專利名稱：：蔓生白薇苷c在制備治療瘧疾藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及藥物，具體涉及化合物蔓生白薇苷c在制備治療瘧疾藥物中的應用，尤其涉及化合物蔓生白薇苷c在制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾藥物中的應用。
背景技術：
：瘧疾是地球上發生最頻繁的寄生蟲病，是由按蚊進行傳播、具有潛在致命危險的疾病。每年全球有5億左右的瘧疾病例，導致超過100萬人死亡，絕大部分發生在非洲。世界衛生組織指出瘧疾平均每30秒殺死一個5歲以下的兒童。瘧疾由瘧原蟲引起。帶有瘧原蟲的雌按蚊叮咬人體后，將瘧原蟲注入人體，經1020天會發生典型的瘧疾臨床癥狀，可分為四期發冷期、發熱期、出汗期和間歇期。瘧疾的反復發作后，病人會出現貧血、肝脾腫大，甚至出現腦型、超高熱型、厥冷型和胃腸型等兇險癥狀，甚至危及生命。隨著已有抗瘧藥物的耐藥性的不斷增加，瘧疾的發病率日益增加，亟待具有新型治療作用的抗瘧藥物的發現。紅細胞內期的瘧原蟲在其酸性食物泡內水解宿主的血紅蛋白以獲得自身生命所需的能量和氨基酸。生物學研究表明，在瘧原蟲的食物泡內包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶(plasm印sins)，半胱氨酸蛋白酶(falcipains)，和金屬蛋白酶(falcilysins)。這些酶已成為瘧疾化學治療的潛在的靶標。半胱氨酸蛋白酶是MT約為2100030000的蛋白質，在pH46.5時具有最高水解活性，它的活性部位具有半胱氨酸殘基。瘧原蟲的半胱氨酸蛋白酶屬于木瓜蛋白酶家族。已知的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶有四個亞型，falcipain-l(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-l)，falcipain-2A(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2A)，falcipain-2B(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2B)，falcipain-3(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-3)。Falcipain1是第一個表達得到的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶，其生物學研究表明，它對瘧原蟲的無性生殖階段并無影響，但能顯著的影響卵囊的功能。Falcipain-2A，falcipain-2B具有97%的同源性，僅在氨基酸序列的7位有所不同。通過寡核苷酸探針的監測發現，falcipain-2BmRNA的表達水平比falcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在癥原蟲營養體晚期其表達的時間依賴性和峰值極為相似，這表明兩種不同的亞型具有相似的生物學功能。Falcipain-3與falcipain-2在催化域有66.6%的同源性，但是它們表達的階段有所不同。Falcipain-2在營養體階段表達達到最高峰，而falcipain-3在更為成熟的瘧原蟲階段表達達到高峰。在這幾種亞型中，對于falcipain-2的研究最多，因此其抑制劑的開發亦受到更為廣泛的關注。中醫中藥治療瘧疾已經有很長的歷史，比如在《素問*剌虐論》中就提出了用針灸預防治療瘧疾，在中草藥方面，除了聞名世界的青蒿外，威靈仙、水蜈蚣、鴉膽子、常山、鵝不食草、檳榔、翻白草、石龍芮等也在民間用來治療瘧疾。從中藥青蒿中發現的活性化合物青蒿素用于治療瘧疾取得了很好的效果，廣泛用于臨床，因此從中藥中尋找具有抗虐活性的化合物意義重大。本發明人通過多年的基礎研究積累了2000多種，并建立了天然產物庫，通過對庫中化合物進行篩選，發現了蔓生白薇苷C具有抗瘧作用。白薇為蘿摩科鵝絨藤屬植物直立白薇、蔓生白薇的根，中醫理論中白薇具有清熱涼血、利尿通淋、解毒療瘡的功效，用于陰虛發熱、骨蒸勞熱、產后血虛發熱等癥。尚未見白薇中的化學成分具有抗瘧作用的報道。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于提研究設計蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應用。本發明提供了蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應用。蔓生白薇苷C的結構式如下蔓生白薇苷c系從直立白薇、蔓生白薇中分離得到的化合物。