專利名稱：一種Ⅱ型膠原透明質酸復合海綿支架及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種組織工程中軟骨修復用的仿生II型膠 原海綿 支架。
背景技術：
關節軟骨主要由大量細胞外基質與分布在其中的高度特異性細胞-軟骨細胞組 成，軟骨缺損在臨床上尚無特效治療方法，組織工程軟骨移植是目前治療軟骨缺損最新、最 有希望的治療技術之一，即將體外培養的種子細胞種植于天然或人工合成的、可在機體降 解和吸收的材料支架上，然后將復合物移植入動物或人體內的缺損部位，形成具有類似軟 骨結構和功能的組織，從而完成缺損部位的修復與再造。組織工程支架材料實際扮演著細胞生長微環境的作用，細胞與基質之間的相互作 用在軟骨修復中非常重要。因此，良好的支架材料應提供與天然軟骨組織相似的環境。軟 骨基質主要由II型膠原和蛋白多糖所組成；II型膠原呈網狀結構分布于整個軟骨基質中， 其主要功能就是為軟骨細胞提供張力和承受力，以防止軟骨組織在受到外力時被撕裂，還 為軟骨細胞的粘附提供基礎，并參與軟骨細胞的表型分化的調節，但是II型膠原提取方法 復雜，尤其是提取高純度的II型膠原較為困難，目前市場上高純度的II型膠原的價格較昂 貴。葉春婷、李斯明等在《中國矯形外科雜志》2001年1月第8卷第1期上的“II型膠原的 研制及其在軟骨細胞培養中的應用”和《生物醫學工程學雜志》上的“高純度豬軟骨II型膠 原的制備與檢測”等文獻公開了的目前較為理想的II型膠原的提取方法，可以得到高純度 的II型膠原。透明質酸是蛋白多糖的重要成份之一，大量研究證實在維持軟骨細胞表型、 促進軟骨基質分泌等方面發揮了重要的作用，現已作為關節功能改善劑和防粘連阻隔劑在 臨床上廣泛使用。以膠原和蛋白多糖復合天然支架材料的研究是軟骨組織工程支架材料研究的重 點。因為提取方法上的困難或成本的關系，國內外所用的膠原支架多以I型為主。Allemarm 等[J Biomed Mater Res. 2001，55 (1) :13_19]及吳煒等在“中國修復重建外科雜志” 2007 年第21卷第4期發表的論文報道I型膠原_透明質酸支架與軟骨基質II型膠原結構相距 甚遠；II型膠原_透明質酸支架材料研究國內外報道較甚少，僅有Taguchi等[J Biomed Mater Res. 2002，61 (2) :330_336]和李長青等[第三軍醫大學學報，2005，27 (13)]報道研 制的II型膠原_透明質酸復合6-硫酸軟骨素海綿支架，在制備方法上先用0. 01mol/L鹽 酸溶解純膠原海綿，配成1. 25% (W/V)即12. 5mg/ml的II型膠原溶液，并用1N鹽酸調整 pH值至1 2，再加入透明質酸鈉溶液混勻，添加6-硫酸軟骨素然后經過交聯制成II型膠 原復合海綿。生理條件下，膠原和透明質酸帶有相反的電荷，極容易形成聚合物(polyion complex, PIC)，而產生沉淀，導致膠原與透明質酸混合不均勻，這成為構建膠原透明質酸復 合海綿支架的難題。目前采用的辦法主要是將兩者混合而形成的聚合物用勻漿器在低溫下 攪拌，得到均勻的混懸液后進行凍干和交聯[Park，Biomaterials，2003，24 1631-1641，吳煒，中國修復重建外科雜志，2007，21 (4) 401-405]；另外，李長青等[第三軍醫大學學報， 2005，27 (13)]報道研制的II型膠原-透明質酸復合6-硫酸軟骨素海綿支架，其制備過程 是用鹽酸溶解成品II型膠原海綿，用1N鹽酸調節pH值在1 2的條件下混合透明質酸 鈉，以抑制PIC的形成，然后攪拌混合。上述方法由于pH值太低會對膠原產生不良的影響， 或對膠原的物理結構產生一定的破壞，使纖維斷裂，只有采用較大濃度的(1.25% (W/V)即 12. 5mg/ml)的II型膠原溶液，才能制備出合適的孔徑結構及一定的力學強度的海綿支架。 上述方法所需膠原濃度太高(如公開號CN101066469A專利申請所述，或文獻Allemarm， JBiomed Mater Res, 2001, 55 13-19，常用膠原液濃度約0. 5%較為理想)，造成生產成本較 尚o
發明內容
