用于呼吸道疾病治療的抗膽堿能藥和4型磷酸二酯酶抑制劑的組合的制作方法

專利名稱：用于呼吸道疾病治療的抗膽堿能藥和4型磷酸二酯酶抑制劑的組合的制作方法
用于呼吸道疾病治療的
抗膽堿能藥和4型磷酸二酯酶抑制劑的組合
本申請是同名發明名稱的中國專利申請第200580002345.X號的 分案申請，原案國際申請號為PCT/EP2005/000651，國際申請日為2005 年1月24曰。
本發明涉及吸入/口服PDE4抑制劑聯合吸入的抗膽堿能支氣管擴 張藥(毒蕈堿受體拮抗劑)的組合，優選羅氟司特(Roflumilast)或 AWD-12-281和R，R-格隆溴銨的組合，用于呼吸道疾病的癥狀治療或預 防性治療，尤其是伴隨阻塞或炎癥的那些疾病，如慢性阻塞性肺病 (COPD)或哞喘。進一步包括以局部應用(吸入)的制劑呈現該組合 和在吸入裝置例如Novol izer +的應用。
支氣管哮喘，在工業化國家中影響多達10%的個體，其特征在于 支氣管收縮，慢性氣道炎癥，氣道反應過度，和粘膜水腫。氣道改造 和改變的非膽堿能、非腎上腺素能神經傳遞可以引起不可逆的氣道阻 塞和肺功能的減退。在過去20年中支氣管哞喘作為全世界的主要公眾 健康問題出現。盡管數據表明目前的哞喘治療導致死亡率有限的降低， 但其持續作為重要的健康護理問題(Mannino等，Surveill Summ 2002; 51: 1-13)。其仍然是全世界可預防的住院治療的主導原因之一并導致 了數百萬失去的工作日。隨著哞喘發病率的提高，與該疾病相關的成 本也顯著提高。
慢性阻塞性肺病(COPD)也是非常常見的。該疾病的特征在于伴 隨炎癥反應的漸進性氣流受限。從全世界的數據調查來看，清楚的是 煙草不是COPD的唯一原因。全世界上升中的年齡也是特定的風險因 素。COPD的發病率存在變化，在3%至10°/。之間，具有穩定上升的趨勢。 盡管COPD是疾病和死亡的主導原因，慢慢才認識到其是公眾健康問 題，盡管COPD上升的死亡率和大部分心血管疾病死亡率的下降(Hurd，Chest 2000; 117 (增補2 ) : 1S-4S )。此外，COPD給個體和社會增添 了顯著的經濟負擔。
目前存在氣道炎癥是哮喘患者的主要基礎問題的強有力證據。哮 喘的病理生理學涉及分子和細胞相互作用的復雜網絡，盡管每個單個
因素的影響在患者與患者之間很可能是不同的，取決于環境和刺激。 津喘表型發展中的主要參與者包括引發刺激物如過敏原本身，細胞如 T細胞，上皮細胞和肥大細胞，這些細胞產生包括IL-5, GM-CSF, IL-3， IL-4和IL-13的多種細胞因子和趨化因子如嗜酸細胞活化趨化因子， 粘附分子等。了解哞喘的炎癥和免疫機理方面的最近進展已經表明許 多潛在的治療手段可以防止或逆轉哮喘中基礎性的反常。
目前，藥物治療是治療哮喘的主要支持。可利用短效和長效的吸 入卩2-腎上腺素能受體激動劑。目前短效J52-腎上腺素能受體激動劑 基于按需使用來用于癥狀的快速緩解。近些年來，長效的吸入p2-腎 上腺素能受體激動劑在津喘控制中具有日益提高的作用，尤其是中等 至嚴重程度的津喘患者。抗毒覃堿藥物在緩解哞喘發作中的有效性比 P2-腎上腺素能受體激動劑低(Rodrigo和Rodrigo， Chest 2002; 121:1977-87 )。然而，隨著新抗膽堿能藥噻托銨(Uotropium )的引 入，在呼吸道疾病中將極大地增加使用抗膽堿能藥。吸入的糖皮質激 素已經成為慢性哞喘治療的主要支持。它們是可獲得的臨床上最有效 治療但可產生嚴重的繼發效應，此外，在皮質類固醇耐藥哞喘中是無 效的。
