專利名稱：：穿山龍治療急性痛風性關節炎的有效部位及其提取方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥的有效部位，尤其涉及一種穿山龍治療急性痛風性關節炎的有效部位，本發明有效部位的提取方法，屬于中藥治療痛風性關節炎領域。
背景技術：
：研究表明，無論發達國家還是發展中國家，痛風的患病率皆呈迅速上升趨勢。痛風的首發癥狀是急性痛風性關節炎，如防治不當，不僅給患者帶來極大痛苦，且易導致關節畸形、腎結石、腎損傷等嚴重后果，故急性痛風性關節炎已成為危害人類健康的一種嚴重疾病，至今尚無法根治。所以迫切需求尋找預防和治療急性痛風性關節炎的有效中藥，以控制疾病的發生、發展。穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷("ioscoreani卯o;n'ca他iiflo)的才艮莖。主產于東北黑龍江省山區。味苦、微寒，無毒，具有祛風濕、活血通絡、清肺化痰作用。痛風發病的根本原因是由于血中尿酸升高而導致的關節周圍的局部炎癥反應，如果既能降低尿酸，又能減緩局部的炎癥反應，那么才是其治療痛風性關節炎的真正意義所在。現有的穿山龍提取物或有效部位僅對于風濕、類風濕性關節炎具有較好的抗炎鎮痛療效，而尚不具備降低患者血中尿酸的功效，提供一種既能P條低患者血中的尿酸，又能減緩患者局部關節周圍的炎癥反應的穿山龍有效部位提取物將具有重要的意義。
發明內容本發明的目的是提供一種既能降低患者血中的尿酸，又能減緩患者局部關節周圍的炎癥反應的穿山龍有效部位提取物。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種治療急性痛風性關節炎的穿山龍有效部位提取物，包括以下步驟制備得到將穿山龍粉碎后用水煎煮提取，收集水煎液，過濾，即得；或者將穿山龍粉碎后用10-95%乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。其中，將穿山龍用水煎煮提取時，優選的用穿山龍藥材水4-IO倍重量的水煎煮l-4小時；為了達到更好的提取效果，可以將穿山龍的水煎液濃縮后上大孔吸附樹脂柱吸附，用蒸餾水或10-95%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，即得；更優選的，用30%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，即得；所述的大孔吸附樹脂柱優選為AB-8型大孔吸附樹脂柱或D101型大孔吸附樹脂柱；優選的，將穿山龍用10-95%乙醇才是取時，用70%乙醇提取所得到的有效部位具有更好的治療急性痛風性關節炎的藥理活性。本發明治療痛風性關節炎的穿山龍有效部位富含活性成分，具有降低尿酸、抗炎、鎮痛的藥理作用。本發明有效部位不但能緩解急性期關節紅腫熱痛的炎癥反應，而且能夠針對病機降低血中尿酸水平，對于痛風標本兼治，因此可以用來制備療效好，安全可靠的防治急性痛風性關節炎的藥物。本發明有效部位的提取工藝簡單，不需高溫高壓和特殊設備，安全，易于操作且成本低。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1將穿山龍干燥根及根莖切片1000g,粉碎，浸泡30分鐘，加水6倍重量，煎煮1小時，得到水煎液；水煎液濃縮至lg/ml上AB-8型大孔吸附樹脂柱，用蒸餾水洗脫至無色，收集洗脫液，得到組分I;再用30%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，得到組分II;回收乙醇，再用50%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，得到組分III;再用70%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，得到組分IV。實施例2將穿山龍干燥根及根莖切片1000g,粉碎，浸泡30分鐘，加水8倍重量，煎煮1小時，煎煮2次，合并煎液，得到水煎液；將水煎液濃縮至2g/ml上D101型大孔吸附樹脂柱，用6倍蒸餾水洗脫，洗脫液棄去，再用8倍30%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得到組分II,再用50%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，得到組分III;再用70%乙醇洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇，得到組分IV。