專利名稱：：用于治療膀胱腫瘤的藥物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種藥物，特別是一種用于在膀胱內灌注治療膀胱腫瘤的，由從中藥中提取的活性成份配伍復方組成的，用于在膀胱內灌注治療膀胱腫瘤的藥物。
背景技術：
：膀胱腫瘤是男性泌尿生殖系統腫瘤，在西方國家中，其發病率在男性泌尿生殖系腫瘤中僅次于前列腺癌，居第一位。并且據流行病學調查，在美國，該疾病的發病率在過去的30年間穩步升高。膀胱腫瘤在我國也較為最常見。由于年齡是該疾病主要的發病風險因素之一，可以預見，隨著人口老齡化的加重，膀胱腫瘤的發病率將進一步升高。膀胱腫瘤中80%以上為淺表性腫瘤，現階段主要治療方法為手術治療，術后輔以膀胱內灌注藥物以抑制腫瘤復發和延緩其向肌層侵襲。若術后不進行輔助治療，術后l年的復發率高達80%。自1976年Morales首次將卡介苗(BCG)應用于淺表性膀胱腫瘤術后灌注預防復發以來，BCG膀胱灌注已成為膀胱腫瘤輔助治療的一種重要手段，并且，目前BCG是美國FDA唯一批準的膀胱內灌注藥物。但其確切的抗腫瘤機制至今尚不清楚，并且BCG膀胱內灌注毒副作用大，患者難以堅持完成整個灌注療程，從而影響療效。中國發明專利公開了多種用于治療膀胱癌的口服中藥制劑，如01131500.8公開了一種由山茨菇、螃蟹、敗醬草、千金子、仙鶴草等五種藥配成，治療膀胱癌的中成藥。01106271.1公開了由全酥、大戟、白花蛇舌草、半枝蓮、大黃、黃連原料組成的一種治療癌癥的中藥。200610057952.2公開了一種以石韋、黃芪、敗醬草、龍葵、蒲黃、土茯苓、琥珀、金錢草、小茴香、烏藥、車前子、海金沙、瞿麥、白術和三七為原料制備的治療膀胱癌的中藥制劑。但在現有技術中尚無以中藥或屮藥活性成份提取物或其配伍復方組成的膀胱灌注藥物。
發明內容本發明提供一種以中藥活性成份提取物配伍復方構成的，用于膀胱內灌注治療膀胱癌的藥物，本發明用于治療膀胱腫瘤的藥物，其特征是藥物由中藥單體人參皂甙Rg3、槲皮素和姜黃素組成，且各組份的摩爾比為人參皂甙Rg3:槲皮素姜黃素-20:5:3。本發明的最佳藥物組方為三種中藥單體人參皂甙Rg3160士4(^mol/L，姜黃素24±6pmol/L，槲皮素38士9(imol/L。中藥人參性甘溫，入心、肺、脾經，大補元氣、寧神益智、健脾益氣、養心生津。人參抗腫瘤作用的活性成分是人參皂甙，研究表明人參皂甙Rg3的抗腫瘤作用最為明顯，其抗腫瘤的主要機制如下(1)促進腫瘤細胞的凋亡；(2)抑制腫瘤細胞的增殖；(3)抑制腫瘤新生血管形成；(4)提高機體的免疫功能。槲皮素是一種黃酮類化合物，中草藥槐米、側柏葉、高良姜、三七、銀杏等均含有槲皮素。既往研究證實槲皮素可抑制惡性腫瘤的生長，眾多的實驗研究結果顯示槲皮素可以抑制腫瘤細胞增殖和信號轉導途徑中的多種酶、清除氧fi由基等作用。目前我們的研究證實槲皮素可抑制膀胱癌細胞增殖，有凋亡誘導效應，這些作用可能通過P53禾nsurvivin蛋白起作用。同時槲皮素可降低膀胱癌細胞生長抑制基因Erb、P16和PASSF1A的甲基水平，參見LiMa，JeanMagloireFeuguang,JianzhongLu，ShengjunFu，BaoliangMa,lBinqiangTian,ChangpingZouangZhipingWang.Growthinhibitorysffectsofquercetinonbladdercancercell.FrontiersinBioscience2006,September1,11,2275-2285.姜黃為姜科黃屬大然植物，有行氣滯、散風活血和止痛功效。2000年別被列入美國藥典。目前對姜黃素的抗癌機制表現在以下幾個方面(l)抗氧化；(2)抑制致癌物活性，誘導解毒酶；(3)抑制花生四稀酸代謝產物的形成；(4)抑制癌基因表達，誘導凋亡，調節細胞信號轉導通路。