專利名稱：麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物及其在制備抑制a549細胞增殖藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥提取物及其應用，具體涉及麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取 物及其在制備抑制A549細胞增殖藥物中的應用。
背景技術：
肺癌是世界各國常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中增長是最快的，是目前人 類癌癥死亡的主要原因，并被認為是當今世界對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤。 全球大約每年新增300萬病例，同時，每年有超過100萬人死于肺癌。在我國，肺癌占 惡性腫瘤發病、死亡的首位，年發病率為35例/10萬人，患者5年生存率僅為lOo/o ， 國際抗癌聯盟(UICC)公布到2005年全世界惡性腫瘤患者男性肺癌占第一位，而中國的 肺癌及患病絕對人數均占全世界的第一位，有資料稱"中國的肺癌將占全球的一半"，約 130.8萬人。90年代以來我國肺癌的流行病學特點是年輕肺癌病例增多，腺癌病例的發 病率在女性繼續增長，男性鱗癌病例減少。首發癥狀不明顯，就診病人多為中、晚期， 已無手術機會。
基于近來對肺癌認識的不斷加深，由WHO和國際肺癌研究協會聯合組成的專門小 組對1981年WHO制定的肺腫瘤分類進行了修改，于1999年正式公布于眾。肺癌患者 中80X是NSCLC (non-small cell lung carcinoma,非小細胞肺癌)，20%是SCLC (small cell lung carcinoma,小細胞肺癌)，基于兩者在光鏡下診斷的差異，二者在臨床治療中的 方式也是不同的。NSCLC和SCLC是肺上皮源性腫瘤中最常見的2種類型，而其它良 性腫瘤，非上皮源性腫瘤等在肺腫瘤中是很少見的。NSCLC包括肺腺癌，肺鱗癌和低 分化甚至是未分化大細胞癌，這三種類型的腫瘤同屬于NSCLC。
A549細胞(Human lung adenocarcinoma epithelial cell line)是人肺泡基底上皮腫瘤 細胞，組織分型屬于肺腺癌，常作為II型肺泡上皮細胞藥物代謝的體外模型，細胞角蛋 白陽性，p53基因為野生型，ras基因突變。
肺癌西醫治療方法的進展肺癌中非小細胞肺癌(NSCLC)占80%以上，在國際 上均一致承認肺癌是一個高發癌，在很多國家及城市中為各種癌癥之首，65%在發現時 為III和IV期，往往無手術條件，放療的效果也不盡人意，而藥物治療中化療雖說是一 種全身性治療藥物，在近10余年較前有了較大進步，大量有效的新化療藥物及減低毒 性藥物的出現在療效、耐受性方面較前有了一定的提高，但NSCLC具有耐藥性高、療 效差的特點，尤對有遠道轉移的IV期患者，化療雖仍為主要治療方法，對該用多少周否"合適"，均為目前腫瘤醫師、患 者所顧慮的問題。尋找一個耐受性高、毒性少而同樣有效或更有效的另一種藥物成為人 們密切關注的事件，生物靶點治療的發展自然成為肺癌新治療的重中之重。
肺癌中醫治療方法的進展肺癌屬中醫"息賁"、"肺積"等范疇。在中醫學文獻中類 似肺癌證候有不少記載。如《素問*咳》"肺咳之狀，咳而喘息有音，甚至唾血。"《素 問-奇病》"病脅下滿氣上逆......病名息積，此不妨于食。"《難經*五十六難》稱"肺
之積，名曰息賁，在右脅下，覆大如杯，久不已，令人灑淅寒熱，喘咳，發肺壅。"明-張 景岳說"勞嗽，聲觀，聲不能出或喘息氣促者，此肺臟敗也，必死。"其發病原因，《諸 病源候論》云"積聚者，有陰陽不和，腑臟虛弱。受于風邪，搏于腑藏之氣所為也。" 清-顧松園認為"煙為辛熱之魁"，清'趙濂《醫門補要》亦有論述"表邪遏伏于肺，失 于宣散，并嗜煙酒，火毒上熏，久郁熱熾，爍腐肺葉"；同時中醫學強調"邪之所湊，其 氣必虛"，《靈樞'刺節真邪》"虛邪之入于身也深，寒與熱相搏，久留而內著......邪氣居
