專利名稱：一種磁性納米造影劑的制備方法及其在胰腺癌磁共振成像上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種造影劑的制備方法，具體為一種磁性納米造影劑 的制備方法，以及這種造影劑在胰腺癌磁共振成像上的應用。
背景技術：
近年來，磁共振成像技術發展迅速，且已日益成熟完善，已經被 廣泛應用于生物醫學領域，成為臨床診斷和基礎研究中必不可少的重
要工具。磁共振成像(MRI)是一種新的、無創性的成像方法，屬于 生物自旋成像技術，無射線影響。MRI圖象的空間分辨率高，解剖結 構的關系非常清晰，提供的信息不但多于醫學影像中的其他許多成像 術，而且提供的信息也不同與已有的成像術，圖象的灰階所反映的是 MR信號的強弱或弛豫原子核的相位和能級時間的長短，而不像CT圖 象所反映的組織密度的差別。MRI當前已廣泛地應用于臨床，是醫學 影像學非常重要的組成部分。
腫瘤的早期診斷(包括微小腫瘤與腫瘤轉移灶)是有效地降低惡 性腫瘤致死率的關鍵。由于MRI可以用來對生物內臟器官進行無損的 快速檢測，已經成為診斷腫瘤的最為有效方法之一。通常為了增強病變組織與正常組織的圖像之間的對比度以提高病變組織的清晰度，需 要選擇合適的造影增強劑來顯示解剖學特征。目前，臨床上常用的造
影劑是Gd—DTPA，但Gd—DTPA有明顯的不足之處，如循環時間短， 注射后Gd—DTPA可迅速通過細胞間隙，并經腎臟排泄，因此需要相 應的快速掃描設備。此外，Gd-DTPA在體內分布沒有特異性，而且其 價格也較昂貴。相比較而言，超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxides， SP10S)可以局部擴增外加磁場，使磁場不均勻，當水 分子彌散穿過不均勻磁場時加速了質子的失相位，從而使組織的橫向 弛豫時間(T2)明顯縮短，信號降低，而對縱向弛豫時間(Tl)影響 較小。此外，超順磁性氧化鐵在生物體組織內存在很高的特異性分布， 可被網狀內皮系統吞噬，有助于提高腫瘤與正常組織的MRI成像對比 度，同時由于其高效、經濟、安全等特點，作為造影增強劑被應用于 MRI，用于各種腫瘤及其他疾病的檢測。納米氧化鐵外部包裹生物降 解高分子，例如葡聚糖、殼聚糖，可以增強其生物相容性，對細胞無毒， 而且在血管中循環時間大大延長。在超順磁性氧化鐵粒子包裹后表面 連接具有生物活性的專一性抗體，可以大大提高其作為造影劑的靶向 性。
胰腺癌是惡性程度很高的腫瘤，其生物學行為特異，臨床療效不 佳。80%的患者就診時腫瘤已處晚期而無法切除，加之胰腺癌細胞 對放化療有較強的抵抗性，患者病死率達98%。胰腺癌因其獨特的解 剖位置，癥狀隱匿，同時缺乏細胞特異性的造影劑，其早期的磁共振 成像較為困難。本研究制備了生物降解高分子包裹的超順磁性納米粒子，并連接了腫瘤標記物，例如抗癌胚抗元CM9-9單克隆抗體，對其 作為耙向造影劑進行了 一系列體內和體外研究，從而為胰腺癌的早期 磁共振診斷提供有用的參考。
發明內容
本發明的目的在于提供一種磁性納米造影劑及其在胰腺癌磁共 振成像上的應用，以彌補現有技術的上述缺陷。 本發明的目的可以通過以下技術方案來實現。
一種葡聚糖包裹的磁性納米粒子的制備方法，其具體步驟為
1) 將氯化鐵(FeCl3 6H20)、氯化亞鐵(FeCl2 4H20)和葡聚糖 (三者的質量比為5-100: 1-10: 1-50)溶解在100ml蒸餾水中，形成
透明穩定的微乳液體系；
2) 取11111濃度為25%-28%濃氨水(重量)用二次蒸餾水稀釋，將 其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續攪拌10-30分鐘使氨水均勻 分散在微乳液中；
3) 將體系的溫度保持在15-40°C，同時不斷攪拌2-5小時；反 應結束后離心去掉沉淀，分離去掉多余的葡聚糖，最終得到穩定的葡 聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液。
一種磁性納米造影劑的制備方法，其具體步驟為
1)取1-5mLa呢/mU上述葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液，
加入濃度為1Omol/L的髙碘酸鉀溶液50-500uL (氧化劑)，避光反應
5-10小時。2) 將溶液進行分離，把分離后的粒子分散在pH為8. 0的硼酸緩 沖溶液中。
3) 在溶液中加入10-50ul鼠抗人CA19-9抗體，在4"C的條件下 反應過夜。
4) 再加入2mol/L的硼氰化鉀溶液2-5mL,反應5-10小時。
5) 將混合物純化分離，然后分散在pH為7. 4的磷酸緩沖溶液中， 即得到磁性納米造影劑。
