專利名稱：旋毛蟲與腫瘤相關抗原蛋白及其制備方法和醫用用途的制作方法
技術領域：
本發明提供了旋毛蟲與腫瘤相關抗原蛋白及其制備方法，本發明還提供了該蛋 白的醫用用途，屬于生物制藥領域。
背景技術：
旋毛蟲是一種寄生于人和多種動物體內的線蟲，近年來研究發現其具有較強的 抗腫瘤活性，但對其抗腫瘤活性成分尚不清楚。據報導惡性腫瘤細胞對異體鑒識物比 較敏感，異體抗原物所產生的免疫細胞對惡性腫瘤具有抵抗力。旋毛蟲與腫瘤細胞相 關抗原能產生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應.
發明內容
本發明提供了旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原蛋白，為一種新的蛋白物質，具有醫 藥活性。
本發明還提供了該相關抗原蛋白的制備方法，適用于工業化生產。 本發明進一步公開了該蛋白的醫用用途，用于制備治療腫瘤的藥物。 本發明公開的旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原蛋白，具有以下表證
分子量是33.211ku， pl是4.64，共由以下284個氨基酸組成
本發明相關抗原蛋白的制備方法如下
利用酶聯免疫吸附試驗確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫 瘤細胞陽性血清間存在相關抗原；利用超濾及透析技術對相關抗原進行分離得到抗原 蛋白。
下述的藥理實驗證實了本發明抗原蛋白具有顯著的抑制腫瘤生長的作用，可以作 為制備抗腫瘤藥物被應用。
旋毛蟲與腫瘤相關抗原抗腫瘤效果
將18 22g的BalB/C小鼠隨機分為活蟲免疫組、ES抗原免疫組、相關抗原免疫組、佐劑免疫對照組，每組10只。將相關抗原與ES抗原各lOCmg (化gA4J加入等 量的弗氏完全佐劑乳化均勻，腹腔免疫。兩周后，以8(^g(l^/叱)加入等體積的弗氏 不完全佐劑進行第二次腹腔免疫。在相關抗原與ES抗原組第一次免疫的同時，給活 蟲免疫組小鼠按400條/只灌胃投服旋毛蟲肌幼蟲活蟲。佐劑對照組則以佐劑加等量 的滅菌生理鹽水進行首免和第二次免疫。按分組情況，第二次免疫后三天于小鼠的右 后肢皮下注射接種lX106個細胞/只。荷瘤30d后，頸椎脫臼處死各個實驗組小鼠， 并進行腫瘤體積、重量等物理指標的測定以及CD3+、 CD4+、 CD8+、 CD19+等免疫指標的 檢測。所有結果數據均利用SPSS 14.0 for Windows軟件進行分析，檢驗差異顯著性。
抗腫瘤試驗結果 結果表明
活蟲免疫組、粗抗原免疫組、ES抗原免疫組、相關抗原免疫組的體內平均抑瘤率 分別為50.53%， 36.95%， 44.49%， 45.34%。接種相關抗原實驗組的瘤重顯著低于空 白對照組(P〈0. 01),各組抗原的抗腫瘤情況見表1，表2)。方差分析，「=34. 265， p=0. 000， 表明各組瘤重有顯著差異。LSD檢驗結果顯示，活蟲與相關抗原組抗瘤率沒有顯著差 異。
表1各種抗原對SP2/0骨髓瘤細胞荷瘤小鼠腫瘤重量的影響(x ±s，n=10)
組別數量腫瘤重量(g)抑瘤率(%)
佐劑105. 06±0. 089
ES抗原102. 83±0. 178*44. 14
相關抗原102. 766±0. 150*45. 35
鵬102. 53±0. 196*50. 07
P*<0. 001
表2各種抗原對SP/20骨髓瘤細胞荷瘤小鼠腫瘤體積的影響(S±s, n=10)
組別數量腫瘤重量(g)抑瘤率(%)
佐劑104. 216±0. 098
粗抗原102. 657±0. 253*36. 98
ES抗原102. 35±0. 035*44. 84
相關抗原102. 305±0. 165*45.33
激102. 108±0. 216*51. 00
P*〈0. 001本發明的積極效果在于腫瘤細胞對異體鑒識物比較敏感，旋毛蟲與腫瘤細胞 相關抗原能產生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應，同時旋毛蟲與腫瘤細胞相 關抗原易于制備和工業化。
