一種腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法

專利名稱：一種腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法
技術領域：
本發明涉及一種腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法，屬 于藥物鑒別領域。
背景技術：
腦心清片是柿葉經水提醇沉后，水提液再由乙酸乙酯萃取，得到 柿葉提取物，再由柿葉提取物加輔料制成的中藥制劑，是廣州白云山 和記黃埔中藥有限公司獨家中藥保護品種，收載于《中華人民共和國
衛生部藥品標準》中藥成方制劑第二十冊第294頁。腦心清片共兩種 規格，其中規格(l)[每片重0. 41g (克)]的批準文號為國藥準字 Z44021765，才丸行標準為WS廠B-3974-98，規格(2 )[每片重O. 41g(每 片含柿葉乙酸乙酯浸出物72毫克)]的批準文號為國藥準字Z20053259， 4丸4亍標準為YBZ02432005。
現行標準中的腦心清片的色譜鑒別方法為
取5片[規格(1)]或3片[規格(2)],研細，加乙酸乙酯25ml (毫升)，加熱回流l小時，濾過，濾液濃縮至約2. 5ml作為供試品溶 液。另取糠酸、原兒茶酸、琥珀酸對照品分別加乙酸乙酯制成每lml (毫升)含lmg (毫克)溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國 藥典2005版一部附錄VI B，簡稱附錄VIB)試—險，吸取上述四種溶液 各3ial (微升)，分別點于以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板 上，以曱苯-乙酸乙酯-曱酸(5 :4:1)為展開劑，展開，取出，晾 干，在105。C加熱半小時，放冷，噴以0. 05%溴曱酚綠乙醇溶液。供試 品色譜中，分別在與各對照品色語相應的位置上顯相同顏色的斑點。 發明人在研究中發現，在原標準的鑒別方法中，利用三個有機酸 "糠酸、原兒茶酸和琥珀酸，，鑒別時，錯誤地將腦心清片中含量較高 的一種未知化合物(可能為蘋果酸)誤認為是琥珀酸，且糠酸和原兒茶酸鑒別的重現性較差。同時，由于腦心清片是柿葉提取物加輔料制成的制劑，腦心清片 和柿葉提取物兩者的有效成分一致，薄層色譜鑒別方法應該基本一致。 考慮到目前未有柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法，本發明將兩者的薄 層色譜鑒別方法放在一起申請專利。發明內容針對上述缺陷，本發明解決的技術問題在于，提供一種腦心清片 和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法，能夠更加準確地鑒別腦心清片或 柿葉提取物。一種腦心清片和柿葉^是取物的薄層色語鑒別方法，包括如下步驟a) 將供試樣品磨碎研細，加入甲醇并用超聲波處理，過濾，將濾 液蒸干，殘渣加水，充分攪拌溶解，濾過，濾液加鹽酸，用無水乙醚 振搖提取，分取乙醚層，揮干，殘渣加曱醇溶解，作為第一供試品溶 液；b) 將柿葉對照藥材磨石f研細，加入曱醇并用超聲波處理，過濾， 將濾液蒸干，殘渣加水，充分攪拌溶解，濾過，濾液加鹽酸，用無水 乙醚振搖提取，分取乙醚層，揮干，殘渣加曱醇溶解，作為第一對照 藥材溶液；c) 取原兒茶酸對照品，加甲醇溶解，作為第一對照品溶液；d) 將第一供試品溶液、第一對照藥材溶液和第一對照品溶液進 行薄層色鐠分析；供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相 應的位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則供試品不為腦心清 片或柿葉提取物。對照藥材是通過權威機構鑒定后，能達到某種標準的，并且能用 以鑒別其他藥材真偽的藥材。薄層色譜是天然藥物化學及其他相關專業常用的一種定性鑒別、 分析手段，其基本步驟是將待分析的樣品點樣于鋪有載有吸附劑的 玻璃板上，將該薄層板置于裝有按一定比例配置好溶劑的容器中，展開，觀察熒光，顯色，根據熒光和顯色情況對樣品進行分析。 優選地，所述超聲波處理的時間為20分鐘以上。 優選地，所述超聲波處理的時間為30分鐘。
優選地，步驟d)的具體操作為