為了克服上述缺陷，本發明提供一種組分與天然軟骨相似，理化性能和生物相容 性良好的人工合成的II型膠原透明質酸復合海綿支架。本發明的II型膠原_透明質酸復合海綿支架，是通過如下方法制備的(1) II型膠原溶液的制備，提供高純度II型膠原溶液；(2) II型膠原溶液的濃縮，將步驟(1)得到的II型膠原溶液注入透析袋中，用足量 的聚乙二醇粉劑包埋透析袋，然后置于低溫下濃縮，收集備用；(3)勻漿，將透明質酸鈉水溶液加入II型膠原溶液中形成沉淀，于4°C低溫狀態下 勻漿，成為II型膠原透明質酸鈉勻漿液；(4)取步驟(3)的II型膠原透明質酸勻漿液與步驟⑵的II型膠原溶液均勻混 合，使透明質酸鈉的含量達到5% (W/W)，II型膠原溶液終濃度為4. 33mg/ml，得到II型膠 原透明質酸復合液；(5)冷凍干燥，步驟(4)得到的II型膠原透明質酸復合液于-80°C低溫冰箱中預 冷凍，然后在-30 -40°C下真空冷凍干燥機中冷凍干燥25小時，即得均勻連通孔徑的II 型膠原透明質酸復合海綿；(6)交聯，配置碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的乙醇溶液作交聯劑，將步驟(5) 得到的II型膠原透明質酸復合海綿浸泡在上述交聯劑中進行交聯，交聯后的II型膠原海 綿用蒸餾水清洗干凈，再進行步驟(5)的冷凍干燥步驟，即得II型膠原透明質酸海綿支架。其中，步驟(2)中用聚乙二醇粉劑包埋透析袋后，置于4°C下濃縮2小時。優選地，步驟(3)中將透明質酸鈉水溶液加入II型膠原溶液中形成沉淀后于4°C 低溫狀態下8000轉/分種勻漿3分鐘，成為II型膠原透明質酸勻漿液。優選地，步驟(5)中II型膠原透明質酸復合液在凍干瓶中于-80°C低溫冰箱中冷 凍24小時。優選地，步驟(5)中-80°C冷凍后的II型膠原透明質酸復合液在冷凍干燥機中 于-30 _40°C下進行冷凍干燥25小時。其中，步驟⑷中所述交聯劑為碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在95%乙醇 里，配制成的碳化二亞胺濃度為33mmol/L、N-羥基琥珀酰亞胺濃度為8mmol/L的交聯劑。優選地，步驟(4)中II型膠原透明質酸海綿在交聯劑中交聯的時間為24小時。進一步地，步驟(4)制備出來的II型膠原透明質酸海綿支架，用Co6°進行消毒后
本發明還提供上述制備方法制備出的II型膠原-透明質酸復合海綿支架，在軟骨 修復中的應用。本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架可作為組織工程植入物，用于修 復關節軟骨缺損；如細胞培養支架材料或藥物控釋等應用于軟骨損傷修復的防治。本發明中用到的高純度II型膠原溶液的提取，可以采用現有的提取方法，詳細可 參照李斯明、葉春婷等在《生物醫學工程學雜志》(2001，18(4)592-594)上的“高純度豬軟骨 II型膠原的制備與檢測”中公開的制備方法。該制備方法是以豬透明軟骨為原料，采用鹽 酸胍抽提蛋白多糖，酸性條件下酶解，中間過程經多步純化去除雜質、降解及變性產物，鹽 析純化制備出產品，經SDS-PAGE電泳、氨基酸成份分析和紫外最大吸收光譜的結果表明， 所提取的II型膠原為高純度II型膠原，該提取方法采用豬軟骨作原料，來源豐富，成本低， 是一種較理想的提取方法。本發明制備出的II型膠原透明質酸復合海綿支架與常見的I型膠原海綿相比，本 發明的II型膠原與透明質酸復合海綿均為軟骨細胞基質，具有復合調控軟骨細胞生長的 作用，更符合軟骨細胞的生理要求。本發明自行提取II型膠原溶液后用聚乙二醇法進行濃縮，使其濃度為4. 5mg/ ml (0. 43% ff/V)，即能制備孔徑為82士7mm的復合海綿支架，并具備適當的力學強度；而現 有文獻報道方法采用鹽酸溶解純膠原海綿或干粉，配成1. 25% (W/V)即12. 5mg/ml的II型 膠原溶液才能制備出與本法孔徑和力學強度相當的支架材料。目前商品化的II型膠原相 當昂貴，本發明能大大地節約生產成本。本發明采用部分勻漿的方法使II型膠原與透明質酸均勻混合，與傳統的全勻漿 方法相比較，能最大限度地減少機械旋轉作用對膠原纖維的破壞，維持膠原纖維的完整性， 保持支架材料的力學性能。本發明的制備方法中采用的部分勻漿法，讓先加入的透明質酸 鈉和少量II型膠原混合，將此時形成的沉淀PIC勻漿攪拌，制備成II型膠原透明質酸勻漿 液，然后再加入大量的II型膠原溶液，此時不再形成PIC，然后再進行冷凍交聯等步驟，該 方法制備出的復合海綿支架性能良好，不受中間產物PIC的影響。