專利名稱：魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及水產生物技術和水產養殖病害防治領域。特別涉及利用分子生物學技 術重組表達的一種魚類白細胞介素-4樣(IL-4-like，IL-4-L)細胞因子在魚類病害防治中 作為免疫增強劑的新用途。
背景技術：
隨著漁業生產的迅猛發展，水產動物病害日益突出，已成為嚴重影響水產養殖業 健康可持續發展的世界性難題，在我國尤其突出。近年來，我國因病害導致的水產養殖業直 接經濟損失每年超過百億元，而且逐年攀升。但長期以來，一直缺乏有效的病害防治方法； 各種抗生素、殺蟲劑濫用，造成養殖環境和水產品嚴重污染，水產食品安全受到嚴重威脅， 同時抗生素產生的耐藥性又加劇了水產動物病害的發生，形成惡性循環。隨著我國加入WTO 和食品安全法的頒布，對環境和食品安全的標準越來越高，當前一大批抗生素已被明令禁 用，水產動物病害防治已面臨無藥可施的困境，因此研制開發包括各種免疫增強劑(佐劑) 在內的天然、安全、高效的水產動物病害防治制劑已迫在眉睫，它對支撐我國水產業健康持 續發展，確保我國食物安全，提高國民健康素質，引領我國漁業經濟發展和水產科學的創新 都非常重要和十分緊迫，具有重大的經濟社會意義。 目前，對水產養殖動物疾病控制的方法主要有三種，即藥物療法、疫苗預防接種和 使用免疫增強劑。藥物療法主要是使用抗生素、殺蟲劑等藥物，但由于抗生素等的使用造成 諸多問題和健康安全隱患已被許多國家禁止。疫苗雖然可以成為控制水產養殖動物疾病最 直接有效的方法，但是目前疫苗的開發和廣泛應用也有困難，由于疫苗反應具有特異性，一 種疫苗只能特異性地預防相應的某種疾病，所以實際應用也受到限制。免疫增強劑則能彌 補藥物治療法和疫苗法的不足，被認為是一種比藥物療法更安全、比疫苗法有更廣泛效力 的防治方法。免疫增強劑通常指單獨或聯合抗原(疫苗)使用均能增強機體免疫應答的 物質，它通過提高動物的天然或特異性免疫功能來增強水產動物的抗病能力。白細胞介素 4(Interleukin-4， IL-4)是由Howard等于1982年首次在人類中發現的一種由T細胞分泌 的細胞因子，由于最初發現其能促進B細胞增殖而被命名為B細胞生長因子-1 (BCGF-1)， 1986年被更名為白細胞介素4。目前在人類和高等動物中的研究顯示，IL-4可由Th2細 胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞和NKT等多種細胞產生，具有促進B細胞表達MHC II類抗原、 促進抗原遞呈、活化B細胞分泌抗體、促進抗體類別轉化等生物學功能。但由于魚類是低等 脊椎動物，其免疫系統組成和免疫應答機制與人類和高等動物存在很大的差異，如參與魚 類獲得性免疫保護的主要球蛋白類型(IgM)就不同于人類和高等物種的免疫球蛋白類型 (IgG)，因此對于魚類確切的免疫學機制，包括哪些因子參與魚類的免疫調控，它們又如何 參與魚類的免疫調控等問題，均有待深入研究。 近年來，申請人所在的實驗室較系統地開展了魚類白細胞介素等免疫細胞因子的 分離鑒定與功能研究，其中首次在河豚(Tetraodon nigroviridis)中發現一個IL-4樣基 因(J.-H丄iet al./Molecular Immunology 44 (2007) 2078-2086)，此后，日本M. 0htani實驗室和申請人所在的實驗室又相繼在斑馬魚中預測到了第二個類似IL-4的基因序列。但 由于它們與高等物種的IL-4序列的同源性很低(11-15% )，目前又缺乏功能方面的研究， 因此，其相應的免疫調節機制尚不明確，還不能真正確認其就是IL-4(目前僅稱之為IL-4 樣因子)。 如序列表中SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO : 2)是預測的斑馬魚IL-4樣基因序列(基因庫登錄號AB375404)，它與其他物種的IL_4同 源性為11_15%，其功能和作用在本發明以前是未知的。 由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila， AH)引起的魚類病害在水產養殖中最 為常見。