專利名稱：一種固液相結合依替巴肽(Eptifibatide)的合成方法
一種固液相結合依替巴肽(Eptifibatide)的合成方法技術領域該發明的名稱是‘一種固液相結合依替巴肽(Eptifibatide)的合成 方法，，屬于生物化學技術領域。涉及應用固相制備所得五肽樹酯(H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (B oc)-Pro-Cys (P1)-RinkAM)與液相制備所得二肽(Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH)聚合后，裂解環 化生成依替巴肽(Eptifibatide)的反應流程。
背景技術：
依替巴肽，英文名為Eptifikitide，分子式為C35H49N11O9S2，分子結構式 為 該多肽是具特異針對性的血小板糖蛋白Ilb/IIIa受體拮抗劑，為美國注冊藥 物INTEGRILIN的主要成份，用于治療急性冠狀動脈粥樣硬化以及栓塞等疾病。中國專利 02145292. X號公開了液相與固相結合的2+5合成策略來合成依替巴肽(Eptifibatide)的 方法，其中五肽系列Gly-Asp-Trp-Pr0-Cys-NH2在Rink AM樹脂上合成，主要用脲鹽作為聚 合劑，Mpa-hArg片斷應用DCC催化的液相胍基化反應來合成。七肽環合在空氣氧化的條 件下完成。該策略的長處在于避免了使用BOC固相反應策略，特別是HF裂解反應.另外， 固相反應在生產上也相對比較省時。上專利并描述了瑞士 Bachem公司所采用的3+3+1合 成策略，其片斷包括Mpa (Trt)-Har-Gly-OH，從 Mpa (Trt)-Lys (Tfa)-Gly-OMe 胍基化與皂 化后得到；Z-Asp (OtBu)-OH 與 Trp-Pro-OMe 聚合后得到 Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OMe,經催 化氫化以及皂化后得到 Asp-Trp-Pro-OH0 Mpa(Trt)-Har-Gly-OH 與 Asp-Trp-Pro-OH 聚合 后得化合物 Mpa (Trt)-hArg-Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-ΟΗ,該化合物隨之與 Cys(Trt)-NH2 聚合后得 Mpa (Trt) -Har-Gly-Asp (OtBu) -Trp-Pro-Cys-NH2,該化合物經去保護基反 應，然后氧化成環，進一步去保護基后得依替巴肽(Eptifibatide).上專利并進一步描 述了 Bachem采用的BOC固相合成策略，即按次將Boc-Cys (OmeBzl) -OH, Boc-Pro-OH, Boc-Trp-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, BOC-Gly-OH 和 Boc-Lys- (Fmoc) -OH 連到樹脂上，接著 去Boc保護基，用3，5_ 二甲基吡唑甲脒胍基化后取得Boc-Har-Gly-Asp (OcHx)-1Trp-Pr O-Cys(OMeBzL)-樹脂，去BOC保護后該六肽樹脂與S-BzL(OMe)-Mpa聚合得S-Bzl (OMe )-Mpa-Har-Gly-Asp (OcHx) -Trp-Pro-Cys (OMeBzL)-樹脂，該粗產品經去保護基反應后， 于樹脂上氧化得雙硫鍵成環，用HF裂解純化后得依替巴肽(Eptifibatide).美國專 利申請書2006/0036071記錄了另一依替巴肽(Eptifibatide)的重要合成方法，其中 氨基端保護的高精氨酸與甘氨酸聚合后得Pl-hArg-Gly-OH;羧基上保護的天冬氨酸與 Trp-Pro 二肽片斷縮合得三肽P3-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH,以上兩個片斷然后聚合得五肽P1-Har-Gly-Asp (O-P2) -Trp-Pro-OH.該五肽在與半胱氨酸聚合后得 P1-Har-Gly-Asp (O-P2) -Trp-Pro-Cys-NH2.該六肽通過一二硫鍵與巰基丙酸結合，去Pl保護基后高精氨酸的N端 與巰基丙酸的羧端偶合后得依替巴肽(Eptifibatide).發明內容該發明公開一種固液相結合合成依替巴肽(Eptifibatide)的方法， 以調整目前依替巴肽(Eptifibatide)制備中高精氨酸成本較高的情況.本發明的方法包括以下步驟(1).本發明用 DIC/HOCt 偶合劑制備了五肽樹酯 H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro -Cys(Trt)-RinkAM 及 H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Acm)-RinkAM ；(2).本發明應用DIC/HOCt的搭配，將二肽Trt-Mpa-Harg (BOC) 2_0H與五肽樹酯H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(Trt)-RinkAM 或H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM 聚合，得七肽樹酯
