一種可再細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法

專利名稱：一種可再細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物瓣瓣膜材料的交聯制備方法，更確切地說，本發明涉及一
種去甲二氫愈創木酸作為交聯劑交聯制備可再細胞化生物瓣瓣膜材料的方法，屬生物醫 學工程學領域。
背景技術：
心臟瓣膜病變是危及人類健康的一種重要疾病。其主要治療方法為心瓣膜置換 術。自1960年Harken和Starr首先用人工球籠式機械瓣置換主動脈瓣和二尖瓣以來，人 工心臟瓣膜獲得了醫學界極大的關注和重視，因此也取得了顯著的進步。
目前，人工心臟瓣膜有機械瓣和生物瓣兩大類。機械瓣在使用了各向同性低溫 熱解碳(或氧化鈦)為材料(或改性材料)后， 一定程度上改善了機械瓣的血液相容性等 性能，使得機械瓣得到了廣泛使用。但由于機械瓣有難以克服的非生理性、瓣膜在不同 程度上阻礙了正常血液流動狀態，手術后的血栓率以及因為必須終身服用抗凝藥物可能 造成的出血并發癥，使得人們在使用機械瓣的同時，不得不關注并探索生物瓣的研制。
臨床應用的幾種生物心臟瓣膜(異種有架生物瓣、無架生物瓣、同種異體主動脈 瓣、自體肺動脈瓣等)具有與人體心臟瓣膜相類似的血流動力學性能和優良的生物相容 性。心瓣膜置換患者僅需短期或不需抗凝治療，特別適用于65歲以上的患者和不宜使用 抗凝藥物或術后難以進行抗凝監測的患者。根據美國胸外科醫師學會國家心臟外科數據 庫8萬多例患者的統計，20世紀90年代生物瓣在主動脈瓣置換術中占37.6%， 二尖瓣置 換術中占23.1%，表明生物瓣具有很大的臨床使用價值。生物瓣中使用最多的是經過戊 二醛處理固定后的豬主動脈瓣。戊二醛處理脈瓣后，提高了瓣膜的強度和韌性，并在很 大程度上掩蓋和減少了生物材料的免疫原性。但植入人體后3周即出現生物瓣的致命弱 點——鈣化，繼而引起血栓，并反過來促進鈣化的生成，使瓣膜失去功能。 一般10年內 約有1/3的患者需再次進行心瓣膜置換術。近年來盡管在改善生物瓣設計和防止鈣化等 方面作了大量研究工作，但目前仍不理想。傳統帶架的異種生物瓣的設計與天然心臟瓣 膜功能相差較大。有架瓣膜存在瓣膜啟閉應力集中的缺點，機械應力集中在異種生物瓣 的鈣化變性過程中起了主導作用；無架生物瓣盡管減少了應力集中，但瓣膜組織內失活 的內皮細胞、結締組織細胞及其碎片留存在瓣膜的內層和表面，形成早期鈣化的好發部 位，仍無法避免無支架瓣膜植入人體后的鈣化變性；低溫保存的同種主動脈瓣植入人體 后，組織內原有的細胞消失，在其組織纖維上可見宿主細胞和細胞外間質生長，瓣膜組 織結構的完整性得以延續，但同種主動脈瓣的來源受限，更由于瓣膜內各種有核細胞膜 的表面上分布有組織相容性抗原，供者與受者之間需配型以減少機體免疫反應而使其來 源更少，并且植入后仍有一系列排斥問題需處理[Schoen FJ.New frontiers in the pathology and therapy of heart valve disease : 2006 society for cardiovascular pathology, distinguished achievement award lecture.United States Canadian Academy of Pathology, Atlanta, GA， February 12， 2006.Cardiovasc Patho12006 ; 15: 271-279.， Schoen FJ， Levy RJ.Tissue heartvalves : Current challenges and future research perspectives.J Biomed Mater Res 1999 ; 47 : 439-465.]。同時，同種主動脈瓣組織內凋亡或變性的細胞隨低溫保存的時間延長而增 多，植入人體后這些凋亡或變性的細胞誘發炎性反應，導致瓣膜內皮丟失和細胞外間質 毀損。自體肺動脈瓣的解剖學和組織結構形態學與主動脈瓣存在差異，且自體肺動脈瓣 移植到主動脈瓣部位后需在肺動脈瓣位植入人工心臟瓣膜，在臨床應用中仍有缺憾。