本發明使用II型膠原濃度為4. 5mg/ml (0. 43% ff/V)制備海綿支架材料，可得到平 衡含水率為43mg/mg(97.66% )的支架材料，表示本發明的支架材料具備很強的吸水性能， 并能在培養液中提供良好的交換能力；而現有文獻報道方法采用1.25% (W/V)即12.5mg/ ml的II型膠原溶液制備的支架材料，由于溶液濃度過高或結構受到一定程度破壞的原因， 其平衡含水率只有(79% )。通過碳化二亞胺(EDC)與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)雙重交聯提高II型膠原透明 質酸復合海綿的力學強度，以增加孔徑結構的三維穩定性。交聯后的海綿材料在彈性模量 及極限拉應力方面均有很大程度的提高。本發明的II型膠原透明質酸海綿支架具有更強 的生物力學性能，能長期保持GFP轉染軟骨細胞的穩定性。下面將結合實驗及其附圖詳細介紹本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架。
圖1為本發明的II型膠原透明質酸海綿支架材料外觀圖；圖2a為全勻漿的I型膠原透明質酸海綿激光共聚焦顯微鏡掃描圖(X 100)；
圖2b為全勻漿的II型膠原透明質酸復合海綿支架激光共聚焦顯微鏡掃描圖 (X100)；圖2c為本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架激光共聚焦顯微鏡掃描圖 (X100)；圖3a為全勻漿的I型膠原透明質酸海綿紅外光譜(FTIR)分析圖；圖3b為本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架紅外光譜(FTIR)分析圖；圖4a為熒光顯微鏡下(X 100)，轉染GFP基因的軟骨細胞在I型膠原透明質酸支 架中立體培養14天生長情況圖，GFP轉染軟骨細胞呈現綠色熒光；圖4b為熒光顯微鏡下(X 100)，轉染GFP基因的軟骨細胞在本發明的II型膠原透 明質酸復合海綿支架材料中立體培養14天，成片生長情況圖，GFP轉染軟骨細胞呈現綠色 熒光；圖5a為激光共聚焦顯微鏡下(X100)材料各層立體掃描，轉染GFP基因的軟骨 細胞在I型膠原透明質酸支架中立體培養28天生長情況圖，GFP轉染軟骨細胞呈現綠色熒 光；圖5b為激光共聚焦顯微鏡下(X100)材料各層立體掃描，轉染GFP基因的軟骨細 胞在本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料中立體培養28天，成片生長情況圖， GFP轉染軟骨細胞呈現綠色熒光。
具體實施例方式實施例、本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架的制備1、高純度II型膠原的制備參照李斯明、葉春婷等，高純度豬軟骨II型膠原的 制備與檢測，生物醫學工程學雜志，2001，18 (4) 592-594材料新鮮豬關節軟骨取材于屠場新鮮屠宰的豬的四肢關節軟骨鹽酸胍Farco500g/ 瓶胃蛋白酶Sigma100g/瓶其余均為國產分析純試劑。方法從新鮮屠宰的豬四肢關節中切取透明軟骨，切成薄片，脫脂、搗碎、制勻漿，然后用 10倍體積的4M(pH7. 5)鹽酸胍攪拌24小時，離心分離；沉淀徑充分洗滌，稱取沉淀濕重約 為260g軟骨顆粒，用質量比1/50的胃蛋白酶在酸性條件下酶解24 48h，離心，上清液經 EDTA終止酶解后用10% NaCl鹽析，沉淀用2000ml的0. 5M HAc使其充分溶解，對水透析脫 鹽和脫酸，得到膠原溶液原液(濃度為2. 9mg/ml左右)。上述制備方法制備的II型膠原溶液，純度較高，若需要進一步得到更高純度的II 型膠原溶液，可將上述制備方法制備出的II型膠原溶液進一步上S印harose H. P.陰離子 柱，再進行層析純化。2、II型膠原溶液的純度檢測根據李斯明、葉春婷等在《生物醫學工程學雜志》2001，18 (4) 592-594上的“高純度豬軟骨II型膠原的制備與檢測”中公開的檢測方法對 II型膠原溶液進行純度檢測，此處不再贅述。