分別吸取第 一供試品溶液、第一對照藥材溶液和第 一對照品溶 液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以展開劑展開，取出，晾干， 置紫外燈(254nm (納米))下觀察。供試品色譜中，在與對照藥 材及對照品色譜相應的位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則 供試品不為腦心清片或柿葉提取物。
優選地，所述展開劑為二氯甲烷、曱醇和曱酸的混合物。 優選地，所述二氯甲烷、甲醇和甲酸的體積比為9 ~ 11: 0. 2 ~ 0. 4: 0. 2 ~ 0. 4。
優選地，所述二氯曱烷、曱醇和曱酸的體積比為10: 0.3: 0.3。 在完成上述的鑒別方法之后，如果確定其不是腦心清片或柿葉提 取物，那么鑒別即可結束。如果在完成上述的鑒別之后，供試品色譜 中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，如果能顯相同顏 色的斑點，那么則可以進行如下的步驟
d) 將供試樣品磨碎研細，加入曱醇并用超聲波處理，過濾，將濾 液蒸干，殘渣加曱醇，充分攪拌溶解，作為第二供試品溶液；
e) 將柿葉對照藥材磨石卒研細，加入曱醇并用超聲波處理，過濾，
將濾液蒸干，殘渣加曱醇，充分攪拌溶解，作為第二對照藥材溶液； f )再取齊墩果酸對照品，加曱醇溶解，作為第二對照品溶液。 g)將第二供試品溶液、第二對照藥材溶液和第二對照品溶液進行
薄層色語分析。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的
位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則供試品不為腦心清片或柿
葉提取物。
優選地，步驟g)的具體操:作為
分別吸取第二供試品溶液、第二對照藥材溶液和第二對照品溶 液，分別點于同一硅膠薄層板上，以展開劑展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照 藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
優選地，所述展開劑為曱苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物。 優選地，所述曱苯、乙酸乙酯和甲酸的體積比為6 ~ 8: 1 ~ 3: 0. 2 ~
0. 4。
優選地，所述曱苯、乙酸乙酯和甲酸的體積比為7: 2: 0.3。 本發明中所述的柿葉提取物是指由柿葉藥材經水提，醇沉，萃取等 多種工藝得到的 一種棕黃色至褐色干浸膏，用來生產腦心清片及其它 制劑的中間體。具體工藝(見腦心清片的執行標準WS廠B-3974-98中腦 心清片的制法)如下取干柿葉，加水煎煮二次，第一次2小時，第 二次1小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度1.12-1.15(60 °C),加乙醇至含醇量達85%，靜置過夜，濾取上清液，備用；沉淀物 用65°/。乙醇洗滌兩次，合并洗滌液，靜置過夜，濾耳又上清液，合并兩次 上清液，回收乙醇，加入適量的水，混勻，濾過，濾液用乙酸乙酯提 取四次，合并乙酸乙酯液，回收乙酸乙酯并濃縮成稠膏，低溫干燥， 即得。
本發明所提供的腦心清片和柿葉提取物的薄層色i普鑒別方法與現 有技術相比，本方法選用原兒茶酸和齊墩果酸作為鑒別成分，對供試 品溶液的制備方法進行了改進，增加了柿葉對照藥材鑒別，該色譜鑒 別方法準確，可靠，重現性好。


圖1是實施例1 ~ 5的薄層色譜比較圖。 圖2是實施例7中的薄層色語比較圖。 圖3是實施例8中的薄層色譜比較圖。 圖4是實施例9中的薄層色語比較圖。
以上薄層色譜圖均是在溫度為25。C和相對濕度為60%的條件下完 成；薄層板為自制板；圖2和3是在紫外光燈254nm下觀察到的色譜 情況；圖1和4是在顯色后，肉眼即可觀察到的色譜情況。
具體實施例方式
為了本領域的技術人員能夠更好地理解本發明所提供的技術方 案，下面結合具體的實施方式進行闡述。 實施例1
取5片[規格(1 )]或3片[規格(2 )]待測片，研細，加乙酸乙 酯25ml,加熱回流1小時，濾過，濾液濃縮至約2. 5ml作為供試品;容 液，簡稱為供試品1。
實施例2 ~ 3