實施例3將穿山龍干燥根及根莖切片lOOOg，粉碎，力口70°/乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龍有效部位提取物(組分V)。對比實施例1將穿山龍干燥根及根莖切片1000g,粉碎，加30%乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龍提取物(組分VI)。對比實施例2將穿山龍干燥根及根莖切片1000g,粉碎，加50%乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龍提取物(組分VII)。對比實施例3將穿山龍干燥根及根莖切片1000g,粉碎，力口60%乙醇3倍重量，回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龍提取物(組分VIH)。對比實施例4將穿山龍干燥根及根莖切片1000g,粉碎，加95%乙醇4倍重量回流提取4次，合并提取液，回收乙醇，得到穿山龍提取物(組分IX)。實驗例1穿山龍提取物的藥效學試驗61:穿山龍水煎液(實施例1或2所制備)；供試藥物2:實施例1或2所制備的組分IV;供試藥物3:對比實施例3所制備的穿山龍提取物(組分VII1);供試藥物4:對比實施例4所制備的穿山龍提取物(組分IX);二、實l全方法①模型制備雄性Wistar大鼠和昆明種小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗方法釆用次黃噤呤和微晶尿酸鈉造模，腹腔注射次黃噤呤500mg/kg,20min后右側踝關節腔注射微晶尿酸鈉溶液0.4ml。四個組分濃縮液連續灌胃3天，檢測大鼠血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變及小鼠醋酸扭體實驗，以檢測抗炎、鎮痛、血尿酸相關指標，統計學分析實驗數據。②血尿酸及關節滑膜組織形態學檢測各組大鼠于造模后lh，目艮底取血1.5mL,以檢測血尿酸。24h后處死，取踝關節內組織急行10%曱醛溶液固定，24h后再鋸取厚度約0.5厘米關節周圍組織。再以10%福爾馬林固定2天。將組織置于脫釣劑(甲酸-福爾馬林液)中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。流水沖洗24小時(除酸)。進行常規脫水，透明，浸蠟，切片。HE染色石蠟切片厚度為5Mm,裱于干凈載玻片上，60。C烤片機烤片2h—二曱苯脫蠟5minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85。/。各5min—流水沖洗5min4蘇木素染胞核5min—流水沖洗5min—伊紅染胞漿5min—乙醇逐級脫水—二甲苯透明—樹脂膠封片—顯微鏡觀察。結果判定大鼠步態分級評分標準據文獻改良0級:正常行走，計0分；l級:輕微跛行，受試下肢略有彎曲，計2分；2級:跛行，受試下肢剛觸及地面，計4分；3級重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走，計6分。鏡下關節滑膜組織形態學檢查，評分標準根據文獻改良，(l)血管充血正常0分；輕度l分；中度2分；重度3分；(2)炎細胞浸潤正常0分；輕度l分；中度2分；重度3分；(3)滑膜腫脹正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分；(4)組織壞死正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的纟全測采用全自動生化分析儀進行檢測。③醋酸致小鼠扭體反應小鼠腹腔注射(ip)藥物20min后，再ipO.7°/。醋酸致痛，記錄注射醋酸后小鼠出現扭體的時間和20min內的扭體次數。計算鎮痛百分率。鏞餾簽息謝對翻組ffl體度俊動物數-鏺葯邇扭體度應動物數？