豬鏈球菌耐藥抑制劑的制作方法

專利名稱：：豬鏈球菌耐藥抑制劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種耐藥抑制劑，尤其涉及連翹提取物的新用途，本發明還涉及由連翹提取物和阿莫西林組成的復方藥物以及它們在抑制豬鏈球菌耐藥林中的用途，屬于豬鏈球菌的防制領域。
背景技術：
：豬鏈球菌(Str印tococcus.suis)屬條件致病菌，在健康動物鼻腔、扁桃體、上呼吸道和支氣管均有本菌存在，一定條件下，可引起腦膜炎、關節炎、心內膜炎以及敗血癥等多種疾病類型，嚴重者可使動物突然死亡。豬鏈球菌病是多年來一直困擾養豬業發展的重要傳染病之一。根據莢膜多糖抗原的差異，可將豬鏈球菌分為35個血清型，即1-34以及1/2型，而2型豬鏈球菌是近年來引起獸醫工作者關注的人畜共患病病原。我國于1990年在廣東省首次發現類似此血清型的鏈球菌存在。1998、1999、2005年先后3次從暴發急性敗血癥死亡的豬中分離到此菌。由于該菌在自然界分布廣泛，抗原結構復雜，血清型眾多，所以用疫苗控制該病效果不理想，現在臨床上普遍應用大環內酯類、四環素類和氟喹諾酮類等藥物進行預防和治療。隨著大環內酯類、四環素類和氟全諾酮類等藥物的廣泛應用，豬鏈球菌對其耐藥性也逐漸增多。丹麥Danish獸醫實驗室從1995-1996年間共分離豬鏈球菌265林，其中9.7%血清2型菌沖朱對林可霉素耐藥，12.9%對螺旋霉素耐藥，56.8°/。血清型對林可霉素及螺旋霉素產生耐藥性。1967-1981年Aarestr叩等在丹麥分離的2型豬鏈球菌對大環內酯類藥物均敏感，而從1992-1997年分離的菌林，20.4%的菌林對大環內酯類藥物產生了耐藥性，據分析這與在過去15年中養豬業中大量應用泰樂菌素有關。2004年王麗平等采用瓊脂兩倍稀釋法和改良的雙紙片法，測定出獸醫臨床分離的40林豬鏈球菌對部分大環內酯類抗生素、克林霉素、林可霉素、青霉素的體外最小抑菌濃度及紅霉素耐藥菌的耐藥表型。實驗結果顯示，豬鏈球菌對紅霉素、羅紅霉素、泰樂菌素及替米考星的耐藥率分別達72.5%、67.5%、72.5%和62.5%,對林可霉素和克林霉素的耐藥率高達65.0%和62.5%,對青霉素耐藥率為40.0%,青霉素耐藥菌林對其他藥物的交叉耐藥率顯著地高于青霉素敏感林。BinChang等分析1996-2006年間的七例豬鏈球菌的耐藥性狀況，發現所有菌抹對環丙沙星都敏感。2001年在波蘭分離到的鏈球菌對環丙沙星、奈啶酸、恩諾沙星的敏感率均為100°/。，對培氟沙星和恩諾沙星的敏感率分別為75.0%和83.3°/。。2005年從西班牙分離到151抹豬鏈球菌，其中98.0°/的菌林都對恩諾沙星敏感。Jose等分析了2003-2006年分離到的992林豬鏈球菌中對壹諾酮類藥物的耐藥性，發現1.2°/。的菌抹對此類藥物耐藥。2006年從歐洲各國分離到的384林豬鏈球菌對恩諾沙星的敏感率為100°/。。我國2001-2003年間在河南六個地區分離到的50林豬鏈球菌中，對環丙沙星敏感率為95.0%,對恩諾沙星敏感率為50.0°/。。M03年從浙江省一豬場分離到的71抹豬鏈球菌中對環丙沙星耐藥率為28.0%，對恩諾沙星耐藥率為31.0%。2003-2004年間/人河南分離的22才朱豬l連球菌，43.0%對環丙沙星耐藥，50.0%對氧氟沙星耐藥。2004年在長春分離的豬鏈球菌對環丙沙星的耐藥率為82.0%,2004到2005年在廣西分離到的32抹豬鏈球菌對環丙沙星的耐藥率為49.0%,對恩諾沙星的耐藥率為57.0%。