超順磁性造影劑，可作為微球體和(或)增穩物中的一種成分。可以將造影劑包裹在囊泡的內部空腔中，并與微球體一同以溶液的形式進行給藥，其中可摻入任何額外的增穩物，也可以將造影劑包被在囊泡表面或囊泡膜上。可以在該組合物中使用任一種或多種順磁性制劑和(或)超順磁性制劑的混合物。如果需要，還可以將順磁性制劑和超順磁性制劑單獨進行共給藥。 如果需要，還可以將順磁性制劑或超順磁性制劑以烷基化形式或其他衍生物形式摻入到組合物中，尤其是摻入到微球體的脂性壁中。詳細地說，硝基氧2，2，5，5_四甲基-1-吡咯烷氧自由基和2， 2， 6， 6-四甲基-1-哌啶烷氧自由基能夠在沒有被甲基占據的環位置上通過多種結合鍵與長鏈脂肪酸形成加合物，例如乙酰氧鍵。這些加合物非常適合于摻入到本發明的生物活性治療因子轉染劑微球體組合物中。 本發明的增穩物和(或)微球體，特別是微球體，不但可作為上述超順磁性制劑的有效載體，還可以提高造影劑的磁化作用。超順磁性造影劑包括經磁疇作用的金屬氧化物，尤其是氧化鐵，此外還包括氧化錳以及具有不同劑量錳、鈷、鎳的氧化鐵。這些制劑均為超微球體或微球體，并且具有極高的批量磁化性和橫向弛豫率。較大的顆粒，如直徑約100nm的顆粒，的&弛豫要比R^也豫高得多。較小的顆粒，如直徑約10-15nm的顆粒，的I^弛豫稍有降低，但&和R2值更加均衡。更小的顆粒，如直徑約3-5nm的單晶氧化鐵顆粒，的R2弛豫較低，但&和R2弛豫率可能最為均衡。此外，還可以用鐵蛋白包裹由弛豫率極高的超順磁性鐵構成的核心。 可以簡單地將氧化鐵摻入到增穩物和(或)微球體中。在微球體是由脂類構成的情況下，優選的是將氧化鐵摻入到微球體的壁中，如吸附在微球體表面或摻入到微球體內部。 4. 12藥物制劑 治療性制劑多核苷酸鹽本發明包括將藥學容許的鹽形式的編碼上述生物活性治療因子的多核苷酸給藥。這些鹽可以用藥學容許的非毒性堿來制備，其中包括有機堿和無機堿。來自無機堿的鹽包括鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂，等等。來自藥學容許的非毒性有機堿的鹽包括一級、二級和三級銨鹽、堿性氨基酸，等等。關于藥用鹽的論述，可參考3.186化6 etal.，藥物科學雜志66 :1-99(1977)，其公開內容在此引入作為參考。 與本發明的適當轉染劑混合或連接并與適當的可注射微顆粒結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸可置于單位劑量安瓿瓶中或多劑量容器中。這些多核苷酸的存在形式可以是懸液、溶液或油性乳液，優選的是存在于水性介質中。作為選擇，還可以是凍干形式的多核苷酸鹽，在遞送時可以用適當的介質進行重構，如無熱源的無菌水。流體形式與需要重構的凍干形式都應含有一些制劑，優選的是緩沖液，其劑量應足以適當調節注射液的pH值。當用于胃腸外給藥時，特別是要將制劑進行靜脈內給藥時，應調節溶質的總濃度，以使制劑處于等滲、低滲或弱高滲狀態。優選的是用非離子型物質來調節張力，如糖，特別優選的則是蔗糖。這些形式都可進一步含有適當的配制劑，如淀粉或糖、甘油或生理鹽水。無論是流體還是固體形式，每單位劑量的組合物都可含有0. 1% _99%的多核苷酸物質。
與本發明的適當轉染劑混合或連接并與適當的可注射微顆粒結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸在使用之前可包裝在單位劑量安瓿瓶或多劑量容器中，其中包括適用于所述多核苷酸的藥學有效劑量或多倍有效劑量的密封容器，該容器封裝有一定劑量的所述多核苷酸或其溶液。與本發明的適當轉染劑混合或連接并與適當的可注射微顆粒結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸可被包裝成無菌制劑的形式，所述密封容器則用于在該制劑被使用之前保持其無菌性。 