3HH，》對撤綴概缽狡應敏物敏X鵬％三、實l^結果表l大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應組別大鼠步態(分)血尿酸(ymol/L)服染色(分)鎮痛百分率(%)空白組0150.24±38.710模型組5.60±1.56273.04±77.1611.5±3.5供試藥物13.8±1.18'197.39±51.06'7.2±2.0'85±22'供試藥物35.4±1.39238.69±47.0110.5±2.842±12供試藥物24.7±1.33"236.87±45.338.5±2.6*'67±18"供試藥物45.4±1.66229.4±46.2910.1±3.153±15注與模型組比較*P<0.01,〃P<0.05。其中在供試藥物3與供試藥物4組間無顯著性差異(P>0.05)。結果表明，供試藥物1和供試藥物2均能顯著改善急性痛風性關節炎大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應，說明對急性痛風性關節炎大鼠有治療作用。其中供試藥物1的作用最為顯著。實驗例2穿山龍提取物的藥效學試驗一、實驗藥物實施例l所制備的組分I,組分II,組分m和組分IV;二、實-瞼方法①模型制備雄性Wistar大鼠和昆明種小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗方法采用次黃噤呤和微晶尿酸鈉造模，腹腔注射次黃噤呤1000mg/kg，15min后右側踝關節腔注射微晶尿酸鈉溶液0.2ml。四個組分濃縮液連續灌胃5天，檢測大鼠血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變及小鼠醋酸扭體實驗，以檢測抗炎、鎮痛、血尿酸相關指標，統計學分析實驗數據。②血尿酸及關節滑膜組織形態學檢測各組大鼠于造模后1.5h，目艮底取血1.5mL,以檢測血尿酸。24h后處死，取踝關節內組織急行10%曱醛溶液固定，36h后再鋸取厚度約0.4厘米關節周圍組織。再以10%福爾馬林固定3天。將組織置于脫鉤劑(VonEbner氏液)中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。流水沖洗18小時(除酸)。進行常規脫水，透明，浸蠟，切片。HE染色石蠟切片厚度為5Mm，裱于干凈載玻片上，60。C烤片才/L烤片1.5h—二曱笨脫錯10minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85%各10min—流水沖洗lOmin—蘇木素染胞核lOmin—流水沖洗10min—伊紅染胞漿lOmin—乙醇逐級脫水—二曱苯透明—樹脂膠封片—顯微鏡觀察。結果判定大鼠步態分級評分標準據文獻改良0級:正常行走，計0分；1級輕微跛行，受試下肢略有彎曲，計2分；2級跛行，受試下肢剛觸及地面，計4分；3級重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走，計6分。鏡下關節滑膜組織形態學檢查，評分標準根據文獻改良，(l)血管充血正常0分；輕度l分；中度2分；重度3分；U)炎細胞浸潤正常0分；輕度l分；中度2分；重度3分；(3)滑膜腫脹正常0分；輕度l分；中度2分；重度3分；(4)組織壞死正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的檢測采用全自動生化分析儀進行檢測。③醋酸致小鼠扭體反應小鼠腹腔注射(ip)藥物15min后，再ip0.5%醋酸致痛，記錄注射醋酸后小鼠出現扭體的時間和15min內的扭體次數。計算鎮痛百分率。謹:〗j—麵固g綱-國隱艦瞧a豕蕭暨#率》對履纖綴律fi慮動物敷x三、實驗結果表2大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與模型組比較*P<0.05。藥效學實驗結果表明，組分n能顯著改善急性痛風性關節炎大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應，其余各組之間無顯著性差異，因此確定組分n為穿山龍治療急性痛風性關節炎的有效部位。實驗例3一、供試藥物供試藥物1:穿山龍水煎液(實施例1或2所制備)；供試藥物2:實施例1或2所制備的組分IV;供試藥物3:對比實施例3所制備的穿山龍提取物(組分V1I1);供試藥物4:對比實施例4所制備的穿山龍提取物(組分IX);二、實驗方法①模型制備雄性Wistar大鼠和昆明種小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗方法采用氧溱酸鉀和微晶尿酸鈉造模，腹腔注射氧。