經透射電子顯微鏡(TEM)檢測，穩定的葡聚糖包裹的磁性納米 粒子的水溶液的粒徑為30-100 nm。
上述方法制備獲得的造影劑可應用于胰腺癌細胞體外磁共振成像。
通過本發明提供的磁性納米造影劑，在胰腺癌細胞體外磁共振成 像的應用中，可表現出明顯的MRI信號下降，MRI信號下降值達到 28%。從而為腫瘤的診斷提供有用的依據。
圖1為本發明的磁性納米造影劑進入細胞的體外磁共振成像； 圖中a為表面連有磁性造影劑的細胞懸液，b為細胞懸液，c 為PBS溶液；
圖2為本發明磁性納米造影劑進入小鼠體內的磁共振成像。
具體實施方式
下面結合附圖與具體實施例進一步闡述本發明的技術特點。 1、葡聚糖包裹的磁性納米粒子的制備 實施例1:
將氯化鐵(FeCl3 6H20)、氯化亞鐵(FeCl2'4H20)和葡聚糖三 者的質量比為5: 1: 1，溶解在100ml蒸餾水中，形成透明穩定的微 乳液體系。取lml濃度為25%濃氨水(重量)用二次蒸餾水稀釋，將 其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續攪拌10分鐘使氨水均勻分 散在微乳液中。將體系的溫度保持在15°C，同時不斷攪拌2小時； 反應結束后離心去掉沉淀，分離去掉多余的葡聚糖，最終得到穩定的 葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液。
實施例2:
將氯化鐵(FeCl3 6H20)、氯化亞鐵(FeCl2 4H20)和葡聚糖三 者的質量比為100: 10: 50,溶解在100ml蒸餾水中，形成透明穩 定的微乳液體系。取lml濃度為28%濃氨水(重量)用二次蒸餾水稀 釋，將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續攪拌30分鐘使氨水 均勻分散在微乳液中。將體系的溫度保持在40°C，同時不斷攪拌5 小時；反應結束后離心去掉沉淀，分離去掉多余的葡聚糖，最終得到 穩定的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液。
實施例3:
將氯化鐵(FeCl3 6H20)、氯化亞鐵(FeCl2 4H20)和葡聚糖三 者的質量比為55: 5: 25溶解在100ml蒸餾水中，形成透明穩定的 微乳液體系。取lml濃度為27%濃氨水(重量)用二次蒸餾水稀釋，將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續攪拌20分鐘使氨水均勻
分散在微乳液中。將體系的溫度保持在3(TC，同時不斷攪拌4小時;
反應結束后離心去掉沉淀，分離去掉多余的葡聚糖，最終得到穩定的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液。
實施例4:
將氯化鐵(FeCl3 6H20)、氯化亞鐵(FeCl2 4H20)和葡聚糖三者的質量比為75: 8: 40溶解在100ml蒸餾水中，形成透明穩定的微乳液體系。取lml濃度為27%濃氨水(重量)用二次蒸餾水稀釋，將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續攪拌25分鐘使氨水均勻分散在微乳液中。將體系的溫度保持在35'C，同時不斷攪拌3小時；反應結束后離心去掉沉淀，分離去掉多余的葡聚糖，最終得到穩定的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液。
上述實施例1-4所制備的產物經透射電子顯微鏡(TEM)檢測，其粒徑大約為30-100 nm不等。
2、磁性納米造影劑的制備實施例1
1)取一定量的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液，加入高碘酸鉀溶液(氧化劑)，避光反應5小時。將溶液進行分離，把分離后的粒子分散在pH為8. 0的硼酸緩沖溶液中。在溶液中加入10ul鼠抗人CA19-9抗體，在4X:的條件下反應過夜。再加入硼氰化鉀溶液反應5小時。將混合物純化分離，然后分散在pH為7. 4的緩沖溶液中，即得到磁性納米造影劑。實施例2
1)取一定量的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液，加入高碘酸鉀溶液(氧化劑)，避光反應10小時。將溶液進行分離，把分離后
的粒子分散在pH為8. 0的硼酸緩沖溶液中。在溶液中加入50ul鼠抗人CA19-9抗體，在4"C的條件下反應過夜。再加入硼氰化鉀溶液反應10小時。將混合物純化分離，然后分散在pH為7. 4的緩沖溶液中，即得到磁性納米造影劑。實施例3