用于包裝與本發明的適當轉染劑混合或連接并與適當的可注射微顆粒結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸的容器帶有一種標簽，該標簽帶有食品和藥物管理局等政府機構授權的一種通告，該通告可說明聯邦法律授權的機構已批準生產、使用、或銷售這些用于人類給藥的與本發明的適當轉染劑混合或連接并與適當的可注射微顆粒結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸。聯邦法律規定，用于對人類進行治療的藥劑應得到聯邦政府機構的認可。強制執行的責任屬于食品和藥物管理局，該機構可頒布適當的法規來確保其批準的可靠性，詳文見21U. S. C. 301-392。 42U. S. C. § 262規定了一些適用于生物學物質的法令，其中包括由動物組織制備的產物。其他大多數國家也要求類似的批準。不同國家的法規也各不相同，但各自的特定程序已為該領域所熟知。 給藥劑量和給藥途徑給藥劑量在很大程度上取決于治療對象的狀況和體格，以及治療頻率和給藥途徑。包括劑量和頻率在內的連續治療方案可以通過初期反應和臨床判斷來指導。優選的是通過胃腸外途徑注射到組織間隙中，但是特定的給藥方法可能要采用其他胃腸外途徑，例如通過吸入氣霧劑而給藥于鼻粘膜、咽粘膜、支氣管組織粘膜或肺粘膜。優選的方法是以每個部位約10iU-lml的劑量將溶解在水性介質中的制劑注射到組織內，其中的制劑含有與本發明的適當轉染劑混合或連接并與微顆粒結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸。在該制劑中，編碼生物活性治療因子的多核苷酸的濃度為約O. lyg/ml—20mg/ml。
用于將多核苷酸和肽轉染到細胞內的優選制劑可含有本發明的陽離子脂多胺轉 染劑，同時含有或不含有效促轉染劑量的溶血磷酯。這種溶血磷酯可以具有中性或電負性 頭部基團。優選的是溶血磷酯酰膽堿和溶血磷酯酰乙醇胺，特別優選的是1-油基溶血磷酯 酰膽堿。有利的是該制劑中含有溶血脂與陽離子脂的摩爾比為0.5的溶血磷酯。此外，還 可以用選自本發明所述新型陽離子脂、DOTMA或DOTAP的溶血型陽離子脂來提高轉染效率。 有利的是在本發明的微球體制劑中含有有效劑量約高達總陽離子脂的三分之一的這些溶 血型脂。 另一方面，本發明提供一種含有本發明所述陽離子脂的微球體組合物，其中的陽 離子脂可作為轉染劑與生物活性治療因子組合物相結合。微球體組合物的脂質還可包括一 種中性脂，這種中性脂可選自磷酯酰膽堿、磷酯酰乙醇胺、神經鞘磷酯或膽固醇。在這些微 球體組合物中，陽離子脂與中性脂的優選摩爾比為約9 : l至l : 9;特別優選的摩爾比為
約5 : 5。微球體組合物還可含有一種溶血型酯，這種溶血型酯可選自溶血磷酯酰膽堿、溶
血磷酯酰乙醇胺，或溶血型陽離子脂。 再一方面，本發明提供一些含有微球體的藥學制品，其中的微球體通過本文公開 的任一種陽離子脂或兩親性脂與生物活性治療因子結合，并且帶有藥學有效劑量的一種附 加的治療劑，如治療性藥物。這些組合物中存在的陽離子脂或兩親性脂可促進生物活性治 療因子和(或)其他活性治療劑的胞內運輸。本發明還提供用于局部、腸內和胃腸外的制 品。藥學制品中的附加治療劑可以是，例如，但不局限于，類固醇；這種附加治療劑還可以 是，例如，但不局限于，一種非甾體抗炎劑。 在本發明的另一種藥學制品中，附加治療劑可以是一種抗病毒核苷類似物，優選 的則是抗病毒核苷類似物的脂類衍生物，其中包括磷酯酰衍生物或二磷酰甘油二酯衍生 物。抗病毒核苷可以是雙脫氧核苷、雙脫氫核苷、核苷的卣代衍生物或疊氮衍生物，或非環 化核苷。在優選的實施方案中，抗病毒核苷的脂類衍生物為(3'-疊氮_3'-脫氧)胸腺 嘧啶_5' _ 二磷酸-3- 二酰基甘油(AZT 二磷酸甘油二酯)和雙脫氧胸腺嘧啶二磷酸甘油 二酯。在特別優選的實施方案中，抗病毒核苷的脂類衍生物為阿昔洛韋或更昔洛韋二磷酸 甘油二酯或l-(2-脫氧-2'-氟-1-|3-0-阿糖呋喃)-5-碘胞嘧啶(FIAC)或l(2'-脫 氧-2'-氟-1-|3-0-阿糖呋喃)-5-碘尿嘧啶(FIAU)的二磷酰甘油二酯衍生物。
