專利名稱：一種提取銀杏總萜內(nèi)酯的方法及含有銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取銀杏總萜內(nèi)酯的方法及含有銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑，屬于中 藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀杏葉提取物具有治療和保健的雙重作用，它可以改善心腦血管循環(huán)，治療心腦 血管疾病，提高記憶力，清除氧自由基，延緩衰老。銀杏提取物中主要活性成分為黃酮類和 萜內(nèi)酯類，萜內(nèi)酯主要包括白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J等，其中白果內(nèi)酯屬于倍半萜 類化合物，銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J屬于二萜類化合物。白果內(nèi)酯為神經(jīng)系統(tǒng)、精神病的藥物， 對(duì)因年老而出現(xiàn)的呆傻現(xiàn)象有奇異的療效，也用于治療神經(jīng)病、腦病和脊髓病等；銀杏內(nèi)酯 作為一種活性較高的血小板拮抗因子，在血栓形成、器官移植排異、老年癡呆、心臟過敏、內(nèi) 毒素導(dǎo)致的休克等病理過程中有重要的藥理作用，開發(fā)和應(yīng)用前景廣闊。銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯是目前唯一的從銀杏中發(fā)現(xiàn)的特殊物質(zhì)，由于空間結(jié)構(gòu)復(fù) 雜，手性多變，合成非常麻煩，目前只能從銀杏葉中提取。自上世紀(jì)60年代初科學(xué)家對(duì)銀杏 內(nèi)酯開始研究包括分離純化、定出結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)研究。70年代中期銀杏提取物(GBE)上市，世 界各國(guó)食品及健康食品廠商都以極大的熱情投入到銀杏葉的開發(fā)中來。目前國(guó)外采用有機(jī) 溶劑多級(jí)萃取與硅藻土、硅膠吸附_洗脫或活性炭吸附_洗脫與醋酸鉛沉淀發(fā)結(jié)合的提取 方法，步驟繁雜、成品率低、純度也較低。國(guó)內(nèi)也有采用浸提、柱純化、萃取、分離、結(jié)晶方法 制備銀杏內(nèi)酯，但純度仍然較低。溶劑萃取方法是具有代表性的制備銀杏提取物的方法，如德國(guó)的Schwabe， Flaschman藥廠，主要為銀杏干葉粗粉，其制備工藝為60%丙酮抽取、壓濾，濾液以四氯化 碳洗脫，丙酮水層用硫酸銨飽和，用甲乙酮提取，提取液減壓濃縮后配成一定濃度的乙醇溶 液，加適量的PB (OH) 2過濾，濾液濃縮后在一硫酸銨飽和，甲乙酮提取，提取液干燥濃縮后 以乙醇精制再濃縮干燥得GBE (德國(guó)專利ED2117429、1767098)。銀杏內(nèi)酯類物質(zhì)在銀杏葉中含量很低，一般只有0.3%左右，而且隨著季節(jié)的變 化而變化，因此，要盡量提高銀杏物提取物中銀杏總萜內(nèi)酯的含量，并且在此基礎(chǔ)上，要盡 可能多地除去雜質(zhì)。由于銀杏萜內(nèi)酯微溶于水，所以，根據(jù)其理化性質(zhì)，選用適合的途徑增 強(qiáng)它的溶解性也是注射劑工藝成型的關(guān)鍵，并且這一過程還不能破壞銀杏總內(nèi)酯的手性結(jié) 構(gòu)。對(duì)于銀杏萜內(nèi)酯的提取方法，國(guó)內(nèi)已有詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道，例如，李新崗等人介紹了 銀杏內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)提取方法(參照李新崗等，銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)室提取方法研究，中 國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜1998第1期)，中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1195665A介紹了銀杏內(nèi)酯的提取方法和含有 銀杏內(nèi)酯的制劑，該方法是將銀杏葉用水煮沸提取，用吸附劑對(duì)提取濾液吸附，再用乙醇洗 脫，回收乙醇，將析出的結(jié)晶溶解，重結(jié)晶，干燥制得銀杏萜內(nèi)酯。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1313287A 也公開了一種銀杏內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝。從銀杏內(nèi)酯的總提取物當(dāng)中分離銀杏內(nèi)酯單體的方法，也有文獻(xiàn)報(bào)道，例如，游松等人介紹了銀杏內(nèi)酯的分離與結(jié)構(gòu)測(cè)定方法(參見游松等， 銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的分離與結(jié)構(gòu)測(cè)定，中國(guó)藥物化學(xué)雜志1995年第4期)。