嗜水氣單胞菌是一種普遍存在于淡水、海水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，對水 產動物、畜禽和人類均有致病性的一種典型人_獸_魚共患病病原，可引起多種水產動物的 傳染性出血性敗血癥，病魚的臨床癥狀常表現為局部損傷出血、壞死、水腫、眼突、及腹部膨 脹、另外可能產生腹水、貧血及破壞內臟器官，脾、腎顏色變黑，肝變白，膽汁變黃等，對水養 殖業造成重大經濟損失。 目前現有的魚類出血性敗血癥的預防方法是使用嗜水氣單胞菌全細胞疫苗，該疫 苗一般是采用注射形式，注射魚體采用劑量一般為1X108 1X109cfu/尾。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途。
為了解決上述技術問題，本發明提供一種魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途， 用于制備能提高魚類的免疫能力的免疫增強劑，該魚類白細胞介素-4樣重組蛋白具有如 SEQ IDN0 :2所示的氨基酸序列。 本發明還同時提供了一種魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途用于制備預防 魚類疾病的制劑。 作為本發明的魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途的改進用于制備預防魚類 出血性敗血癥的制劑，該制劑由嗜水氣單胞菌全細胞疫苗和具有如SEQ ID N0:2所示的氨 基酸序列的魚類白細胞介素_4樣重組蛋白組成。 本發明的魚類白細胞介素-4樣重組蛋白作為一種增強魚類抗病能力的免疫增強 劑，給藥途徑可采用注射的方式，注射劑量為0. 025 0. 25 ii g/g體重；一般能在28天內持 續產生效力。 本發明的魚類白細胞介素-4樣重組蛋白能與嗜水氣單胞菌全細胞疫苗配合使 用，從而提高預防魚類出血性敗血癥的效果。其給藥途徑可采用注射的方式，注射劑量一 般為嗜水氣單胞菌全細胞疫苗1 X 108 1 X 109cfu/尾，且魚類白細胞介素_4樣重組蛋白 0. 025 0. 25 ii g/g ;嗜水氣單胞菌全細胞疫苗和魚類白細胞介素_4樣重組蛋白在注射時， 兩者可以同時注射，也可以前后分別注射。 本發明利用原核表達系統，以斑馬魚中的IL-4樣基因序列為代表，首次研制出 魚類IL-4樣因子的重組蛋白，在此基礎上，深入研究了其免疫生物學功能，發現其具有促 進魚類淋巴細胞增殖分化、特別是促進IgM抗體產生等新功能，這與人類和高等物種中的 IL-4主要參與二次免疫應答過程中抗體的類別轉化以及過敏反應等的功能有很大的區 別，表明魚類IL-4樣分子具有與魚類免疫系統相適應的特殊功能和調節機制，特別是研究揭示了其可以作為魚類的免疫佐劑或免疫增強劑，提高魚體對疫苗(魚類嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila滅活疫苗)的應答效果，提高病害防治的免疫保護率。該魚類白細胞介素-4樣重組蛋白作為免疫增強劑的發現及其開發應用，可望為水產養殖動物的感染性疾病預防與治療提供一種新途徑。 本發明以魚類常見的敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，AH)為對象，以斑馬魚和養殖鯽魚為實驗模型，研究了魚類白細胞介素-4樣重組蛋白促進魚類獲得性體液免疫應答以及促進嗜水氣單胞菌疫苗對斑馬魚和鯽魚的免疫保護作用，發現該因子能有效地促進魚類B淋巴細胞增殖和IgM類抗體的產生，從而顯著提高斑馬魚和鯽魚的抗病能力，提高成活率。因此本發明的魚類白細胞介素-4樣重組蛋白作為免疫增強劑應用于水產養殖動物病害防治具有重要意義。 本發明選擇上述疾病作為研究和應用模型，并結合典型的蛋白抗原血藍蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)，研究重組表達的魚類IL-4樣細胞因子對抗原誘發的體液免疫的調節作用，以及生產性應用的嗜水氣單胞菌疫苗對魚類敗血癥的免疫保護的促進和增強功能。 