其間而不反，發為瘤。"《景岳全書》"凡脾腎不足及虛弱失調之人，多有積聚之病。" 《活法機要》"壯人無積，虛人則有之。"《醫宗必讀'積聚》指出"積之成者，正氣不 足，而后邪氣踞之"。病機如《雜病源流犀燭》中說:"邪積胸中，阻塞氣道，氣不得通， 為痰、為食、為血，皆邪正相搏，邪積乃生，正不得制之，遂結成形而有塊。"說明肺 中積塊的產生與正虛邪侵、氣機不通、痰血搏結有關，對后世研究肺癌的發病和治療具 有重要啟迪意義。許多學者對其病因病機有著不同的認識，但無外乎正氣虛損和邪毒內 積2個方面。病變部位在肺，與脾、腎有關，病理因素主要為氣滯、痰濁、瘀血、熱毒， 病理性質為本虛標實，虛實錯雜。劉嘉湘[1]認為臟腑陰陽失調，正氣虛損是患病的主要 內在原因，"正氣不足，而后邪氣踞之"，肺、脾、腎三臟氣虛均可導致肺氣不足，加之 嗜 煙日久，熱灼津液，或房事不節，精血內耗，均可導致肺陰不足，陰虛內熱或氣陰兩 虛；外在邪毒得以趁虛而入，客邪留滯，氣機不暢，血行瘀滯，津液不布，聚津為痰， 痰瘀交阻，日久形成積塊。因此，認為肺癌是全身性疾病的一個局部表現，是因虛而致 病，因虛而致實，早期的虛多見肺脾氣虛或氣陰兩虛，晚期多為陰虛內熱或陰陽兩虛， 局部的實不外乎氣滯、血瘀、痰凝、毒聚的病理變化。洪廣祥[2]認為血瘀為肺癌的基本 病理改變，瘀血阻肺為其基本證型，肺脾氣虛則是其病理基礎。陳玉琨[3]則認為痰瘀既 是邪毒侵肺，臟腑功能失調的病理產物，又是導致正氣內虛，邪毒膠結成塊的致病因素， 因而痰瘀貫穿于肺癌的整個發病過程。
麥門冬湯源自張仲景《金匱要略'肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》，其曰"火逆 上氣，咽喉不利，止逆下氣者，麥門冬湯主之"[4]。 一般是治療"虛熱肺痿"的主方。后世 對該方的主治范圍有所擴大，用治肺陰不足及胃陰不足諸證。麥門冬湯由麥冬、半夏、人參、甘草、粳米、大棗等6味藥組成，其主要有兩大配伍特點 一是方中重用七升麥 冬滋肺養胃，并清虛熱，僅用一升半夏降逆下氣，化其痰涎，半夏雖辛溫，但與大量麥 冬配伍則其燥被制，而麥冬得半夏則滋而不膩，兩藥配伍，相反相成。二是人參、甘草、 粳米、大棗補脾益氣，體現了虛則補母、培土以生金之法[5]。全方共奏養胃陰而潤肺燥， 下逆氣而止濁唾之功。因其用藥精當，主從有序，配伍嚴謹，療效顯著，故為后世醫家 所推崇，并加以推廣運用。現代藥理學研究表明，麥門冬湯具有呼吸道凈化、改善呼吸 道高敏性、緩解支氣管收縮、調節肺表面活性物質分泌等類固醇樣藥理作用[6—9]，對咳 嗽、呼吸道過敏、炎癥等引起的呼吸道病變有重要的調節作用。
《千金》葦莖湯出自唐今i、思邈的《備急千金要方》巻十七肺臟方之肺癰第七，同時 也見載于《金匱要略，肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》，由薏苡仁、瓜瓣、桃仁、葦莖 組成，具有清熱化痰、逐瘀排膿之功，主治肺癰。其中葦莖清泄肺熱；冬瓜仁、生薏仁 清化熱痰，利濕排膿；桃仁活血祛瘀以消熱結。由于麥門冬湯主治"肺中氣陰虧虛"、 《千金》葦莖湯清肺化痰活血[1()]，與現代中醫所認為之肺癌的病機"氣陰兩虛、熱毒痰 瘀互結"[11]基本相符。現代有人以其中一首方劑加味的方式應用于臨床來治療肺癌而取 效者，如吳玉生氏[12]用加味葦莖湯加減內服治療124例晚期非小細胞肺癌患者，李柳寧 [13]等以千金葦莖湯加味應用在肺癌圍放療期的臨床治療等。 參考文獻劉嘉湘.肺癌的中醫藥治療進展.中國腫瘤,2002,11(6):326 [2]洪廣祥.論中醫藥治療肺癌.中醫藥通報，2007，6(2):5-8、15 [3]陳玉琨.蔣梅.肺癌的中醫治療.新中醫，1999，31(5):31-32 [4]張仲景.金匱要略方論[M].北京:中國書店，1993,4.包素珍，陳明顯.麥門冬湯治療慢性肺系疾病的藥理學研究述要[J].