中國(guó)專利文獻(xiàn) CN1287121A公開了由銀杏葉或銀杏葉浸膏制備銀杏內(nèi)酯A、B的方法。將銀杏內(nèi)酯制成注 射劑，非常重要的一項(xiàng)技術(shù)問題是如何解決其難溶性，到目前為止，銀杏內(nèi)酯注射劑制備過 程當(dāng)中，對(duì)于助溶劑的選擇也非常重要，這直接影響到產(chǎn)品的穩(wěn)定性和臨床療效。根據(jù)銀杏內(nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，一般很容易想到用酸或堿使其開環(huán)，或者用有機(jī)溶 劑溶解，但是它在一般的有機(jī)溶劑中溶解性也很差，如在聚乙二醇400，甘油，乙醇，丙二醇 中的溶解度都很小。所以，目前銀杏內(nèi)酯制備注射劑的方法有通過使用堿溶液增加銀杏內(nèi) 酯的溶解性而制得，例如CN200510040497. 0，CN02134223. 7，CN02134223. 7 ；在加入葡甲胺 的情況下，銀杏內(nèi)酯的溶解性也能得到很好的增加，例如CN02128962.X;對(duì)銀杏內(nèi)酯采用 羥丙基_ β _環(huán)糊精增溶也可制得其水溶液，例如CN200510072466. 3，CN200410013937. 9， CN200410041120. 2 ；另外，CN0310034. 6公開針劑中含有5-99%銀杏葉提取物、1-95%泊洛 沙姆188和PH值調(diào)節(jié)劑以及其它賦形劑；CN03137720. 3 一種銀杏內(nèi)酯B針劑的制備方法， 將銀杏內(nèi)酯B原料溶解于注射用水溶劑聚乙二醇中，聚乙二醇可單獨(dú)使用或與無水乙醇配 成混合溶劑，按體積計(jì)，聚乙二醇乙醇=0. 5 0. 5 0. 9。但是，加堿或加葡甲胺都屬于讓內(nèi)酯環(huán)開環(huán)成鹽，在中性或酸性條件下，很難再形 成有效形勢(shì)的內(nèi)酯原形，甚至沒有白果內(nèi)酯。并且，在銀杏葉提取過程中，白果內(nèi)酯極易水 解或氧化。而白果內(nèi)酯是目前最受關(guān)注的化學(xué)成分，動(dòng)物試驗(yàn)報(bào)導(dǎo)，白果內(nèi)酯具有促進(jìn)神經(jīng) 生長(zhǎng)的作用，以及防止腦、脊髓神經(jīng)脫髓鞘的作用，其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)作用比銀杏內(nèi)酯 強(qiáng)，目前國(guó)際上對(duì)銀杏提取物的要求是，白果內(nèi)酯含量為2. 6-3.2%。國(guó)內(nèi)外上市的銀杏葉 提取物注射劑，主要有國(guó)產(chǎn)舒血寧注射液與德國(guó)威瑪舒培大藥廠生產(chǎn)的金納多注射液。由于 注射液生產(chǎn)過程中需要高溫滅菌，其中銀杏內(nèi)酯中白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯B等活性成分大部分 被破壞，制劑中含量很低。對(duì)于銀杏葉提取物活性成分萜類內(nèi)酯類，金納多注射液因制劑工藝 不過關(guān)，銀杏內(nèi)酯大部分被破壞，成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中不檢測(cè)其總萜內(nèi)酯；國(guó)產(chǎn)舒血寧注射液僅 要求檢測(cè)銀杏內(nèi)酯A的含量。經(jīng)檢測(cè)，以上兩種產(chǎn)品白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯B的含量都很低。為了解決純度問題和有效性問題，本發(fā)明公開了一種銀杏總萜內(nèi)酯的精制方法， 以及用該總萜內(nèi)酯制成穩(wěn)定的注射劑，而且，其成分與銀杏葉中各組分比例非常接近。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是克服現(xiàn)有提取分離技術(shù)中純度不高、有效成 分容易被破壞以及注射劑不穩(wěn)定等的不足，提供一種綜合運(yùn)用多種技術(shù)手段提取、分離銀 杏總萜內(nèi)酯的方法。本發(fā)明所涉及的提取分離銀杏總萜內(nèi)酯的方法，包括如下步驟1)取銀杏葉，加乙醇和枸櫞酸或酒石酸，回流提取，濃縮醇提液；2)步驟1)濃縮物上大孔樹脂柱，梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮；3)步驟2)濃縮物上硅膠柱，乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，干燥；4)步驟3)干燥物經(jīng)乙醇溶解，加水，放置，得第一次結(jié)晶產(chǎn)物；母液回收乙醇，水 液冷沉，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物；合并兩次結(jié)晶產(chǎn)物即得銀杏總萜內(nèi)酯。優(yōu)選地，步驟1)所述乙醇的濃度為60% 80%，所述枸櫞酸或酒石酸的加入量為0. ；優(yōu)選地，步驟1)濃縮醇提液的比例為與藥材比為1 0. 