綜上所述，本發明的魚類白細胞介素-4樣重組蛋白作為魚類疫苗的免疫增強劑的優勢表現在能顯著增強疫苗接種后魚體的抗病原的能力，提高成活率，從而增強魚類抵抗病害發生的能力；同時可降低疫苗的使用劑量，減少疫苗的毒副作用。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖1是pUCM-T-IL-4-L重組質粒示意圖； 圖2是重組質粒pET41a-IL-4-L的構建圖； 圖3是重組蛋白srIL-4-L的SDS-PAGE分析圖； 圖4是流式分析重組sIL-4-L對B細胞增殖試驗效果圖； 圖5是流式分析統計淋巴細胞增殖的剌激/轉化指數； 圖6是重組IL-4-L增強魚類抗體產生試驗效果圖； 圖7是重組IL-4-L增強魚類免疫抗病能力的試驗效果具體實施例方式
實施例1、斑馬魚IL-4樣基因(以下稱IL-4-L)的獲得方法 首先用大腸桿菌內毒素LPS(英文全稱，Sigma， 055 :B5 E. coli)按1 ii g/尾
的劑量預注射斑馬魚(學名Danio rerio，體長3-4cm，體重3-4g)進行IL-4-L mRNA
的誘導表達，注射了 LPS的實驗魚置26-28 t:水溫下飼養，12小時后取斑馬魚腎臟或
脾臟組織，用TRizol(Invetigen)提取總RNA，提取方法按說明書進行。然后用逆轉
錄試劑盒RNA PCR kit (AMV) Ver3. 0 (TaKaRa)進行逆轉錄和PCR擴增。引物序列為
F15' -GAAGACACTTCTGCTGCTCGC-3' ， R15' -CAAATTGTCT TCAGGTAGAAC-3'，該引物由上海英俊
公司合成。優化的PCR條件為94t:預變性4min，94t:變性40s，52t:退火lmin，72t:延伸
30s，72t:延伸10min，共30個循環。PCR產物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 結果表明，按上述方法進行誘導和RT-PCR，可以擴增出預期880bp的IL-4-L cDNA
5特異性片段，用PCR產物回收Kit進行IL-4-L cDNA的分離純化，具體方法按Axygen公司提供的操作手冊進行，然后進行T-A克隆，將PCR產物直接鏈接于pUCM-T質粒(參見圖2)，轉化E. coli DH5a感受態細胞，培養于含有Amp、 IPTG和X-gal的LB平板上，挑取白色陽性重組子菌落，分別進行PCR和酶切鑒定，并進行序列分析(由上海英俊公司進行)。結果表明，所克隆的斑馬魚IL-4-L cDNA全長為887個核苷酸(如SEQ ID NO :1所示)，編碼157個氨基酸(如SEQ ID NO :2所示)。將上述由T載體和目的基因所構建成的重組質粒命名為T-IL-4-L(參見圖1)。 實施例2、斑馬魚IL-4-L基因原核表達質粒的獲得方法 首先在IL-4-L基因的上下游引物兩端分別引入BamH I和Xhol I酶切位點，重新設計的兩個引物序列分別為F25' -CTAGCTAGCGGATCCGGGATGGAACATAAGACTGTATTAAAGG-3'，
俊公司合成。然后以T-IL-4-L重組質粒為模板，F2和R2為引物，按以下PCR循環程^擴增IL-4-L的cDNA :94。C預變性4min，94。C變性40s，52。C退火lmin，72。C延伸30s，72。C延伸10min，共30個循環。PCR產物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后回收PCR產物，具體方法按Axygen提供的操作手冊進行，用BamHI和Xhol I雙酶切后，重組連接到表達載體pET41a中。經重組子篩選后，分別用BamH I和Xhol I雙酶切和PCR進行鑒定，結果顯示，用雙酶切鑒定，能得到預期5. 8kb和880bp大小的片斷，此外，用載體和片段上的引物同時進行PCR擴增，能擴增出預期的887bp大小的條帶。結果表明，通過上述方法，獲得了包含887bp的IL-4-L的原核表達質粒，將該質粒命名為pET41a-IL-4-L(參見圖2)。