Trt-Mpa-Harg (BOC) 2_Gly_Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Trt) -RinkAM 或Trt-Mpa-Harg (BOC) 2_Gly_Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM(3)七肽樹酯 Trt-Mpa-Harg (BOC)2-Gly-Asp (OtBu)-Trp (Boc)-Pro-Cys (Trt) RinkAM 或Trt-Mpa-Harg (BOC) 2_Gly_Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM 用三氟乙 酸/三異丙基硅烷/茴香硫醚/茴香醚/水95 2.5 2.5 2.5 2. 5裂解，去保護 基；(4).用乙醚沉淀出線性七肽 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 或Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2 ；(5).線性七肽 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys_NH2 或 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2用IOOmM碘/乙醇溶液環化1小時，氧化成環得粗品依替巴肽 (Eptifibatide)；(6).依替巴肽(Eptifibatide)粗品經離子交換樹脂純化。
下面結合附圖對本發明進一步說明.圖1固液相結合制備依替巴肽(Eptifibatide)的反應流程
具體實施例方式1. Trt-Mpa-Harg (Boc)2-OH(MW 720. 91)的制備。將 Trt-Mpa-Lys-OMe (MW491. 66) 與Boc-NH-C (S) -NH-Boc (MW 276. 35)，有機堿數滴，金屬催化劑混溶或懸浮于DMF中，回流 一天；用冰乙醚沉淀出反應產物；反應體系中Boc-NH-C (S) -NH-Boc 的摩爾數是 Trt-Mpa-Lys-OMe 的摩爾數的 1 5 倍；過渡金屬鹽催化劑的摩爾數與Boc-NH-C(S)-NH-Boc的摩爾數等同；過渡金屬鹽催化劑包括錳鹽，鐵鹽，鈷鹽，鎳鹽，銅鹽，銀鹽，汞鹽，鎘鹽，鋅鹽以及 鉛鹽；有機堿包括三乙胺等叔胺。2.五肽樹酯 H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Trt) -RinkAM 的制備取 Rink AM 樹酯(替代度 0. 733mmol/g)，在 DCM DMF NMP 1 1 1 中，以 DIC(MW 126. 20) 及HOCt (MW 171.15)為偶合試劑N2攪動條件下依次聯接Fmoc-Cys (Trt)-OH (MW 585.71)，Fmoc-Pro-OH(Mff 337.37)， Fmoc-Trp(Boc)-OH(Mff 526.58)， Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Mff 411. 50)，以及 Fmoc-Gly-OH (MW 297. 30)，以 25%六氫吡啶 /DCM DMF NMP (1 1 1) 去Fmoc保護基，Ninhydrin試劑檢測反應進程。反應體系中氨基酸用量是樹酯用量的倆倍或以上偶合試劑用量與氨基酸用量等同3.五肽樹酯 H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM 的制備 取 Rink AM 樹酯(替代度 0. 733mmol/g)，在 DCM DMF NMP 1 1 1 中，以 DIC(MW 126. 20)及 H0Ct(MW 171. 15)，N2 攪動條件下依次聯接 Fmoc-Cys (Acm)-OH (MW 414.47)， Fmoc-Pro-OH(Mff 337. 37)，Fmoc-Trp(Boc)-OH(MW526. 58)，Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Mff 411. 50)，以及 Rnoc-Gly-OH(MW 四7· 30)，以 25 %六氫吡啶/DCM DMF NMP 1 1 1 去Fmoc保護基，Ninhydrin試劑檢測反應進程。反應體系中氨基酸用量是樹酯用量的倆倍或以上