總的來說，關于COPD的發病機理比哞喘知道得少得多。最近的研 究已經極大地擴展了對COPD潛在的發病機理的了解。因此，同意COPD 也是炎性疾病。從目前的發病機理觀點看，嗜中性粒細胞，CD8+淋巴 細胞和巨噬細胞及其介質可能在C0PD的發病機理中起著決定性的作 用。
目前的控制聚焦于C0PD患者的肺功能改善。該方法中的第一步是 停止吸煙。存在減少或停止吸煙可以導致一些呼吸參數改善的證椐。 支氣管擴張藥(p2-腎上腺素能受體激動劑和抗膽堿能藥)目前是癥狀治療的主要支持。短效和長效的|32-腎上腺素能受體激動劑如沙丁胺 醇，非諾特羅，沙美特羅和福莫特羅是在COPD癥狀控制中已建立的治 療劑。短效抗毒萆堿藥物中，廣泛使用異丙托銨(ipratropium)。最 近，噻托銨， 一種對M「毒萆堿受體具有特定偏好的長效抗膽堿能藥， 目前已經引入全世界(Hansel和Barnes, Drugs Today (Bare) 2002; 38: 585-600 )。抗膽堿能藥也可以有效地用于馬的COPD治療，2400ng/ 馬劑量的異丙托銨是COPD馬的有效支氣管擴張藥(Duvivier等， Equine Vet J 1999; 31:20-4， Bayly等，Equine Vet J. 2002年1 月；34 (1): 36-43 )。目前，還沒有解決COPD的抗炎治療。在過去20 年中已經可觀地增加了對COPD的全身和吸入糖皮質激素的使用。它們 已經得到了測試，前提是對COPD中炎癥的干預應當改變疾病的進程。 盡管吸入的皮質類固醇在嗜喘控制中具有證實的益處，但是直至最近， 它們在非哞喘性的與吸煙相關的COPD中的效用是沒有證據基礎的 (Bonay等，Drug Saf 2002: 25:57-71 )。吸入的糖皮質激素對表征 COPD的炎癥過程具有相對小的影響(Adcock和Chung, Curr Opin Investig Drugs 2002; 3: 58-60 )。因此，它們的適應癥是存在顯著 的支氣管擴張藥反應或患者具有伴隨頻繁加重的更嚴重疾病 (Alsaeedi等，Am J Med 2002; 113:59-65 )。
氣流阻塞和氣道炎癥是孝喘以及COPD的特征。盡管哞喘和COPD 中的氣道炎癥各自涉及不同的細胞類型，但都是與細胞浸潤和激活相 關的慢性炎癥性質的疾病。盡管支氣管哮喘的主要特征在于嗜酸粒細 胞和CDl淋巴細胞，嗜中性粒細胞、CD8淋巴細胞和巨嗟細胞在COPD 的發病機理中起主要作用。因此，涉及平滑肌松弛并且也在嗜酸粒細 胞以及嗜中性粒細胞和其他炎性和免疫活性細胞中發現的PDE可能構 成兩種疾病進展中的基礎元素。這些疾病發病機理中涉及的許多事件 和機理受到環核苷酸信號途徑激活的抑制。因此，胞內cAMP的增加干 擾了淋巴細胞、嗜酸粒細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞激活，并阻斷 了細胞因子產生、細胞復制和細胞趨向炎癥部位。此外，氣道平滑肌 細胞中cAMP信號途徑的激活促進了松弛并阻斷了平滑肌細胞復制
6(Tomlinson等，Biochem Pharmacol 1995; 49:1809-19 )，由此防
止了疾病慢性階段中觀察到的氣道改造。