實施例3、可溶性重組IL-4-L蛋白的獲得 將PET41a-IL-4-L陽性克隆接種于5ml含氨芐青霉素(50 y g/ml)的LB液體培養基中，置37t:搖床，以250rpm轉速培養5小時，再將培養物以l : 100比例加入含氨芐青霉素(50yg/ml)的LB液體培養基，置37t:搖床，以250rpm轉速繼續培養。測定細菌生長曲線，待0D600至0. 6 1. 0時，加入IPTG，使終濃度為0. 1 lmM，然后轉入20°C的低溫培養箱，100rpm過夜，以誘導可溶性重組蛋白的表達。然后離心收集細菌(5000Xg，15min)，棄上清，用適量的PBS重懸細菌后，用超聲波破裂細菌，直至溶液變成半透明。收集上清液與細菌沉淀，采用GST親和層析柱分離純化重組蛋白，純化的重組蛋白用SDS-PAGE鑒定。結果表明，重組表達的IL-4-L(帶GST標簽)的分子量約為50KDa(參見圖3，其中列1為標準蛋白分子量，列2為純化的帶GST標簽的可溶性IL-4-L重組蛋白，列3為pET41a空質粒表達的GST蛋白)。 實施例4、驗證本發明提供的重組IL-4-L蛋白(即實施例3所得的IL_4_L重組融合蛋白)增強魚體的免疫功能，進而增強了魚類疫苗的免疫效果和魚對病原的抵抗能力
1、重組IL-4-L蛋白提高魚類B淋巴細胞增殖能力的試驗 將斑馬魚(體重3 4g)置26-28。C循環水條件下飼養一周以上，確認健康后，進行體內淋巴細胞增殖試驗。取實驗魚100余尾，分成5組，每組20尾，分別注射不同濃度(1 y g/ml、10 ii g/ml和100 ii g/ml，每尾注射10 y 1)的重組IL-4-L蛋白，同時設不注射重組IL-4-L蛋白的正常對照組(僅注射PBS)以及GST標簽蛋白對照組，3 6天后收集斑馬魚脾臟淋巴細胞，采用流式細胞術，測定體內增殖的B淋巴細胞(mlg,細胞)數量。淋巴細胞標記方法采用間接免疫標記法，首先用Ficoll淋巴細胞分離液分離淋巴細胞(2500rpm離心25min)，用5X山羊血清于37。C作用1小時后，與兔抗斑馬魚mlgM抗體(anti-mlgM，使用濃度l : 100)于37t:孵育45分鐘，經PBS清洗3次后，加入FITC標記的羊抗兔第二抗體(羊抗兔IgG， Chemicon， 1 : 400) ， 37。C避光孵育30分鐘，PBS清洗3次，經標記的B淋巴細胞用流式細胞儀(Bection-Dickinson， San Jose， CA)檢測，發射光波長為525nm，上述實驗至少重復3次，結果以M士SD表示，統計學方法采用t檢驗，P < 0. 01被定為顯著差異。結果顯示，在正常對照組斑馬魚脾臟組織中，B淋巴細胞的含量/比例占淋巴群體的4. 37% ±0. 62X，而注射重組IL-4-L蛋白后B細胞的含量顯著(P < 0. 01)增加，表現為注射1 y g/ml組的B細胞含量為7. 26% ±0. 71 % ，注射10 y g/ml組的B細胞含量為21. 89%±0. 91 % ，而注射100 ii g/ml組的B細胞含量達到21. 41 % ±0. 73% ，可見隨著IL-4-L重組蛋白注射劑量的增加，B細胞增殖效應逐步增強，三組實驗組的B淋巴細胞含量分別比正常對照組提高了 3%， 17. 5%和17%，而注射GST標簽蛋白(劑量1 P g/尾)的陰性對照組，其B細胞的含量與正常對照組相比，無明顯差異，表明GST標簽蛋白沒有對實驗結果造成影響(參見圖4，左側圖代表未進行FITC抗體標記的對照組，右側圖代表用FITC抗體標記后所得數據)。通過進一步統計淋巴細胞增殖的剌激/轉化指數(stimulation index, SI， SI=實驗組含量/對照組含量)，可見注射不同濃度重組IL-4-L蛋白的實驗組的淋巴細胞轉化效率顯著(P < 0. 01)高于對照組(參見圖5)。