姜黃素能誘導多種腫瘤細胞凋亡，能引起人肝癌細胞P53和C-myc蛋白明顯變化，參見Jiang，M.C.,H.f.Yang-Yen，J.K丄inandJ.J.Yen.DifferentialregulationofP53,c-Myc，Bcl-2andBaxproteinexpressionduringapoptosisinducedbywidelydivergentstimuliinhumanhepatoblastomacells.Oncogene,1996,13(3):609-16.。發明人的的前期研究表明，姜黃素顯著誘導三種膀胱腫瘤細胞T24、EJ和UMU2凋亡，阻滯腫瘤細胞在G2/M期。兩種抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達下調，4同時Bax和p53表達上調。克隆形成試驗證實姜黃素大劑量、短期作用于膀胱癌細胞有致命的效應。同吋體內試驗證實姜黃素誘導原位膀胱癌細胞凋亡，抑制并減緩膀胱癌的形成和發展，參見BinqiangTian,ZhipingWang,YingmeiZhao,DeguiWang，YonggangLi，LiMa,XiaomingLia,JingLia，NanXIaoa,Yiaoa,YichenWanga,RonaldRodriguezc.Effectsofcurcuminonbladdercancercellsanddevelopmentofurotheliatumorsinaratbladdercarcinogenesismodel.Canncerletters,2008，8;264(2);299-308.。目前公認腫瘤的發生發展是多基因、多步驟共同參與累積的結果，這與中醫的整體觀有相似之處。本發明亦遵循這一理論觀點，從整體觀出發，堅持在中醫藥理論指導下，以病證結合、方證相應、理法方藥一致為原則，進行有效單體成分復方配伍，發掘膀胱腫瘤灌注的優勢中藥，從與腫瘤發生有關細胞凋亡闡明配伍復方的抗膀胱癌作用。古籍《素問，氣厥論篇》說"胞移熱于膀胱，則癃溺血"。膀胱腫瘤病位在膀胱，與心、脾、腎密切相關，尤其是手術后絕大多數患者證侯表現虛實夾雜，多以氣虛血瘀為主，因此治療原則當以益氣活血，溫補脾腎為宜。在這些原則下確定了本發明組方的具體藥物，同時考慮到本發明是種用于膀胱灌注的藥物，因此本發明采用由藥物中提取的活性成份。相關研究表明，本發明作用于人膀胱癌腫瘤細胞后凋亡和死亡明顯優于相對比的其他分組，具有抗腫瘤、抑制腫瘤復發、增強免疫力的療效，且不良反應和副作用較小的優點。圖1為雙變量流式細胞儀的散點圖，用于比較本發明和其他分組，作用于人膀胱癌腫瘤細胞后凋亡和死亡的情況。圖2為本發明作用于膀胱腫瘤細胞24h后熒光顯微鏡照片。具體實施例方式以下提供本發明的最佳實施例中藥有效組分配伍復雜繁瑣，傳統研究方法費時費力，也不容易發現其內在規律。正交實驗設計作為一種多因素多水平實驗設計的科學方法，在醫學中藥方劑研究中具有十分重要的意義。本發明的最佳實施例即采用正交實驗，得出最佳的配伍比例，具體的做法如下1、三種中藥的體外的抗腫瘤試驗通過膀胱癌細胞的培養及細胞毒試驗來計算三種中藥單體的半數抑制濃度(IC50)。通過實驗"三種單體成分體外抗膀胱癌細胞株T24的半數抑制率(IC50)"得到三種中藥單體24小時內作用于膀胱癌細胞株T24的半數抑制率(24h/IC50)結果人參皂武Rg3160ymol/L;姜黃素24umol/L;槲皮素158umol/L。2、根據治療原則依照，以人參皂甙Rg3為君藥，槲皮素、姜黃素為復方臣藥組成復方。3、運用數理統計學方法，通過計算機正交設計計算出三種中藥單體的最佳藥效的劑量配伍。