PDE4屬于至少11種催化cAMP和/或cGMP水解的同工酶的超家族。 PDE4是免疫和炎癥細胞、氣道平滑肌和肺神經中的主要cAMP代謝酶。 基于其細胞和組織分布，這種酶的選擇性抑制劑抑制了從炎癥細胞釋 放介質(Hatzelmann和Schudt ， J Pharmacol Exp Ther 2001 ; 297:267-79, Marx等，Pulm Pharmacol Ther 2002; 15:7-15, Kuss 等，J Pharmacol Exp Ther 2003; 307:373-85 )。它們在COPD的動 物模型中顯示出廣語的活性(Billah等，J Pharmacol Exp Ther 2002; 302: 127-37， Kuss等，J Pharmacol Exp Ther 2003; 307: 373-85 )。 類別相關的副作用，主要是惡心和嘔吐，看來通過所謂的"第二代" PDE4抑制劑已經至少部分克服。目前臨床研究有說服力地表明了 PDE4 4中制劑在嗜喘和COPD中的治療有效寸生(Dyke和Montana, Expert Opin Investig Drug 2002; 11: 1-13， Grootendorst等,Pulm Pharmacol Ther 2003; 16:341-7， Spina, Drugs 2003; 63:2575-94 )。最小化或消 除有時與PDE4抑制劑相關的上述不良事件的努力包括創建不透入中 樞神經系統的抑制劑，和通過吸入而不是口月艮來給藥PDE4抑制劑。同 工酶PDE4的抑制劑減輕了哞喘和COPD中的炎癥過程。因此，PDE4抑 制劑的這些效果使得支氣管哮喘或COPD患者的支氣管功能改善。
已經認可抗膽堿能藥物治療作為COPD和慢性哮喘中的重要治療 方式。本發明中所用的抗膽堿能支氣管擴張藥一一毒覃堿受體拮抗劑， 是長效化合物。這種類型的任何化合物可用于該聯合治療方法中。長 效的意思是藥物對支氣管的效果持續約12小時或更長，長達24小時。 最近批準的長效吸入抗膽堿能藥——瘞托銨，在整個一天24小時產生 持續的支氣管擴張作用(Calverley等,Thorax 2003; 58:855-60 )。
格隆溴銨屬于所謂的抗膽堿能藥并在乙酰膽堿受體位點拮抗神經 遞質乙酰膽堿。該效應導致顯著的支氣管擴張和減少的粘液分泌。格 隆溴銨， 一種季銨化合物，由四種立體異構體組成。它的粘膜吸收差， 因此降低了抗膽堿能藥的副作用(Ali-Melkkila等，Acta
7Anaesthesiol Scand 1993; 37:633-42 )。格隆溴銨在其與MH^受體 結合中不具有選擇性。然而，動力學研究表明格隆溴銨從M3毒蕈堿受 體緩慢地解離(Haddad等，Br J Pharmacol 1999; 127:413-20 )。 與噻托銨相似，這種行為解釋了格隆溴銨的相對受體選擇性及其作用 的長持續時間。實際上，存在外消旋的格隆溴銨在哮喘和COPD患者中 產生了顯著的和長效的支氣管擴張效果的證據(Walker等，Chest 1987; 91: 49-51， Schroeckenstein等，J Allergy Clin Immunol 19881; 82:115-9， Gilman等，Chest 1990; 98:1095-8， Cydulka和Eme函n, Ann Emerg Med 1995; 25:470-3 )。因為哞喘和C0PD的特征在于增 加的粘液分泌，抗膽堿能藥如格隆溴銨的抗分泌效果是它們治療這些 疾病的應用的附加優勢。
目前對于哮喘和COPD的治療是不令人滿意的。鑒于這些疾病的高 發病率，因此高度需要改進的、更有效和更方便的治療干預。本發明 潛在的問題是提供具有更高效力和降低副作用的這樣的改進治療替 代。
通過包括PDE4抑制劑和抗膽堿能藥的新組合藥物解決了這個問 題，在治療效力，作用的起效和持續時間，或副作用方面，這種組合 優于單一化合物。