重復實施例1的步驟，分別得到供試品2和供試品3。 實施例4
取蘋果酸對照品，加入乙酸乙酯制成每lml (毫升)含lmg (毫克) 的蘋果酸對照品溶液。 實施例5
取琥珀酸對照品，加入乙酸乙酯制成每lml (毫升)含lmg (毫克) 的蘋果酸對照品溶液。 實施例6
將實施例1 ~ 3得到的供試品溶液1 ~ 3、實施例4得到的蘋果酸對 照品溶液和實施例5得到的蘋果酸對照品溶液，照薄層色譜法(附錄 VI B)試驗。吸取上述三種溶液各1(V1 (其中供試品溶液為一式三份， 以下同)，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-曱醇-甲酸(25: 1: l)為展開劑，展開，展距12cm(厘米)，取出，晾午，放冷，噴以0.05% 溴曱酚綠乙醇溶液，得到薄層色譜圖，如圖1所示。
從圖1可以看出，腦心清片中含量較高的一種未知化合物(可能 為蘋果酸)在現有技術中被誤認為是琥珀酸，而在與琥珀酸標準品對 應位置，樣品色譜中基本無琥珀酸斑點出現，證明腦心清片中琥珀酸 的含量很低，不適合用于薄層色譜鑒別。
實施例7
由實施例1 ~ 3得到供試品1 ~ 3。另取糠酸、原兒茶酸、琥珀酸對照品分別加乙酸乙酯制成每lml含lmg溶液，作為對照品溶液。照薄 層色譜法(附錄VI B)試驗，吸取上述兩種溶液各3^1，分別點于以羧 甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以曱苯-乙酸乙酯-甲酸(5 : 4 : 1)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外燈光(254nm (納米)) 下觀察薄層色譜情況，如圖2所示。
從圖2可以看出，在原兒茶酸熒光斑點附近，有大量的其他熒光 物質存在，能對原兒茶酸熒光斑點判斷產生干擾。
實施例8
本實施例利用的原兒茶酸鑒別原理為原兒茶酸易溶于極性較大 的溶劑，所以先用曱醇進行提取；所得的提取物用水處理，去掉一部 分雜質；利用酸性條件下，原兒茶酸易溶于乙醚的性質，用乙醚萃取 出水溶液中的原兒茶酸；將原兒茶酸點于硅膠GF254板上，展開，取出， 晾干，置紫外光燈下(254nm (納米))下檢視，在原兒茶酸色譜相應 的位置上，顯一定顏色的熒光斑點。
具體操作如下取供試樣品5片[腦心清片規格(1)]或3片[腦 心清片規格(2)]或0. 2g(柿葉提取物)，研細，加甲醇"ml,超聲 處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15ml，充分攪拌使溶解，濾 過，濾液加鹽酸O. 5ml，用無水乙醚30ml振搖提取，分取乙醚層，揮 干，殘渣加曱醇lml使溶解，作為供試品溶液(本實施例中，腦心清 片供試品溶液平行制備三次，得供試品4 6;柿葉提取物供試品溶液 一份，簡稱柿葉提取物供試品)。另取柿葉對照藥材8g,同法制成對照 藥材溶液(簡'稱柿葉對照藥材)。再取原兒茶酸對照品，加甲醇制成每 lml含lmg的溶液，作為對照品溶液(原兒茶酸對照品)。照薄層色譜 法(附錄VI B)試驗，吸取上述三種l(Vl,分別點于同一硅膠GF254薄 層板上，以二氯甲烷-曱醇-曱酸(10 : 0.3: 0.3)(或者為10: 0.2: 0. 4或者為10: 0.4: 0. 2等都是可以接受的)為展開劑，展開，取出， 晾干，置紫外光燈(254nm)下抬3見。供試品色譜中，在與對照藥材及 對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
具體如圖3所示。從圖3可以看出，本發明所提供的方法可以清晰鑒別腦心清片和柿葉才是取物。
實施例9
本實施例選擇齊墩果酸進行鑒別的依據齊墩果酸在柿葉、柿葉 提取物和腦心清片中的含量較高，顯色穩定，且有一定的抗心腦血管 疾病的活性，因此，將齊墩果酸作為薄層的鑒別指標成分之一，薄層 鑒別的主要原理是齊墩果酸易溶于甲醇；10%硫酸乙醇溶液是該類物 質的常用顯色劑；105。C加熱至斑點顯色清晰也是該類物質通用的顯色 方法。