通過蔓生白薇苷C與Falcipain-2蛋白酶結合活性測定等試驗，結果證明蔓生白薇苷C與FP-2蛋白有明顯的結合，對FP-2酶有較高的抑制活性。蔓生白薇苷C體外抗瘧活性測定，結果顯示，蔓生白薇苷C有較好的體外抗瘧原蟲活性。因此，可用于制備治療瘧疾的藥物本發明的另一目的是提供以蔓生白薇苷C為活性成分，用于制備治療瘧疾的藥物組合物，尤其用于制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物組合物。本發明所述藥物組合物含有治療有效量的蔓生白薇苷C為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載體。其中活性成分在藥物組合物中的重量為5-95%。所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水燈；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其職稱常規的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊等或制成液體制劑如水或油懸浮劑、糖漿等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水貨油性懸浮劑等。本發明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。具體實施例方式實施例1:蔓生白薇苷C的制備白薇干燥根10kg粉碎后，以10倍量90%乙醇回流3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物上大孔樹脂HP-20柱，分別用蒸餾水和30%EtOH洗脫至洗脫液無色，再用90%EtOH洗脫至硫酸乙醇皂苷顯色陰性為止，回收90%EtOH洗脫液至干，得90%EtOH洗脫部分。將90%EtOH洗脫部分進行硅膠柱層析，以氯仿_甲醇(1:11:10v/v)進行梯度洗脫，用薄層層析檢查層析流分，具有相同單一斑點的流分合并，濃縮，分得流分1、2、3、4、5，將其中的第3和第4部分再分別進行正相硅膠柱層析，以不同比例的氯仿-甲醇進行洗脫，第3流分得AI-VII流分、第4流分得BI-V流分，將其中的BIV流分經反復的RP-C18層析(MeOH:H20)分離、純化，得到蔓生白薇苷C146mg。制得的蔓生白薇苷C用于實施例2-5。蔓生白薇苷C(cynanversicosideC)，白色無定形粉末，mpl24-128。C，[a]d28:+49.8。(c=0.562，MeOH)，分子式C28H4。014。經光譜數據分析和理化性狀測定與文獻報道(QiuSheng-Xiang，etal.Phytochemistry，1989，28(11)，3175-3178)的蔓生白薇苷C完全一致。實施例2:蔓生白薇苷C與Falcipain-2蛋白酶結合活性測定Falcipain-2蛋白酶與紫草酸丁酯結合活性的篩選和動力學常數的測定基于SPR(表面等離子共振)原理，使用的儀器是Biacore3000(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)。(1)Falcipain-2質粒(pQE30-Fa12)的構建根據Falcipain-2cDNA序列設計引物，正向和反向引物分另l」為5，CGTGGATCCCAAATGAATTATGAAG3，和5，ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含BamHI和SalI酶切位點，通過PCR擴增Falcipain-2片段，將酶切后的PCR產物和表達載體pQE30連接后鑒定正確，轉化入大腸桿菌M15(Qiagen)進行表達。(2)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達與純化將構建好的質粒pQE30-Fa12轉入大腸桿菌M15中得到表達工程菌，將工程菌培養于含100iig/mL氨芐青霉素和50iig/mL卡那霉素的10mLLB培養基中培養過夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L)。然后按1:100轉接入1L含氨芐青霉素和卡那霉素的新鮮LB培養基中，37t:下，220轉/分培養。當0D600達到約0.8時，加入IPTG至終濃度0.5mM，同時將溫度降到25t:培養12小時進行蛋白的誘導表達。4000轉/分離心30分鐘收集菌體，收集好后放于-8(TC超低溫冰箱保存過夜。將菌體用20mL的緩沖液1(20mMTris-Cl，O.5MNaCl，and10mM咪唑，pH8.0)懸起，將懸浮液冰浴上超聲波破碎(300W，工作30分鐘，一次5秒，中間間隔10秒)。