王麗平等分析全國不同地區的豬鏈球菌對喹諾酮類藥物的耐藥性狀況時，發現氧氟沙星對豬源鏈球菌呈現較好的抗菌活性，其敏感率達63.11%,其次為環丙沙星，敏感率為53.18%,而恩諾沙星、培氟沙星和諾氟沙星的效果較差，敏感率分別為41.15%、21.15%和34.14%。2006年在湖南分離到的13抹豬鏈球菌中對環丙沙星的壽文感率為30.8%,對左氧氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星的^:感率均為38.4%。同年從浙江一屠宰場分離到的義烏、蕭山和河南各地的38抹豬鏈球菌中對環丙沙星和氧氟沙星的敏感率為15.7%,對恩諾沙星的敏感率為10.5%,對諾氟沙星的敏感率為31.6%。本課題從2005-2006年在東北地區共分離到114抹豬鏈球菌，經過藥敏試驗檢測，其中對環丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星的敏感率分別為40.0%、34.0%、39.0%,敏感菌抹大多集中在遼寧省鞍山、臺安等地。國內外調查表明，豬鏈球菌對四環素類藥物表現出極高的耐藥性，耐藥率達95.oy。以上。在藥物選擇性的壓力下，耐藥菌株不斷出現，耐藥現狀不斷惡化，影響了抗菌藥物的有效應用。為此，世界各國科研工作者均在考慮如何解決細菌耐藥性的問題，試圖遏制豬鏈球菌不斷耐藥的趨勢。而中草藥具有來源廣泛，價格便宜，毒副作用小、不易產生耐藥性的優點，用于畜禽疾病的防治。
發明內容本發明的目的之一是將連翹提取物應用于抑制豬鏈球菌耐藥抹；本發明的目的之二是提供一種用于抑制豬鏈球菌耐藥抹的復方藥物；本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的本發明首先選取桂枝、紫蘇、荊芥、防風、羌活、白芷、薄荷、牛蒡子、桑葉、菊花、柴胡、升麻、知母、蘆根、梔子、決明子、黃芩、連翹、黃柏、龍膽草、苦參、白鮮皮、雙花、中藥1、蒲公英、穿心蓮、大青葉、板藍根、貫眾、魚腥草、山豆根、玄參、牡丹皮、紫草、大黃、茵陳、小薊、地榆、白茅根、艾葉、川芎、桔梗、百部、紫苑、五味子、烏梅、訶子、石榴皮、五倍子、吳茱萸等50味中藥的水提物和乙醇提取物，采用紙片擴散法和微量稀釋法，分別測定了上述50味中藥的7K提物和乙醇提取物對5抹豬鏈球菌臨床分離耐藥林的體外抗菌活性。實驗結果表明，50種中藥中，連翹提取物對豬鏈球菌臨床分離耐藥林有較好的抑制作用，其余49種中藥的提取物對豬鏈球菌臨床分離耐藥抹均無抑制作用。所述的連翹提取物可以是水提取物或乙醇提取物，其中，所述的乙醇提取物可以是10-95%乙醇提取物，優選為75%乙醇提取物。本發明進一步連翹提取物中的活性成分連翹酯苷、連翹苷和盧丁分別分離出來，并分別測定了這些活性成分對豬鏈球菌的抑菌活性，實驗結果表明，連翹酯苷為連翹提取物中的抑制豬鏈球菌的主要活性成分。本發明將連翹提取物分別與P-內酰胺類藥物中的頭孢噻肟鈉、頭孢瘙呋鈉、阿莫西林、青霉素鉀、頭孢拉定、氨節西林鈉、頭孢唑啉鈉和頭孢曲松鈉聯合使用，分別測定了它們的體外或體外的抑制豬鏈球菌的活性；試驗結果表明，連翹提取物和阿莫西林聯合使用時，對于豬鏈球菌的抑制活性呈顯著的協同增效功效。其中，為了達到更好的抑菌功效，優選的，將連翹提取物和阿莫西林按照4:1的重量比例進行配伍；所述的連翹提取物可以是水提取物或乙醇提取物，其中，所述的乙醇提取物可以是10-95%乙醇提取物，優選為75%乙醇提取物。