專利名稱：：rLZ-8在治療血小板減少癥中的應用及其制劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)對血小板減少癥的治療用途。背錄技術1989年，由日本Kino等人第一次從赤靈芝菌絲體提取物中分離得到了一種免疫調節蛋白，即靈芝免疫調節蛋白ImmunoregulatoryProteinfromGanodermaLucidum，LZ-8)，命名為LZ-8，并測定了其基因序列、氨基酸順序和免疫生理活性。蛋白質測序表明LZ-8由IIO個氨基酸殘基組成，氨基端乙酰化。分子量為12.4kD，等電點為4.4。發明人之一已在另一專利申請中公開了基因重組靈芝免疫調節蛋白的晶體空間結構，其結構的主要特征為包括一個N-端的形成二聚體所需的重要結構域和一個C端的FNIII結構域，N-端結構域由一個a-helix(序列為2-SDTA-LIFRLAWDVK-15,14個氨基酸組成)和P-strand(序列為16-KLSFD-20,5個氨基酸組成)，其中在a-helix上的Ser的殘基被乙酰化封閉。LZ-8單體上的N端a-helix和P-strand與另一單體上相同的結構域通過空間交換形成了重要的二聚體結合結構域，呈啞鈴狀。C-端的FNIII結構域屬于免疫球蛋白三文治結構，包含e-sheetIandP-sheetII兩個結構，二者分別由P-strandsA-B-Eand0-strandsG-F-C-D形成。研究結果表明基因重組靈芝免疫蛋白的本質作用可能是通過N端a螺旋A形成同源二聚體(研究表明，其N端13個氨基酸殘基對FIP形成有功能的同源二聚體十分必要)。血小板減少癥可能源于造血干細胞損傷引起的血小板產生不足，血小板減少癥通常伴隨著貧血和白細胞減少癥。血小板減少癥也可能是由于使用一些特殊藥物引起的，如奎寧、奎尼丁、肝素、非甾類抗炎藥物、還有一些化學試劑等，尤其是一些臨床使用的化療藥物會抑制巨核細胞的產生。目前，臨床上常用的藥物以基因工程重組類藥物為主，主要為血小板生成素CThrombopoietin,THPO)和白介素-11(IL-ll)。THPO是作用于巨核細胞系分化發育的特異性造血因子，是最早階段巨核細胞和血小板分化發育最重要的生理性調節因子。THPO長期或大劑量應用存在以下潛在的毒副作用，如刺激腫瘤細胞生長、與其他細胞因子產生競爭性相互作用、骨髓纖維化、肝脾腫大等，故THPO使用的安全性問題仍有待進一步研究，所出現的不良反應為注射部位疼痛、紅腫、硬結、結膜充血、水腫、心悸、乏力等。IL-11可用于預防非血液系統惡性腫瘤化療所致的重度血小板減少癥,降低化療導致的重度血小板減少的發生率,減少血小板成分輸血的次數。重組人IL-11最常見的副作用是輕度的可逆性貧血，其發生與液體潴留產生的血液稀釋有關，在治療中水腫約占20%，心律失常約占15%。中醫中藥在血小板減少癥的治療中也有應用的報道，其中單味中藥和復方制劑主要有人參、當歸、補骨脂、地黃、白術、黃芪、阿膠、刺五加等，盡管中醫藥對放化療所造成的造血及免疫功能抑制有較好的調節作用，但目前療效評價只停留在有效、無效的水平上,且由于各地療效標準不一，不少報道未設對照組，療程長短相差大,影響療效的說服力。本發明結果表明，基因重組靈芝免疫調節蛋白具有明顯的治療及預防由多種原因導致的血小板減少癥，在臨床應用劑量、治療效果及臨床不適癥等方面均優于現有的臨床應用藥物。動物實驗表明，基因重組靈芝免疫調節蛋白的副作用遠低于IL-ll和THPO。綜上所述，發明人利用畢赤酵母真核表達系統表達了靈芝免疫調節蛋白；在國際同類研究中，發明人首次實現了工業級30克生產規模的rLZ-8生產，并且建立了完整的生產及純化工藝方案；完成了rLZ-8空間結構的測定工作。本發明發現了rLZ-8可以提升實驗動物血小板低下模型的血小板數量，且藥效學作用明顯強于THPO;安全性實驗表明，rLZ-8對大鼠血細胞無明顯毒性；對主動脈、主靜脈血管壁未見病理性破壞作用；骨髓涂片結果表明對造血機能也無病變作用。本發明首次公開了LZ-8對預防及治療多種原因導致的血小板減少癥的新用途。