破碎后得到的細胞勻漿在4°C，以10000轉/分離心30分鐘，棄上清，用20mL的buffer2(6M胍HC120mMTris-Cl250mMNaCl20mM咪唑，pH8.0)溶解沉淀，室溫下溫和攪拌1小時，10000轉/分離心30min，并將上清上樣到用綁定緩沖液2(6MguanidineHCl，20mMTris-Cl，250mMNaCl，pH8.0)平衡好的Ni2+_NTA柱上，先后用沖洗緩沖液1(8M尿素，20mMTris-Cl，500mMNaClpH8.0)和沖洗緩沖液2(8M尿素，20mMTris-Cl，30mM咪唑)各30ml洗去非特異性結合的雜蛋白，再用洗脫緩沖液(8M尿素，20MmTris-Cl，lM咪唑)10ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE檢測蛋白的分子量和純度。(3)FP-2包涵體蛋白的復性將純化得到的蛋白加入10mMDTT，37。C下溫浴45分鐘后，將蛋白溶液稀釋到10g/ml進行透析(透析液100mMTris-Cl，lmMEDTA，20%甘油，250mML-精氨酸，lmM谷胱甘肽，lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH8.0)過夜。將透析好的蛋白濃縮即可用作酶抑制活性的測定。(4)FP-2蛋白的偶聯徹底清洗Biacore3000機器后，用PBS緩沖液(10mM4_羥基哌嗪乙磺酸，150mMNaCl，3mMEDTAand0.005%(v/v)surfactantP20，pH7.4)平衡機器至基線平穩。0.2MN_ethyl_N'-dimethylaminopropylcarbodiimide(N-乙基-N'_二甲基氨丙基碳二亞胺)和50mMMN-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)1:1混禾P，以5yL/min進樣7分鐘以活化芯片表面。FP-2蛋白用10mM乙酸鈉，pH4.2，稀釋至終濃度為69iig/ml，以5iiL/min流速進樣。最后，用1M鹽酸乙醇胺，pH8.5以5iiL/min流速進樣7分鐘，封閉芯片表面，最終FP-2蛋白的偶聯量為9300RU左右。(5)化合物篩選底物Z-Phe-Arg-pNAHC1(BachemAG)作為陽性對照。實施例1制得的蔓生白薇苷C用100%匿SO溶解，母液濃度為10mM。用HBS-EP緩沖液稀釋化合物，至終濃度為1PM和10iiM，DMS0的終濃度為0.1%。根據紫草酸丁酯與芯片上FP-2蛋白的結合的RU(ResponseUnit，共振單位)值，判斷化合物是否具有結合活性。有結合活性的化合物可進行詳細的動力學實驗。結果證明蔓生白薇苷C與FP-2蛋白有明顯的結合。(6)動力學測定蔓生白薇苷C用工作緩沖液HBS-EP(含O.1%匿SO)，分別配成不同的濃度梯度，以30iU/min進樣lmin，解離2min，然后用相同緩沖液穩定2min。得到蔓生白薇苷C與FP-2蛋白相互作用的傳感圖，再用Biacore分析軟件中的1:1(Langmuir)結合模型或穩態模型進行擬合，得到確切的動力學和熱力學常數。(6)試驗結果表1陽性對照和蔓生白薇苷C與FP-2蛋白結合常數的測試結果。序號編號KD一)1蔓生白薇苷c5.782Z-Phe-Arg-pNA.HC1~32.1實施例3蔓生白薇苷C對falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的測定(1)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達與純化和FP-2包涵體蛋白的復性參見實施例2(2)本發明化合物對FP-2酶抑制活性的測定在197iiL的100mMNaOAc，10mMDTT，pH5.5的buffer體系中加入FP-2蛋白(終濃度10g/ml)和溶于匿SO的待測化合物溶液，終濃度10M和0M(陰性對照)，室溫下孵育30min后用MDSpectraMaxM5酶標儀于激發波長excitation355nm;發射波長emission460nm處連續測15min內的RFU值，計算出反應速率Km，以下列公式得出待測化合物在10M下百分抑制率，計算公式為(對照組Km值_實驗組Km值)/對照組Km值X100%(3)化合物活性測試結果蔓生白薇苷C對falcipain-2的抑制率為83%。實施例4蔓生白薇苷C對falcipain-2蛋白酶半數有效抑制濃度(IC5。)的測定選取IOM抑制率在50%以上的化合物測IC5。，選擇合適的化合物濃度梯度，即蔓生白薇苷C溶液，實驗方法和體系如實施例3。根據化合物在不同濃度下FP-2酶活的反應速率Km，計算化合物在不同濃度下對FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin軟件進行擬合得到化合物的IC5。