本實驗選用L9(34)正交表，本實驗所設計的因素水平表如卜正交試驗因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>優化配伍復方的體外抗膀胱腫瘤試驗(1)AnnexinV-FITC/PI檢測凋亡正常細胞膜磷脂的分布是不對稱的，膜內表面含負電的磷脂(如磷脂酰絲酸，PS)，而膜外表面含有占絕大多數的中性磷脂。在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。AnnexinV是一種分子量為3536kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將AnnexinV進行熒光素FITC標記即能檢測到細胞早期凋亡。碘化丙啶(propidineio2dide，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的對PI有拒染性，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。具體實驗步驟略。(2)細胞毒實驗得到如下正交實驗數據表正交試驗數據表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>得到最佳復方配伍劑量為人參皂甙Rg3160umol/L，槲皮素38ymol/L，姜黃素24timol/L。(3)中藥復方與單體中藥及羥基喜樹堿對人膀胱癌細胞株T24凋亡作用的對比。經A皿exinV-FITC/PI檢測凋亡。得到雙變量流式細胞儀的散點圖，見圖1;實驗細胞的熒光顯微鏡觀察見圖2和圖3。圖l給出雙變量流式細胞儀的散點圖，比較了中藥復方制劑和其他分組，作用于人膀胱癌腫瘤細胞后凋亡和死亡的情況。即為AnnexinV-F工TC/PI檢測凋亡的流式細胞儀分析結果。流式細胞儀激發光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測P工。結果判斷凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC+ZPI+);而右下象限為凋亡細胞，顯現(FITC+/PI-)。經本發明組方作用后的細胞主要位于右上象限和右下象限，其作用后的人膀胱癌腫瘤細胞以凋亡和死亡為主，而活細胞基本沒有。由這一實驗可知本發明的藥效要好于其他分組。實驗細胞的熒光顯微鏡觀察結果見圖2和圖3。由圖2可見，在熒光顯微鏡下，雙色濾光片(FITC和羅丹明)觀察，經本發明藥物處理后膀胱癌腫瘤細胞開始凋亡，由圖3可見膀胱癌腫瘤細胞已經破裂壞死。權利要求1、用于治療膀胱腫瘤的藥物，其特征是藥物組成由人參皂甙、槲皮素和姜黃素構成，且人參皂甙、槲皮素、姜黃素三種中藥單體的摩爾比約為20∶5∶3。。2、根據權利要求l所述治療膀胱腫瘤的藥物，其特征是其最佳配伍比例的劑量范圍為人參皂甙槲皮素姜黃素-160士40(imol/L:24±6pmol/L:38±9fimol/L。3、權利要求1或2所述的藥物在制備治療膀胱腫瘤藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種由從中藥中提取的活性成份配伍復方組成的，用于在膀胱內灌注，治療膀胱腫瘤的藥物。本發明藥物由中藥單體人參皂甙Rg3、槲皮素和姜黃素組成，且各組份的摩爾比為人參皂甙Rg3∶槲皮素∶姜黃素＝20∶5∶3，其最佳藥物組方為三種中藥單體人參皂甙Rg3160±40μmol/L，姜黃素24±6μmol/L，槲皮素38±9μmol/L。文檔編號A61K31/704GK101623295SQ20091016548公開日2010年1月13日申請日期2009年8月13日優先權日2009年8月13日發明者濤宋,王志平,王晶宇,田斌強,郭亞收,莉馬申請人:蘭州大學