因此，鈣化、免疫原性和耐久性差是目前所有生物瓣不能廣泛使用的共同缺 點，減少鈣化、降低免疫原性和提高生物瓣的耐久性是生物瓣研制的主要方向。近幾年 隨著組織工程技術的日益提高，采用組織工程技術研制瓣膜的研究工作已取得了初步成 果。理想的組織工程心臟瓣膜是指應用組織工程技術復制出的一種具有細胞活性的新型 生物瓣膜。其原理是利用可吸收的聚合物或其他生物材料為支架，將活細胞種植于瓣膜 支架上，制造出一種與受體組織相容性好，有活力而無免疫原性，不需抗凝，耐久性強 的生物心臟瓣膜。移植后能支持患者心臟功能至終生。這種理想的瓣膜不僅能為正在成 長的患者提供增長能力，還能修復累加的創傷。1995年Shinoka應用此技術，將羊成纖 維細胞(Fibroblasts, FBCs)及血管內皮細胞依次種植于人工合成的聚乙醇酸/聚乳酸支架 上制成瓣膜，植入羊肺動脈瓣區，獲得初步成功，表明組織工程生物瓣的研制已有了一 個良好的開端。 組織工程瓣膜的研制主要有三方面的工作(1)支架材料的選擇及加工處理； (2)種子細胞的選擇及培養；(3)在特定的環境中，將細胞種植到支架材料上，并進行適 應體內環境的重構。其中組織工程瓣膜支架的選材及處理尤為重要，好的組織工程瓣膜 支架可以方便細胞的種植、構建，甚至可以直接在體內誘導細胞貼附，繼而向內長入、 分化、細胞外基質代謝等瓣膜重建過程。因此組織工程生物瓣膜支架需要足夠的機械強 度、抗炎、無毒、好的細胞相容性等性能。 雖然目前可吸收的高分子材料支架，在材料來源方面具有一定的優勢，但由于 心臟瓣膜是個復雜的三維結構，人工合成支架構建心臟瓣膜還涉及支架結構按照瓣膜血 液流變學原理塑形，難度較大，短期內不可能進入臨床。同時，組織工程生物瓣膜要想 進入臨床必須克服穩定性、安全性對病人心理的影響。由于每個人的代謝能力和生理特 點各不相同，因而要制備降解速率適合每個病人瓣膜再生速度相匹配的組織工程生物瓣 膜，目前還是極大的難題，必須在原有的較為可靠的生物瓣的基礎上，向組織工程生物 瓣膜過渡。這就需要一種既能在較長時期內起生物瓣功能，又能在一定時期后隨著材料 的逐漸代謝和細胞的貼附、增殖、長入而細胞化的人工生物瓣膜。 因而應用豬脫細胞主動脈瓣作為新型生物瓣瓣膜材料被國內外學者所重視。脫 細胞法處理動物來源的瓣膜材料可防止細胞殘片引起免疫反應。通過去垢劑、酶消化和 超聲清洗等方法徹底抽提細胞，保留由膠原蛋白、彈性蛋白、纖粘連蛋白(fibronectin)和 層粘連蛋白(laminin)組成的天然支架結構。這種材料植入犬體內試驗結果顯示，無炎癥 反應、不致瘤、不f丐化，而且有可能再生內皮。因而脫細胞材料成為人們探索新型可再 細胞化生物瓣瓣膜材料的一種重要選擇。 2001年以來，Koob TJ等為構建組織工程肌腱修復肌腱損傷而尋找一種用于交 聯膠原蛋白的交聯劑，發現從灌木Larrea divaricata中分離提取出來的一種二元酚—— NDGA，是 一 種優良的膠原蛋白交聯劑[Thomas J.Koob， Daniel J.Hernandez.Materialproperties of polymerized NDGA-collagen composite fibers : development of biologically based tendon constructs Biomaterials， Volume 23， Issue 1， January 2002， P203-212.， Thomas J.Koob.Biomimetic approaches to tenden repair.Comparative Biochemistry and Physiology-Part A : Molecular & Integrative Physiology, Volume 133， Issue 4， December 2002， P1171-1192.]。他們將此二元酚加入到I型膠原纖維中，得到拉伸強度超過天然肌腱2倍 的膠原纖維。其拉伸強度和彈性模量較戊二醛膠聯的膠原纖維分別高出約50%和20%， 較碳化二亞胺交聯的材料分別高出約230%和220%。
