用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體及其制備方法

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專利名稱：用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤靶向的磁共振成像診斷用順磁性造影劑的脂質體及其制備方法。技術背景
腫瘤嚴重威脅著人類的健康與生命，全世界每年因惡性腫瘤死亡約600萬人，確診約1000萬人。腫瘤治療面臨的關鍵問題是如何早期發現，診斷和治療。目前影像學已有多種腫瘤診斷技術，如磁共振成像，X-射線成像，超聲波成像和核醫學成像等。
其中磁共振成像技術中造影劑被用來增強影像的強度，通過改變組織局部磁場強度或弛豫時間，或通過造影劑生理、生化特性來增強成像因素的差異，達到造影目的。
磁共振造影劑用的最廣泛的就是順磁性金屬釓離子Gd3+的螯合物，常用的螯合劑主要為多氨多羧化合物，如二乙三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷_1，4，7， 10-四乙酸(DOTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)以及它們的衍生物。這些Gd3+的親水性螯合物，如Gd-DTPA，Gd-DOTA, Gd-D03A_HP和Gd-DTPA-BMA分布于胞外，且被腎臟消除。游離的釓離子具有高毒性，在體內分布于骨骼和肝臟，并可迅速導致肝臟壞死。所有的含釓造影劑都是螯合物，螯合后能改變體內的分布以提高圖像對比度，同時改善其毒副作用(參見西北大學學報(自然科學網絡版)，2004年11月第2卷第11期，羅麗等人，磁共振成像造影劑的研究進展)。
脂質體作為一種定向藥物載體，可以將藥物粉末或溶液包埋在類細胞結構的微粒中改變藥物的體內分布，減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒副作用，并且可作為藥物儲庫，產生持久的治療作用。脂質體注入體內后，會被網狀內皮系統攝取而從血流中快速清除，而納米脂質體由于其的小尺寸效應、表面效應可使其逃避網狀內皮系統的攝取而延長藥物在體內的停留時間，進而達到病變部位。
目前，國內外已有許多將順磁性金屬離子及其螯合物包被于脂質體中的報道，已有技術主要可分兩類第一類是利用脂質體將所需要的診斷劑包裹在中心水性腔內，因這些螯合物均是親水性的，極易從脂質膜中滲漏，包封率較低(參見hter J Pharm，2006，312 :105-112.Uyen M Le, Zhengrong Cui, et α 1.Long-circulating gadolinium-encapsulated liposomes for potential application in tumor neutron capture therapy)，而一些采取適合脂質體包裹水溶性藥物的方法如復乳法制備的多室脂質體(參見 Acad J Sec Mil Med Univ. 2007,28(1) :87-90. ZHANG Wei, GENG Fang, et α 1. Preparation and characterization of pulmonary targeting DepoFoam loaded MR contrast media :gadopentetate dimeglumine),雖然包封率提高，但其粒徑較大，在微米級范圍；第二類是將所需要的螯合物與疏水性“錨”基結合，使螯合物限定在脂質體膜上，這類結合物已報道的有Hnatowich等人的DTPA-二硬脂酰胺(參見J Nucl Med, 1981,22 :810-814. Hnatowich D J, Friedman B, Clancy B, and Novak Μ. Labeling of Preformed Liposomes with Gd_67and Tc_99m by Chelation), Kabalka 等人的 DTPA- 二硬脂酰酯(參見 Magn Reson Med 1991，19 :406-415. Kabalka G W, Davis M A. et α 1.Gadolinium-labeled liposomes containing amphiphilic Gd-DTPAderivatives of varying chain lengthtargeted MRI contrast enhancement agents for the liver) 和 Volkmar 等人的 DTPA-PLL-NGPE 多螯合聚合物(參見 Colloids and Surfaces B Biointerfaces,2000,18,293-299. Weissig V, Babich J, Torchilin V. Long-circulating gadolinium-loaded liposomes -potential use for magnetic resonance imaging of the blood pool)，此類方法制備的脂質體穩定性較好，釓螯合物或絡合物不易從脂質膜滲漏出來，但其制備步驟比較復雜，一些成分也較昂貴，并且一些水不溶性物質無法從肝臟中消除，而永久保留其中。