遼寧中醫學院 學報，2005,(2): 168-169浜洋一郎.麥門冬湯對體外氣管炎炎癥模型分泌亢進的作用[J].和漢醫藥學志， 1994,11(4):306-307. Aizawa H, Shigyo M， Nakano H, et al. Effect of the Chinese herbal medicine, Bakumondo-to, on airway hyperresponsivenes induced by ozone exposure inguinea-pigs [J]. Respirology. 1999，4(4):349-54. Aizawa H, Yoshida M, Inoue H， et al. Traditional oriental herbal medicine, Bakumondo-to, suppresses vagal neuro-effector transmission in guinea pig trachea [J]. J Asthma. 2003,40(5):497-500. Isohama Y， Kai H， Miyata T. Bakumondo-to,a traditional'herbal medicine,stimulatesphosphatidylcholine secretion, through the synergistic cross-talk between different signal transduction systems in alveolar type II cells[J]. Nippon Yakurigaku Zasshi.1997,110 Suppl 1:120-125.范永升主編.新世紀全國高等中醫藥院校規劃教材'金匱要略。中國中醫藥出版社 2003.P114、 118陳四清，周仲瑛.原發性支氣管肺癌辨證分型探討.新中醫2002， 34 (11): 6-8 [12]吳玉生，吳凡.加味葦莖湯治療晚期非小細胞肺癌124例療效觀察.新中醫，2004， 36 (7): 13-14李柳寧,劉偉勝.千金葦莖湯加味在肺癌圍放療期的臨床應用.遼寧中醫雜志2006年 第33巻第12期1599
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物，該提
取物對肺癌細胞A549有較好的抑制作用。
本發明還要解決的一個技術問題是提供上述提取物的制備方法。 本發明還要解決的一個技術問題是提供上述提取物在制備抑制肺腺癌細胞A549細
胞增殖藥物中的應用。
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下 一種麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物，它是由下列制備步驟制得
(1) 按重量份數取麥冬200~300份、法半夏100~150份、生曬參200 300份、甘 草80-120份、蘋莖200~300份、薏苡仁200~300份、冬瓜子200-300份、桃仁100~150 份，粉碎后，加入總藥材重量8 12倍的水，浸泡20 60min;加熱至沸騰，并保持沸騰 2~3小時；停止加熱，冷卻至室溫，過濾得濾液，藥渣再加入與第一次水煎相同量的水， 同樣方法再提取1 2次，合并提取液，減壓濃縮，得到水提濃縮液；
(2) 將步驟(1)制得的水提濃縮液加90 95。/。(v/v)乙醇至含醇量為80%(v/v)，靜 置20 30小時，得醇沉上清液和醇沉沉淀，將醇沉上清液減壓濃縮至無醇味后，冷卻至 室溫，過濾得到醇沉上清濃縮液；
(3) 將步驟(2)得到的醇沉上清濃縮液，加入1 2倍容量的環己烷，搖勻后靜置， 待分層后分出上層環己烷溶液，下層水溶液再用環己烷用相同方法萃取1 2次后，合并 下層水溶液；