NDGA交聯的膠原纖維表現出優 良的生物相容性，可快速長入肌腱成纖維細胞。NDGA是兒茶酚的二聚體，氧化后變成 二醌，再經氧化實現分子間縮合。縮合前后的醌基團可與蛋白質中Lys和Arg等堿性氨 基酸殘基的"氨基反應，從而將膠原纖維交聯起來，這一交聯機理不同于戊二醛等交聯 劑直接交聯賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)等堿性氨基酸殘基，也不同于碳化二亞胺等交聯 劑直接交聯堿性氨基酸殘基Lys和酸性氨基酸殘基天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)等。除 了交聯特性之外，作為兒茶酚的衍生物，NDGA還是一種抗氧化劑，能清除多種活性氧 自由基，保護肌體免受氧化損傷。參與細胞外和細胞內的信號轉導而調節肌體的代謝， 如通過抑制Smad信號途徑抑制轉形生長因子P (transforming growth factor- P )的活性[7， 8]。研究還發現NDGA還具有較弱的雌激素活性，可以調節肌體的生長發育。NDGA的 這些作為交聯劑的特點和其優良的生理活性表明，NDGA很適合用于交聯動物心臟瓣膜 材料，使交聯的材料不僅可保持其天然性能，還能滿足瓣膜正常的力學性能要求，便于 再細胞化。但至今未見采用NDGA交聯脫細胞動物心臟瓣膜制備生物瓣瓣膜材料的報道 和相關專利。 基于上述分析，本發明擬以脫除細胞的豬心臟主動脈瓣膜為材料，采用NDGA 交聯處理法對瓣膜進行交聯、增強力學性能，制備出性能優良的可再細胞化的生物瓣瓣 膜材料。

發明內容
本發明目的在于提供一種可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，它是通過去
甲二氫愈創木酸作為交聯劑對天然生物瓣瓣膜材料的交聯而實現。所述的去甲二氫愈創
木酸(nordihydroguaiaretic acid NDGA，又名3， 4- 二羥基愈創木酸，橙花醇乙酸酯)。本 發明制備的生物瓣瓣膜材料不僅能保持瓣膜的天然形態和柔軟性，增強材料的力學強度 和穩定性，并有很好的細胞相容性，有利于植入人體后的細胞遷移、增殖、生長和組織重建。 具體地說，本發明提供的生物瓣瓣膜材料的制備方法包括(1)豬主動脈天然心臟 瓣膜作脫細胞處理和(2)脫細胞后的生物瓣瓣膜材料的交聯，現分述如下
( — )天然瓣膜的脫細胞過程 l.將屠宰場采集的新鮮豬主動脈瓣膜，放入l-6t:、加入雙抗的無Ca、 Mg的磷 酸緩沖液(D-Hanks液)中，2小時內帶回，在4。C下、4小時內剪下瓣膜葉片后，用無菌 D-Hanks液清洗干凈。所述的D-Hanks液配方為無Ca、 Mg離子的磷酸緩沖液將0.4g KCl， 0.06g KH2P04， 8.00g NaCl， 0.35g NaHC03和0.09g Na2HP04 7H20溶解于1L超純 水中。超純水的電阻為18.2MQ
2.將取回的豬主動脈瓣膜放入l-6t:的無菌D-Hanks液作為儲存運輸液，用1-6°C 平衡鹽緩沖液D-Hanks液清洗三遍。 3.將剪下的瓣膜葉片放入脫細胞液中，l-4(TC下60-360rpm(轉/分鐘)轉速搖動 脫除瓣膜細胞8-96小時，清洗干凈，使用DNA酶和RNA酶液37t:下60-360rpm轉速搖 動降解脫除細胞核成分消化12-96小時，脫去細胞核，以完全去除瓣膜材料上的細胞成 分，降低材料的免疫原性。所述的脫細胞溶液配方為將O.lg胰蛋白酶、0.5g非離子去 垢劑聚乙二醇辛基苯基醚(4-(1， 1， 3， 3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,商 品名Triton X-IOO，即曲利通)、0.5g脫氧膽酸鈉和0.02g EDTA溶解于lOOmL超純水中。 所述的DNA酶與RNA酶液配方為用D-Hanks液在l-4"下配制的20 y g/ml的核酸酶 (RNase)和0.2mg/ml的脫氧核酸酶(DNase)按1 : 1體積比混合即可。
4.用超純水配制的無菌D-Hanks液，將脫細胞生物瓣瓣膜材料在1-40°C下、 60-360rpm轉速搖動清洗瓣膜細胞殘留的細胞碎片、游離蛋白質和核酸等大分子5-10次， 每次l-2小時，最后再次用超純水配制的無菌D-Hanks液充分清洗干凈，得到脫細胞天然 生物瓣瓣膜材料。用D-Hanks液清洗脫細胞生物瓣膜材料的最佳環境條件是37°C 。