實體瘤生長與轉移離不開血管生成，是所有實體瘤的共同特征。若無血管生長，實體瘤不能長到1 2mm3以上大小。為此，血管生成成為當今腫瘤診治的可靠靶點。血管內皮細胞屬于可暫時被血管生成因子活化的正常組織，在缺氧或血管生成促進因子存在下，可能通過發芽生長新的毛細血管。
腫瘤新生血管內皮細胞可以特異地表達許多受體，從而將他們與靜止期血管內皮細胞區別開來。研究資料證實，血管內皮細胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)和新生血管內皮細胞表達整合素受體ανβ3;這些受體特異性高，在全身其它組織幾不表達(整合素受體ανβ3在部分器官中有較高的表達)。有人應用噬菌體展示技術，發現整合素參與放射引起的腫瘤血管生成，其中含有 R⑶片段是整合素的主要配體。R⑶三肽能特異性地與整合素受體中的β3亞單位結合，從而有效地抑制腫瘤血管生成，最終達到延緩或抑制腫瘤生長的療效。血管內皮細胞生長因子VEGF是VEGFR的配體，在許多實體瘤表達明顯上調；它具有與VEGFR特異性地結合，誘導內皮細胞增殖和促進血管生長樣作用，是目前作用最強、特異最高的血管生成因子。Soker 等(Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-induced Endothelial Cell Proliferation by a Peptide Corresponding to the Exon 7-Encoded Domain of VEGF165. J BC 1997，272，31582-31588)發現 VEGF 存在多個外顯子；其中，外顯子7編碼44個氨基酸的多肽，與VEGF競爭結合到VEGFR上，抑制血管生長。Roselyna Binetruy-Tournaire^ (Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. EMBO J. 2000 Apr 3,19(7) :1525-33)采用噬菌體庫技術，篩選到一個多肽分子，ATWLPPR，它能特異性地與VEGF競爭地結合到細胞表面的VEGFR KDR上，從而在體內與體外抑制內皮細胞增殖與血管生成。周彩存等人(腫瘤，2008年6月第觀卷第6期第495頁，靶向腫瘤新生血管的順磁性納米脂質體在MRI 診斷肺癌中的研究，)將RGDlO多肽分子(序列GARYCRGDCFDG，靶點為整合素ανβ3，親和常數 9. 41 X IO7)、F56 多肽(序列 WHSDMEWWYLLG，靶點為 VEGFR-I，親和常數為 3. 87 X IO7)、 K237多肽分子(序列HTMYYHHYQHHL，靶點為VEGFR-2，親和常數為5. 98 X IO7)分別與棕櫚酸 (Pal)和α -氨基己酸(C6)的連接物用于腫瘤靶向脂質體中，磁共振成像對比結果表明，整合素α V β 3和VEGFR-I配體靶向脂質體在MRITl加權像上腫瘤信號強度明顯增強，達到對照的1. 8 2. 8倍，清晰顯示直徑2 5毫米微小腫瘤病灶。其中含I3aI-Ce-RDGlO的脂質體的成像有效時間達到1. 5小時。中國專利文獻CN101301479A公開了一種用于磁共振成像診斷的腫瘤靶向顯影組合物及其制備方法，但其載釓濃度偏低，釋放速度也較快，因此在動物試驗中表現為有效的顯影時間較短，而且信號的比對度尚難以滿足臨床應用要求。發明內容
本發明的目的是公開一種用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體及其制備方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
所述用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，由如下重量百分比的組分組成
以金屬釓的重量計的Gd3+螯合物8 30份卵磷脂脂質體穩定劑脂質體修飾劑多肽分子連接物20-80 份5-20 份2 10份0.1-2.5 份緩沖液800 1000份
進一步的，優選的，所述用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，由如下重量百分比的組分組成
以金屬釓的重量計的Gd3+螯合物10~20份
卵磷脂脂質體穩定劑脂質體修飾劑多肽分子連接物緩沖液40-60 份 10-20 份 5~8份 0.5-1.5 份 800-1000 份
上述的Gd3+螯合物為金屬釓的三價離子與螯合劑的螯合物，其用量是以金屬釓的重量為計算基準的，下同；所述螯合劑選白DTPA、DTPA-BMA、DOTA、D03A-HP或D03A-butrol，優選 DTPA 或 DTPA-BMA ；