4. 13試劑盒 本發明還涉及藥物包或藥物試劑盒，其中含有一個或多個裝有本發明的一種或多
種上述組合物成分的容器。這些容器可帶有一種由藥物或生物制品管理政府機構授權的通
告，該通告可說明該機構已批準生產、使用、或銷售這種用于人類給藥的制品。文中所述的
任一種檢測或方法所使用的試劑也可作為試劑盒的成分而被包括在內。 在一種試劑盒中，本發明的商品化微珠或微顆粒可存在于一種含有本發明的轉染
劑和編碼生物活性治療因子的多核苷酸的生理相容性流體溶液中，其中的所有三種成分都
存在于一個瓶中。在另一種試劑盒中，本發明的商品化微顆粒可存在于一個瓶中。與本發
明的轉染劑結合的編碼生物活性治療因子的多核苷酸可存在于另一個瓶中，然后可以將微
顆粒與多核苷酸轉染劑復合物相混合。最后，在另一種試劑盒中，本發明的商品化微珠或微
顆粒可存在于一個裝有生理相容性流體溶液的瓶中。商品化的轉染劑可存在于另一個獨立
的瓶中。本發明的編碼生物活性治療因子的多核苷酸可存在于第三 個瓶中。然后可將三種不同瓶中的成分合并，以形成本發明的結合有編碼生物活性治療因子的多核苷酸和轉染劑 的微顆粒。 在另一種試劑盒中，本發明的微珠或微顆粒可存在于一種含有與轉染劑結合的編 碼生物活性治療因子的多核苷酸的生理相容性流體溶液中，其中的轉染劑與一種促轉染劑 相結合。在另一種試劑盒中，本發明的微珠或微顆粒可存在于一種含有與轉染劑結合的編 碼生物活性治療因子的多核苷酸的生理相容性流體溶液中，其中的轉染劑與一種生物活性 治療劑吸附增強劑相結合。 以下實施例只用于說明，而不作為限制。
5.實施例
實施例1 在裝有100ml去離子水的燒杯中溶解58g氯化鈉和27g醋酸鈉。加入400ml甘 油，然后將pH值調至5.9-6. 1。然后添加90g N-三-羥基-甲基甲基丙烯酰胺、35mg二 乙基氨基乙基丙烯酰胺和10g N， N-亞甲基-雙-丙烯酰胺。60-70C加熱，并添加100mo 的300mg/ml熱明膠溶液。添加熱水，將混合物的總體積調至980ml，然后加入20ml濃度為 70mg/ml的過硫酸銨溶液和4ml N， N， N' ， N'-四甲基乙二胺。 將該溶液倒入石蠟油中，50-70C攪拌。幾分鐘后，提高溫度以顯示丙烯酸單體的聚
合反應。然后進行傾析、仔細清洗、篩濾，并在緩沖介質中高壓滅菌，以回收微球體。 經過篩選校準的微球體具有栓塞術所需的特性，其中包括一種標記的陽離子電荷
和一種有效的粘著劑(明膠或變性膠原)。
實施例2 按照實施例1的方法進行，但用三乙基氨基乙基丙烯酰胺代替二乙基氨基乙基丙 烯酰胺。將微球體回收之后，用25%的戊二醛溶液(100ml所有微球體)使明膠形成網狀。 該處理需在4C條件下攪拌過夜。然后用去離子水清洗。
實施例3和實施例4 按照實施例1和實施例2的方法進行，但用10g丙烯酸代替10g N-三_羥基_甲 基甲基丙烯酰胺。所得微球體具有高膨脹性，通過鹽濃度、離子濃度和PH值可以控制其膨 脹性。在進行操作時，直接從使用者的角度來考慮方便有效的微球體。
實施例5和實施例6 按照實施例1和實施例2的方法進行，但用10g N-丙烯酰環六亞甲基普施安紅 亞-38代替^三-羥基_甲基甲基丙烯酰胺。所得微球體具有濃烈的紅色，這是因為丙烯 酸染料結合到聚合物的晶格中。在進行操作時，直接從使用者的角度來考慮方便有效的微 球體。 實施例7和實施例8 用0. 1M pH8的硼酸鹽緩沖液清洗按實施例1-4的方法獲得的100ml微球體，然后 將微球體懸浮在50ml的5mg/ml羅丹明異硫氰酸鹽溶液中。將懸浮液至少攪拌15小時，然 后用中性緩沖液清洗至上清液無色為止。 然后對這些熒光紅色微球體進行標定和滅菌，并將其用于栓塞性基因療法。