( 二 )脫細胞天然生物瓣瓣膜材料的交聯 l.NDGA在堿性條件下的溶解度比在中性條件下大，因此先稱取lOOmg NDGA 溶于2mL濃度為lmol/L NaOH中，然后用D-Hanks溶液將其稀釋成0. l-10mg/ml的NDGA 交聯劑溶液中，推薦組分為O.l， 0.5， 1.5， 2.5， 5mg/mLNDGA溶液。
2.將完全脫細胞后的瓣膜材料浸入0.1-10mg/ml的NDGA交聯劑溶液中，1-40°C 恒溫60-360rpm/min恒速搖蕩交聯2-96小時，使交聯劑與瓣膜成分接觸。同時以6.25mg/ ml的戊二醛溶液交聯作為對照。 3.取出的瓣膜材料在D-Hanks中l-4(TC條件下60-360rpm搖動條件下震蕩清洗10 遍，每遍持續180min。4.交聯后得到的瓣膜材料浸在D-Hanks液中，可放入l-6。C低溫冰箱作后處理
3-40天，優先推薦后處理7-10天，每天更換D-Hanks溶液；以60-360rmp搖動清洗5-10
次，每次持續3小時，得到本發明交聯的可脫細胞化的生物瓣瓣膜材料。 為了驗證本發明提供的交聯方法制備的生物瓣瓣膜材料的特性，本發明進行形
態學觀察、力學性能測試、穩定性測試、體外毒性測試及體外細胞種植試驗。 (1)形態學觀察 脫細胞后的豬心臟瓣膜在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察其微觀形貌。瓣膜脫水 制樣過程如下 l.將樣品浸泡在濃度為2.5X的戊二醛的D-Hanks溶液中4個小時。取出后用 D-Hanks緩沖液清洗三遍，每遍持續10分鐘。 2.把瓣膜浸泡在濃度梯度依次提高的乙醇溶液中(乙醇的體積份數分別為30% ， 50%， 70%， 90%， 95%， 100%)，每個濃度10分鐘，使之脫水。隨后將樣品浸入體積 比為50 : 50的乙醇與六甲基二硅胺烷(HMDS)干燥10分鐘，然后放入100%的HMDS 中干燥10分鐘，最后放入通風櫥中干燥過夜。 3.在觀察之前，將干燥的樣品噴金掃描電鏡觀察其瓣膜材料纖維的形貌。
(2)力學性能的測定(最大抗張強度與彈性模量)
新鮮豬心臟瓣膜、未交聯的、NDGA交聯的和戊二醛交聯的以及2.5mg/ml NDGA交聯后在D-Hanks溶液中保存ld、 3d、 7d及15d的脫細胞天然生物瓣瓣膜材料， 作最大抗張強度和彈性模量等力學性能的測定。測試的步驟如下 1.將要測試的瓣膜沿膠原纖維的方向剪成寬約4mm，長約25mm的長條。每組
6個樣品，經SHIMADZU材料力學測試儀在2mm/min的拉伸速率下測試最大抗張強度。
最大抗張強度的數值可從電腦顯示的stress-strain曲線圖中直接讀出。 2.取stress-strain曲線的最大斜率即為最大彈性模量，最大彈性模量可以說明瓣
膜材料本身的柔軟度與彈性。 (3)穩定性測試
1.體外酶降解 交聯后的瓣膜膠原纖維與彈性纖維力學性能提高，強度增強，纖維更緊密，穩 定性增強，抗體外酶降解的能力提高。樣品秤重后，浸在1.8mg/mL II型膠原酶的D-Hanks溶液中(酶活力單位1000U/ mL， pH7.4)， 37。C 、 60rpm降解。分別在1 、 4和24h后加入50 y L 10mmol/L EDTA終
止反應，剩余樣品干燥至恒重，再次秤重(Wt)。瓣膜酶解后的相對殘留量(WX)可以通
過下式計算 W%=Wt/W0X100 式中W。表示每個樣品的初始質量，Wt表示相應的每個樣品酶降解后的質量。 殘留量百分比越高，說明抗酶降解能力越強，交聯后的材料越穩定。
2.NDGA體外釋放動力學的測定 (1)測定NDGA標準曲線將NDGA用D-Hanks液配置成200 y g/ml的標準溶 液，進行全波長掃描，找到最大吸收峰位置437nm。后在437nm處測定不同濃度NDGA 的OD值，得到NDGA濃度-OD值標準曲線。(2)NDGA樣品濃度的測定NDGA樣品 在437nm處測定OD值，以濃度-OD值的標準曲線推算出NDGA樣品濃度。(3)NDGA 體外釋放動力學的測定NDGA交聯的瓣膜材料放置于D-Hanks緩沖液中，定時收集浸 泡瓣膜的緩沖液，每天進行換液，測定NDGA釋放的濃度。
C4)體外細胞毒性試驗 將10mg NDGA溶于lml的DMSO中，用DMEM培養液稀釋成不同濃度(稀釋 后培養基中DMS0的濃度低于1X)。將牛心臟瓣膜間質細胞、平滑肌細胞或人臍靜脈內 皮細胞(HUVEC)以1000細胞/孔接種于96孔板，培養24小時后，加入上述不同濃度的 NDGA。以系列濃度的戊二醛作毒性對照，同時設空白對照及l^DMSO對照。細胞每 2-3天換液，連續培養7天，MTT法測細胞活力。