8 1 ；優(yōu)選地，步驟2)洗脫時(shí)用水洗3 5倍柱體積，再以20%的乙醇洗脫3 5倍柱 體積，除雜，棄去，然后用75%的乙醇洗脫3 6倍的柱體積；優(yōu)選地，步驟3)所述樣品上硅膠柱前，將步驟2)所得提取物加適量的水，以適量 的硅膠充分拌勻，真空干燥后上硅膠柱；本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種含有上述銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑。 由于銀杏萜內(nèi)酯微溶于水，所以怎樣增加其在注射溶劑中的溶解度是制備注射劑的關(guān)鍵。本發(fā)明所涉及的含有銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑，它由以下成分組成
銀杏總萜內(nèi)酯0. 8% 1. 2%
賦形劑10% 60%
PH調(diào)節(jié)劑適量
抗氧化劑0. 02% 0. 04%
注射用水40% 89%
其中，所述賦形劑包括乙二醇、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇中的-
PH調(diào)節(jié)劑為以下緩沖液的一種磷酸氫鈉-磷酸二氫納、枸櫞酸_枸櫞酸鈉或醋酸_醋酸 鈉，PH調(diào)節(jié)劑的用量為使得注射液的PH調(diào)至3. 5 5.0即可；所述抗氧化劑為亞硫酸氫鈉、 乙二胺四乙酸二鈉中的一種。優(yōu)選地，所述PH調(diào)節(jié)劑為以下緩沖液的一種PH3. 2 4. 8的磷酸氫鈉-磷酸二 氫納、PH4. 4 4. 8的枸櫞酸-枸櫞酸鈉、PH3. 8 5. 2的醋酸-醋酸鈉。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明方法具有以下的顯著的進(jìn)步1)白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯分子結(jié)構(gòu)中有很多手性碳，內(nèi)酯環(huán)的斷裂或是構(gòu)象改變都 可能影響到其藥理、藥效，本發(fā)明創(chuàng)造性地使用緩沖溶液調(diào)PH值至3. 5 5. 5，能有效地避 免內(nèi)酯環(huán)的斷裂，從而使所得注射劑療效更佳；2)采用大孔樹脂和硅膠柱兩種柱層析方法組合進(jìn)行除雜，能最大程度地除去雜 質(zhì)；大孔樹脂柱能有效地吸附內(nèi)酯和黃酮類等極性相對(duì)較小的物質(zhì)，能除去糖類和氨基酸 等極性比較大的雜質(zhì)；硅膠柱能有效地除去銀杏黃酮苷類雜質(zhì)；3)采用分步結(jié)晶的方式使內(nèi)酯類成分逐個(gè)析出，使得內(nèi)酯類成分純度更高，雜質(zhì) 更少；4)與現(xiàn)有的銀杏注射劑相比較，用本發(fā)明所得到的總萜內(nèi)酯含量高，成分全，經(jīng)測(cè) 定，其總萜內(nèi)酯含量達(dá)到85%以上，其中，不僅含有白果內(nèi)酯，也含有銀杏內(nèi)酯A、B、C等，與 銀杏葉各組分比例最為接近。5)因萜內(nèi)酯難溶于水，且不穩(wěn)定，本發(fā)明采用了復(fù)合溶媒制成注射液，從而有效地 提高了萜內(nèi)酯的溶解度和注射劑的穩(wěn)定性；6)在提取前，在乙醇中添加了適量的枸櫞酸、酒石酸，可以有效地阻止白果內(nèi)酯的 水解，使內(nèi)酯的比例與葉中天然比例基本一致。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1銀杏總萜內(nèi)酯的制備
1)取干燥銀杏葉10千克，加60%的乙醇回流提取兩次，每次回流提取1小時(shí)，第 一次加醇量為50千克(其中加枸櫞酸50克，即0. 1 %的枸櫞酸)，第二次加醇量為40千克 (其中加入枸櫞酸40克，即0. 1 %的枸櫞酸)，合并兩次醇提取液，以200目的濾布濾過，在 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收乙醇，將提取液濃縮至8千克，待用。2)取處理好的大孔樹脂(AB-8型)10千克，濕法裝柱，上樣，流速為120ml/min，然 后，先后以水洗脫30千克，流速為250ml/min，以20%的乙醇洗脫30千克，流速為280ml/ min，棄去，然后以70 %的乙醇洗脫30千克，流速為260ml/min，收集洗脫液，在80°C， 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收醇洗脫液，濃縮至5公斤，待用。3)準(zhǔn)確稱量200目的硅膠H 3千克，濕法裝柱，緩緩加入上述5公斤的樣品，調(diào)整 流速為ISOml/min，上樣完畢，以30千克乙酸乙酯洗脫，流速為250ml/min，收集洗脫液，在 0. 06個(gè)大氣壓、70°C減壓回收乙酸乙酯，將乙酸乙酯洗脫液濃縮，0. 08個(gè)大氣壓，95°C真空 干燥，得干燥物385克，待用。