實施例9和實施例10 按照實施例1-4的方法進行，但用10g不透X-射線的(丙烯酰胺基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6_苯甲酸單體代替10g N—三_羥基_甲基甲基丙烯酰胺。 所得微球體具有吸收X-射線的特性，因而對栓塞性基因療法中的體內微球體跟
蹤尤為重要。 實施例11-14 按照實施例1和2的方法進行，在最初的單體溶液中添加5g不透射線的可溶性線
性聚合物、丙烯酰胺基-3-三碘-2，4，6-苯甲多酸(實施例ll和實施例12)或(丙烯酰胺
基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲多酸(實施例13和實施例14)。 這些分子量超過100， 000Dalton的聚合物被束縛在聚合物晶格中，并且在不破壞
該申請書所述微球體的一般特性的情況下，這些聚合物有可能具有不透射線的特性，該性
質可用于栓塞性基因療法的體內跟蹤。 實施例15和實施例16 按照實施例1和2的方法進行，在最初的單體溶液中添加200g硫酸鋇粉末。所得 微球體既不透可見光，也不透X-射線。
實施例17和實施例18 按照實施例1和實施例2的方法進行，在最初的單體溶液中添加50mg磁鐵礦 (Fe304)。 所得微球體具有能夠用磁共振成像(MRI)方法進行檢測的特性。
實施例21 制備用于栓塞性基因療法的可注射懸液 本發明的另一項實施方案包括使用上述實施例1-20中的任一種微球體，然后將 這種微球體與受適當啟動子調控的編碼p53基因的多核苷酸相混合，其中的多核苷酸與 一種轉染劑相結合，如Transfectam⑧(Biosphere Medical)。這些微球體/P53基因 / Transfectam⑧組合物可用于小動脈栓塞和改良，繼而可用于清除多種癌癥，如肝癌、腎 癌和胰腺癌。 實施例22 制備用于組合栓塞性基因療法和抗血管發生性療法的可注射懸液
本發明的另一項實施方案包括使用上述實施例1-20中的任一種微球體，然后將 這種微球體與一種由多核苷酸(在適當啟動子的控制下)編碼的抗血管發生劑相混合，其 中的多核苷酸與一種轉染劑相結合，如Transfectam⑧(Biosphere Medical)。這些微球 體/P53基因/ Transfectam⑧組合物可用于癌癥的組合小動脈栓塞，繼而可用于抑制血 管發生，以改善癥狀，然后可用于清除多種癌癥，如前列腺癌。 上文描述的本發明的實施方案只是作為說明，該領域的技術人員都將認可或能夠 確定與本文描述的特定方法等價的多種方法。所有這些等價方法都將被認為處在本發明的 范圍只內，并且將包括在下文的權利要求中。 文中描述的所有文獻的內容都在此引入作為參考。其他實施方案將包括在下文的 權利要求中。
權利要求
一種適用于主動栓塞術的微球體，該微球體含有一種生物相容性的、交聯的和基本上親水的聚合物以及一種或多種活性成分，所述活性成分包括藥物、疫苗，或其任意組合。
2. 權利要求l的微球體，其中的微球體含有一種或多種彈料。
3. 權利要求2的微球體，其中的彈料選自丙烯酸聚合物、丙烯酰胺聚合物、乙烯醇聚合 物、丙烯酸酯聚合物、多糖、聚硅酮，及其混合物。
4. 權利要求2的微球體，其中微球體的直徑為約10 ii m-2000 y m。
5. 權利要求4的微球體，其中微球體的直徑為約50 ii m-300 y m。
6. 權利要求l的微球體，其中的微球體是可膨脹的。
7. 權利要求6的微球體，其中的微球體包含一些聚合物，這些聚合物選自丙烯酸鈉聚 合物、丙烯酰胺聚合物、丙烯酰胺衍生物聚合物或共聚物、丙烯酸鈉與乙烯醇的共聚物、乙 酸乙烯酯與丙烯酸酯的共聚物、乙酸乙烯酯與馬來酸甲酯的共聚物、異丁烯-馬來酸酐交 聯共聚物、淀粉_丙烯腈接枝共聚物、交聯的聚丙烯酸鈉聚合物，以及交聯的聚環氧乙烷。
8. 權利要求6的微球體，其中的微球體的直徑在膨脹之前為約10 ii m-400 y m。