(5)體外細胞種植試驗 將交聯和不交聯的生物瓣瓣膜材料剪成直徑10mm的圓片，放入48孔板內，每 片種植1(^個人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，培養24小時后固定、脫水、噴金，掃描電鏡 觀察細胞種植黏附狀態。 綜上所述，本發明公開一種可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法。首先，本 發明以動物心臟瓣膜為原料，經及時處理和脫細胞，得到脫細胞瓣膜的多孔胞外基質材 料。該材料即為天然生物瓣瓣膜材料，但其①力學強度低于天然瓣膜，②殘留免疫原性易引起宿主炎癥反應，③易降解等。所以本發明將此天然材料浸入不同濃度、不同比例 的去甲二氫愈創木酸溶液中，在適當溫度條件下，搖動交聯處理，從而得到無毒性、不 皺縮、柔軟、多孔、胞外基質纖維自然排列、機械強度高，穩定性好，細胞相容性好、 可在l-6t:下長期保存在D-Hanks液中備用，既可當作生物瓣用于臨床心臟瓣膜置換、 修復，又可作為支架用于體內或體外再細胞化構建成組織工程心臟瓣膜應用于臨床。可 以通過調節交聯劑去甲二氫愈創木酸溶液的濃度、交聯的時間和清洗時間等，實現交聯 的力學強度、抗酶解能力、交聯劑釋放、促進組織再生能力等方面的可調控(詳見實施 例)。


圖l脫細胞天然生物瓣瓣膜材料掃描電鏡照片。豬心臟瓣膜作脫細胞處理，并 清洗干凈之后取樣掃描電鏡觀察。照片顯示由細胞外基質組成的多孔結構沒有任何殘留 細胞和細胞碎片。 圖2未交聯及交聯處理的脫細胞生物瓣瓣膜材料。從左至右，l:未交聯處理的 天然生物瓣瓣膜材料；2: 0.625% GA交聯處理的生物瓣瓣膜材料；3: 0.5mg/ml NDGA 交聯處理的生物瓣瓣膜材料；4: 1.5mg/mlNDGA交聯處理的生物瓣瓣膜材料；5: 5mg/ ml NDGA交聯處理的生物瓣瓣膜材料。 圖3為本發明用特殊交聯劑去甲二氫愈創木酸(濃度為0.5、 1.5、 2.5禾P5mg/ ml)所交聯制備的脫細胞生物瓣瓣膜材料的最大抗拉強度(A)和最大彈性摸量(B)比較。 Control:未交聯的脫細胞生物瓣瓣膜材料；GA:傳統交聯劑戊二醛(6.25mg/ml)交聯的 脫細胞生物瓣瓣膜材料。圖NDGA:去甲二氫愈創木酸。"*"表示與未交聯的脫細胞 生物瓣瓣膜材料相比有顯著差異，p<0.05。 圖4為本發明所用特殊天然交聯劑去甲二氫愈創木酸以2.5mg/ml濃度交聯制備 的脫細胞生物瓣瓣膜材料，浸泡于D-Hanks液中保存不同時間后的最大抗拉強度(A)和最 大彈性摸量(B)的變化。"*"表示與未交聯的脫細胞生物瓣瓣膜材料相比有顯著差異， p < 0.05。 圖5為本發明所用特殊天然交聯劑去甲二氫愈創木酸以不同濃度(0.5、 1.5、 2.5 和5mg/ml)交聯制備的脫細胞生物瓣瓣膜材料在抗膠原酶降解后的相對質量比較圖。A : 不交聯的脫細胞組織工程瓣膜；B:傳統交聯劑戊二醛(6.25mg/ml)交聯的脫細胞生物瓣 瓣膜材料。 圖6為本發明所用特殊天然交聯劑去甲二氫愈創木酸(2.5mg/mL)交聯的脫細胞 瓣膜在D-Hanks液中浸泡15天時，交聯劑去甲二氫愈創木酸釋放過程。圖中右上角是去 甲二氫愈創木酸吸光度-濃度標準曲線(線性關系為y = 0.0988x-0.1646， R2 = 0.9757)。 D-Hanks溶液每天換一次，10天之后去甲二氫愈創木酸濃度超出檢測下限之外，所以沒 有濃度結果。 圖7.為本發明所用特殊天然交聯劑去甲二氫愈創木酸和傳統交聯劑戊二醛對瓣 膜間質細胞(A)血管平滑肌細胞(B)和內皮細胞(C)的增殖抑制作用。從圖中可以看出去 甲二氫愈創木酸對三種細胞的增殖抑制毒性均約為戊二醛的1%。 "*"表示與空白對照 或DMSO相比有顯著差異，p<0.05。