4)將上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入360克水，常溫下放置20小時(shí)，得一次 結(jié)晶產(chǎn)物(主要含銀杏內(nèi)酯A、B、C)；母液在旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀上減壓回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小時(shí)，過濾，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(含白果內(nèi)酯，以及少量的銀杏內(nèi)酯A、B、C)，合并上 兩次結(jié)晶產(chǎn)物，即得干燥的銀杏總萜內(nèi)酯60. O克，備用。經(jīng)高效液相測(cè)定(參考中國(guó)藥典2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，其白 果內(nèi)酯、銀杏總內(nèi)酯A、B、C四種萜內(nèi)酯總的含量為95.6%。實(shí)施例2銀杏總萜內(nèi)酯的制備1)取干燥銀杏葉10千克，加80%的乙醇回流提取兩次，每次回流提取2小時(shí)，第 一次加醇量為90千克(其中加枸櫞酸900克，即的枸櫞酸)，第二次加醇量為70千克 (其中加入枸櫞酸700克，S卩1 %的枸櫞酸)，合并兩次醇提取液，以200目的濾布濾過，在 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收乙醇，將提取液濃縮至10千克，待用。2)取處理好的大孔樹脂(D-101型)10千克，濕法裝柱，上樣，流速為120ml/ min,然后，先后以水洗脫50千克，流速為250ml/min，以20 %的乙醇洗脫50千克，流速為 280ml/min,棄去，然后以70%的乙醇洗脫60千克，流速為260ml/min，收集洗脫液，在80°C， 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收醇洗脫液，濃縮至5公斤，待用。3)準(zhǔn)確稱量200目的硅膠H 3千克，濕法裝柱，緩緩加入上述5公斤的樣品，調(diào)整 流速為ISOml/min，上樣完畢，以60千克乙酸乙酯洗脫，流速為250ml/min，收集洗脫液，在 0. 06個(gè)大氣壓、70°C減壓回收乙酸乙酯，將乙酸乙酯洗脫液濃縮，0. 08個(gè)大氣壓，95°C真空 干燥，得干燥物412克，待用。4)將上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入360克水，常溫下放置20小時(shí)，得一次 結(jié)晶產(chǎn)物(主要含銀杏內(nèi)酯A、B、C)；母液在旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀上減壓回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小時(shí)，過濾，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(含白果內(nèi)酯，以及少量的銀杏內(nèi)酯A、B、C)，合并上 兩次結(jié)晶產(chǎn)物，即得干燥的銀杏總萜內(nèi)酯58. 5克，備用。經(jīng)高效液相測(cè)定(參考中國(guó)藥典2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，其白 果內(nèi)酯、銀杏總內(nèi)酯A、B、C四種萜內(nèi)酯總的含量為95. 1%。實(shí)施例3銀杏總萜內(nèi)酯的制備1)取干燥銀杏葉10千克，加70%的乙醇回流提取兩次，每次回流提取1. 5小時(shí)，第一次加醇量為70千克(其中加枸櫞酸350克，即0. 5%的枸櫞酸)，第二次加醇量為60 千克(其中加入枸櫞酸300克，即0. 5%的枸櫞酸)，合并兩次醇提取液，以200目的濾布濾 過，在0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收乙醇，將提取液濃縮至9千克，待用。2)取處理好的大孔樹脂(HPD-100型)10千克，濕法裝柱，上樣，流速為120ml/ min，然后，先后以水洗脫40千克，流速為260ml/min，以20 %的乙醇洗脫40千克，流速為 280ml/min,棄去，然后以70%的乙醇洗脫40千克，流速為260ml/min，收集洗脫液，在80°C， 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收醇洗脫液，濃縮至5. 2公斤，待用。3)準(zhǔn)確稱量200目的硅膠H 3千克，濕法裝柱，緩緩加入上述5. 2公斤的樣品，調(diào) 整流速為ISOml/min，上樣完畢，以40千克乙酸乙酯洗脫，流速為250ml/min，收集洗脫液， 在0. 06個(gè)大氣壓、70°C減壓回收乙酸乙酯，將乙酸乙酯洗脫液濃縮，0. 08個(gè)大氣壓，95°C真 空干燥，得干燥物395克，待用。