秦酸鉀500mg/kg,30min后右側踝關節腔注射微晶尿酸鈉溶液0.4。四個組分濃縮液連續灌胃9天，檢測大鼠血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變及小鼠醋酸扭體實驗，以檢測抗炎、鎮痛、血尿酸相關指標，統計學分析實驗數據。②血尿酸及關節滑膜組織形態學檢測各組大鼠于造模后2h,目艮底取血l.5mL，以檢測血尿酸。24h后處死，取踝關節內組織急行10y。曱醛溶液固定，48h后再鋸取厚度約0.3厘米關節周圍組織。再以10%福爾馬林固定1天。將組織置于脫4丐劑(Clayden氏液)中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。流水沖洗12小時(除酸)。進行常規脫水，透明，浸蠟，切片。HE染色石蠟切片厚度為5Mm,^表于干凈載玻片上，60。C烤片機烤片2.5h—二甲苯脫蠟15minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85%各15min—流水沖洗15min—蘇木素染胞核15min—流水沖洗15min—伊紅染胞漿15min—乙醇逐級脫水—二曱苯透明—樹脂膠封片4顯^敖鏡觀察。結果判定大鼠步態分級評分標準據文獻改良0級:正常行走，計0分；l級輕微跛行，受試下肢略有彎曲，計2分；2級:跛行，受試下肢剛觸及地面，計4分；3級:重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走，計6分。鏡下關節滑膜組織形態學檢查，評分標準根據文獻改良，(1)血管充血正常O分；輕度l分；中度2分；重度3分；(2)炎細胞浸潤正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分；(3)滑膜腫脹正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分；(4)組織壞死正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的檢測釆用全自動生化分析儀進行檢測。③醋酸致小鼠扭體反應小鼠腹腔注射(ip)藥物25min后，再ip0.9°/。醋酸致痛，記錄注射醋酸后小鼠出現扭體的時間和25min內的扭體次數。計算鎮痛百分率。編癧龍童對厫組扭體度應動物數-毚藥組扭體虔應動物數，通S分舉-對麒組綴缽反魔動物蕺X柳％表3大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應組別大鼠步態(分)血尿酸((Jmol/L)HE染色(分)鎮痛百分率(％)空白組0132.80±40.110模型組5.30±1.45282.19±55.2611.4±3.7供試藥物14.0±1.2T201.45±52.08'6.8±1.8'83±23'供試藥物35.0±1.29244.59±70.1410.2±2.641±11供試藥物24.5±1.26''242.75±65.218.1±2.4…66±21''供試藥物45.2±1.55231,61±65.1110.4±2.751±14注:與模型組比較'P〈0.01，'*P<0.05。其中在供試藥物3與供試藥物4組間無顯著性差異(P〉0.05)。結果表明，供試藥物1和供試藥物2均能改善急性痛風性關節炎大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應，說明對急性痛風性關節炎大鼠有治療作用。其中供試藥物1的作用最為顯著。實驗例4穿山龍提取物的藥效學試驗一、實驗藥物實施例l所制備的組分I,組分II,組分III和組分IV;二、實"驗方法12①模型制備雄性Wistar大鼠和昆明種小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗方法采用氧溱酸鉀和微晶尿酸鈉造模，腹腔注射氧溱酸鉀300mg/kg，25min后右側踝關節腔注射微晶尿酸鈉溶液0.3ml。四個組分濃縮液連續灌胃7天，檢測大鼠血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變及小鼠醋酸扭體實驗，以檢測抗炎、鎮痛、血尿酸相關指標，統計學分析實驗數據。②血尿酸及關節滑膜組織形態學檢測各組大鼠于造才莫后0.5h,目艮底取血l.5mL,以檢測血尿酸。