圖8.為本發明所用特殊天然交聯劑去甲二氫愈創木酸交聯制備的脫細胞生物瓣 瓣膜材料(A)在種植人臍靜脈內皮細胞24后的低倍(B)和高倍(C)掃描電鏡觀察照片。從 圖中可以看出去甲二氫愈創木酸交聯后對內皮細胞的貼附沒有毒性。 圖9是以每片瓣膜加10ml的比例，加入0.1mg/ml、 0.5mg/ml、 1.5mg/ml和5mg/ ml去甲二氫愈創木酸的D-Hanks溶液，24。C下、以240rpm的搖動速度，交聯2小時(圖 中的3、 4、 5禾P6)、 240小時(圖中的7、 8、 9禾P 10)和72小時(圖中的11、 12、 13和 14)的脫細胞生物瓣瓣膜材料。圖中的l為未交聯的脫細胞生物瓣瓣膜材料，2為戊二醛 交聯的脫細胞生物瓣瓣膜材料。3至14分別代表0.1mg/ml、 0.5mg/ml、 1.5mg/ml禾P 5mg/ ml去甲二氫愈創木酸交聯不同時間的脫細胞生物瓣瓣膜材料，交聯完成后不皺縮，能保 持原有外形，穩定性良好。
具體實施例方式
通過下面結合附圖，以進一步闡明本發明的實質性特點和顯著的進步，但本發
明決非僅局限于實施例。 實施例1 用l-6t:的平衡的鹽緩沖液D-Hanks液作為儲存運輸液，2小時內從屠宰場取來 新鮮的豬主動脈心臟瓣膜，在4t:下、4小時內剪下瓣膜葉片，使用D-Hanks液清洗干 凈。所制備好脫細胞豬心臟主動脈瓣膜，脫洗干凈，得到如圖l結構和外形的脫細胞生 物瓣瓣膜材料。掃描電鏡下瓣膜材料的胞外基質纖維呈束狀疏松排列，無纖維腫脹斷裂 現象，瓣膜材料多孔、胞外基質纖維自然排列，表面亦無細胞碎片殘留。瓣膜材料以 每片加2ml的比例加入2.5mg/ml去甲二氫愈創木酸的D-Hanks特制溶液浸泡，37。C下 120rpm搖動交聯48小時。再以每片材料加2ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在 37t:下120rpm搖動清洗10小時以上，重復清洗5次。所得瓣膜材料作上述性能評價。 圖2中2為6.25mg/ml戊二醛交聯的脫細胞瓣膜材料，與未交聯脫細胞天然生物瓣瓣膜材 料(圖中l)一樣松弛，無法維持瓣膜外形。而圖中3、 4、 5和6為本發明所用交聯劑去 甲二氫愈創木酸以lmg/ml、 1.5mg/ml、 2.5mg/ml和5mg/ml濃度交聯的脫細胞生物瓣瓣膜 材料，交聯后能維持瓣膜原來外形，柔潤而不皺縮。圖3顯示2.5mg/ml去甲二氫愈創木 酸交聯的脫細胞瓣膜材料最大抗拉強度為16.8MPa，優于戊二醛交聯的脫細胞瓣膜材料 (10.5MPa)，也優于不交聯的脫細胞瓣膜材料(8.7MPa)。圖4顯示2.5mg/ml去甲二氫愈創 木酸交聯后的脫細胞瓣膜材料在D-Hanks液中浸泡120天時，其各時間點的最大抗張強度 能與剛交聯后的基本持平，沒有減小。隨著浸泡時間的延長，彈性模量也逐漸增長。表 明本發明所用交聯劑去甲二氫愈創木酸對脫細胞瓣膜材料交聯的力學穩定性維持良好。 圖5顯示本發明以0.5mg/ml、 1.5mg/ml、 2.5mg/ml和5mg/ml濃度的去甲二氫愈創木酸 交聯的脫細胞瓣膜材料和戊二醛交聯的脫細胞瓣膜材料，均有較強的抗酶解能力，其中 2.5mg/ml去甲二氫愈創木酸交聯的脫細胞瓣膜材料酶解24小時后只降解了 9.68%，與戊 二醛交聯的脫細胞瓣膜降解率(23.01 %)接近。相對于不交聯的脫細胞瓣膜，兩種交聯 劑交聯的脫細胞瓣膜的降解率都很低，表明脫細胞瓣膜的組成分子分別被去甲二氫愈創 木酸和戊二醛交聯修飾，該結果也同時說明去甲二氫愈創木酸具有良好的交聯效果。圖 6顯示去甲二氫愈創木酸交聯的脫細胞瓣膜在緩沖溶液中，交聯劑去甲二氫愈創木酸釋放較快，釋放量基本在3iig/ml以下，至第11天，已在0.5iig/ml以下，超出檢測范圍。釋 放量極低也可能是交聯后力學強度穩定性良好的原因。圖7顯示本發明所使用的交聯劑 去甲二氫愈創木酸在濃度為1 P g/ml以下時對牛心臟瓣膜間質細胞、牛血管平滑肌細胞和 人血管內皮細胞株HUVEC的增殖潛力沒有抑制，在濃度大于1 y g/ml時細胞OD值小于 對照組，表現有毒性；而戊二醛直到濃度為0.001 yg/ml時才對瓣膜間質細胞的增殖潛力 沒有抑制，濃度為0.01iig/ml時已有明顯抑制，在濃度大于0.01iig/ml時細胞OD值小于 對照組，表現有毒性。該結果顯示去甲二氫愈創木酸對瓣膜間質細胞的增殖潛力抑制較 戊二醛小100倍(10/0.001)。對照圖6，脫細胞瓣膜交聯后的殘余交聯劑去甲二氫愈創木 酸在D-Hanks液中浸泡9天后的釋放量在去甲二氫愈創木酸對上述細胞的毒性范圍以下， 無任何毒性。圖8為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在2.5mg/ml去甲二氫愈創木酸交聯的 脫細胞瓣膜材料上的貼附和伸展，可見去甲二氫愈創木酸交聯的脫細胞瓣膜材料具有很 好的細胞相容性，適合作為原位組織工程瓣膜用作病損瓣膜的替換，也適合作為組織工 程瓣膜的體外構建。