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例5一、材料與方法1.1材料1.1.1菌林與病料質控菌抹金黃色葡萄球菌ATCC29213購于中國獸藥監察所。病料系2006~2007年分別從東北三省各豬場通過滅菌棉拭子采集的豬鼻腔分泌物。編號為l-2、15、36b、36c、SS2。根據實驗室藥敏結果，均為耐藥才朱，其耐藥譜見表l。表l5株豬鏈球菌臨床分離耐藥株對9種抗菌藥物的耐藥情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注R耐藥1.1.2試劑及4義器腦心浸液培養基、瓊脂、生理鹽水、溫箱、電子天平、震蕩培養箱、冰箱、電爐子、旋轉蒸發儀、涂布棒、移液槍、Tip頭、酒精燈、試管、平皿。1.1.3藥物桂枝、紫蘇、荊芥、防風、羌活、白芷、薄荷、牛蒡子、桑葉、菊花、柴胡、升麻、知母、,根、梔子、決明子、黃芩、連翹、黃柏、龍膽草、苦參、白鮮皮、雙花、中藥l、蒲公英、穿心蓮、大青葉、板藍根、貫眾、魚腥草、山豆根、玄參、牡丹皮、紫草、大黃、茵陳、小薊、地榆、白茅根、艾葉、川芎、桔梗、百部、紫苑、五味子、烏梅、訶子、石榴皮、五倍子、吳茱萸。購自哈爾濱世一堂。1.2方法1.2.1中藥水提取物的制備精密稱取每味中藥各15.OOg,加8倍量蒸餾水煎制沸騰，改為文火煎lh,期間始終保持8倍量水，用4層絹布過濾后取藥液；濾渣再加6倍量蒸餾水按上述方法進行操作后過濾，合并兩次過濾藥液，用文火濃縮至15ml，使其濃度為lg/ml。1.2.2中藥75%乙醇提^4勿的制備精密稱取每味中藥各15.OOg,力口10倍量75%乙醇，超聲30min，用4層絹布過濾后取藥液；濾渣再加8倍量75°/。乙醇，超聲15min,過濾，合并兩次過濾藥液，用旋轉蒸發儀(50°C)回收醇，將剩余液體用水浴鍋(6(TC)蒸發水份，殘渣用曱醇溶解，再用蒸餾水調節使其濃度為lg/ml。1.2.3抗耐藥菌中藥的篩選1.2.3.1紙片擴散法藥敏片的制備選用新華濾紙l號，用打孔器制成6.OO腿的小圓紙片，高壓滅菌后放入藥液中浸泡l2h,真空干燥，裝入滅菌青霉素瓶中，4'C水箱備用。菌液的制備取臨床分離耐藥抹凍存菌抹接種至腦心浸液瓊脂平板，37'C孵育過夜。取單個菌落接種于腦心浸液培養基中，37。C過夜培養。比濁法將菌液濃度先調整為O.5麥氏管懸液(1.5xl08cfu/ml),然后用腦心浸液培養基稀釋為約5x105cfu/ml。取l.5xl()5cfu/ml菌液100ijL接種于腦心浸液瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂開。將含有不同藥物的藥敏片貼于平板上。于37。C培養48后，取出觀察，測量抑菌圈直徑。1.2.3.2體外最小抑菌濃度(MIC)測定選擇對豬鏈球菌臨床分離耐藥株的抑菌圈直徑>10mm的中藥水提取物，采用試管二倍稀釋法(黃青云.畜牧微生物學[M].中國農業出版社)測定其對豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的MIC。先將中藥水提取物用蒸餾7jc做1:IO倍稀釋，菌液的制備同紙片擴散法，分別取11支滅菌試管，加入調制好的被測菌種懸液各2mL,在第1管加入2mL濃度為0.lg/mL的藥液，按照倍比稀釋的方法使l10管藥物依次成1:2,1:4,…1:1024濃度梯度，第11管作無藥生長對照，于37。