具體操作如下取供試樣品5片[腦心清片規格(1 )]或3片[腦 心清片規格(2)]或0. 2g(柿葉提取物)，研細，加曱醇25ml,超聲 處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加曱醇lml使溶解，作為供試品 溶液(本實施例中，腦心清片供試品溶液平行制備三次，得供試品7~ 9;制備柿葉提取物供試品溶液一次)。另取柿葉對照藥材2g，同法制 成對照藥材溶液。再取齊墩果酸對照品，加甲醇制成每lml含lmg的 溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄VI B)試驗，吸取上述 三種溶液各10pl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以曱苯-乙酸乙酯-曱酸(7: 2: 0. 3)(或者為7: 1: 0. 4或者為7: 3: 0. 2等都是可 以接受的)為展開劑，展開，展距12cm,取出，晾干，噴以10%硫酸 乙醇溶液，在105。C加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照 藥材及對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
具體如圖4所示。從圖4可以看出，本發明所提供的方法可以清 晰鑒別腦心清片和柿葉提取物。
本發明的實施例中薄層板自制過程為
1. 配置好0. 8°/ 的羧曱基纖維素鈉水溶液。
2. 取薄層硅膠(硅膠G或者硅膠GF254)約100g,加入0. 8°/。的羧甲 基纖維素鈉水溶液約300ml,用玻璃棒充分攪拌使其混合均勻，得到一 乳濁液。
3. 用鋪板器將乳濁液平鋪于數塊備好的玻璃板上，晾干，將晾干 的硅膠板放入烘箱，ll(TC溫度下烘約30min (分鐘)，拿出，放冷，備
ii用。
本發明對選擇原兒茶酸和齊墩果酸兩種成分對腦心清片進行鑒 別，與原標準中利用三種有機酸(糠酸、原兒茶酸、琥珀酸)對腦心 清片進行鑒別的方法相比，選擇的鑒別成分更加合理；本發明還對供 試品溶液的制備過程進行了優化，優化后的供試品色譜中，；險測成分 的斑點清晰可見，未見其它成分的干擾，使色譜鑒別更加明顯且重復
性好；增加利用柿葉對照藥材進行鑒別，^f吏鑒別方法更加合理和完整。 綜上所述，本發明所提供的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒 別方法與現有技術相比，可以更加準確地對腦心清片和柿葉才是取物進 行鑒別。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領 域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出 若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1、一種腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法，包括如下步驟a)將供試樣品磨碎研細，加入甲醇并用超聲波處理，過濾，將濾液蒸干，殘渣加水，充分攪拌溶解，濾過，濾液加鹽酸，用無水乙醚振搖提取，分取乙醚層，揮干，殘渣加甲醇溶解，作為第一供試品溶液；b)將柿葉對照藥材磨碎研細，加入甲醇并用超聲波處理，過濾，將濾液蒸干，殘渣加水，充分攪拌溶解，濾過，濾液加鹽酸，用無水乙醚振搖提取，分取乙醚層，揮干，殘渣加甲醇溶解，作為第一對照藥材溶液；c)取原兒茶酸對照品，加甲醇溶解，作為第一對照品溶液；d)對第一供試品溶液、第一對照藥材溶液和第一對照品溶液進行薄層色譜分析，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則供試品不為腦心清片或柿葉提取物。
2、 根據權利要求1所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，所述超聲波處理的時間為20分鐘以上。
3、 根據權利要求2所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，所述超聲波處理的時間為30分鐘。
4、 根據權利要求1所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，步驟d)的具體操作為'分別吸取第一供試品溶液、第一對照藥材溶液和第一對照品溶液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以展開劑展開，取出，晾干， 置紫外燈254納米下觀察，供試品色譜中，在與對照藥材及對照 品色鐠相應的位置上，顯相同顏色的斑點。