令人驚訝地，已經表明使用包括局部(吸入)抗膽堿能藥如外消 旋的格隆溴銨，或其對映體，尤其是R，R-格隆溴銨，或其非對映異構 體，或它們生理學上可接受的鹽，和吸入/口服磷酸二酯酶(PDE) 4 抑制劑如AWD12-281或羅氟司特或它們生理學上可接受鹽的組合，導 致對支氣管津喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的更有效和更安全的治療， 其允許較低的劑量或降低了副作用。
兩類藥物-抗膽堿能藥(尤其是R，R-格隆溴銨)和PDE4抑制劑的 藥效特性相互補充，并使得對所提及疾病的治療更有效。此外，還提 高了患者的依從性。
本發明中有用的PDE4抑制劑可以是已知抑制PDE4酶的任何化合 物，并發現其作為高度特異性的PDE4抑制劑和其優選用于吸入。例如，高效和選擇性PDE4抑制劑AWD 12-281的臨床前和臨床研究表明這種 該化合物具有良好的臨床前和臨床效用。在Brown Norway大鼠中，AWD 12-281抑制了過敏原誘導的氣道嗜酸粒細胞增多，當肺內給藥時，具 有7pg/kg的ID50。已知皮質類固醇倍氯米松的ID50值是相當的 (0. lpg/kg)。由于其獨特的代謝特征，在局部(鼻或吸入)給藥后 該化合物具有合適的安全特征。當通過吸入將AWD 12-281給予狗時， 直至最高的可行劑量(15mg/kg)也沒有誘發嘔吐，表明AWD 12-281 可用于孝喘和COPD的吸入治療(Kuss等，J Pharmacol Exp Ther 2003; 307:373-85)。
實驗部分
使用人外周血單核細胞(PBMC)研究了 R，R-格隆溴銨聯合PDE4 抑制劑對TNF分泌的影響。根據赫爾辛基和東京的國際聲明該研究通 過我們的學院倫理學委員會的批準。
通過密度梯度離心從健康捐獻者的肝素化血樣中分離PBMC。將等 體積的Hanks緩沖液(Life Technologies, Heidelberg, Germany) 加入肝素化的全血樣品中。用最大40ml的血液/Hanks混合物覆蓋15ml Histopaque-1077 (Sigma, Deisenhofen， Germany)， 室溫離心 30 分鐘(2000rpm)。將含有PBMC的可見條帶轉移至新鮮的管中并用 Hanks-緩沖液洗涂兩次。最后，將細胞接種于含有Glutamax I ( Gibco BRL， Eggenstein)和10%月臺牛血'清(Boehringer Mannheira， Penzberg， Germany)的RPMI 1640培養基(Life Technologies, Heidelberg, Germany )中。分離后，將P匿在補充10%胎牛血清(FCS )的RPMI 1640 培養基中培養，37。C 5%0)2過夜。通過粘附方法從其他細胞中分離出 PBMC,通過更換培養基除去非附著細胞。
將細胞以106細胞/ml重懸浮并在24-孔組織培養板(Falcon Bee ton Dick謂n Labware)中以5(%1體積37°C 5。線溫育。用測 試物質(0. 5jU/500nl培養基)預溫育30分鐘后，用脂多糖(LPS) (lug/ml )刺激細胞。在所示的時間，通過離心將細胞沉淀，收集上
9清液并在-80X:保持冷凍直至蛋白質測定；通過RLT裂解緩沖液
(Qiagen， Hilden， Germany)裂解細胞并在-80。C冷凍直至分析。