C培養16-18h觀察結果，以無菌生長的最低稀釋度為MIC。再將對豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的抑菌圈直徑>1Omm的中藥乙醇提取物以同法測定MIC值。由于國內尚無統一的中藥抑菌效果的MIC標準，參考劉忠儀的文章(劉忠儀，張國威，何云志.解脲支原體中藥藥敏試驗[J].中華皮膚科雜志，1996,29(5):349.),MIC<7.82mg/ml,為高度敏感，介于7.82mg/ml~250mg/ml,為中度敏感，>250mg/ml,為不敏感。1.2.4復方藥物配方的確定1.2.4.1體外復方藥物配方的確定連翹提取物分別與(3-內酰胺類藥物中頭孢塞將鈉、頭孢塞呋鈉、阿莫西林、青霉素鉀、頭孢拉定、氨千西林鈉、頭孢唑啉鈉和頭孢曲松鈉對17抹豬鏈球菌(分別為1—2、卜17、59a、B9、T9、15、1—4、D6、42a、C2、36b、2—22、49a、36c、1-13、64a、D9)進行瓊脂擴散試驗(劑量比暫定為4:1)，具體方法見1.2.3.1紙片擴散法。1.2.4.2體內復方藥物配方的確定利用15號豬鏈球菌在昆明鼠體內進行病理模型的復制，其對昆明鼠的LD50為9.61x108cfu/Ml。將連翹提取物分別與頭孢噻肟鈉、頭孢噻呋鈉、阿莫西林、青霉素鉀、頭孢拉定、氨千西林鈉、頭孢唑啉鈉和頭孢曲松鈉(劑量比暫定為4:1)制成復合物。當每只小鼠腹腔注射菌液9.61xI08cfu/Ml0.5mL，灌藥7天，每天三次，觀察2周，記錄小鼠的死亡情況。1.2.5連翹中抗豬鏈球菌耐藥菌成分的確定1.2.5.l藥材提取液的制備將連翹粉碎，過20目篩，稱取500g,放入圓底燒瓶，按液料比8:1加入75°/。的乙醇水溶液回流提取兩小時，提取溫度6(TC。提取液趁熱抽濾，濾去藥渣，濾液收集好靜置。同法連續回流4次，濾液合并在一起。將靜置的濾液濃縮至濃縮液無醇味，加入適量蒸餾水溶解，并轉移至離心管中，用離心才幾離心，收集上清液。將上清液通過D101大孔吸附樹脂，用不同濃度的乙醇梯度洗脫，再把洗脫液分別經硅膠柱色譜，然后用氯仿-甲醇梯度洗脫，經反復硅膠柱色譜，并對洗脫液用薄層層析跟蹤檢測，最后通過連翹酯香、連翹香標準品作為對照，確定其成分并收集洗脫液。將收集洗脫液，旋轉蒸發減壓濃縮，將分別得到的樣品進行薄色色譜。以苯丙酮乙酸乙酉旨曱酸水=20:25:30:3:3作展開劑為最佳展開條件，5%香草醛濃硫酸作為顯色劑進行薄層層析。1.2.5.2連翹中抗豬鏈球菌耐藥菌成分的確定將得到的連翹酯苷、連翹苷分別進行對上述17抹豬鏈球菌耐藥菌進行紙片擴散試驗，具體實驗方法見1.2.3.1紙片擴散法。二、實驗結果與討論(一)抗耐藥菌中藥的篩選選取桂枝、紫蘇、荊芥、防風、羌活、白芷、薄荷、牛蒡子、桑葉、菊花、柴胡、升麻、知母、,根、梔子、決明子、黃芩、連翹、黃柏、龍膽草、苦參、白鮮皮、雙花、中藥1、蒲公英、穿心蓮、大青葉、板藍根、貫眾、魚腥草、山豆根、玄參、牡丹皮、紫草、大黃、茵陳、小薊、地榆、白茅根、艾葉、川芎、桔梗、百部、紫苑、五味子、烏梅、訶子、石榴皮、五倍子、吳茱萸50味中藥的水提物和75%乙醇提取物對5林豬鏈球菌臨床分離耐藥林的體外抗菌活性。對豬鏈球菌臨床分離耐藥抹分別進行紙片擴散法和微量稀釋法，目的是通過對抗菌效果的比較，篩選出對耐藥菌抗菌活性好的中草藥。50種中藥中，連翹提取物對豬鏈球菌臨床分離耐藥林有較好的抑制作用，其余49種中藥的提取物對豬鏈球菌臨床分離耐藥抹均無抑制作用，抑菌圏直徑為0。