偶合試劑用量與氨基酸用量等同4.七肽樹酯 Trt-Mpa-Harg (Boc) 2-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Trt) -Rink AM的制備由步驟 2 所得五肽樹酯 H-Gly-Asp (OtBu)-Trp (Boc)-Pro-Cys CTrt)-R inkAM，以DIC (MW 126. 20)及HOCt (MW 171. 15)為偶合劑，N2攪動條件下與二肽 Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH(MW 720. 91)偶合而得，Ninhydrin 試劑檢測反應進程。反應體系中二肽用量是樹酯用量的倆倍或以上偶合試劑用量與二肽用量等同5.七肽樹酉旨 Trt-Mpa-Harg (Boc)2-Gly-Asp (OtBu)-Trp (Boc)-Pro-Cys (Acm )-RinkAM 的制備 由步驟 3 所得五肽樹酯 H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (A cm)-RinkAM 以 DIC (MW 126. 20)及 HOCt (MW171. 15)為偶合劑，N2 攪動條件下與二肽 Trt-Mpa-Harg(Boc)2-OH(MW 720. 91)偶合而得，Ninhydrin 試劑檢測反應進程。反應體系中二肽用量是樹酯用量的倆倍或以上偶合試劑用量與二肽用量等同6.七肽 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 的制備由步驟 4 所得七肽樹酯 iTrt-Mpa-Harg (Boc) 2_Gly_Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Trt) -RinkAM 用裂解液三氟乙酸 / 三 異丙基硅烷/茴香硫醚/茴香醚/水(95 2. 5 2. 5 2. 5 2. 5)裂解并去保護基而得。7.七肽 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2 的制備由步驟 5 所得七肽樹酯 Trt-Mpa-Harg (Boc) 2_Gly_Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM 用裂解液三氟乙酸 /三異丙基硅烷/茴香硫醚/茴香醚/水(95 2.5 2.5 2.5 2. 5)裂解并去保護基 而得。8.依替巴肽(Eptifibatide)的制備與純化(MW 831.96).將步驟(6,7)所得Mpa -Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (P1) -NH2,其中 Pl 是 H-或 Acm-，用 IOOmM I2 的乙醇溶液氧化 環化后得依替巴肽(Eptifibatide)粗品，陰離子交換樹酯純化。反應體系中I2 的摩爾數是 Mpa-Harg-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (P1) -NH2 的摩爾數的65 10倍；實施例1實施例與前述過程中所采用的原料列表如下
權利要求
1.一種固液相結合合成依替巴肽(Eptifibatide)的方法，包括以下五個主要階段(1).本發明以DIC/HOCt為偶合劑，將Trt-Mpa-Harg(BOC) 2_0H與五肽樹酯 RinkAM 樹酯-Cys (P1) -Pro-Trp (Boc) -Asp (OtBu) -Gly-H (P1 = Trt-, Acm-)聚合，得 Trt-Mpa-Harg (BOC) 2-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (P1) -RinkAM(2).以裂解試劑三氟乙酸/三異丙基硅烷/茴香醚/茴香硫醚/水 95 2. 5 2. 5 2. 5 2. 5將七肽從樹酯上裂解下來并去保護基；(3).用乙醚沉淀出線性七肽Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 或 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2(4)·線性七肽 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 或 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2用IOOmM碘/乙醇溶液環化1小時，氧化成環得粗品依替巴肽(Eptifibatide)；(5).粗品依替巴肽(Eptifibatide)經陰離子交換樹脂純化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟(1)五肽樹酯H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Trt) -RinkAM 樹酯的制備取 Rink AM樹酯，在DCM DMF NMP(1 1 1)中，以DIC及HOCt為偶合試劑，依次聯接 Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH(MW 337. 