所述Gd3+螯合物可采用市售產品，如德國Bayer Schering Wiarma公司的釓噴酸葡胺注射液或Amersham Health公司的釓雙胺產品，或者采用李鐵福等人(“MRI順磁性造影劑Gd-DTPA的合成”，化學試劑，2004，26 (3)，ppl90_191)或Tatjana, N等人 ("Paramagnetic liposomes containing amphiphilic bisamide derivatives of Gd-DTPA with aromatic side chain groups as possible contrast agents for magnetic resonance imaging”，Eur Biophys J (2006) 35 :136-144)文獻報道的方法進行制備；
所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂或氫化蛋黃卵磷脂；
所述脂質體穩定劑選自膽固醇、硬脂胺、磷脂酸或維生素E，優選膽固醇或維生素 E
所述脂質體修飾劑選自聚乙二醇磷脂化衍生物，優選如聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺 PEG-PE、聚乙二醇-磷脂酰膽脂PEG-PC或聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE ；最優選聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺PEG-DSPE ；其中，聚乙二醇的分子量選用2000 5000 ；
所述多肽分子連接物選自RDGlO多肽與棕櫚酸的連接物、F56多肽與棕櫚酸的連接物或K237多肽與棕櫚酸的連接物、RDGlO多肽與棕櫚酸和α -氨基己酸的連接物、F56 多肽與棕櫚酸和α-氨基己酸的連接物或Κ237多肽與棕櫚酸和α-氨基己酸的連接物，其中，α-氨基己酸作為所述多肽和棕櫚酸的連接臂；
所說多肽與棕櫚酸的連接物中，多肽分子的末端氨基與棕櫚酸的羧基形成酰胺鍵共價結合；所說多肽與棕櫚酸和α-氨基己酸的連接物中，α-氨基己酸的羧基與多肽分子的末端氨基以及α-氨基己酸的氨基與棕櫚酸的羧基分別形成酰胺鍵共價結合；
術語“RDG10 多肽”，在“Novel RGD Iipop印tides for the targeting of liposomes to integrin-expressing endothelial and melanoma cells，，，Protein Engineering, Design &Selection vol. 17no. 5pp. 433-441,2004, Peter H0lig等人的文獻中有詳細的報道；
術語“F56多肽”，SUPPRESSION OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS BY A VEGFR-I ANTAGONIZING PEPTIDE IDENTIFIED FROM A PHAGE DISPLAY LIBRARY,Int. J. Cancer :111, 165-173(2004)，Ping An等人的在文獻中有詳細的報道；
術語“K237 多肽”，在“A Novel Peptide Isolated from a Phage Display Library Inhibits Tumor Growth and Metastasis by Blocking the Binding of Vascular Endothelial Growth Factor to Its Kinase Domain Receptor，，，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol. 277,No. 45,Issue of November 8，pp. 43137-43142，2002， Lei Hetian等人的文獻中有詳細的報道；
所述多肽分子連接物，可采用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethoxy carbony，Fmoc) 固相合成法進行制備，然后采用高效液相色譜柱提純；所說Fmoc固相合成法可以采用熊瑛等人(Eptifibatide的固相合成及分離純化，廈門大學學報(自然科學版)2007年1月第 46卷第1期第100 103頁)文獻報道的方法，所說多肽與棕櫚酸和α-氨基己酸的連接物的固相法肽鍵的合成次序可以采用首先合成多肽-α-氨基己酸連接肽鍵，再合成α-氨基己酸-棕櫚酸之間的肽鍵，或者先合成α -氨基己酸-棕櫚酸之間的肽鍵，然后合成多肽-α-氨基己酸之間的肽鍵；
所述的緩沖液選自ρΗ為6. 8 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液或生理鹽水；