發明內容本發明的內容為重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在血小板減少癥的治療領域中的應用。本發明公開了rLZ-8具有預防和治療血小板減少癥的作用。在環磷酰胺所致小鼠和犬血小板減少癥的預防和治療實驗中，將生理鹽水配制的rLZ-8對實驗動物血小板低下模型進行給藥，用THPO和IL-6為陽性藥物，連續給藥，檢測血液中血小板數量，對比治療前后血小板數變化，分析藥物療效。與模型組比較，在給藥初期(第3-5天)rLZ-8藥物組已明顯刺激小鼠、豚鼠和犬的血小板增生，差異極其顯著，在給藥中期(第7-10天)時恢復到正常水平，在治療由注射抗血小板血清導致的血小板減少癥豚鼠實驗動物模型也取得了很好的效果。具體實施例方式實施例1.rLZ-8預防環砩酰胺引起的犬血小板減少癥的藥效學試驗1.藥物配制試驗用藥重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)無菌生理鹽水配制成3.85ng'kg—1、1.925叱kg"劑量組，lml/只。陽性對照藥血小板生成素(THPO),沈陽三生制藥股份有限公司生產，20ng'kg"/d，lml/只。化療藥物環磷酰胺(Cy)，江蘇恒瑞制藥有限公司生產，生產批號08112121:200mg/支。用電子秤準確稱取7mg'kg"/只。血小板稀釋液尿素:1.3g、枸櫞酸鈉0.5g、甲醛O.lml，加蒸餾水至100ml混合，過濾備用。2.實驗方法實驗動物分成5組，分別為正常對照組、模型組(CP)、陽性藥物對照組和實驗藥物組，每組2只犬，雌雄各半。除正常對照組(給予等體積生理鹽水)外，每只犬均給予口服環磷酰胺(7mgAg"/只/d)，連續5天。rLZ-8和陽性藥物對照組于第一次口服環磷酰胺的同時給藥，連續皮下注射11天。按上述分組分別給予rLZ-8(3.85嗎-kg4、1.925ng-kg"，lml/只/d)、陽性藥(THPO20嗎'kg-、lml/只/d)，藥后第一天開始隔Fl采集靜脈血于顯微鏡下進行血小板計數。3.實驗結果所有實驗數據先進行檢驗方差齊性，再進行獨立樣本的組間f檢驗，統計軟件采用SPSS16.0。與模型組比較，各藥物劑量組每只犬在口服給藥環磷酰胺第7天血小板明顯下降，第ll天降至最低值；與模型組比較，各藥物劑量組血小板數明顯高于模型組，具有顯著性差異0^0.05)。表l,rLZ-8預防犬白細胞減少癥每只犬血小板結果(單位*109/L)分組治療前3rd大5lh大7lh天9lh天llLh天"正常對照組2652702612622642202"d正常對照組2782612542742492463rdCP2751981635562104thCP1741942049444105山THP021925514015545366thTHPO29524725018635257thrLZ-8283325213208107808thrLZ-8238229313393163789[hrLZ-8222329236317937010thrLZ-831737226130210080表2.rLZ-8預防犬血小板減少癥血小板數試驗結果(F±S,,n=2)(單位*109/L)分組治療前3rd天5[h天7th天9th天11th天下降率正常對照組271±2.91265±1.75257±2.52268±2.69256±1.87233±0.76模型組224±0.12196±0.25183±0.4774±0.1453±0.4010±0.1495%THPO257±0.20251±0.53210±0.31170±0.31*40±0.2I30±0.4788%rLZ-8(1.925嗎'kg-)260±0.11277±0.11263±0.24300±0.1]'135±0.40*79±0.14*69%rLZ-8(3.85(ig.kg勺269±0.11350±0.18248±0.79309±0.25'96±0.78*75±0.82*72%與模型組比較存在顯著性差異，*p<0.05實施例2.rLZ-8治療環磷酰胺引起的犬血小板減少癥的藥效學試驗1.藥物配制試驗用藥重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)無菌生理鹽水配制成3.85ng.kg—、1.925ng'kg—1劑量組，lml/只。陽性對照藥血小板生成素(THPO)，沈陽三生制藥股份有限公司生產，20嗎'kg—Vd，lml/只。