37)，Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-0H,以 及Rnoc-Gly-OH，反應過程中均以25%六氫吡啶/DCM DMF NMP(1 1 1)去Fmoc保護基。反應體系中氨基酸用量是樹酯用量的倆倍或以上偶合試劑DIC/HOCt用量與氨基酸用量等同(2).五肽樹酯H-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM 的制備取 Rink AM 樹酯，在 DCM DMF NMP(1 1 1)中，以 DIC 及 HOCt，依次聯接 Rnoc-Cys (Acm)-0H， Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Trp (Boc) -OH, Fmoc-Asp (OtBu) -0H,以及 Rnoc-Gly-OH，反應過程中均以 25%六氫吡啶/DCM DMF NMP(1 1 1)去 Fmoc 保護基。反應體系中氨基酸用量是樹酯用量的倆倍或以上偶合試劑DIC/HOCt用量與氨基酸用量等同(3).七肽樹酯Trt-Mpa-Harg (Boc) 2-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Trt) -RinkAM 樹酯的制備。將步驟(1)所得五肽樹酯 H-Gly-Asp (OtBu)-Trp (Boc)-Pro-Cys (Trt)-RinkA M 樹酯與 Trt-Mpa-Harg (Boc) 2_0H 聚合而得；反應體系中偶合試劑為DIC/HOCt二肽用量是樹酯用量的倆倍或以上(4)七肽樹酯Trt-Mpa-Harg (Boc) 2-Gly-Asp (OtBu) -Trp (Boc) -Pro-Cys (Acm) -RinkAM 樹酯的制備。將步驟⑵所得五肽樹酯H-Gly-Asp (OtBu)-Trp (Boc)-Pro-Cys (Acm)-RinkA M 樹酯與 Trt-Mpa-Harg (Boc) 2_0H 聚合而得；反應體系中偶合試劑為DIC/HOCt二肽用量是樹酯用量的倆倍或以上(5).以試劑三氟乙酸/三異丙基硅烷/茴香醚/茴香硫醚/水·95 2.5 2.5 2.5 2. 5將七肽從樹酯上裂解下來并去保護基。用乙醚沉淀出線性七 月太 Mpa-Harg-GIy-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2 或 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2,(6)Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2 或 Mpa-Harg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH 2，用IOOmM碘/乙醇溶液環化1小時，氧化成環得粗品依替巴肽。(7).依替巴肽(Eptifibatide)粗品經陰離子交換樹脂純化。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在步驟(1-4)中，偶合劑均為DIC/HOCt組合。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于在步驟(5)中，裂解及去保護基試劑為三氟 醋酸茴香硫醚茴香醚三異丙基硅烷水(90 2.5 2.5 2.5 2. 5)。
全文摘要
本發明屬生物化學技術領域，特別涉及了一種新的依替巴肽(Eptifibatide)的固液相結合合成方法。技術方案是1.按照Fmoc固相合成策略合成五肽樹酯H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-RinkAM，其中P1為Trt-及Acm-保護基；2.將Trt-Mpa-Har(Boc)2-OH和五肽樹酯H-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-RinkAM縮合得到七肽樹酯Trt-Mpa-Har(Boc)2-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Pro-Cys(P1)-RinkAM；3.七肽從樹酯上裂解下來，脫去各側鏈保護基團后，碘氧化成環得到依替巴肽(Eptifibatide)粗品；4.依替巴肽(Eptifibatide)粗品經離子交換樹酯純化后制得純品依替巴肽(Eptifibatide)。本發明的方法操作簡便，解決了高精氨酸成本的問題。
文檔編號A61P9/10GK102040652SQ20091015341
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月12日 優先權日2009年10月12日
發明者阮小麗 申請人:杭州諾泰制藥技術有限公司