4)將上述干燥物以1200克乙醇溶解，加入365克水，常溫下放置20小時(shí)，得一次 結(jié)晶產(chǎn)物(主要含銀杏內(nèi)酯A、B、C)；母液在旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀上減壓回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小時(shí)，過濾，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(含白果內(nèi)酯，以及少量的銀杏內(nèi)酯A、B、C)，合并上 兩次結(jié)晶產(chǎn)物，即得干燥的銀杏總萜內(nèi)酯60. 6克，備用。經(jīng)高效液相測(cè)定(參考中國(guó)藥典2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，其白 果內(nèi)酯、銀杏總內(nèi)酯A、B、C四種萜內(nèi)酯總的含量為96.5%。實(shí)施例4銀杏總萜內(nèi)酯的制備1)取干燥銀杏葉10千克，加75%的乙醇回流提取兩次，第一次回流提取2小時(shí)， 第二次每次回流提取1. 5小時(shí)，第一次加醇量為80千克(其中加酒石酸480克，即0. 6%的 枸櫞酸)，第二次加醇量為60千克(其中加入酒石酸360克，即0. 6%的枸櫞酸)，合并兩次 醇提取液，以200目的濾布濾過，在0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收乙醇，將提取液濃縮 至8. 6千克，待用。2)取處理好的大孔樹脂(HPD-100型)10千克，濕法裝柱，上樣，流速為115ml/ min，然后，先后以水洗脫30千克，流速為260ml/min，以20 %的乙醇洗脫60千克，流速為 290ml/min,棄去，然后以70%的乙醇洗脫50千克，流速為275ml/min，收集洗脫液，在80°C， 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收醇洗脫液，濃縮至4. 9公斤，待用。3)準(zhǔn)確稱量200目的硅膠H 3千克，濕法裝柱，緩緩加入上述4. 9公斤的樣品，調(diào) 整流速為175ml/min，上樣完畢，以50千克乙酸乙酯洗脫，流速為250ml/min，收集洗脫液， 在0. 06個(gè)大氣壓、70°C減壓回收乙酸乙酯，將乙酸乙酯洗脫液濃縮，0. 08個(gè)大氣壓，95°C真 空干燥，得干燥物398克，待用。4)將上述干燥物以1150克乙醇溶解，加入365克水，常溫下放置20小時(shí)，得一次 結(jié)晶產(chǎn)物(主要含銀杏內(nèi)酯A、B、C)；母液在旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀上減壓回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小時(shí)，過濾，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(含白果內(nèi)酯，以及少量的銀杏內(nèi)酯A、B、C)，合并上 兩次結(jié)晶產(chǎn)物，即得干燥的銀杏總萜內(nèi)酯61. 6克，備用。經(jīng)高效液相測(cè)定(參考中國(guó)藥典2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，其白 果內(nèi)酯、銀杏總內(nèi)酯A、B、C四種萜內(nèi)酯總的含量為94. 1%。實(shí)施例5銀杏總萜內(nèi)酯的制備1)取干燥銀杏葉10千克，加85%的乙醇回流提取兩次，第一次回流提取1. 5小
7時(shí)，第二次每次回流提取2小時(shí)，第一次加醇量為90千克(其中加酒石酸720克，即0. 8% 的酒石酸，第二次加醇量為50千克(其中加入酒石酸400克，即0. 8%的酒石酸)，合并兩 次醇提取液，以200目的濾布濾過，在0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收乙醇，將提取液濃 縮至9. 15千克，待用。2)取處理好的大孔樹脂(HPD-100型)10千克，濕法裝柱，上樣，流速為125ml/ min，然后，先后以水洗脫40千克，流速為260ml/min，以20 %的乙醇洗脫40千克，流速為 290ml/min,棄去，然后以70%的乙醇洗脫60千克，流速為275ml/min，收集洗脫液，在80°C， 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收醇洗脫液，濃縮至5. 05公斤，待用。3)準(zhǔn)確稱量200目的硅膠H 3千克，濕法裝柱，緩緩加入上述5. 05公斤的樣品，調(diào) 整流速為185ml/min，上樣完畢，以55千克乙酸乙酯洗脫，流速為2650ml/min，收集洗脫液， 在0. 06個(gè)大氣壓、70°C 80°C減壓回收乙酸乙酯，將乙酸乙酯洗脫液濃縮，0. 08個(gè)大氣壓， 95°C真空干燥，得干燥物402. 5克，待用。4)將上述干燥物以1180克乙醇溶解，加入375克水，常溫下放置20小時(shí)，得一次 結(jié)晶產(chǎn)物(主要含銀杏內(nèi)酯A、B、C)；母液在旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀上減壓回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小時(shí)，過濾，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(含白果內(nèi)酯，以及少量的銀杏內(nèi)酯A、B、C)，合并上 兩次結(jié)晶產(chǎn)物，即得干燥的銀杏總萜內(nèi)酯60. 