(4) 在步驟(3)得到的下層水溶液中加入1 2倍容量的乙酸乙酯，搖勻后靜置， 待分層后分出上層乙酸乙酯溶液，下層水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1~2次后，合并上層乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑乙酸乙酯后，得到稠膏。 步驟(1)中，加入水量為總藥材重量的10倍。 步驟(1)中，浸泡時間為30min。
步驟(2)中，水提濃縮液加95。/。(v/v)乙醇至含醇量為80%(v/v)。 上述麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物在制備抑制巨細胞肺癌A549增殖藥物中 的應用。
本發明采用麥門冬湯與千金葦莖湯合方，但對其進行的改進，即于麥門冬湯方中刪 去了組分粳米和大棗。這是因為粳米、大棗為食源性藥物，對疾病治療性功效較弱；本 研究用處方是兩首經典方劑的合用之方，考慮到全方總藥味數的問題，故于方中減去此 二物。
麥門冬湯和千金葦莖湯合用，具有清熱養陰、潤肺降氣、祛瘀排膿之功，和現代中 醫所認為之肺癌的病機"氣陰兩虛、熱毒痰瘀互結"基本相符。
"氣陰兩虛、熱毒痰瘀互結"是肺癌的主要病機。"從多靶點綜合考慮治療肺癌是我 國中醫藥治療肺癌的特色之一"。中藥復方的成分復雜、整體層次研究困難，單一成分 研究較容易，但又常失去中醫藥的特色，因此，對于有效部位群的藥效相關性研究就顯 得尤為重要，它在中藥現代化研究中起著承前啟后的作用。
有益效果本發明的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物即乙酸乙酯萃取部分能夠 顯著抑制肺腺癌細胞A549的生長，并對人體正常細胞(人胚肺成纖維細胞HFL-1)無顯 著影響。提示該提取部位具有細胞毒作用，可以進一步分離篩選抑制肺腺癌細胞A549 增殖的組分及單體化合物。
圖1麥門冬湯合千金葦莖湯有效部位制備流程。
圖2 MW-06部位各濃度對A549細胞和HFL-1細胞增殖的影響。其中*表示與 D(596。DMSO對照組)相比p<0.05， **表示與D(596。DMSO對照組)相比pO.Ol 。
圖3 MW-06部位各濃度對A549細胞增殖的影響(x400)。其中A為空白對照組， B為5%。DMSO對照組，C為500pg/mLMW-06， D為100ng/mL MW-06, E為lO^g/mL MW-06, F為lpg/mL MW-06。
圖4 MW-06部位各濃度對A549細胞克隆形成的影響。其中A為空白對照組，B 為5%。DMSO對照組，C為l嗎/mLDDP順鉬，D為500|_ig/mLMW-06, E為100pg/mL MW-06, F為10pg/mL MW-06, G為lpg/mL MW-06。
圖5 MW-06部位對A549細胞克隆數影響的柱形圖。其中*表示與D(596。DMSO對照組)相比p<0.05， **表示與D(596oDMSO對照組)相比p<0.01 。
圖6 MW-06部位各濃度誘導A549細胞凋亡的作用(x400)。其中A為空白對照 組，B為1%。DMS0對照組，C為lng/mLDDP， D為100|jg/mLMW-06， E為lO^g/mL MW-06, F為lpg/mL MW-06。
具體實施例方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會 限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
實施例l:材料與方法。
1、 主要試劑
旋轉蒸發儀(南京金正教學儀器有限公司，1002升降恒溫水浴鍋)、水循環式真空泵 (河南鞏義市英峪予華儀器廠)、數顯調溫電熱套(通州市張芝山鎮)、HH-S數顯恒溫水浴 鍋(金壇市醫療儀器廠)、圓底燒瓶(20L)、冷凝管、鐵架臺、分液漏斗(5000 ml)(南京金 正教學儀器有限公司)。
麥冬(四川)，法半夏(貴州)，生曬參(吉林)，甘草(內蒙古)，葦莖(安徽)，薏苡仁(貴 州)，冬瓜子(安徽)，桃仁(山東)。