通過夾層ELISA 4吏用匹酉己的抗體對(Pharmingen， Heidelberg, Germany)來進行培養物上清液中的細胞因子測量。用在pH9. 5， 0. 1M 碳酸鹽緩沖液中的抗細胞因子單克隆抗體(mAb)將ELISA板
(Maxisorb， N畫)包被過夜。洗滌后，用測定稀釋液(Pharmingen， Heidelberg, Germany )將平板封閉1小時并再次洗滌。將適當稀釋的 上清液樣品和標準品一式兩份分配，并將平板在室溫溫育2小時。將 平板洗滌，用工作檢測劑(生物素化的抗細胞因子抗體和抗生物素蛋 白-辣根過氧化物酶綴合物)溫育1小時。洗滌后，加入底物(TMB和 過氧化氫)。通過加入1M H3P0,來停止反應。將平板在微平板閱讀器
(Dynatech)中以450nm讀板。將結果表示為化合物不存在下經刺激 細胞產生細胞因子的對照水平的百分比。
LPS-刺激后，從單核細胞釋放的基礎TNFa從328pg/ml提高至 7，258pg/ml。 R，R-格隆溴銨單獨沒有影響LPS-誘導的TNF(x釋放，直 至l(Vno1/1。 PDE4抑制劑咯利普蘭以濃度依賴性方式抑制了 TNFa的 釋放。咯利普蘭的1(:35值等于68. 9±15. 2nmo1/1。同時加入10nmo1/1 R，R-格隆溴銨令人驚訝地和高度顯著地將IC35降低至1.70±1.18nM
(p=0. 0151 )。
這些結果表明R， R-格隆溴銨以超加性方式顯著地和令人驚訝地 增強了 PDE4抑制劑的抗炎活性。
抗膽堿能藥和吸入/口服PDE4抑制劑兩者均可有效地用于治療各 種馬的氣道疾病。激活的嗜中性粒細胞慕集至COPD馬的肺，可以引起 炎癥和肺損傷。已經證明PDE4抑制劑可以降低C0PD馬體內的嗜中性 粒細胞活化(Rickards等，J Vet Pharmacol Ther 2001; 24: 275-81 )。
本發明涉及的聯合治療包括給藥PDE4抑制劑和長效抗膽堿能支 氣管擴張藥來防止肺疾病事件的發作或來治療現存的病癥和來減輕氣 道炎癥。可以以單個劑型一起給藥化合物，或以不同的劑型來給藥。 可以同時給藥，或者以接近的或遠離的時間給藥，如其中一種藥物在早上給藥，第二種藥物在晚上給藥。可以預防性地或在癥狀發作后使 用該組合。 一些情況中，該組合可用于防止肺病的進展或來停滯功能 如肺功能的衰退。
這些藥物，抗膽堿能藥和PDE4抑制劑，通常作為氣溶膠給藥，使 用或不使用推進劑，或作為吸入的粉末給藥，例如使用Novolizer 。 本發明涉及以一種傳送形式如吸入器來共同給藥兩種藥物，將兩種藥 物放入相同的吸入器中。制劑是本領域技術范圍內的(例如，含有賦 形劑如乳糖單水合物)。
活性成分可以一天給予1至8次，足以呈現所需的活性。優選， 活性組分一天給予約一次至四次，更優選一天一次或兩次。
PDE4抑制劑給藥成人的量為200至5，000ng/天，優選500至 2，000ing/天，取決于氣道炎癥的強度。PDE4抑制劑，例如羅氟司特， 可以吸入或口服給藥。吸入的抗膽堿能藥，外消旋格隆溴銨，其對映 體之一，尤其是R，R-格隆渙銨，或其非對映異構體之一，或其混合物 及其鹽、溶劑化物和水合物，給藥成人的量為5至500網/天，優選 15至300pg/天。尤其優選5至100ng/天的劑量范圍。
考慮同時或時間上非常接近地給藥兩種活性劑。或者， 一種藥物 可在早上服用， 一種在這天中的晚些時候服用。或者另一種情況中， 一種藥物每日服用兩次，另一種每日一次，與每日兩次給藥中的一次 同時或分開。優選同時一起月l用兩種藥物。