3、II型膠原溶液的濃縮，將上述得到的初始濃度為2. 9mg/ml的II型膠原溶液注 入長約15cm直徑約為5cm的透析袋中，密封后置于500ml的燒杯中，再加入足量的聚乙二 醇粉劑(分子量6000D)包埋透析袋，然后置于干燥皿中在4°C下濃縮2小時，得到的II型 膠原溶液濃度為4. 5mg/ml，收集備用。4、勻漿，稱取透明質酸鈉12mg，溶于2ml蒸餾水中，配制成透明質酸鈉溶液，濃度 為6mg/ml ；加入II型膠原溶液中形成沉淀，于4°C低溫狀態下勻漿(8000轉/分種)3分 鐘，成為II型膠原透明質酸勻漿液；5、取步驟4的II型膠原透明質酸勻漿液9ml與II型膠原溶液31ml均勻混合，使 透明質酸鈉的含量達到5% (W/W)，II型膠原溶液終濃度為4. 33mg/ml ；6、冷凍干燥，將得到的II型膠原復合液注入凍干瓶中，于-80°C低溫冰箱中預冷 凍24小時，然后在-30 -40°C下真空冷凍干燥機中冷凍干燥25小時，即得均勻連通孔徑 的II型膠原透明質酸復合海綿；7、交聯，配制碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的乙醇溶液作交聯劑，碳化二亞胺 和N-羥基琥珀酰亞胺，溶解在95%乙醇里，配制成的碳化二亞胺濃度為33mmol/L、N-羥基 琥珀酰亞胺濃度為8mmol/L的交聯劑，室溫下將II型膠原透明質酸復合海綿浸泡在上述交 聯劑中交聯24小時。8、交聯后的復合II型膠原海綿用蒸餾水清洗干凈，再次冷凍干燥，即得II型膠原 透明質酸復合海綿支架；9、把上述得到的復合海綿支架用Co6°消毒備用。如圖1所示，為本發明的II型膠原透明質酸海綿支架材料外觀圖。實驗例一紅外光譜(FTIR)分析本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料，與文獻報道的I型膠原透明質酸 復合海綿材料作比較，用紅外光譜儀測定(Spectrum one，美國Perkin-Elmer公司)。對照FTIR譜圖，本發明采用部份勻漿法制得II型膠原透明質酸復合海綿支架，與 傳統的全勻漿法制得I型膠原透明質酸復合海綿，于1402cm—1處兩者均出現透明質酸的特 征吸收峰，證實兩種勻漿方法均能制備具有膠原與透明質酸兩種特性的復合海綿，結果如 圖3a和圖3b所示。實驗例二 11型膠原透明質酸復合海綿支架材料的孔徑檢測本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料，與文獻報道的I型膠原透明質酸 復合海綿和現有全勻漿方法制備的II型膠原透明質酸材料作比較。結果見表1采用激光共聚焦顯微鏡對兩種膠原海綿進行膠原自發熒光分層掃描，激發波長為 488nm，發射波長為520nm，以自發熒光信號強度為限進行測量，測定海綿材料的孔徑大小； 使用CLSM圖像分析系統進行操作和分析，然后以SPSS13. 0軟件包對數據處進行統計。結果如圖2a和圖2b和圖2c所示，激光共聚焦顯微鏡結果顯示各組的膠原海綿均 具有明顯的自發熒光，表明本發明的II型膠原復合海綿支架材料具有膠原特有的生物學 特性。激光共聚焦顯微鏡結果顯示本發明的II型膠原復合海綿支架材料的孔徑為 92. 63士32. 51 u m,符合軟骨細胞的生長要求；全勻漿方法制備的II型膠原復合海綿材料 的孔徑為士 210. 1 士 70. 74 iim，I型膠原復合海綿材料的孔徑為士 241. 87 士 59. 87 y m，上述
7兩種方法制備的材料與本發明方法相比效孔徑明顯偏大。表1各種方法制備海綿支架材料的性能比較 *與其余兩組比較P < 0. 01實驗例三11型膠原透明質酸復合海綿支架材料的孔隙率檢測本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料、文獻報道的I型膠原透明質酸復 合海綿材料和現有全勻漿方法制備的II型膠原透明質酸材料作比較，結果如表1。取海綿材料，稱量(ms)，浸入盛滿乙醇，質量為叫的比重瓶中，使乙醇充分充盈于 膠原海綿孔隙中。脫氣，加滿乙醇，再次稱量，質量記為m2，小心取出膠原海綿，稱量剩余乙 醇與比重瓶的質量，記為m3，孔隙率按照如下公式計算 式中分子表示與海綿中孔隙具有相同體積的乙醇的質量，分母表示與海綿的虛 體積(海綿實有體積與孔隙體積之和)相同體積的乙醇的質量。I型膠原透明質酸復合海綿材料孔隙率為98. 60%，全勻漿法制備的II型膠原透 明質酸材料孔隙率為97. 