化療藥物環磷酰胺(Cy)，江蘇恒瑞制藥有限公司生產，生產批號08112121;200mg/支。用電子秤準確稱取7mg-kg—V只。血小板稀釋液尿素:1.3g、枸櫞酸鈉0.5g、甲醛O.lml，加蒸餾水至100ml混合，過濾備用。2.實驗方法實驗動物分成5組，分別為正常對照組、模型組(CP)、陽性藥物對照組和實驗組，每組2只犬，雌雄各半。除正常對照組(給予等體積生理鹽水)外，每只犬均給予口服環磷酰胺(7mg.kg1/只/d),連續5天。于第11天，血小板下降至最低值時，按上述分組分別皮下注射給予rLZ-8(3.85ng.kg1、1.925ng.kg",lml/只/d)、陽性藥(THPO20嗎'kg—1、lml/只/d)治療，連續給藥7天，并于造模前、造模后、給藥第3天、7天、14天采集靜脈血于顯微鏡下進行血小板計數。3.實驗結果所有實驗數據先進行檢驗方差齊性，再進行獨立樣本的組間f檢驗，統計軟件采用SPSS16.0。與模型組比較，各藥物劑量組每只犬給藥第3天血小板數已明顯升高,在給藥第7天基木達到正常，且有顯著性差異(^<0.05)。表3.rLZ-8治療犬白細胞減少癥每只犬血小拔結果(單位*109/L)分組造模前造模后3rd天7th天14lh天Ist正常對照組2452312542382282"d正常對照組251240228246239dCP265416174804thCP248316877855thTHPO26190921762456thTHPO25145951622397thrLZ-8217351012142678thrLZ-8245401062232759thrLZ-82383511021128910thrLZ-824140186187252表4.rLZ-8治療犬血小板減少癥血小板數試驗結果(F"±S，n=2)(單位::*109/L)分組造模前造模后3rd天7th天14[h天下降率Normalcontrolgroup248±0.15235±0.28241±0.1S242±0.19233±0.54CPcontrolgroup256±0.4536±0.7464.5±0.4775.5±0.]882.5±CU256%THPO256±03467±0.2493.5±0.54*169±0.39*242±0.65*72%rLZ-8(9.625嗎.kg-1)231±0.5437.5±0.41103.5±0.78*271±0，86%rLZ-8(19.25iig.kg1)239±0.4137.5±0.94148土0,89^199土0,43^270±0.4"72%與模型組比較存在顯著性差異，*p<0.05實施例3.rLZ-8預防環碟酰胺引起的小鼠血小板減少癥的藥效學試驗1.藥物配制試驗用藥重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)無菌注射用水配制成19.25嗎-kg4、9.625嗎.kg—1劑量組，0.2ml/只。陽性對照藥血小板生成素(THPO),沈陽三生制藥股份有限公司生產，770嗎.kg-Vd，0.2ml/只。化療藥物環磷酰胺(Cy),江蘇恒瑞制藥有限公司生產，生產批號08112121;200mg/支。無菌注射用水配制成lOOmg.kg-1,0.2ml/只。血小板稀釋液尿素:1.3g、枸櫞酸鈉0.5g、甲醛O.lml，加蒸餾水至100ml混合，過濾備用。2.實驗方法實驗動物分成5組，每組10只小鼠，雌雄各半。除正常對照組(給予等體積生理鹽水)外，每組小鼠均腹腔注射環磷酰胺，100mg-kg—1，0.2ml/只/d，連續3天。rLZ-8和陽性藥物對照組于第一次注射環磷酰胺的同時給藥，連續11天。按上述分組分別皮下給予11^-8(19.25嗎']^-1、9.625嗎.]^10,2ml/只/d)、陽性藥(THPOTTOng-kg^0.2ml/只/d)，藥后第一天開始隔日采集靜脈血于顯微鏡下進行血小板計數。3.實驗結果所有實驗數據先進行檢驗方差齊性，再進行獨立樣本的組間f檢驗，統計軟件釆用SPSS16.0。與模型組比較，各藥物劑量組每組鼠在給藥環磷酰胺第7天血小板明顯下降，第ll天降至最低值；與模型組比較，各藥物劑量組血小板數明顯高于模型組，具有顯著性差異(<0.05)。