對于獸醫使用，將抗膽堿能藥，尤其是R，R-格隆溴銨，以 l-32ng/kg/天，優選4至16^g/kg/天的量，單獨或聯合給藥量為成人 4至100jtg/天，優選10至40jig/天的吸入PDE4抑制劑給予馬，取決 于氣道炎癥的強度。
通過以下的實施例來說明本發明，但不是來限制本發明。
每單次劑量5(Vg R，R-格隆溴銨和500ng AWD 12-281的粉末吸入 將50g量的微粉化R， R-格隆溴銨和100g a乳糖單水合物混合， 將混合物通過0. 5mm網孔的篩子過篩，最后再次混合。將500g微粉化的AWD 12-281和lOOOg a乳糖單水合物混合，將混合物通過0.8mm 網孔的篩子過篩，最后再次混合。將收到的兩種混合物混合并補充a 乳糖單水合物至12000g。隨后，將其再次混合并將收到的粉狀混合物 裝入每單次劑量釋放12mg粉末的粉末吸入器中。每單次劑量從粉末吸 入器中釋放5(Vg R,R-格隆溴銨和500ng AWD 12-281并提供給患者的 氣道。
權利要求
1. 局部應用的R，R-格隆溴銨或其生理學上可接受的鹽和PDE4抑制劑羅氟司特或其生理學上可接受的鹽的組合產品，用于治療支氣管哮喘或慢性阻塞性肺病。
2. 根據權利要求1的組合產品，其中R，R-格隆溴銨的日劑量為5 至500ng， PDE4抑制劑的日劑量為200至5， 00(Vg/天。
3. 根據權利要求2的組合產品，其中R，R-格隆溴銨的日劑量為15 至30(Vg, PDE4抑制劑的日劑量為500至2, 000ng/天。
4. 根據權利要求1的組合產品，其中R，R-格隆溴銨的日劑量為5 至100pg, PDE4抑制劑的日劑量為200至5， 00(Vg/天。
5. 根據權利要求4的組合產品，其中PDE4抑制劑的日劑量為500 至2， OQ(Vg/天。
6. 治療呼吸道疾病的藥物，包含局部應用的R，R-格隆溴銨或其生 理學上可接受的鹽和羅氟司特或其生理學上可接受的鹽。
7. 根據權利要求6的藥物，其中所述的呼吸道疾病為哞喘。
8. 根據權利要求6的藥物，其特征在于吸入時以合適的粒徑分散 獲得兩種活性物質。
9. 根據權利要求6的藥物，特征在于其是含或不含推進劑的可吸 入氣溶膠。
10. 根據權利要求6的藥物，特征在于其是可吸入的干粉。
11. 根據權利要求6的藥物，特征在于其是可吸入的懸浮液或溶液。
12. 根據權利要求6-11任一項的藥物，存在于吸入器中。
13. 根據權利要求6-11任一項的藥物，其特征在于活性物質存在 于固定或自由組合中，用于與常用的賦形劑一起在適于吸入應用的藥物 形式中同時、順次或分開給藥。
14. 局部應用的R， R-格隆溴銨或其生理學上可接受的鹽和羅氟司特 或其生理學上可接受的鹽相組合用于制備治療哺乳動物的哮喘或慢性 阻塞性肺病的藥物的用途。
15. 根據權利要求14的用途，其中哺乳動物是人或馬。
全文摘要
本發明涉及吸入/口服PDE4抑制劑聯合吸入抗膽堿能支氣管擴張藥(毒蕈堿受體拮抗劑)的組合，優選羅氟司特或AWD-12-281和R，R-格隆溴銨的組合，用于呼吸道疾病的癥狀治療或預防性治療，尤其是那些伴隨阻塞或炎癥的疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘。進一步包括以局部應用(吸入)制劑呈現該組合和其在吸入裝置例如Novolizer^中的應用。
文檔編號A61K9/00GK101518532SQ20091013353
公開日2009年9月2日 申請日期2005年1月24日 優先權日2004年2月6日
發明者B·法爾尼斯, I·斯澤勒尼, J·矛斯, P·J·科諾塔 申請人:Meda制藥有限及兩合公司