9. 權利要求8的微球體，其中的微球體的直徑在膨脹之前為約10 ii m-200 y m。
10. 權利要求6的微球體，其中的微球體的直徑在膨脹之后為約10 ii m-2000 y m。
11. 權利要求1的微球體，其中的藥物選自抗腫瘤藥物、抗血管發生藥物、抗真菌藥物、 抗病毒藥物、抗炎藥物、抗細菌藥物，以及抗組胺藥物。
12. 權利要求l的微球體，其中的疫苗選自肺炎球菌疫苗、脊髓灰質炎疫苗、炭疽熱疫 苗、結核(BCG)疫苗、甲型肝炎疫苗、霍亂疫苗、腦膜炎球菌A、C、Y疫苗、W135疫苗、鼠疫疫 苗、狂犬病(人類二倍體)疫苗、黃熱病疫苗、日本腦炎疫苗、傷寒(苯酚滅活和熱滅活的) 疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、灰質炎疫苗、 麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、水痘疫苗、肺炎鏈球菌Ty(活體突變菌)疫苗、Vi(Vi莢膜 多糖)疫苗、DT(類毒素)疫苗、Td(類毒素)疫苗、aP(滅活的細菌抗原/非細胞的(DtaP)) 疫苗、Hib (細菌多糖_蛋白結合物)疫苗、乙肝病毒(來自病毒抗原/重組抗原的滅活血 清)疫苗、流感疫苗、輪狀病毒疫苗、呼吸道合胞體病毒(RSV)疫苗、人星狀病毒疫苗、輪狀 病毒疫苗、人類A型及B型流感病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、減毒的活體3型副流感病毒疫苗、 腸道病毒疫苗、逆轉錄病毒疫苗，以及細小核糖核酸病毒疫苗。
13. 權利要求l的微球體，該微球體還包含一種選自熒光標記衍生物、化學染料和磁共 振成像劑的成像劑或造影劑。
14. 權利要求1的微球體，其中的聚合物具有占分子量約0. 5% _20%的交聯物。
15. —種可注射組合物，該組合物含有權利要求1的微球體和一種生物相容性載體。
16. 權利要求15的組合物，其中組合物含有占重量約10% _90%的微球體以及占重量 約10% _90%的生物相容性載體。
17. 權利要求16的組合物，其中組合物含有占重量約10% _50%的微球體以及占重量 約50% _90%的生物相容性載體。
18. 權利要求15的組合物，其中的組合物是所述微球體在所述生物相容性載體中的一 種懸液。
19. 權利要求18的組合物，其中的生物相容性聚合物存在于一種乳劑中。
20. 權利要求18的組合物，其中的生物相容性聚合物存在于一種有機溶液或非水性溶液中。
21. 權利要求18的組合物，其中的生物相容性聚合物存在于一種水基溶液、一種水-有 機溶液，或其混合物中。
22. 權利要求18的組合物，其中的生物相容性載體含有約0. 01M-5M的陽離子鹽，其中 的陽離子選自鈉、鉀、鈣、鎂、鐵、鋅和銨。
23. 權利要求22的組合物，其中的鹽是以造影劑的形式提供。
24. 權利要求18的組合物，其中的造影劑為(丙烯酰胺基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2， 4，6-苯甲酸單體。
25. 權利要求15的組合物，其中的組合物可以用18號或更小的針頭進行注射。
26. —種用于在哺乳動物中進行主動栓塞術的方法，該方法包括將一種微球體給藥于 需要治療的哺乳動物，該微球體含有一種生物相容性的、交聯的和基本上親水的聚合物，以 及一種或多種藥物、疫苗，或其組合。
27. 權利要求26的方法，其中的微球體含有一種或多種彈料。
28. 權利要求27的方法，其中的彈料選自丙烯酸聚合物、丙烯酰胺聚合物、乙烯醇聚合 物、丙烯酸酯聚合物、多糖、聚硅酮，及其混合物。
29. 權利要求27的方法，其中的微球體的直徑為約10 ii m-2000 y m。
30. 權利要求27的方法，其中的微球體的直徑為約50 ii m-300 y m。
31. 權利要求26的方法，其中的微球體是可膨脹的。