8克，備用。經(jīng)高效液相測(cè)定(參考中國(guó)藥典2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，其白 果內(nèi)酯、銀杏總內(nèi)酯A、B、C四種萜內(nèi)酯總的含量為94.7%。實(shí)施例6銀杏總萜內(nèi)酯的制備1)取干燥銀杏葉10千克，加80%的乙醇回流提取兩次，第一次回流提取1. 5小 時(shí)，第二次每次回流提取1小時(shí)，第一次加醇量為80千克(其中加酒石酸720克，即0. 9% 的酒石酸，第二次加醇量為80千克(其中加入酒石酸720克，即0. 9 %的酒石酸)，合并兩 次醇提取液，以200目的濾布濾過，在0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收乙醇，將提取液濃 縮至9. 26千克，待用。2)取處理好的大孔樹脂(AB-8型)10千克，濕法裝柱，上樣，流速為135ml/min，然 后，先后以水洗脫50千克，流速為260ml/min，以20%的乙醇洗脫50千克，流速為290ml/ min，棄去，然后以70 %的乙醇洗脫60千克，流速為275ml/min，收集洗脫液，在80°C， 0. 06 0. 08個(gè)大氣壓下減壓回收醇洗脫液，濃縮至4. 98公斤，待用。3)準(zhǔn)確稱量200目的硅膠H 3千克，濕法裝柱，緩緩加入上述4. 98公斤的樣品，調(diào) 整流速為195ml/min，上樣完畢，以60千克乙酸乙酯洗脫，流速為255ml/min，收集洗脫液， 在0. 06個(gè)大氣壓、70°C 80°C減壓回收乙酸乙酯，將乙酸乙酯洗脫液濃縮，0. 08個(gè)大氣壓， 95°C真空干燥，得干燥物399. 5克，待用。4)將上述干燥物以1180克乙醇溶解，加入375克水，常溫下放置20小時(shí)，得一次 結(jié)晶產(chǎn)物(主要含銀杏內(nèi)酯A、B、C)；母液在旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀上減壓回收乙醇，水液在2 4°C 冷沉24小時(shí)，過濾，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(含白果內(nèi)酯，以及少量的銀杏內(nèi)酯A、B、C)，合并上 兩次結(jié)晶產(chǎn)物，即得干燥的銀杏總萜內(nèi)酯60. 2克，備用。經(jīng)高效液相測(cè)定(參考中國(guó)藥典2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，其白 果內(nèi)酯、銀杏總內(nèi)酯A、B、C四種萜內(nèi)酯總的含量為94. 1%。實(shí)施例7銀杏總萜內(nèi)酯注射液的制備
處方銀杏萜內(nèi)酯60. 0克1，2_ 丙二醇2500 毫升95%的乙醇500毫升磷酸氫鈉_磷酸二氫納緩沖溶液適量注射用水2000毫升_制成500支(10毫升/支)取上述實(shí)施例1制備的總萜內(nèi)酯提取物60. 0克，先以95%的乙醇溶解，再緩緩加 入1，2-丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、1，2-丙二醇和乙醇的用量比例混為，注 射用水乙醇(95%) 1，2_丙二醇=5 1 4，即在60克總萜內(nèi)酯提取物中加入2500 毫升的注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。加入亞硫酸氫鈉1克， 即0. 02%的比例，攪拌，并緩緩加入PH為3. 2的磷酸氫鈉-磷酸二氫納緩沖溶液，調(diào)PH至 3.5，以0. 22微米的醋酸纖維素鈉濾膜濾過，在以超濾膜(截留分子量為一萬)濾過，灌裝， 滅菌(105°C下30分鐘)，即得10毫升銀杏總內(nèi)酯注射液成品500支，經(jīng)高效液相法測(cè)定， 每支含銀杏總萜內(nèi)酯約58. 15毫克。實(shí)施例8銀杏總萜內(nèi)酯注射液的制備處方銀杏萜內(nèi)酯58. 5克1，2_ 丙二醇2000 毫升95%的乙醇500毫升枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液適量注射用水2500毫升_制成500支(10毫升/支)取實(shí)施例2制備的總萜內(nèi)酯提取物58. 5克，先以95%的乙醇溶解，再緩緩加入1， 2丙二醇，最后加如注射用水，其中注射用水、1，2丙二醇和乙醇用量比例為，注射用水乙 醇(95%) 1，2丙二醇=6 1 3，即在60克總萜內(nèi)酯提取物中加入2500毫升的注射用 水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。并加入亞硫酸氫鈉1. 75克，即0.025% 的比例，攪拌，并緩緩加入PH為4. 8的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液，調(diào)PH至5. 