表5.rLZ-8預防小鼠血小板減少癥血小板數試驗結果(ir±S,n=10)(單位*109/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例4.rLZ-8治療環雜酰胺引起的小鼠血小板減少癥的藥效學試驗1.藥物配制試驗用藥重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)無菌注射用水配制成19.25ng.kg—1、9.625ng.kg"劑量組，0.2ml/只。陽性對照藥血小板生成素(THPO)，沈陽三生制藥股份有限公司生產，770ng.kg々d,0.2ml/只。化療藥物環磷酰胺(Cy),江蘇恒瑞制藥有限公司生產，生產批號08112121;200mg/支。無菌注射用水配制成100mg'kg-1，0.2ml/只。血小板稀釋液尿素:1.3g、枸櫞酸鈉0.5g、甲醛O.lml，加蒸餾水至100ml混合，過濾備用。2.實驗方法實驗動物分成5組，每組10只小鼠，雌雄各半。除正常對照組(給予等體積生理鹽水)外，每組小鼠均腹腔注射環磷酰胺，lOOmg'kg.1，0.2ml/只/d,連續3天。血小板數降到300X109/L以下時，按上述分組分別皮下給予相應劑量rLZ-8(19.25ng'kg-1、9,625ng'kg"0.2ml/只/d)及陽性藥(THPO770嗎.kg-'、0.2ml/只/d)治療，正常對照組和模型組(CP)組給予等體積生理鹽水，于治療第3d和第7d、14d分別小鼠尾靜脈取血，高倍鏡下血小板't卜數。3.實驗結果所有實驗數據先進行檢驗方差齊性，再進行獨立樣本的組間f檢驗，統計軟件采用SPSS16.0。與模型組比較，各藥物劑量組每只小鼠給藥第3天血小板數已明顯升高，在給藥第7天基本込到正常，且有顯著性差異(p<0.05)。表6.rLZ-8治療小鼠血小板減少癥血小板數試驗結果(]T土S,n=10)(單位*109/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型組比較存在顯著性差異，*p<0.05實施例5.rLZ-8治療豚鼠血小板減少癥的藥效學試驗1.藥物配制試驗用藥重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)無菌注射用水配制成40嗎'kg—、2f^g'kg—i劑量組，0.2ml/只。陽性對照藥重組白介素6(rhIL-6)，40wkg々d，0.2ml/只。造模藥物豚鼠血小板抗血清，lmhkg-1。血小板稀釋液尿素:L3g、枸櫞酸鈉0.5g、甲醛O.lml,加蒸餾水至100ml混合，過濾備用。2.實驗方法實驗動物分成5組，每組10只豚鼠，雌雄各半。除止常對照組(給予等體積生理鹽水)外，每組豚鼠均注射血小板抗血清(lmHig—1),24h后，各組血小板均降至最低值。于給藥4h后，按上述分組分別肌注給予相應劑量rLZ-8WOng'kg-1,20ug'kg—10.2ml/只/d)及陽性藥(rhIL-6^ng'kg-1,0.2ml/只/d)治療，正常對照組和模型組給予等體積生理鹽水，于治療第3d和第7d、14d分別豚鼠足墊采血，高倍鏡下血小板計數。3.實驗結果所有實驗數據先進行檢驗方差齊性，再進行獨立樣本的組間f檢驗，統計軟件采用SPSS16.0。與模型組比較，各藥物劑量組豚鼠在給藥第3天血小板數已明顯升高,在給藥第7天基本達到正常，且有顯著性差異(p〈0.05)。表7.rLZ-8治療豚鼠血小板減少癥血小板數試驗結果(F土S，n-lO)(單位*109/L)分組造模前造模后3rd天7th天14'h天正常對照組728±031740±0.13760±0.73861±0.41867±0.71模型組751±0.39217±0.19269±0.92379±0.70387±0.66THPO842±0.14244±0.39295±0.37582±0.41*639士0.23'rLZ-8(20吸kg-1)831±0.50237±0.21420±0.25'712土0.74'881土0.63'rLZ-8(40吸kg-1)843±0.41243±0.28414±0.38*790土0.18'845±0.11'與模型組比較存在顯著性差異，*;<0.05實施例6.rLZ-8治療環磷酰胺引起的小鼠血小板減少癥的藥效學試驗(鼻腔給藥途徑)1.