連翹水提取物和75°/。乙醇提取物對豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的抑菌圈直徑見表2。表2中藥水提取物和75%乙醇提取物對10株豬鏈球菌臨床分離耐藥株的抑菌圈直徑樣液1-21536b36cSS21-1759aB9T915平均值連翹1418202211161517191616.8水提取物連翹1520222213181718201918.475%乙醇提取物其余的0000000000049種中藥水提取物其余的0000000000049種中藥75%乙醇提取物由表2可以看出，連翹提取物對10抹豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的抑菌圈直徑>10mm,連翹水提取物對10抹豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的平均抑菌圈直徑為16.8mm,連翹75°/。乙醇提取物的平均抑菌圈直徑為18.4mm;采用微量稀釋法分別測定連翹對1O林豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的MIC。由表3可以看出，連翹不同提取物對10抹豬鏈球菌臨床分離耐藥抹的MIC〈7.82mg/ml，但75%乙醇提取物對豬鏈球菌臨床分離耐藥林的MIC都較相應水提取物的MIC小，為2.3872mg/ml;綜合以上結果，可以看出，連翹水提取物或乙醇提取物對于豬鏈球菌有顯著的抑制活性。表3連翹水提取物和75y。乙醇提取物對5株豬鏈球菌臨床分離耐藥株的MICCmg/ml)9樣液1-21536b36cSS21-1759aB9T915平均值連翹水6.2503.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.1253.4375提取物連翹5.1253.1251.5621.5623.1251.5621.5621.5621.5623.1252.387275%乙醇提取物(二)抑制豬鏈球菌的復方藥物的篩選1、連翹提取物與(3-內酰胺類藥物體外抗菌試驗選取連翹提取物分別與P-內酰胺類藥物中頭孢漆肟鈉、頭孢漆呋鈉、阿莫西林、青霉素鉀、頭孢拉定、氨卡西林鈉、頭孢唑啉鈉和頭孢曲松鈉對17林豬鏈球菌進行瓊脂擴散試驗(劑量比暫定為4:1),結果表明連翹提取物分別與頭孢噻肟鈉、頭孢噻呋鈉、阿莫西林、青霉素鉀、頭孢拉定、氨千西林鈉、頭孢哇啉鈉和頭孢曲松鈉對174朱豬鏈球菌抑菌圈直徑平均值分別為0mm、22mm、29mm、17咖、16mm、15mm、21mm、18mm。只有阿莫西林和連翹提取物共同使用時，抑菌圈直徑最大并且差異顯著。2、連翹提取物與|3-內酰胺類藥物體內抗菌試驗利用15號菌在昆明鼠體內進行病理模型的復制，其對昆明鼠的LD50為9.61xl08cfu/Ml。將連翹提取物分別與頭孢p塞將鈉、頭孢瘞呔鈉、阿莫西林、青霉素鉀、頭孢拉定、氨千西林鈉、頭孢唑啉鈉和頭孢曲松鈉(劑量比暫定為4:1)制成復合物。當每只小鼠腹腔注射菌液9.61x108cfu/Ml0.5mL，灌藥7天，每天三次，觀察2周，記錄小鼠的死亡情況。