實施例2 按前述方法制備豬脫細胞組織工程瓣膜天然材料并清洗干凈后，以每片瓣膜材 料加2ml的比例加入1.5mg/ml去甲二氫愈創木酸的D-Hanks特制溶液實施例1方法交聯， 所得交聯后生物瓣瓣膜材料同樣能維持瓣膜原來外形、柔潤、不皺縮、多孔、胞外基質 纖維自然排列。圖3顯示1.5mg/ml去甲二氫愈創木酸交聯的脫細胞瓣膜材料最大抗拉強 度為13.18MPa。圖5顯示1.5mg/ml去甲二氫愈創木酸交聯的脫細胞瓣膜瓣膜材料酶解 24小時后，只有約10%被降解。表明該濃度去甲二氫愈創木酸同樣對脫細胞組織工程瓣
膜瓣膜材料具有交聯作用，并具有良好的力學性能和抗酶解穩定性。
實施例3 按實施例1方法從屠宰場取來新鮮的豬主動脈心臟瓣膜并清洗干凈。用D-Hanks 溶液清洗三次之后，用脫細胞溶液4t:下靜止脫除瓣膜細胞96小時。用D-Hanks液將 脫細胞的心臟瓣膜材料在24tU常溫)下、120rpm轉速搖動清洗瓣膜細胞殘渣、碎片及 游離蛋白質、核酸等大分子等5次，每次10小時以上。以每片瓣膜加10ml的比例加入 0.1mg/ml、 0.5mg/ml、 1.5mg/ml和5mg/ml去甲二氫愈創木酸的D-Hanks溶液，24。C下、 以240rpm的搖動速度，交聯2小時(圖9中的3、 4、 5和6)、 72小時(圖9中的11、 12、 13和14)和240小時(圖9中的7、 8、 9和10)。以每片瓣膜加20ml的比例加入D-Hanks 溶液浸泡瓣膜，常溫下120rpm清洗。這樣所制得的本發明的人工生物瓣膜材料，作前述 性能評價。交聯2小時的最大抗拉強度分別為9.2MPa、 12.1MPa和13.6MPa ;交聯72小 時的最大抗拉強度分別為14.0MPa、 14.5MPa、 15.9MPa和15.7MPa ;交聯240小時的最 大抗拉強度分別為14.4MPa、 14.9MPa、 16.9MPa和15.7MPa。 以去甲二氫愈創木酸最低 濃度0.1mg/ml交聯最短時間2小時制備的脫細胞生物瓣瓣膜材料，其酶降解率為28.4%與 戊二醛的相當。以去甲二氫愈創木酸最高濃度5mg/ml交聯最長時間240小時制備的脫細 胞生物瓣瓣膜材料，其殘余交聯劑在D-Hanks溶液中的約3天時間釋放的溶液濃度超出檢 測限之外，此時釋放的去甲二氫愈創木酸對人血管內皮細胞株HUVEC無任何毒性。圖9 中瓣膜1為未交聯的脫細胞組織工程瓣膜天然材料，2為戊二醛交聯的脫細胞生物瓣瓣膜 材料。3至14分別代表0.1mg/ml、 0.5mg/ml、 1.5mg/ml和5mg/ml去甲二氫愈創木酸交聯不同時間的脫細胞生物瓣瓣膜材料，顯示交聯完成后材料不皺縮，能保持原有外形， 穩定性良好。所有交聯的脫細胞生物瓣瓣膜材料均可在4°CT D-Hanks溶液長期保存。
權利要求
一種可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于包括對豬主動脈心臟瓣膜作脫細胞處理，然后用去甲二氫愈創木酸溶液交聯，交聯后再作后處理，具體步驟為a)將屠宰場采集的新鮮豬主動脈瓣膜，放入1-6℃、加入雙抗的無Ca、Mg的磷酸緩沖D-Hanks液中，2小時內帶回，在4℃下、4小時內剪下瓣膜葉片后，用無菌D-Hanks液清洗干凈；b)將步驟a剪下的瓣膜葉片，放入脫細胞液中，在1-6℃下以60-360rpm轉速搖動脫除瓣膜細胞，之后將瓣膜用無菌D-Hanks液清洗干凈；c)將步驟b清洗干凈的脫細胞瓣膜用DNA酶與RNA酶液在37℃下60-360rpm搖動降解脫除細胞核成分，再次用無菌D-Hanks液清洗干凈；d)用超純水配置的無菌D-Hanks液將脫完細胞的瓣膜材料在1-40℃下、以60-360rpm轉速搖動清洗瓣膜上殘留的細胞碎片、游離蛋白質及核酸成分，再次用超純水配制的無菌D-Hanks液將脫細胞瓣膜清洗干凈，得到完全脫細胞的、天然心臟瓣膜材料；e)將步驟d得到的完全脫細胞的天然心臟瓣膜材料浸入0.1-10mg/ml的NDGA溶液中，在1-40℃下60-360rpm搖動交聯2-240小時，取出交聯的心臟瓣膜天然材料，用無菌D-Hanks液清洗干凈；f)將交聯后的天然心臟瓣膜材料浸入D-Hanks液中置于1-6℃下作后處理3-40天后可得到可細胞化的生物瓣瓣膜材料；所述的D-Hanks液配方為無Ca、Mg離子的磷酸緩沖液將0.4g