0，以0. 22微 米的醋酸纖維素鈉濾膜濾過，在以超濾膜(截留分子量為一萬)濾過，灌裝，滅菌(105°C下 30分鐘)，即得10毫升銀杏總內(nèi)酯注射液成品500支，經(jīng)高效液相法測(cè)定(參考中國(guó)藥典 2005版第221頁(yè)銀杏葉萜類內(nèi)酯的測(cè)定)，每支含銀杏總萜內(nèi)酯約56. 03毫克。實(shí)施例9銀杏總萜內(nèi)酯注射液的制備處方銀杏萜內(nèi)酯60. 6克1，2_ 丙二醇2000 毫升醋酸-醋酸鈉緩沖溶液適量注射用水3000毫升_制成500支(10毫升/支) 取實(shí)施例3制備的總萜內(nèi)酯提取物60. 6克，先以95%的乙醇溶解，再緩緩加入1，2丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、1，2丙二醇和乙醇的用量比例混為，注射用 水乙醇(95%) 1，2丙二醇=6 1 3，即在60克總萜內(nèi)酯提取物中加入3000毫 升的注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1800毫升。加入亞硫酸氫鈉1. 5克， 即0. 03%的比例，攪拌，并緩緩加入PH為4. 4的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液，調(diào)PH至4. 5， 以0. 22微米的醋酸纖維素鈉濾膜濾過，在以超濾膜(截留分子量為一萬)濾過，灌裝，滅菌 (105°C下30分鐘)，即得10毫升銀杏總內(nèi)酯注射液成品500支，經(jīng)高效液相法測(cè)定，每支含 銀杏總萜內(nèi)酯約58. 12毫克。實(shí)施例10銀杏總萜內(nèi)酯注射液的制備處方銀杏萜內(nèi)酯61. 6克聚乙二醇1500毫升醋酸-醋酸鈉緩沖溶液適量注射用水3500毫升_制成500支(10毫升/支)取實(shí)施例4制備的總萜內(nèi)酯提取物61. 6克，先以95%的乙醇溶解，再緩緩加入1， 2丙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混為，注射用水乙 醇(95%)乙二醇=6 1 3，即在60克總萜內(nèi)酯提取物中加入3000毫升的注射用水， 95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1500毫升。加入EDTA_Na2(乙二胺四乙酸二鈉)1.5 克，即0. 03%的比例，攪拌，并緩緩加入PH為3. 8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，調(diào)PH至4. 0，以 0. 22微米的醋酸纖維素鈉濾膜濾過，在以超濾膜(截留分子量為一萬)濾過，灌裝，滅菌 (105°C下30分鐘)，即得10毫升銀杏總內(nèi)酯注射液成品500支，經(jīng)高效液相法測(cè)定，每支含 銀杏總萜內(nèi)酯約58. 35毫克。實(shí)施例11銀杏總萜內(nèi)酯注射液的制備處方銀杏萜內(nèi)酯60. 8克95%的乙醇500毫升枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液適量注射用水4500毫升_制成 500支(10毫升/支)取實(shí)施例5制備的總萜內(nèi)酯提取物60. 8克，先以95%的乙醇溶解，再緩緩加入聚 乙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混為，注射用水乙 醇(95%)乙二醇=5.5 1 3. 5，即在60克總萜內(nèi)酯提取物中加入2750毫升的注 射用水，95%的乙醇500毫升和1，2_丙二醇1750毫升。加入EDTA_Na2 (乙二胺四乙酸二 鈉)2. 0克，即0. 04%的比例，攪拌，并緩緩加入PH為4. 8枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液，調(diào) PH至5.0，以0. 22微米的醋酸纖維素鈉濾膜濾過，在以超濾膜(截留分子量為一萬)濾過， 灌裝，滅菌(105°C下30分鐘)，即得10毫升銀杏總內(nèi)酯注射液成品500支，經(jīng)高效液相法 測(cè)定，每支含銀杏總萜內(nèi)酯約60. 80毫克。實(shí)施例12銀杏總萜內(nèi)酯注射液的制備處方銀杏萜內(nèi)酯60. 2克
10
1，2_ 丙二醇1500 毫升95%的乙醇500毫升磷酸氫鈉-磷酸二氫納緩沖溶液 適量注射用水3000毫升_制成500支(10毫升/支)取實(shí)施例6制備的總萜內(nèi)酯提取物60. 2克，先以95%的乙醇溶解，再緩緩加入聚 乙二醇，最后加入注射用水，其中注射用水、乙二醇和乙醇的用量比例混為，注射用水乙 醇(95%) 1，2_丙二醇=5 1 4，即在60. 2克總萜內(nèi)酯提取物中加入2500毫升的 注射用水，95%的乙醇500毫升和1，2-丙二醇2000毫升。加入EDTA_Na2(乙二胺四乙酸 二鈉)1. 75克，即0. 035 %的比例，攪拌，并緩緩加入PH為5. 2醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，調(diào) PH至5.3，以0. 