24h后處死，取踝關節內組織急行10%曱醛溶液固定，12后再鋸取厚度約0.3厘米關節周圍組織。再以10%福爾馬林固定4天。將組織置于脫4丐劑(福爾馬林-硝酸液)中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。流水沖洗20小時(除酸)。進行常規脫水，透明，浸蠟，切片。HE染色石蠟切片厚度為5卿，-浪于干凈載玻片上，50。C烤片機烤片3h—二曱苯脫蠟10minx4次—乙醇100%1次—100%2次—95%—90%—85%各10min—流水沖洗10min—蘇木素染胞核10min-流水沖洗lOmin—伊紅染胞漿lOmin—乙醇逐級脫水—二曱苯透明—樹脂膠封片—顯孩i鏡觀察。結果判定大鼠步態分級評分標準據文獻改良O級:正常行走，計O分；l級:輕微跛行，受試下肢略有彎曲，計2分；2級:跛行，受試下肢剛觸及地面，計4分；3級:重度跛行，受試下肢離開地面，三足著地行走，計6分。鏡下關節滑膜組織形態學檢查，評分標準根據文獻改良，(1)血管充血正常O分；輕度l分；中度2分；重度3分；(2)炎細胞浸潤正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分；(3)滑膜腫脹正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分；(4)組織壞死正常0分；輕度1分；中度2分；重度3分。大鼠血尿酸水平的檢測采用全自動生化分析儀進行檢測。③醋酸致小鼠扭體反應小鼠腹腔注射(ip)藥物30min后，再ipl。/。醋酸致痛，記錄注射醋酸后小鼠出現扭體的時間和30min內的扭體次數。計算鎮痛百分率。慣顯s分率畫對履組扭體反應動物載xt纖三、實驗結果表4大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注:與模型組比較*P<0.05。藥效學實驗結果表明，組分n能顯著改善急性痛風性關節炎大鼠步態、血尿酸水平、關節滑膜組織形態學改變和醋酸致小鼠扭體反應，其余組分之間無顯著性差異，因此確定組分n為穿山龍治療急性痛風性關節炎的有效部位。權利要求1、一種治療急性痛風性關節炎的穿山龍有效部位提取物，包括以下步驟制備得到將穿山龍粉碎后用水煎煮提取，收集水煎液，過濾，即得；或者將穿山龍粉碎后用10-95％乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。2、按照權利要求1所述的穿山龍有效部位提取物，其特征在于將穿山龍藥材用4-10倍重量的水煎煮1-4小時。3、按照權利要求l所述的穿山龍有效部位提取物，其特征在于將穿山龍的水煎液濃縮后上大孔吸附樹脂柱吸附，用蒸餾水或10-95%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液，即得。4、按照權利要求3所述的穿山龍有效部位提取物，其特征在于將穿山龍的水煎液濃縮后上大孔吸附樹脂柱吸附，用30%的乙醇進行洗脫，收集洗脫液。5、按照權利要求3或4所述的穿山龍有效部位提取物，其特征在于所述的大孔吸附樹脂柱選自AB-8型大孔吸附樹脂柱或D101型大孔吸附樹脂柱。6、按照權利要求l所述的穿山龍有效部位提取物，其特征在于將穿山龍粉碎后用70%乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。7、權利要求l-4任何一項所述的穿山龍有效部位提取物在制備治療急性痛風性關節炎藥物中的用途。全文摘要本發明公開了一種治療急性痛風性關節炎的穿山龍有效部位提取物及其制備方法。本發明穿山龍有效部位提取物包括以下步驟制備得到將穿山龍粉碎后用水煎煮提取，收集水煎液，過濾，即得；或者將穿山龍粉碎后用10-95％乙醇提取，收集醇提液，回收乙醇，即得。本發明治療痛風性關節炎的穿山龍有效部位富含活性成分，具有降低尿酸、抗炎、鎮痛的藥理作用。本發明有效部位不但能緩解急性期關節紅腫熱痛的炎癥反應，而且能夠針對病機降低血中尿酸水平，對于痛風標本兼治，可以用來制備療效好，安全可靠的防治急性痛風性關節炎的藥物。本發明有效部位的提取工藝簡單，不需高溫高壓和特殊設備，安全，易于操作且成本低。文檔編號A61P19/02GK101537103SQ20091013557公開日2009年9月23日申請日期2009年4月27日優先權日2009年4月27日發明者于書儀,劉樹民,麗姚申請人:劉樹民