值，結果蔓生白薇苷C對falcipain-2酶活抑制IC5。值為1.54M。提示蔓生白薇苷C具有較好的抗瘧活性。實施例5蔓生白薇苷C體外抗瘧活性測定抗癥活性可以通過測量癥原蟲LDH活性來確定(Jain，M.;Khan，S.I.;Tekwani，B丄；Jacob，M.R.;Singh，S.;Singh，P.P.;Jain，R.Synthesis,antimalarial,antileishmanial，andantimicrobialactivitiesofsome8_quinolinamineanalogues.Bioorg.Med.Chem.2005，13，4458-4466.)。在含10iiL連續稀釋測試樣本的96孔板的每個孔中加入感染了D6orW2株P.falciparum的紅細胞混懸液(200yL，在RPMI1640培養集中加入10%人血清和601g/mL阿米卡星，使瘧原蟲血癥達到2%，紅細胞壓積達到2%)，然后用90%^，5%02，and5%C02組成的混合氣體沖洗板，在培育房內培育72小時，溫度保持在37t:。LDH活性用MalstatTM試劑(FlowInc.，Portland,OR)測定，測定程序參照Makler禾口Hinrichs的禾呈序(M.T.MaklerandD.J.Hinrichs，MeasurementofthelactatedehydrogenaseactivityofPlasmodi咖falcipar咖asanassessmentofparasitemia.J.Am.J.Trop.Med.Hyg.1993,48(2):205-210)。簡要說來，就是將20yL培育的混合物同100iiLheMalstat試劑混合，在室溫下培育30分鐘.然后加入20微升NBT/PES的混合物(NBT/PES比例為1:1)(Sig腿，St.Louis,M0)，在黑暗條件下培育1小時。之后，加入100iiL5%醋酸溶液終止這一反應，并用650nm來檢測板.藥物對照組中加入青蒿素和氯喹。從劑量-效應曲線中計算出IC5。。測定化合物抗瘧活性的選擇性指標時，也要測定他們在體外對哺乳動物細胞的毒性.測試在96孔組織培養板中進行(J.Mustafa,S.I.Khan，G.Ma，L.A.WalkerandI.A.Khan，SynthesisandAnticancerActivitiesofFattyAcidAnalogsofPodophyllotoxin.Lipids.2004，39(2):167-172.)。在96孔板中以25，000個/孔的密度種植非洲綠猴腎異倍體細胞并培育24小時.加入不同濃度的樣品，即蔓生白薇苷CDMS0溶液，濃度為528.8ng/ml、1586.4ng/ml、4760g/ml，繼續培育48小時。利用NeutralRedassay方法測定存活細胞數，從劑量-效應曲線中計算出IC5。.用阿霉素作為陽性對照藥物。蔓生白薇苷C的對D6和W2的IC5。值如下表藥物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結果顯示，蔓生白薇苷C有較好的體外抗瘧原蟲活性。權利要求蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應用，其特征在于蔓生白薇苷C的結構式如下2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物為治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物。3.—種治療瘧疾的藥物組合物，其特征在于含有如權利要求1中所述的蔓生白薇苷C和藥學上可以接受的載體。4.根據權利要求3所述的藥物組合物，其特征在于活性成分蔓生白薇苷C在藥物組合物中的重量含量為5-95%。全文摘要本發明提供了蔓生白薇苷C在制備治療瘧疾藥物中的應用，蔓生白薇苷C的結構式如下并提供了含有所述的蔓生白薇苷C和藥學上可以接受的載體組成的藥物組合物。所述活性成分蔓生白薇苷C在藥物組合物中的重量含量為5-95％。通過蔓生白薇苷C與Falcipain-2蛋白酶結合活性測定等試驗，結果證明蔓生白薇苷C與FP-2蛋白有明顯的結合，對FP-2酶有較高的抑制活性。蔓生白薇苷C體外抗瘧活性測定，結果顯示，蔓生白薇苷C有較好的體外抗瘧原蟲活性。因此，可用于制備治療瘧疾的藥物，有較大的臨床應用價值。文檔編號A61P33/06GK101693036SQ20091019747公開日2010年4月14日申請日期2009年10月21日優先權日2009年10月21日發明者單磊,盧偉強,張衛東,張壽德,李洪林,蘇娟,陳瞳,黃瑾申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學;華東理工大學;