KCl，0.06g KH2PO4，8.00g NaCl，0.35g NaHCO3和0.09g Na2HPO4·7H2O溶解于1L超純水中；所述的脫細胞溶液是由0.1g胰蛋白酶、0.5g非離子去垢劑聚乙二醇辛基苯基醚、0.5g脫氧膽酸鈉和0.02g EDTA溶解于100mL超純水中配制而成的；所述的DNA酶與RNA酶液配方為用D-Hanks液在1-4℃下配制的20μg/ml的核酸酶和0.2mg/ml的脫氧核酸酶(DNase)按1∶1體積比混合；所述的NDGA交聯劑溶液配方為將NDGA用2mL 1mol/L的NaOH溶解溶解后，再用D-Hanks液稀釋配制成濃度為0.1-10mg/mL溶液。
2. 根據權利要求1所述的可細胞化生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于步驟b所 述的脫除瓣膜細胞的時間為8-96小時；步驟c所述的用DNA酶與RNA酶脫除細胞核成 分的時間為12-96小時。
3. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于所有清 洗步驟所涉及的D-Hanks清洗液是采用18.2M Q超純水配制的D-Hanks液。
4. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于步驟d 所述的用超純水配無菌D-Hanks液清洗脫細胞生物瓣瓣膜材料的細胞殘留的細胞碎片、 游離蛋白質或核酸大分子的清洗次數為5-10，每次1-2小時。
5. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于所述的 用D-Hanks液清洗脫細胞生物瓣瓣膜材料的環境條件是37°C 、 60-360rpm轉速搖動清洗。
6. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于所述的 脫細胞生物瓣瓣膜材料的交聯劑NDGA的濃度分別為0.1、 0.5、 1.5、 2.5禾P 5mg/ml。
7. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于步驟e所述的脫細胞生物瓣瓣膜材料的交聯時間為8-96小時。
8. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于所述的 交聯后用D-Hanks液清洗的條件是D-Hanks液在l-4(TC下，10-360rpm搖動清洗10次， 每次持續3小時。
9. 根據權利要求1所述的可細胞化生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于所述的 交聯后處理是將交聯后的完全脫細胞的心臟瓣膜材料浸入D-Hanks液中放置在l-6。C環境 中，后處理7-10天，每天更換D-Hanks液，之后用D-Hanks液清洗干凈。
10. 根據權利要求1所述的可細胞化的生物瓣瓣膜材料的制備方法，其特征在于經過 后處理的生物瓣瓣膜材料，在l-6t:下長期保存于D-Hanks液中備用，并通過調節NDGA 交聯劑的力學強度-抗酶解能力、交聯劑釋成和促進組織再生能力的調控。
全文摘要
本發明涉及一種可細胞化生物瓣膜材料的制備方法，其特征在于包括對豬主動脈心臟瓣膜作脫細胞處理，然后用去甲二氫愈創木酸溶液交聯，交聯后再作后處理。使用交聯劑的濃度為0.1-10mg/ml。交聯條件是1-40℃下60-360rpm搖動交聯2-240小時，取出后浸入D-Hanks液中置于1-6℃條件下后處理3-40天即可獲得可細胞化的生物瓣膜材料。通過調節交聯劑去甲二氫愈創木酸溶液的濃度、交聯的時間和清洗時間等，實現交聯的力學強度、抗酶解能力、交聯劑釋放、促進組織再生能力等方面的可調控。
文檔編號A61L27/00GK101690829SQ200910194839
公開日2010年4月7日 申請日期2009年8月31日 優先權日2009年8月31日
發明者常江, 翟萬銀 申請人:中國科學院上海硅酸鹽研究所