13%，本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料的孔隙率為 94. 89%，三者的膠原濃度、透明質酸的加入比例一致，因此孔隙率基本沒有差異，均具有良 好的孔洞結構。實驗例四11型膠原透明質酸復合海綿支架材料的平衡含水率檢測本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料、文獻報道的I型膠原透明質酸復 合海綿材料和和現有全勻漿方法制備的II型膠原透明質酸作比較。結果如表1。質量為m的海綿在水中浸泡24h后測其質量mw。在同一塊海綿中取三塊樣品進行 重復試驗。吸水率按照如下公式計算吸水率(mg/mg) = (mw_m)/m本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架的平衡含水率為97. 66%，全勻漿 法制備的II型膠原透明質酸材料平衡含水率為97. 13%, I型膠原透明質酸復合海綿為 98. 68%，三者均具有較強的吸水性能，提供良好的物質交換能力。實驗例五11型膠原透明質酸復合海綿支架材料的生物力學檢測本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料、文獻報道的I型膠原透明質酸復 合海綿材料和和現有全勻漿方法制備的II型膠原透明質酸材料作比較。用刀具將海綿材料裁剪成25mmX 5mm大小，用厚度測量儀測定試樣厚度。將試樣 固定在力學試驗機上，以5mm/min拉伸速率，測試材料的抗張強度和斷裂伸長率。三種方法制備的材料力學結果如表2，抗張強度結果顯示出采用現有全勻漿方法制備的材料，無論是I型還是II型，由于勻漿過程對膠原纖維有一定的破壞，在其余條件基 本相同的情況下其力學性能明顯降低；單純II型膠原的結構與排列有別于I型，其力學性 能也低于I型，因此采用全勻漿法對力學強度影響尤其顯著；此外，斷裂伸長率的結果顯示 三種材料的伸長率均在40%以上，表明材料的延伸性良好。表2各種方法制備海綿支架材料的力學性能比較 實驗例六(GFP)轉染軟骨細胞在II型膠原透明質酸復合海綿支架材料中長期培 養穩定性觀察本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架材料，與文獻報道的I型膠原透明質酸 復合海綿材料作比較。原代分離兔軟骨細胞，將第三代軟骨細胞接種于25cm2培養瓶中，接種密度為 7.5父105個細胞/瓶。加入DMEM完全培養基(含有血清和抗生素)，37°C，5% C02條件下 孵育過夜。加入攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的病毒上清液感染軟骨細胞，用DMEM-F12培養基， 37V,5% C02條件下培養過夜，在熒光顯微鏡下觀察GFP的綠色熒光表達。分別將轉染GFP基因的軟骨細胞接種于本發明的II型膠原海綿支架材料與對照 組材料中，接種濃度為1X105個細胞/ml，在DMEM-F12完全培養基(含有血清和抗生素) 進行立體培養，隔天換液，長期培養觀察細胞在材料中的生長情況；一周內每天觀察，一周 后每三天觀察一次，觀察時間最長為28天。 在激光共聚焦顯微鏡下三維立體觀察GFP的綠色熒光表達，如圖4a，4b所示，可見 大量的細胞成團生長，在支架材料(本發明的II型膠原海綿支架材料)中附著良好，細胞 與材料之間呈現著良好的相容性。如圖5a和圖5b所示，材從料表層至底層的立體掃描圖 顯示，無論是細胞數量或GFP的綠色熒光維持時間，本發明的II型膠原海綿支架材料均明 顯優于I型膠原透明質酸復合海綿材料。實驗例七本發明方法的II型膠原海綿支架材料及其制備方法與現有的李長青 等文獻報道的II型膠原透明質酸海綿材料及其制備方法的比較[李長青，周躍，張傳志仿 生髓核組織工程細胞支架的構建及初步理化指標分析。第三軍醫大學學報.2005，27 (13) 351 354]。表3本發明方法與現有方法的比較 由上述列表可看出，本發明的II型膠原海綿支架材料的制備方法所用的II型膠 材料濃度低，制備而成的II型膠透明質酸復合海綿支架材料的孔徑較均勻，孔徑大小更合 適，海綿支架含水率更高，具備良好的物質交換能力。 以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