圖1旋毛蟲肌幼蟲總蛋白雙向電泳圖譜； 圖2雙向電泳后的免疫印跡。
圖3 Western-blot鑒定旋毛蟲與H印al-6肝癌細胞間相關抗原成分
具體實施方法-
實施例1
1. 旋毛蟲與骨髓瘤細胞相關抗原確定
首先制備旋毛蟲可溶性抗原和SP2/0骨髓瘤細胞抗原并分別免疫BalB/C小鼠制 備兩種抗原的陽性血清。按常規操作步驟包被旋毛蟲可溶性抗原和SP2/0骨髓瘤細胞 抗原并使其分別與SP2/0骨髓瘤細胞陽性血清、旋毛蟲陽性血清、健康鼠血清反應， 酶標儀測得OD490值，以P/N》3為判定標準，ELISA結果顯示旋毛蟲肌幼蟲抗原與 SP2/0骨髓瘤細胞抗體以及SP2/0骨髓瘤細胞抗原與旋毛蟲抗體均具有較好的免疫交
叉反應，所獲得的最佳抗體效價分別是骨髓瘤細胞高免血清l: 6 400;旋毛蟲高免
血清l: 3 200，同時兩種抗原都不與健康小鼠血清反應。
2. 旋毛蟲與骨髓瘤細胞相關抗原蛋白氨基酸測定
提取旋毛蟲肌幼蟲總蛋白制備雙向電泳上樣蛋白。利用雙向電泳起始試劑盒完成 等點聚焦過程，將聚焦好的膠條繼續進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據同一塊膠上的標 準分子量蛋白的電泳遷移率(Rf)，建立回歸方程，進而求出各蛋白點的分子量。取 雙向分離后的凝膠中的一塊進行考染并脫色，其余凝膠與篩選好的旋毛蟲陽性血清進 行免疫印跡雜交。嚴格參照免疫印跡結果，分別于三張凝膠上同時選取能夠與骨髓瘤 細胞高免血清雜交的旋毛蟲肌幼蟲蛋白點，進行串聯質譜分析。以Typsin酶解考染 樣品，并用50%乙腈與0. P/。無水三氟乙酸(TFA)混合液提取肽段，并在N2流下吹干濃 縮。將完全干燥的肽段重新溶解于0.7叱，0.5g/L的a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA 溶齊l」，0. 1%TFA+50%ACN)溶液中，并將其全部點到192-well靶板上，室溫下自然干燥， 采用正離子模式、反射式飛行時間方式檢測，采用Myoglobin的標準胰蛋白酶酶解肽 段做外標校正，質量誤差小于5X 10 — 5,加速電壓20 kV，激光源為波長355 nm、脈沖 200 Hz的Nd:YAG固體紫外激光器。采集質譜(MS)圖條件 一級質譜掃描范圍1000
54000 /27/z,選擇符合要求的離子作為母離子繼續二級質譜，在上述各主要參數固定的 前提下，獲得一系列串聯質譜圖。MALDI-TOF/TOF-MS得到的譜圖用Applied Biosysteras公司的專用譜圖處理軟件Data Explorer 4. 5和4700Explorer 2. 0分析， 并運用MASCOT引擎檢索數據庫。數據庫檢索條件為肽譜、串級質譜圖質量偏差分 別為0. 1和0. 5 Da，選擇N端乙酰化修飾，電荷選擇MALDI為+ 1。結果發現旋毛蟲 肌幼蟲總蛋白經pH3 10膠條等電聚焦和SDS-PAGE分離后，再經考馬斯亮蘭R-250 染色后得到二維圖譜。蛋白點主要分布于pH4 7、分子量14 100ku的范圍(如圖l 所示)。通過IraageMaster5. 0軟件分析，5張膠同一樣本蛋白點匹配率91%，圖譜重 復性很好。①通過自動點檢測(Auto detection)獲得蛋白質檢測圖；②利用背景扣 除(background duduction)消減部分背景條紋；③選取其中的一張凝膠作為參考凝 膠(refrence gel),其余圖譜與之匹配，生成凝膠報告，并進行修正，從而在凝膠 報告中獲得蛋白點的等電點、分子量、凝膠之間的點匹配率等信息。軟件分析顯示， 考染后的凝膠共有288±12個蛋白點。將雙向電泳分離后的旋毛蟲總蛋白與Sp2/0骨 髓瘤高免血清進行免疫雜交，得到了三種不同分子量和等電點的相關抗原蛋白。分別 是分子量為33ku、 pl是4. 6和6. 8的蛋白以及分子量為66 ku、 pl是6. 9的蛋白 (如圖2所示)。經過飛行時間串聯質譜分析，最終確定這種與骨髓瘤細胞相關的抗原 成分主要是旋毛蟲的原肌球蛋白(Tr叩omyosin， TM)，其精確分子量是33. 211ku， pl 是4.64，共由284個氨基酸組成