本發明的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體的制備方法，包括如下步驟
(1)將卵磷脂、脂質體穩定劑和脂質體修飾劑溶解于乙醇，獲得溶液I，將多肽分子溶于二甲基亞砜，獲得溶液II，然后將兩種溶液混合，減壓蒸干溶劑，獲得脂類薄膜；
溶液I中，卵磷脂的含量為10 50mg/ml，脂質體穩定劑的含量為2. 5 16. 5mg/ ml，脂質體修飾劑的含量為1 6. 7mg/ml ；
脂質體修飾劑脂質體穩定劑卵磷脂=1 2 2. 5 8 10，重量比；
溶液II中，多肽分子的含量為50 200mg/ml ；
溶液I 溶液 II = 1 0. 0012 0. 0065，體積比；
(2)將脂類薄膜與含有Gd3+螯合物的緩沖溶液進行水合反應，反應溫度為30 50°C，反應時間為2 4小時，獲得脂質體懸浮液；
所述含有Gd3+螯合物的緩沖溶液中，Gd3+螯合物的濃度為0. 05 0. 4mmol/ml ；
脂類薄膜的用量為20 110mg/ml含有Gd3+螯合物的緩沖溶液；
(3)將所得脂質體懸浮液高壓均質，壓力為40 90MPa，循環次數為5 15次，控制粒徑在20 200nn ；
(5)用0. 22微米濾膜過濾除菌，獲得產品。
本發明提供的于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，由順磁性造影劑、卵磷脂、脂質體穩定劑、脂質體修飾劑、多肽分子作為組分制備而成，本發明將大量釓造影劑包入脂質體中，獲得了高的藥/脂比值，通過釓造影劑的納米脂質體化和靶向多肽修飾，達到腫瘤識別和造影劑延緩(延長造影劑腫瘤部位的有效時間)，提高磁共振造影成像診斷早期腫瘤的效能。
采用本發明的方法，可以制備小粒徑、性能穩定的高載釓量的脂質體制劑，并通過提高磷脂濃度提高其包封率，且脂質體修飾劑的加入延緩了其釋放時間，提高了穩定性。
本發明采用了無水乙醇作為磷脂類的有機溶劑，因為高純度的卵磷脂可完全溶于乙醇，其他穩定劑和修飾劑也可溶于乙醇，這樣既排除了文獻常用的毒性較大的有機溶劑氯仿或甲醇的殘留，又減少了環境污染，降低了生產成本，且保護了操作人員的安全，更適合于工業化生產。

圖1為腫瘤靶向順磁性脂質體制劑的透射電鏡照片。
具體實施方式
通過下面實施例說明本發明的具體實施方式
，但本發明的保護范圍，不局限于此。
超濾離心法測定脂質體的包封率精密量取脂質體0. 3ml置于超濾管中超速離心 13000rpm離心lOmin，定量取離心下液，消解后采用等離子體電感耦合發射光譜法測定清液中釓的含量為游離藥物量Wis。另精密量取同脂質體0. 3ml直接消解后采用等離子體電感耦合發射光譜法檢測釓含量為總藥物量W^按下式計算脂質體對釓螯合劑的包封率QW% =(W總-W游)/W總 X100% ；
其中Qw代表重量包封率，％，W總代表藥物的總投入量，mg/ml, W游代表未包入脂質體的藥物量，mg/ml。
實施例1
稱取大豆卵磷脂4g、膽固醇lg、維生素EO. 4g、PEG_DSPE2000(德國Lipod公司)0. 4g溶于IOOml無水乙醇，0. 02g多肽分子(Pal_C6_RDG10，上海市肺科醫院)溶于0. 2ml 二甲基亞砜，兩者混勻，45°C恒溫減壓下旋轉蒸發去除溶劑形成脂質薄膜；加入 Gd-DTPA螯合物濃度為0. lmmol/ml的pH7. 4磷酸鹽緩沖溶液100ml，進行水合洗脫薄膜2h，制得脂質體懸浮液；將脂質體懸浮液進行高壓均質，50MI^下均質15次，0. 22微米微孔濾膜過濾除菌，獲得產品。
用動態光散射激光粒度分析儀測定其體積平均粒徑為121nm，超濾離心法測定釓螯合劑的包封率為56. 4%，其透射電鏡照片如圖1所示。
實施例2
稱取蛋黃磷脂6g、膽固醇2g、維生素E0. 6g、PEG-DSPE2000 (德國Lipod公司)Ig 溶于IOOml無水乙醇，0. 025g多肽分子(RDG10多肽與棕櫚酸的連接物，上海市肺科醫院) 溶于0. 2ml 二甲基亞砜，兩者混勻，40°C恒溫減壓下旋轉蒸發去除溶劑形成脂質薄膜；加入 Gd-DTPA-BMA螯合物濃度為0. 2mmol/ml的生理鹽水100ml，進行水合洗脫薄膜3h，制得脂質體懸浮液；將脂質體懸浮液進行高壓均質，60MI^下均質10次，0. 22微米微孔濾膜過濾除菌，獲得產品。
實施例3
稱取氫化大豆磷脂10g、膽固醇5g、維生素E0. 5g、PEG-DSPE2000 (德國Lipod 公司)2g溶于IOOml無水乙醇，0.04g多肽分子(Pal_C6_RDG10，上海市肺科醫院)溶于0.二甲基亞砜，兩者混勻，35°C恒溫減壓下旋轉蒸發去除溶劑形成脂質薄膜；加入 Gd-DTPA-BMA螯合物濃度為0. 25mmol/ml的pH6. 8，磷酸鹽緩沖溶液100ml，進行水合洗脫薄膜4h，制得脂質體懸浮液；將脂質體懸浮液進行高壓均質，SOMPa下均質8次，0. 22微米微孔濾膜過濾除菌，獲得產品。
權利要求