一種II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，是通過如下方法制備的(1)II型膠原溶液的制備，提供高純度II型膠原溶液；(2)II型膠原溶液的濃縮，將步驟(1)得到的II型膠原溶液注入透析袋中，用足量的聚乙二醇粉劑包埋透析袋，然后置于低溫下濃縮，收集備用；(3)勻漿，將透明質酸鈉水溶液加入II型膠原溶液中形成沉淀，于4℃低溫狀態下勻漿，成為II型膠原透明質酸勻漿液；(4)取步驟(3)的II型膠原透明質酸勻漿液與步驟(2)的II型膠原溶液均勻混合，使透明質酸鈉的質量百分數達到5％，II型膠原溶液終濃度為4.33mg/ml，得到II型膠原透明質酸復合液；(5)冷凍干燥，步驟(4)得到的II型膠原透明質酸復合液于-80℃低溫冰箱中預冷凍，然后在-30～-40℃下真空冷凍干燥機中冷凍干燥25小時，即得均勻連通孔徑的II型膠原透明質酸復合海綿；(6)交聯，配制碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的乙醇溶液作交聯劑，將步驟(5)得到的II型膠原透明質酸復合海綿浸泡在上述交聯劑中進行交聯，交聯后的II型膠原海綿用蒸餾水清洗干凈，再進行步驟(5)的冷凍干燥步驟，即得II型膠原海綿支架。
2.如權利要求1所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(2)中用 聚乙二醇粉劑包埋透析袋后，置于4°C下濃縮2小時。
3.如權利要求1或2所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(3) 中將透明質酸鈉水溶液加入II型膠原溶液中形成沉淀后于4°C低溫狀態下8000轉/分種 勻漿3分鐘，成為II型膠原透明質酸勻漿液。
4.如權利要求3所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(5)中II 型膠原透明質酸復合液在凍干瓶中于-80°C低溫冰箱中冷凍24小時。
5.如權利要求1或4所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(5) 中-80°C冷凍后的II型膠原透明質酸復合液在冷凍干燥機中于-30 -40°C下進行冷凍干 燥25小時。
6.如權利要求5所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(4)中所 述交聯劑為碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在95%乙醇里，配制成的碳化二亞胺濃 度為33mmol/L、N-羥基琥珀酰亞胺濃度為8mmol/L的交聯劑。
7.如權利要求1或6所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(4) 中II型膠原海綿在交聯劑中交聯的時間為24小時。
8.如權利要求1所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，其特征在于，步驟(4)制備 出來的II型膠原海綿支架，用Co6°進行消毒后備用。
9.如權利要求1所述的II型膠原透明質酸復合海綿支架，在軟骨修復中的應用。
全文摘要
本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種組織工程中軟骨修復用的仿生II型膠原透明質酸復合海綿支架。本發明的II型膠原透明質酸復合海綿支架在提取出的高純度II型膠原溶液后，用聚乙二醇濃縮法，對II型膠原溶液進行濃縮，然后采用部分勻漿法將透明質酸溶液與高純度II型膠原溶液分次進行混合，然后用EDC和NHS雙重交聯劑對濃縮后的II型膠透明質酸復合海綿進行交聯制備得到的。本發明的II型膠原透明質酸海綿支架可作為組織工程植入物，細胞培養支架材料或藥物控釋等應用于軟骨損傷修復的防治。
文檔編號A61L27/40GK101862475SQ20091019297
公開日2010年10月20日 申請日期2009年10月10日 優先權日2009年10月10日
發明者楊小紅, 秦勝男, 陳鴻輝 申請人:廣州市創傷外科研究所