2、重組IL-4-L因子促進魚體產生抗體能力的試驗 取斑馬魚(體重3 4g) 100余尾，分成5組，每組20尾，用標準蛋白抗原KLH免疫實驗魚，同時聯合注射不同濃度的重組IL-4-L蛋白，抗原和因子導入采用腹腔注射的方法，KLH的注射濃度為lmg/ml (作為正常陽性對照組)，重組蛋白的注射濃度分別為0 y g/ml(空白PBS對照)、liig/ml、10iig/ml和100 y g/ml，每尾注射10 yl。同時設GST標簽蛋白(劑量1P g/尾)對照組，4周后收集外周血，提取血清，采用ELISA的方法檢測血清中抗體(IgM抗體)的含量的變化。 結果顯示，在注射KLH四周后的斑馬魚外周血中，能檢測到相應的IgM抗體，同時，在聯合注射KLH和不同劑量重組IL-4-L蛋白的實驗魚外周血中，觀察到了 IgM含量隨著注射重組IL-4-L蛋白劑量的提高而明顯增加，當注射濃度達到100ii g/ml時，實驗魚外周血中的IgM含量與對照組相比，出現極顯著(P<0.01)增加(參見圖6)，這說明在合適的濃度范圍內，IL-4-L蛋白具有顯著的增強魚體體液免疫功能的作用。而聯合注射KLH和GST標簽蛋白或空白PBS的對照組，其IgM的含量與單獨注射KLH的正常免疫組相比，無明顯差異，表明GST標簽蛋白和PBS沒有對重組IL-4-L蛋白的作用產生影響。在圖6中，第1列表示正常免疫KLH抗原的對照組中所檢測到的IgM的含量；第2列表示注射KLH和濃度為1 y g/ml IL-4-L蛋白的實驗組中所檢測到的IgM的含量；第3列表示注射KLH和濃度為10 ii g/ml IL-4-L蛋白的實驗組中所檢測到的IgM的含量；第4列表示注射KLH和濃度為100 ii g/ml IL-4-L蛋白的實驗組中所檢測到的IgM的含量；第5列表示注射KLH和GST標簽蛋白對照組中所檢測到的IgM的含量。
3、重組IL-4-L增強魚類免疫抗病能力的試驗
(1)增強斑馬魚免疫抗病能力試驗 取斑馬魚(體重3 4g) 150余尾，隨機分成3組，每組50尾，分別預先接種嗜水氣單胞菌全細胞疫苗。疫苗制備采用常規福爾馬林滅活法，所用嗜水氣單胞菌毒株是從
7患傳染性出血性敗血癥的鯽魚分離的野生型嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila， AH)BSK-10菌株，由浙江省淡水水產研究所提供，疫苗制備的福爾馬林濃度為0. 5% (V/V)，滅活時間為36小時，嗜水氣單胞菌經滅活后，用PBS洗滌3次，每次4000rpm離心15分鐘沉淀收集菌體，-2(TC保存備用。三組實驗魚分別腹腔注射滅活AH(5.0X10Scfu/尾)、滅活AH(5.0Xl()Scfu/尾)聯合重組IL-4-L蛋白(0. 1 y g/尾)以及空白PBS(不免疫的對照組)，經免疫接種后的實驗魚飼養于26 28t:水溫中，30天后用嗜水氣單胞菌BSK-10菌株進行感染攻毒試驗，以評價疫苗的免疫保護效果以及重組IL-4-L因子對疫苗的免疫"佐劑"效應。每尾實驗魚感染2. 0X105cfu的嗜水氣單胞菌，72小時內記錄死亡數，統計成活率，計算相對免疫保護率{Relative Percent Survival, RPS = 1_(免疫組死亡率/對照組死亡率)X100XM，實驗重復三次。結果顯示，未免疫的對照組(注射空白PBS)感染AH(2.0Xl()Scfu/尾)后，其死亡率平均為58% ±2%，而經免疫(注射滅活AH)的實驗組，其死亡率平均為44% ±2%，可見死亡率降低了 14X，而用重組IL-4-L聯合免疫(注射滅活AH+IL-4-L)的實驗組，其死亡率平均只有26% ±2% ，可見死亡率進一步得到降低，而其免疫保護率(55.2%)與單純注射滅活AH的實驗組(24. 1%)相比，得到極顯著(P<0.01)的提高(參見圖7-A)，表明重組IL-4-L因子具有增強斑馬魚免疫抗病的能力。
(2)增強鯽魚免疫抗病能力的試驗 養殖鯽魚(Carassius auratus)體重為80. 0±5. 2g，置25。C水溫循環水中飼養一周，確認健康后進行實驗。取實驗魚60余尾，隨機分成3組，每組20尾，分別于背鰭下注射滅活AH (4 X 109cfu/ml ， 0. 5ml)、滅活AH (4 X 109cfu/ml ， 0. 5ml)聯合重組IL-4-L (5 ii g/尾)以及空白PBS(不免疫的對照組)，經免疫接種后的實驗魚飼養于25 26t:水溫中，30天后用嗜水氣單胞菌BSK-IO菌株進行感染攻毒試驗，以評價疫苗的免疫保護效果以及重組IL-4-L因子對疫苗的免疫"佐劑"效應。