藥物配制試驗用藥重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)無菌注射用水配制成9,625嗎'kg"、4.81嗎'kg入2.40嗎'kg—1劑量組，10ul/只。陽性對照藥血小板生成素(THPO)，沈陽三生制藥股份有限公司生產，770嗎'kg—Vd，10ul/只。化療藥物環磷酰胺(Cy)，江蘇恒瑞制藥有限公司生產，生產批號08112121;200mg/支。無菌注射用水配制成100mgkg—、0.2ml/只。血小板稀釋液尿素1.3g、枸櫞酸鈉0.5g、甲醛0.lml，加蒸餾水至100ml混合，過濾備用。2.實驗方法實驗動物分成6組，每組10只小鼠，雌雄各半。除正常對照組(給予等體積生理鹽水)外，每組小鼠均腹腔注射環磷酰胺，100mg'kg—、0.2ml/只/d，連續3天。血小板數降到300X109/L以下時，按上述分組分別鼻腔途徑給予相應劑量rLZ-8(9.eSSng'kg-1,4.81嗎4^、2.40嗎'kg"、10ul/只/d)及陽性藥(THPO770嗎'kg-Vd，10ul/只/天)治療，正常對照組和模型組(CP)組給予等體積生理鹽水，于治療第3d和第7d、14d分別小鼠尾靜脈取血，高倍鏡下血小板計數。3.實驗結果所有實驗數據先進行檢驗方差齊性，再進行獨立樣本的組間f檢驗，統計軟件采用SPSS16.0。進行比較與模型組比較，各藥物劑量每組小鼠給藥第3天血小板數已明顯升高，在給藥第7天基本達到正常，且有顯著性差異(p〈0.05)。表8.rLZ-8治療小鼠血小板減少癥血小板數試驗結果(F±S,n=10)(單位*109/L)分組造模前造模后3rd天7th天14th天正常對照組838±0.11946±0.18870±0.23760±0.31965±0.70模型組850±0.34239±0.12256±0.93301±0.30323±0.67THPO851±0.34284±0.19360±0.38401±0.32689±0.65*rLZ-8(2.40嗎'kg—1)839±0.40251±0.41683±0.45'785±0.78*998士0.61'rLZ-8(4.81嗎'kg—1)946±0.45296±0.78541±0.48*870土0.28'1021±0.31*rLZ-8(9.625嗎'kg.1)916±0.45246±0.45520土0.45'906土0.45'992土0.45'與模型組比較存在顯著性差異，=><0.0權利要求本發明的權利要求如下1.一種重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)，該蛋白被用于治療血小板減少癥。1.一種重組靈芝免疫調節蛋白GLZ-8)，該蛋白被用于治療血小板減少癥。2.根據權利要求l所述，重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)治療血小板減少癥的有效劑量為10,10mg/m1.3.根據權利要求l所述，一種靈芝免疫調節蛋白藥物制劑可選用任何的藥學可接受的輔劑。4.根據權利要求1所述重組靈芝免疫調節蛋白藥物制劑可以通過口服和非腸道給藥，口服藥包括口服液、片劑、丸劑和膠囊；非腸道用包括外用藥、吸入制劑、栓劑和注射劑。全文摘要本發明提供了重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)用于治療血小板減少癥的一種新用途。在環磷酰胺所致小鼠和犬血小板減少癥的預防和治療實驗中，將生理鹽水配制的rLZ-8對血小板低下的實驗動物模型進行給藥，用THPO和IL-6為陽性藥物，連續給藥，檢測血液中血小板數量，對比治療前后血小板數變化，分析藥效。與模型組比較，在給藥初期(第3-5天)rLZ-8藥物組已明顯刺激小鼠、豚鼠和犬的血小板增生，差異極其顯著，在給藥中期(第7-10天)時恢復到正常水平，在治療由注射抗血小板血清導致的血小板減少癥豚鼠實驗動物模型也取得了很好的效果。文檔編號A61K38/16GK101612385SQ20091014342公開日2009年12月30日申請日期2009年5月25日優先權日2009年5月25日發明者非孫,張喜田,梁重陽申請人:張喜田