1)取一定量的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液，加入高碘酸鉀溶液(氧化劑)，避光反應8小時。將溶液進行分離，把分離后的粒子分散在pH為8. 0的硼酸緩沖溶液中。在溶液中加入30ul鼠抗人CA19-9抗體，在4'C的條件下反應過夜。再加入硼氰化鉀溶液反應8小時。將混合物純化分離，然后分散在pH為7. 4的緩沖溶液中，即得到磁性納米造影劑。
3、利用功能性磁性納米粒子進行胰腺癌細胞體外磁共振成像研
究
1) 取適量磁性造影劑分散在細胞培養液RPMI1640中，過濾除菌。然后，將粒子與胰腺癌細胞BXPC-3 (細胞濃度為1X106個/mL)共同孵育2小時，用胰酶進行消化，然后離心去除未反應的粒子。
2) 把處理好的細胞用0.5-2%戊二醛固定，然后分散在PBS中，進行體外磁共振成像。
結果見附圖l，由圖可以看出連有粒子的細胞懸液與正常細胞相
比，在T2-weight和T*2-weight上都表現出明顯的MRI信號下降，在T*2ieight上MRI信號下降值達到28%。
4、利用功能性的磁性納米粒子進行胰腺癌細胞體內磁共振成像
研究
1) 將胰腺癌細胞BXPC-3制成1X106的細胞懸液，注入成年裸鼠(體重在20-30g)單側腋下皮下，培養2-3周，待腫瘤長到1cm左右。
2) 將裸鼠麻醉后，進行磁共振成像，然后按照卜2mg Fe/kg體重的劑量注入磁性納米造影劑，然后在不同時間對小鼠進行磁共振掃描。
結果見附圖2，由圖可以看出采用T2-weight序列成像，未打入造影劑之前，腫瘤呈現出較高的MRI信號，打入造影劑后，腫瘤MRI信號開始下降，腫瘤與正常相比一直呈現較低的MRI信號強度。打入造影劑兩小時后，腫瘤MRI信號的下降值達到25%，從而為腫瘤的診斷提供有用的依據。
權利要求
1、一種葡聚糖包裹的磁性納米粒子的制備方法，其特征在于其具體步驟為1)將FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O和葡聚糖三者按照質量比為5-100∶1-10∶1-50的比例溶解在100ml蒸餾水中，形成透明穩定的微乳液體系；2)取1ml濃度為25％-28％濃氨水用二次蒸餾水稀釋，將其緩慢加入到不斷攪拌的微乳液中，持續攪拌10-30分鐘使氨水均勻分散在微乳液中；3)將體系的溫度保持在15-40℃，同時不斷攪拌2-5小時；反應結束后離心去掉沉淀，分離去掉多余的葡聚糖，最終得到穩定的葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液。
2、 根據權利要求1所述的一種葡聚糖包裹的磁性納米粒子的制備方法，其特征在于葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液的粒徑為30-100 nm。
3、 一種磁性納米造影劑的制備方法，其特征在于其具體步驟為[1) 取濃度為lmg/mL的上述葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液l-5mL，加入濃度為10mol/L的高碘酸鉀溶液50-500uL，避光反應5-10小時；[2) 將溶液進行分離，把分離后的粒子分散在pH為8. 0的硼酸緩沖溶液中；3) 在溶液中加入10-50ul鼠抗人CA19-9抗體，在4。C的條件下反應過夜；4) 再加入2mol/L硼氰化鉀溶液2-5mL，反應5-10小時；5) 將混合物純化分離，然后分散在pH為7. 4的磷酸緩沖溶液中，即得到磁性納米造影劑。
4、根據權利要求3所述的磁性納米造影劑的制備方法，起特征在于制備獲得的造影劑可應用于胰腺癌細胞體外磁共振成像。
全文摘要
本發明公開了一種造影劑的制備方法，具體為一種磁性納米造影劑的制備方法，以及這種造影劑在胰腺癌磁共振成像上的應用。取適量葡聚糖包裹的磁性納米粒子的水溶液，加入高碘酸鉀溶液，避光反應5-10小時。將溶液進行分離，把分離后的粒子分散在pH為8.0的硼酸緩沖溶液中。在溶液中加入10-50μl鼠抗人CA19-9抗體，在4℃的條件下反應過夜。再加入適量硼氰化鉀溶液反應5-10小時。將混合物純化分離，然后分散在pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，即得到磁性納米造影劑。通過本發明提供的磁性納米造影劑，在胰腺癌細胞體外磁共振成像的應用中，可表現出明顯的MRI信號下降。從而為腫瘤的診斷提供有用的依據。
文檔編號A61K49/06GK101648025SQ20091019515
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月4日 優先權日2009年9月4日
發明者沈鶴柏, 飛 繆, 高明遠, 黃明鳴 申請人:上海師范大學