5、 根據權利要求4所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，所述展開劑為二氯曱烷、曱醇和曱酸的混合物。
6、 根據權利要求5所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，所述二氯甲烷、曱醇和甲酸的體積比為9 ~ 11: 0. 2 ~
7、 根據權利要求6所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，所述二氯曱烷、曱醇和曱酸的體積比為10: 0.3: 0. 3。
8、 根據權利要求1~7所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜 鑒別方法，其特征在于，步驟d)中，供試品色語中，在與對照藥材 及對照品色語相應的位置上，如果顯相同顏色的斑點，則進4亍如下 步驟e) 取供試樣品，磨碎研細，加入甲醇并用超聲波處理，過濾，將 濾液蒸干，殘渣加曱醇，充分攪拌溶解，作為第二供試品溶液；f) 將柿葉對照藥材磨碎研細，加入曱醇并用超聲波處理，過濾， 將濾液蒸干，殘渣加曱醇，充分攪拌溶解，作為第二對照藥材溶液；g) 再取齊墩果酸對照品，加甲醇溶解，作為第二對照品溶液；h) 將第二供試品溶液、第二對照藥材溶液和第二對照品溶液進 行薄層色譜分析，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的 位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則供試品不為腦心清片。
9、 根據權利要求8所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別 方法，其特征在于，步驟h)的具體操作為分別吸取第二供試品溶液、第二對照藥材溶液和第二對照品溶 液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以展開劑展開，取出，晾干，噴 以10。/。碌u酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，在105。C加熱至斑點顯 色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上， 顯相同顏色的斑點。
10、 根據權利要求9所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒 別方法，其特征在于，所述展開劑為曱苯、乙酸乙酯和甲酸的混合物。
11、 根據權利要求10所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒 別方法，其特征在于，所述曱苯、乙酸乙酯和曱酸的體積比為6~8: 1~ 3: 0.2-0.4。
12、 根據權利要求11所述的腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法，其特征在于，曱苯、乙酸乙酯和曱酸的體積比為7: 2: 0.3。
全文摘要
本發明公開一種腦心清片和柿葉提取物的薄層色譜鑒別方法，包括如下步驟a)將供試樣品磨碎研細，加入甲醇并用超聲波處理，過濾，將濾液蒸干，殘渣加水，充分攪拌溶解，濾過，濾液加鹽酸，用無水乙醚振搖提取，分取乙醚層，揮干，殘渣加甲醇溶解，作為第一供試品溶液；b)另將柿葉對照藥材進行與步驟a)相同的操作，作為第一對照藥材溶液；c)再取原兒茶酸對照品，加甲醇溶解，作為第一對照品溶液；d)將第一供試品溶液、第一對照藥材溶液和第一對照品溶液進行薄層色譜分析。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上，如果不能顯相同顏色的斑點，則供試品不為腦心清片或柿葉提取物。
文檔編號A61K36/44GK101658546SQ200910171358
公開日2010年3月3日 申請日期2009年8月27日 優先權日2009年8月27日
發明者幼 利, 尹仁杰, 張小雪, 李楚源, 挺 林, 梁敬儀, 王德勤, 杰 羅, 薇 陳 申請人:廣州白云山和記黃埔中藥有限公司