32. 權利要求31的方法，其中所述微球體含有離子型多糖和離子型合成聚合物。
33. 權利要求32的方法，其中的離子型多糖選自羧甲基葡聚糖、硫酸葡聚糖和藻酸。
34. 權利要求32的方法，其中的離子型合成聚合物選自丙烯酸鈉聚合物、丙烯酰胺聚 合物、丙烯酰胺衍生物聚合物或共聚物、丙烯酸鈉與乙烯醇的共聚物、乙酸乙烯酯與丙烯酸 酯的共聚物、乙酸乙烯酯與馬來酸甲酯的共聚物、異丁烯_馬來酸酐交聯共聚物、淀粉_丙 烯腈接枝共聚物、交聯的聚丙烯酸鈉聚合物，以及交聯的聚環氧乙烷。
35. 權利要求31的方法，其中的微球體的直徑在膨脹之前為約10 ii m-400 y m。
36. 權利要求35的方法，其中的微球體的直徑在膨脹之前為約10 ii m-200 y m。
37. 權利要求31的方法，其中的微球體的直徑在膨脹之后為約10 ii m-2000 ii m。
38. 權利要求26的方法，其中的治療性活性藥物選自抗腫瘤藥物、抗血管發生藥物、抗 真菌藥物、抗病毒藥物、抗炎藥物、抗細菌藥物、抗組胺藥物、抗血管發生因子、抗瘤劑、激素 和類固醇、維生素、肽和肽類似物、酶、抗過敏劑、循環系統藥物、抗結核劑、抗病毒劑、抗心 絞痛劑、抗原生動物劑、抗風濕劑、麻醉劑、強心苷、鎮靜劑、局部麻醉劑、全身麻醉劑。
39. 權利要求26的方法，其中的疫苗選自肺炎球菌疫苗、脊髓灰質炎疫苗、炭疽熱疫 苗、結核(BCG)疫苗、甲型肝炎疫苗、霍亂疫苗、腦膜炎球菌A、C、Y疫苗、W135疫苗、鼠疫疫 苗、狂犬病(人類二倍體)疫苗、黃熱病疫苗、日本腦炎疫苗、傷寒(苯酚滅活和熱滅活的) 疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、b型流感嗜血桿菌疫苗、灰質炎疫苗、 麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、水痘疫苗、肺炎鏈球菌Ty(活體突變菌)疫苗、Vi(Vi莢膜 多糖)疫苗、DT(類毒素)疫苗、Td(類毒素)疫苗、aP(滅活的細菌抗原/非細胞的(DtaP)) 疫苗、Hib(細菌多糖-蛋白結合物)疫苗、乙肝病毒(來自病毒抗原/重組抗原的滅活血 清)疫苗、流感疫苗、輪狀病毒疫苗、呼吸道合胞體病毒(RSV)疫苗、人星狀病毒疫苗、輪狀病毒疫苗、人類A型及B型流感病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、減毒的活體3型副流感病毒疫苗、 腸道病毒疫苗、逆轉錄病毒疫苗，以及細小核糖核酸病毒疫苗。
40. 權利要求26的方法，其中的微球體還包含一種選自熒光標記衍生物、化學染料和 磁共振成像劑的成像劑或造影劑。
41. 權利要求26的方法，其中的聚合物具有占分子量約0. 5% _20%的交聯物。
42. 權利要求26的方法，其中的給藥包括對需要栓塞的所述哺乳動物的某個區域進行 注射。
43. 權利要求1的微球體，其中的抗腫瘤藥物為紫杉酚、阿霉素、他莫昔芬，或其組合。
44. 一種用于在哺乳動物中進行主動栓塞術的方法，該方法包括將一種微球體給藥于 需要治療的哺乳動物，該微球體含有一種生物相容性的、交聯的和基本上親水的聚合物，以 及一種或多種藥物、疫苗，或其組合，其中所述微球體是通過使用定向抗體而被遞送至作用 部位。
全文摘要
本發明涉及一些可注射組合物，這些組合物含有能夠在栓塞藥物治療中有效遞送生物活性治療因子的聚合物載體，這些載體具有生物相容性、可膨脹性、基本親水性、無毒性，并且基本為球形。本發明還涉及利用這些可注射組合物進行栓塞基因治療的方法，尤其用于血管發生依賴性和非血管發生依賴性疾病的治療。
文檔編號A61K39/21GK101708165SQ200910204299
公開日2010年5月19日 申請日期2001年3月23日 優先權日2000年3月24日
發明者E·波舍蒂, J·-M·沃格爾 申請人:生物領域醫療公司