22微米的醋酸纖維素鈉濾膜濾過，在以超濾膜(截留分子量為一萬)濾過， 灌裝，滅菌(105°C下30分鐘)，即得10毫升銀杏總內(nèi)酯注射液成品500支，經(jīng)高效液相法 測(cè)定，每支含銀杏總萜內(nèi)酯約57. 93毫克。實(shí)施例13銀杏總萜內(nèi)酯注射液的穩(wěn)定性考察室溫留樣考察將灌封好的樣品置于公司實(shí)驗(yàn)室室溫留樣室(溫度25°C 士2°C， 60士 10%RH)，分別于第3、6、9、12、18個(gè)月定期取樣檢測(cè)，并與0月結(jié)果比較，見表1。由穩(wěn) 定性試驗(yàn)結(jié)果可知，以本方法制成的銀杏萜內(nèi)酯注射劑，其在PH值為4. 5左右時(shí)，穩(wěn)定性良 好。第0、3、6、9、12、18個(gè)月的樣品取樣時(shí)間分別為2007年3月20日、2007年6月20 日、2007年9月20日、2007年12月20日、2008年6月20日。樣品為魯南厚普制藥有限公 司厚普實(shí)驗(yàn)室自制，處方、工藝見實(shí)施例9。表1、銀杏總萜內(nèi)酯注射液穩(wěn)定性試驗(yàn)分析(室溫)
權(quán)利要求
一種提取銀杏總萜內(nèi)酯的方法，其特征在于，包括如下步驟1)取銀杏葉，加乙醇和枸櫞酸或酒石酸，回流提取，濃縮醇提液；2)步驟1)濃縮物上大孔樹脂柱，梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮；3)步驟2)濃縮物上硅膠柱，乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，干燥；4)步驟3)干燥物經(jīng)乙醇溶解，加水，放置，得一次結(jié)晶產(chǎn)物；母液回收乙醇，水液冷沉，得第二次結(jié)晶產(chǎn)物；合并兩次結(jié)晶產(chǎn)物即得銀杏總萜內(nèi)酯。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述乙醇的濃度為60% 80%，所 述枸櫞酸或酒石酸的加入量為0. (重量/體積百分比)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)醇提濃縮液的重量與藥材的重量比 為 1 0. 8 1。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)洗脫時(shí)先用水洗3 5倍柱體積，除 雜，棄去；再以20%的乙醇洗脫3 5倍柱體積，除雜，棄去。然后用75%的乙醇洗脫3 6倍的柱體積，收集醇洗脫液，濃縮，待用。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述樣品上硅膠柱前，將步驟2)所 得提取物加適量的水，以適量的硅膠充分拌勻，真空干燥后上硅膠柱。
6.一種含有銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑，其特征在于，它由以下組分組成銀杏總萜內(nèi)酯0.8% 1.2%賦形劑10% 60%PH調(diào)節(jié)劑適量抗氧化劑0.02% 0.04%注射用水40% 89%其中，所述賦形劑包括乙二醇、乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇中的一種或兩種，所述PH 調(diào)節(jié)劑為以下緩沖液的一種磷酸氫鈉_磷酸二氫納、枸櫞酸_枸櫞酸鈉或醋酸_醋酸鈉， PH調(diào)節(jié)劑的用量為使得注射液的PH調(diào)至3. 5 5. 0即可；所述抗氧化劑為亞硫酸氫鈉、乙 二胺四乙酸二鈉中的一種。
7.如權(quán)利要求6所述的注射劑，其特征在于，所述PH調(diào)節(jié)劑為以下緩沖液的一種 PH3. 2 4. 8的磷酸氫鈉-磷酸二氫納、PH4. 4 4. 8的枸櫞酸-枸櫞酸鈉和PH3. 8 5. 2 的醋酸-醋酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提取銀杏總萜內(nèi)酯的方法及含有該銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明克服了現(xiàn)有提取分離技術(shù)中純度不高、有效成分容易被破壞以及注射劑不穩(wěn)定等的不足，提供了一種綜合運(yùn)用多種技術(shù)手段提取、分離銀杏總萜內(nèi)酯的方法。另外，本發(fā)明公開了用該方法制備的一種含有銀杏總萜內(nèi)酯的注射劑。與現(xiàn)有的銀杏注射劑相比較，用本發(fā)明所得到的注射劑，具有總萜內(nèi)酯含量高、成分全的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)測(cè)定，其總萜內(nèi)酯的含量能達(dá)到85％以上。
文檔編號(hào)A61P25/28GK101926835SQ20091014947
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者李守信, 蘇瑞強(qiáng), 趙志全 申請(qǐng)人:山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司