藥用乙醇(分析純，南京化學試劑有限公司)，環己垸(分析純，上海試四赫維化工有 限公司)，乙酸乙酯(分析純，南京化學試劑有限公司)，純凈水(南京水森活純凈水制備 公司)。
肺癌細胞株A549和人胚肺成纖維細胞HFL-1均購自中科院上海生物細胞所。麥門 冬湯合千金蘋莖湯提取部位，由南京中醫藥大學方劑重點實驗室制備提供。RPMI1640 培養基為美國GIBCO公司產品；優級新生牛血清為蘭州民海生物工程有限公司產品； 胰蛋白酶為AMRESCO公司產品；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)為AMRESCO 公司產品；噻唑藍(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazoli腦bromide, MTT)為 AMRESCO公司產品；吉姆薩染液購自南京建成生物工程研究所；Hoechst 33258染色 劑為碧云天生物技術研究所產品；順鉑注射液(DDP，批號071201)為江蘇豪森藥業股份 有限公司產品，其余試劑均為國產分析純。
2、 細胞培養
取對數生長期的人非小細胞肺癌細胞A549和人胚肺細胞HFL-1用含10%小牛血清 的RPMI1640 (青霉素100U/mL、鏈霉素100pg/mL， PH7.4)培養液，置于37°C、 5% C02 培養箱中培養。待細胞鋪展至培養瓶的80%，用0.25%胰酶消化進行傳代培養。乙酸乙酯萃取部分(MW-06部位)用二甲基亞砜(DMSO)助溶，配制成10mg/mL的母液，-20 'C保存備用。
實施例2:麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物的制備。
稱取麥冬200 g,法半夏100 g，生曬參200 g，甘草80 g，葦莖200 g，薏苡仁200 g， 冬瓜子200g，桃仁100g，組成全方共1280g，粉碎后置于20,000 mL圓底燒瓶中，加 藥材量10倍量純凈水，振搖混合后，浸泡30min;連接回流冷凝裝置，置電熱套中緩 緩加熱至11(TC沸騰，并保持微沸2小時后，停止加熱，放置至溶液溫度降為室溫，拆 掉回流冷凝裝置，傾出燒瓶中的溶液，用紗布過濾。藥渣再加入純凈水至與第一次相同 刻度，同樣方法再提取一次，合并提取液，分次用10,000 mL圓底燒瓶進行減壓濃縮， 得到水提濃縮液(MW-01);如此反復提取藥材21.60kg，共得到水提濃縮液(MW-01) 5.37 kg。將上述濃縮液加95Q/。(v/v)乙醇至含醇量為80。/。(v/v)，靜置24小時，得醇沉上 清液2700mL和醇沉沉淀(MW-02) 3.85kg;將醇沉上清液減壓回收溶劑至無醇味，過 濾得到醇沉上清液回收溶劑后沉淀(MW-03)0.05 kg和醇沉上清濃縮液(MW-04) 1.4 kg; 將醇沉上清濃縮液平均分成兩份，分別倒入兩個5000 mL的分液漏斗中，各加入1500 mL 環己垸，搖勻后靜置，待分層后分出上層環己垸溶液，下層水溶液再用環己烷同樣比例 相同方法萃取兩次后，減壓回收溶劑，得到環己環萃取部分(MW-05) 0.18 kg;水層再 各加入1500mL乙酸乙酯，搖勻后靜置，待分層后分出上層乙酸乙酯溶液，下層水溶液 再用乙酸乙酯同樣比例相同方法萃取兩次后，合并上層乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑后 得到乙酸乙酯萃取部分(MW-06)0.13kg;水層再各加入1500mL正丁醇，搖勻后靜置， 待分層后分出上層正丁醇溶液，下層水溶液再用正丁醇同樣比例相同方法萃取兩次后， 合并上層正丁醇溶液，減壓回收溶劑后得到正丁醇萃取部分(MW-07) 0.46 kg和水溶 性部位(MW-08) 0.65 kg;具體制備流程圖見圖l。
實施例3:乙酸乙酯萃取部分(MW-06)對A549細胞抑制作用實驗。 1、實驗方法
1.1細胞增殖抑制實驗(MTT)法