1.用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，是由如下重量百分比的組分制備的以金屬釓的重量計的Gd3+螯合物8-30 份卵磷脂20-80 份脂質體穩定劑5-20 份脂質體修飾劑2 10份多肽分子連接物0.1-2.5 份緩沖液800-1000 份所述的Gd3+螯合物為金屬釓的三價離子與螯合劑的螯合物，其用量是以金屬釓的重量為計算基準的。
2.根據權利要求1所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，是由如下重量百分比的組分制備的以金屬釓的重量計的Gd3+螯合物10-20 份卵磷脂40-60 份脂質體穩定劑10-20 份脂質體修飾劑5-8份多肽分子連接物0.5-1.5 份緩沖液800 1000 份。
3.根據權利要求1或2所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述螯合劑選自 DTPA、DTPA-BMA、DOTA、D03A-HP 或 D03A_butrol。
4.根據權利要求3所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述螯合劑選自DTPA或DTPA-BMA。
5.根據權利要求1所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述的卵磷脂選自蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化大豆卵磷脂或氫化蛋黃卵磷脂。
6.根據權利要求1所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述脂質體穩定劑選自膽固醇、硬脂胺、磷脂酸或維生素E。
7.根據權利要求1所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述脂質體修飾劑選自聚乙二醇磷脂化衍生物。
8.根據權利要求1所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述多肽分子連接物選自RDGlO多肽與棕櫚酸的連接物、F56多肽與棕櫚酸的連接物或K237 多肽與棕櫚酸的連接物、RDGlO多肽與棕櫚酸和α -氨基己酸的連接物、F56多肽與棕櫚酸和α-氨基己酸的連接物或Κ237多肽與棕櫚酸和α-氨基己酸的連接物，其中，α -氨基己酸作為所述多肽和棕櫚酸的連接臂。
9.根據權利要求1所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體，其特征在于，所述的緩沖液選自pH為6. 8 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液或生理鹽水。
10.根據權利要求1 9任一項所述的用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將卵磷脂、脂質體穩定劑和脂質體修飾劑溶解于乙醇，獲得溶液I，將多肽分子溶于二甲基亞砜，獲得溶液II，然后將兩種溶液混合，減壓蒸干溶劑，獲得脂類薄膜；溶液I中，卵磷脂的含量為10 50mg/ml，脂質體穩定劑的含量為2. 5 16. 5mg/ml, 脂質體修飾劑的含量為1 6. 7mg/ml ；脂質體修飾劑脂質體穩定劑卵磷脂=1 2 2. 5 8 10，重量比；溶液II中，多肽分子的含量為50 200mg/ml ；溶液I 溶液II = I 0. 0012 0. 0065，體積比；(2)將脂類薄膜與含有Gd3+螯合物的緩沖溶液進行水合反應，反應溫度為30 50°C，反應時間為2 4小時，獲得脂質體懸浮液；所述含有Gd3+螯合物的緩沖溶液中，Gd3+螯合物的濃度為0. 05 0. 4mmol/ml ；脂類薄膜的用量為20 110mg/ml含有Gd3+螯合物的緩沖溶液；(3)將所得脂質體懸浮液高壓均質，壓力為40 90MPa，循環次數為5 15次，控制粒徑在20 200nm ；(5)用0. 22微米濾膜過濾除菌，獲得產品。
全文摘要
本發明提供了一種用于磁共振診斷的腫瘤靶向順磁性脂質體及其制備方法，所述脂質體是由如下重量百分比的組分制備的以金屬釓的重量計的Gd3+螯合物8～30份，卵磷脂20～80份，脂質體穩定劑5～20份，脂質體修飾劑2～10份，多肽分子連接物0.1～2.5份，緩沖液800～1000份，本發明將大量釓造影劑包入脂質體中，獲得了高的藥/脂比值，通過釓造影劑的納米脂質體化和靶向多肽修飾，達到腫瘤識別和造影劑延緩，提高磁共振造影成像診斷早期腫瘤的效能，既排除了文獻常用的毒性較大的有機溶劑氯仿或甲醇的殘留，又減少了環境污染，降低了生產成本，且保護了操作人員的安全，更適合于工業化生產。
文檔編號A61K49/18GK102028959SQ20091019647
公開日2011年4月27日申請日期2009年9月25日優先權日2009年9月25日
發明者余蓉蓉, 吳秋芳, 徐云龍, 戎麗娜, 楊景輝, 錢秀珍申請人:上海華明高技術(集團)有限公司

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