實施例2
旋毛蟲與肝癌細胞相關抗原確定
首先制備旋毛蟲可溶性抗原和Hepal-6肝癌細胞抗原并分別免疫BalB/C小鼠制備 兩種抗原的陽性血清。按常規操作步驟包被旋毛蟲可溶性抗原和H印al-6肝癌細胞抗原 并使其分別與H印al-6肝癌細胞陽性血清、旋毛蟲陽性血清、健康老鼠血清反應，酶 標儀測得0D490值，以P/N》3為判定標準，ELISA結果顯示，旋毛蟲與H印al-6肝癌 細胞之間存在相關抗原，所獲得的交叉反應的最佳抗體效價分別是H印al-6肝癌細胞抗原免疫血清1:400;旋毛蟲蟲體抗原免疫血清1:800。旋毛蟲可溶性粗抗原在20 130kDa蛋白分子量范圍內存在可以與H印al-6肝癌細胞高免血清反應的蛋白條帶，反 應條帶的相對分子量為26. OkDa左右和130kDa。而H印al-6肝癌抗原在14. 4 94. OkDa 蛋白分子量范圍內有可以與旋毛蟲高免血清反應的蛋白條帶，反應條帶的相對分子量 為94. OkDa， 35. OkDa和14. 4kDa (如圖3所示)。 實施例3
旋毛蟲與乳腺癌細胞相關抗原確定
首先通過ELISA來確定旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞之間存在相關抗原，再進行 SDS-PAGE, Western-bloting確定其分子量.結果發現ELISA方法確定了旋毛蟲抗原與 MCF-7乳腺癌細胞間存在能夠產生免疫交叉反應的相關抗原；SDS-PAGE結果表明 MCF-7乳腺癌細胞抗原與旋毛蟲抗原之間至少存在6條具有分子量相似的蛋白帶 分別是6條具有分子量相似的蛋白帶分別是66.2 90 (2條)、52、 45、 26 35 (2 條)kDa,其中最明顯的是52、 45kDa的這兩條蛋白帶；Westem-bloting結果表明旋毛 蟲可溶性抗原在23 97.4kDa蛋白分子量范圍內可以與MCF-7乳腺癌細胞高免血清 反應，反應條帶的相對分子量分別為97、 66、 42、 33、 23kDa，其中42kDa的抗原帶 交叉免疫反應最強烈。
權利要求
1、一種旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原蛋白，其特征在于分子量是33.211ku，pI是4.64，其氨基酸序列為MDAIKKKMQAMKIEKDNAMDRADAAEEKARQQQERVEKLEEELRDTQKKMMQVENELDKAQEELTGANAQLEEKEKKVQEAEAEVAALNRRIQLLEEDFERAEERLIIATEKLGEASQTADESERVRKVMENRSLQDEERVYQLEAQLKEAQLLAEEADRKYDEVARKLAMVEADLERAEERAEAGENKIVELEEELRVVGNNLKSLEVSEEKALQREDSYEEQIRLLTQRLKEAETRAEFAERSVQKLQKEVDRLEDELVHEKEKYKAISEELDQTFQELSGY。
2.權利要求l所述抗原蛋白的制備方法，包括以下步驟 利用酶聯免疫吸附試驗確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間存在相關抗原；利用超濾及透析技術 對相關抗原進行分離得到抗原蛋白。
3.權利要求1所述抗原蛋白在制備治療腫瘤藥物的應用。
全文摘要
本發明提供了旋毛蟲與腫瘤相關抗原蛋白及其制備方法，該抗原蛋白分子量是33.211ku，pI是4.64，共由284個氨基酸組成；旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原能產生針對腫瘤強的特異性和非特異性免疫反應，同時旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原易于制備和工業化。本發明還提供了該蛋白用于制備治療腫瘤的藥物。
文檔編號A61K39/00GK101671387SQ20091016377
公開日2010年3月17日 申請日期2009年8月14日 優先權日2008年12月31日
發明者宮鵬濤, 楠 張, 張景芝, 張西臣, 李建華, 舉 楊 申請人:吉林大學