消化收集對數生長期的A549細胞和HFL-1細胞，以5><103/孔接種于96孔板中， 待細胞融合至80%，換無血清培養液培養12h，使細胞同步化，之后實驗組分別加入用 RPMI1640培養液稀釋的終濃度為500pg/mL， lOOpg/mL, 10pg/mL和lpg/mL的MW-06 部位，每孔200uL，同時設等體積的含DMSO對照組(即終濃度5%。)和不含DMSO 的空白對照組，每組設8個平行孔，繼續培養72h，顯微鏡下(x400)觀察后，每孔加 入用PBS配置的濃度為5mg/mL MTT 20pL于37°C 、 5% C02培養箱孵育4h，棄上清后以二甲亞砜溶解藍紫色顆粒，以Ascent酶標儀檢測490 nm波長的每孔吸光度值，根據 公式細胞存活率-實驗孔OD值/對照孔OD值><100%，計算細胞存活率。 1.2克隆形成實驗
取對數生長期的A549細胞，經胰酶消化制備成單細胞懸液，以250個細胞/孔均勻 接種于六孔板中，24h后，每孔換無血清培養基各2mL， 12h后，吸去培養液，加入用 含10%小牛血清的RPMI1640培養液稀釋的終濃度為500pg/mL, 100ng/mL, 10pg/mL和 lpg/mL的MW-06部位，每孔2mL，同時設等體積含5%>DMSO對照組、不含DMSO 的空白對照組和終濃度為lpg/mL的順鉑注射液(DDP)陽性藥對照組，每組3個平行 孔，置37。C、 5%0)2培養箱中培養7天，去除培養液，95%乙醇固定10 min,吉姆薩 染液染色10min，自來水沖洗，晾干，用Quantity One軟件計算克隆數。克隆形成率-克隆數/接種細胞數xlOO。/。；克隆形成抑制率=(1-實驗組克隆形成率)/對照組克隆形成率 xl00%。
1.3Hoechst 33258熒光染色
預先將無菌蓋玻片置于6孔板內，取對數生長期的A549細胞，經胰酶消化制備成 單細胞懸液，均勻接種于預置蓋玻片的六孔板中，24h后，分別以RPMI1640培養液稀 釋的終濃度為100ng/mL、 lOpg/mL和lpg/mL的MW-06部位處理，同時設1%。DMS0 對照組、不含DMSO的空白對照組和濃度為lng/mL的順鉑注射液(DDP)陽性藥對照 組，72h后，吸棄培養液，加入0.5mL固定液，固定10min;去固定液，用PBS洗2次， 每次3min，吸棄液體；加入0.5mL Hoechst 33258染色液，染色5min;去染色液，用 PBS洗兩次，每次3min，吸棄液體；用熒光顯微鏡觀察并拍照。結果判斷正常細胞 的細胞核呈現彌散均勻熒光，出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒 塊狀熒光，甚至可見DNA熒光碎片。 2、實驗結果 2.1細胞增殖抑制實驗 2丄1 MTT試驗
表1 MW-06部位對A549細胞和HFL-1細胞生長的影響(n=8)
細胞株藥物濃度(Hg/mL)OD值存活率
A5495000.295375±0扁3**52.08%
1000.376375±0.0485**70.41%
100.2565±0.0219**43.28%
10.233375±0.020**38.05%
c(對照組)0.581125±0.2162116.75%(續表1)
D(596。DMSO)0.507125±0.0720100.00%
HFL國15000.269±0.0157100.53%
1000.288375±0.0815112.32%
100.327125±0.0523**135.89%
10.296875±0.0679117.49%
c(對照組)0.32625±0.0290135.36%
D(596oDMSO)0.268125±0.0296100.00%
注*表示與D(596oDMSO對照組)相比p<0.05， **表示與D(596。DMSO對照組)相比pO.Ol
由表1、圖2可見50(Vg/mL, 100ng/mL， lO^ig/mL和l^ig/mL MW-06部位均表現 出抑制A549細胞增殖的作用(P<0.01 )，而對正常細胞HFL-1作用不明顯，即對HFL-1 細胞無毒性作用。