每尾實驗魚腹腔注射6X 105cfu/mL嗜水氣單胞菌0.2ml，72小時內記錄死亡數，統計成活率，計算相對免疫保護率(RPS)，實驗重復三次。結果顯示，未免疫的對照組(注射空白PBS)感染AH后，其死亡率平均為65% ±5%，而經免疫(注射滅活AH)的實驗組，其死亡率平均為45% ±5%，可見死亡率降低了 20%，而用重組IL-4-L聯合免疫(注射滅活AH+IL-4-L)的實驗組，其死亡率平均達為30% ±5%，可見死亡率進一步得到降低，而其免疫保護率(53. 8% )與單純注射滅活AH的實驗組(30. 8% )相比，也有極顯著(P < 0. 01)的提高(參見圖7-B)，表明重組斑馬魚IL-4-L因子具有增強鯽魚免疫抗病的能力，具有在鯽魚病害防治上的應用價值。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
序列表
SEQ ID NO : 1
301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 SEQ Met Gly Lys Lys Lys Ala Lys Asn Arg Val Gin
TGATCTGTTACTTGCTGTAAGCCAAATAAATTCAGAGCATTACAAAG
ID NO :2
MetLysThrLeuLeuLeuLeuAlaCysThrValPheValSer
PheThrLeuLysGlyThrAspAlaMetHisLysThrValLeu
GluLeuValLeuGluLeuGluAlaValLeuValAsnProPro
LysLysLysAlaLysGluGluliePheLeuValAspLeuGly
LysGlySerGlyLeuLysCysGluHisAspTyrPheCysGin
GluGluGluMetValLysLysValSerGlyLeuSerGlyVal
PheAspProPheArgThrAspLysLysLeuMetArgAsnLeu
ThrTyrAsnHisGinAspGluLysAsnCysLysLysGlulie
SerHisAlaAlaAspGluAspLeuGluGlulieThrLeuAsp
PheLeuLysAspLeuLeuLysCysValLysAsnlieAsnSer
LysSerProArgProSer
9
權利要求
一種魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途，其特征是用于制備能提高魚類免疫能力的免疫增強劑，所述魚類白細胞介素-4樣重組蛋白具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2. —種魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途，其特征是用于制備預防魚類疾病的制劑。
3. 根據權利要求2所述的魚類白細胞介素_4樣重組蛋白的用途，其特征是用于制備預防魚類出血性敗血癥的制劑，該制劑由嗜水氣單胞菌全細胞疫苗和具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的魚類白細胞介素_4樣重組蛋白組成。
全文摘要
本發明公開了一種魚類白細胞介素-4樣重組蛋白的用途用于制備能提高魚類免疫能力的免疫增強劑，該魚類白細胞介素-4樣重組蛋白具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。該魚類白細胞介素-4樣重組蛋白還能用于制備預防魚類疾病的制劑，例如用于制備預防魚類出血性敗血癥的制劑，該制劑由嗜水氣單胞菌全細胞疫苗和具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的魚類白細胞介素-4樣重組蛋白組成。
文檔編號A61P7/00GK101693105SQ20091015351
公開日2010年4月14日 申請日期2009年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者方瑋, 潘萍萍, 董偉仁, 邵健忠, 項黎新 申請人:浙江大學;