實驗結果見表4:表4連翹提取物與P-內酰胺類藥物的藥效學比較實驗藥物存活數存活率平均死亡時間(h)陽性對照510%(5/10)陰性對照10100%(10/10)連翹70%(7/10)12頭孢噻JB鈉060%(7/10)9頭孢噻呋鈉670%(7/10)20阿莫西林70%(6/10)24青霉素鉀460%(7/10)18頭孢拉定550%(7/10)18氨芐西林鈉650%(7/10)20頭孢唑啉鈉650%(7/10)20頭孢噻躬鈉-連翹復方藥物060%(7/10)18頭孢噻呋鈉-連翹復方藥物770%(7/10)24阿莫西林-連翹復方藥物8100%(8/10)36青霉素鉀-連翹復方藥物560%(7/10)24頭孢拉定-連翹復方藥物550%(7/10)24氨芐西林鈉-連翹復方藥物660%(7/10)24頭孢唑啉鈉-連翹復方藥物660%(7/10)24綜合上述2個實驗，相比于單獨的抑菌活性，從體內外實驗結果可以看出將連翹提取物和阿莫西林配伍在一起使用時具有顯著的協同抑制豬鏈球菌的功效。(三)連翹中抗耐藥菌成分的確定將中藥連翹藥材上清液通過D101大孔吸附樹脂，用不同濃度的乙醇梯度洗脫,再把洗脫液分別經硅膠柱色譜，然后用氯仿-甲醇梯度洗脫，經反復硅膠柱色譜，并對洗脫液用薄層層析跟蹤^:測，最后通過樣品對照，確定其成分并收集洗脫液。將收集洗脫液，旋轉蒸發減壓濃縮，最后分別得到連翹酯苷、連翹苷、盧丁。將得到的連翹酯苷、連翹苷、盧丁分別進行對上述17抹豬鏈球菌耐藥菌進行瓊脂擴散試驗，分別進行連翹酯苷、連翹苷、盧丁對上述17林豬鏈球菌耐藥菌抑菌圏的直徑平均為20mra士2.74、0mm、0mm。連翹酯苷對17抹豬鏈球菌耐藥抹的MIC值平均值為3.125mg/ml。所以得出連翹中抗豬鏈球菌耐藥株的主要成分是連翹酯苷，而連翹武無抗菌活性，因此把測定連翹戒的含量作為考察指標無意義，在建立連翹原料藥及制劑的質量標準時應選擇具有抗菌活性的成分連翹酯戒作為考察的指標。權利要求1、連翹提取物在制備抑制豬鏈球菌藥物中的用途。2、按照權利要求1所述的用途，其特征在于所述連翹提取物的有效部位是連翹酯苷；其中，所述連翹提取物是連翹水提取物或連翹乙醇提取物。3、按照權利要求2所述的用途，其特征在于所述的連翹乙醇提取物是10-95%乙醇提取物。4、按照權利要求3所述的用途，其特征在于所述的連翹乙醇提取物為75%乙醇提取物。5、一種抑制豬鏈球菌的復方藥物，其特征在于包括連翹提取物和阿莫西林組成。6、按照權利要求5所述的復方藥物，其特征在于由連翹提取物和阿莫西林按照4:1的重量比例組成。7、按照權利要求5或6所述的復方藥物，其特征在于所述連翹提取物的有效部位是連翹酯苷；其中，連翹提取物是連翹7K提取物或連翹乙醇提取物。8、按照權利要求7所述的復方藥物，其特征在于所述連翹乙醇提取物是10-95%乙醇4是取物。9、按照權利要求8所述的復方藥物，其特征在于所述連翹乙醇提取物是75°/。乙醇提取物。10、一種預防或治療由豬鏈球菌所導致疾病的藥物組合物，其特征在于由有效量的權利要求5所述的復方藥物和藥學上可接受的賦料或載體所組成。全文摘要本發明公開了一種豬鏈球菌耐藥抑制劑，屬于豬鏈球菌的防制領域。本發明分別測定了50種中藥提取物對豬鏈球菌的體外和體內的抑制活性，最終發現，連翹提取物對于豬鏈球菌耐藥株無論是體外還是體內均有顯著的抑制作用，可作為豬鏈球菌耐藥抑制劑使用。在此基礎上，本發明又發現，將連翹提取物與阿莫西林聯合使用時，該復方藥物有顯著的協同抑制豬鏈球菌的功效，可與豬鏈球菌耐藥抑制劑共同應用。文檔編號A61K36/634GK101612204SQ20091015991公開日2009年12月30日申請日期2009年7月21日優先權日2009年7月21日發明者遜劉,琳崔,李明雁,李艷華,王瑞雪,盛尊來,棟邊,陳儉清申請人:東北農業大學