2丄2形態學觀察
藥物作用72小時之后，顯微鏡(x400)下觀察發現對照組細胞大小均一，數目 較多，形態正常，而MW-06部位各濃度加藥組細胞形態不規則，數量明顯減少，在 500ng/mL藥物組出現細胞模糊的現象，可能與藥物顏色和濃度較高有關(見圖3)。 2.2平板克隆形成試驗
藥物作用7天后，MW-06部位各濃度對A549細胞克隆形成的影響見圖4， 5%。DMSO 對照組較不含DMSO的空白對照組單克隆所含細胞數少，提示5%。DMSO對A549細胞 有輕度影響，500pg/mL和lpg/mL順鈾組無克隆形成，統計結果見表2、圖5: 500ng/mL， 10(Vg/mL， 10pg/mL和l|ag/mLMW-06部位均明顯抑制A549細胞克隆形成的能力(PO. 01)。
表2 MW-06部位對A549細胞克隆數的影響
組別濃度(jig/mL)克隆數(個)克隆形成率克隆形成抑率
65000.00%117.37%
100162±25.12*64.80%41.31%
1063±6.24**25.20%87.79%
156±6.08**22.40%91.08%
C241±9.0296.40%
D213±9.0785.20%
DDP10**0.00%117.37%
12注*表示與D(596。DMSO組)p〈0.05, **表示與D(596。DMSO組)p〈0.01
2.2 Hoechst 33258染色
在熒光顯微鏡下觀察發現，對照組細胞所發熒光較弱，較均勻，經MW-06部位不 同濃度作用72 h后，細胞數量減少，細胞核明顯變小，熒光強度增高，可見凋亡小體 (x400)(見圖6)。 3、討論
實驗結果顯示，采用MTT法和形態學觀察發現不同濃度麥門冬湯合千金蘋莖湯 MW-06部位有明顯抑制肺癌A549細胞增殖的能力，而對正常對照細胞HFL-1無明顯抑制 作用，說明該部位對肺癌細胞有細胞毒作用而對正常細胞并無殺傷性。細胞克隆形成能 力是評價單細胞存活和增殖的一個良好指標。由實驗結果能夠進一步看出，MW-06部位 在不同濃度時對肺癌A549細胞均有顯著抑制克隆形成的作用。所有腫瘤細胞都存在凋亡 抑制現象，通過誘導細胞凋亡治療腫瘤已成為腫瘤治療的新途徑。細胞發生凋亡時，染 色質會固縮，Hoechst染色細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。9f究顯示，經MW-06 部位干預72h后的各組細胞，用Hoechst33258染色后，均能找到胞核致密濃縮發白發亮 的細胞，表明MW-06部位可以誘導A549細胞凋亡，提示MW-06部位抑制A549細胞增殖 的主要機制可能是誘導細胞凋亡。綜合以上結果，提取部位群中，MW-06部位對非小細 胞肺癌A549細胞株有明顯的細胞毒作用，且對正常細胞人胚肺成纖維細胞HFL-1無毒副 作用。因此，對有效部位群及其進一步提取組分、化合物單體對非小細胞肺癌的信號轉 導通路及相關作用機制研究值得進一步探討，同時為豐富中醫經典復方有效作用機制提 供科學依據。
權利要求
1、一種麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物，其特征在于它是由下列制備步驟制得(1)按重量份數取麥冬200～300份、法半夏100～150份、生曬參200～300份、甘草80～120份、葦莖200～300份、薏苡仁200～300份、冬瓜子200～300份、桃仁100～150份，粉碎后，加入總藥材重量8～12倍的水，浸泡20～60min；加熱至沸騰，并保持沸騰2～3小時；停止加熱，冷卻至室溫，過濾得濾液，藥渣再加入與第一次水煎相同量的水，同樣方法再提取1～2次，合并提取液，減壓濃縮，得到水提濃縮液；(2)將步驟(1)制得的水提濃縮液加90～95％(v/v)乙醇至含醇量為80％(v/v)，靜置20～30小時，得醇沉上清液和醇沉沉淀，將醇沉上清液減壓濃縮至無醇味后，冷卻至室溫，過濾得到醇沉上清濃縮液；(3)將步驟(2)得到的醇沉上清濃縮液，加入1～2倍容量的環己烷，搖勻后靜置，待分層后分出上層環己烷溶液，下層水溶液再用環己烷用相同方法萃取1～2次后，合并下層水溶液；(4)在步驟(3)得到的下層水溶液中加入1～2倍容量的乙酸乙酯，搖勻后靜置，待分層后分出上層乙酸乙酯溶液，下層水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1～2次后，合并上層乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑乙酸乙酯后，得到稠膏。
2、 權利要求1所述的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物的制備方法，其特征在 于該方法包括如下步驟(1) 按重量份數取麥冬200~300份、法半夏100-150份、生曬參200-300份、甘 草80-120份、等莖200-300份、薏攻仁200~300份、冬瓜子200~300份、桃仁100-150 份，粉碎后，加入總藥材重量8 12倍的水，浸泡20 60min;加熱至沸騰，并保持沸騰 2~3小時；停止加熱，冷卻至室溫，過濾得濾液，藥渣再加入與第一次水煎相同量的水， 同樣方法再提取1 2次，合并提取液，減壓濃縮，得到水提濃縮液；(2) 將步驟(1)制得的水提濃縮液加90~95% (v/v)乙醇至含醇量為80% (v/v)，靜 置20 30小時，得醇沉上清液和醇沉沉淀，將醇沉上清液減壓濃縮至無醇味后，冷卻至 室溫，過濾得到醇沉上清濃縮液；(3) 將步驟(2)得到的醇沉上清濃縮液，加入1 2倍容量的環己垸，搖勻后靜置， 待分層后分出上層環己垸溶液，下層水溶液再用環己垸用相同方法萃取1 2次后，合并 下層水溶液；(4) 在步驟(3)得到的下層水溶液中加入1 2倍容量的乙酸乙酯，搖勻后靜置， 待分層后分出上層乙酸乙酯溶液，下層水溶液再用乙酸乙酯用相同方法萃取1~2次后， 合并上層乙酸乙酯溶液，減壓回收溶劑乙酸乙酯后，得到稠膏。
3、 根據權利要求2所述的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物的制備方法，其特 征在于步驟(1)中，加入水量為總藥材重量的10倍。
4、 根據權利要求2所述的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物的制備方法，其特 征在于步驟(1)中，浸泡時間為30min。
5、 根據權利要求2所述的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物的制備方法，其特 征在于步驟(2)中，水提濃縮液加95。/Q(v/v)乙醇至含醇量為80%(v/v)。
6、 權利要求1所述的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物在制備抑制肺腺癌細胞 A549增殖藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物，是將麥門冬湯與千金葦莖湯合方經水提、醇沉、環己烷和乙酸乙酯萃取多個步驟后得到的稠膏。本發明公開了上述提取物的制備方法，還公開了上述提取物在制備抑制肺腺癌細胞A549增殖藥物中的應用。本發明的麥門冬湯與千金葦莖湯合方的提取物即乙酸乙酯萃取部分能夠顯著抑制肺腺癌細胞A549的生長，并對人體正常細胞無顯著影響。提示該提取部位具有細胞毒作用，可以進一步分離篩選抑制肺腺癌細胞A549增殖的組分及單體化合物。
文檔編號A61K36/8994GK101653575SQ20091018345
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月22日 優先權日2009年9月22日
發明者周宇輝, 唐于平, 淼 姜, 怡 孫, 旭 張, 戴曉明, 段金廒, 琳 湯, 飛 熊, 王明艷, 明 蔣, 蔣鳳榮, 趙宏宇, 鄭璐玉, 健 馬 申請人:南京中醫藥大學