專利名稱：：咖啡酸3,4-二羥基苯乙酯的醫藥用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于藥學領域，涉及咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的醫藥用途，特別是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：Phytochemistry，2000;55:927-931首次公開從植物中分離得到新化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯及其化學結構，但沒有披露其生物活性。中國專利申請(公開號CN1879672A)公開了咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯體外抑制人結腸癌細胞(HCT-8)、人胃癌細胞(BGC-823)、人卵巢癌細胞(A-2780)生長和體內抗小鼠Si80的作用。但披露的瘤種和腫瘤株不夠全面，為更好的預測本化合物的臨床抗腫瘤作用，有必要進一步揭示其對其它瘤種和更多的瘤株的活性，從而進一步揭示咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯抗腫瘤的醫藥用途。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯在制備抗腫瘤藥物中的應用，以及一種含有咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的抗腫瘤藥物組合物。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的腫瘤選自消化系統腫瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中樞神經系統腫瘤，黑色素瘤或白血病；所述消化系統腫瘤選自胃癌，結腸癌，肝癌或者胰腺癌。一種抗腫瘤藥物組合物，包含治療有效量的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽，以及藥學上可接受的賦形劑或者載體，其特征在于所述的腫瘤選自消化系統腫瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中樞神經系統腫瘤，黑色素瘤或白血病；所述消化系統腫瘤選自胃癌，結腸癌，肝癌或者胰腺癌。本發明所述的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯藥學上可以接受的鹽可以是由化合物帶正電荷的部分，與具有相反電性的帶負電荷的有機或者無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、三氟乙酸、檸檬酸或者馬來酸的酸根加成的鹽；或者是由化合物帶負電荷的部分，例如羰基，與正電荷的堿或者堿土金屬例如鈉、鉀、鈣、鎂形成的鹽，或者與帶正電荷的有機堿例如甲胺、二甲胺、三甲胺所成的鹽。本文所定義的治療有效量，是指可對人和/或動物產生功能或者活性的且可被人和/或動物接受的量。本文所定義的藥學上可接受的賦形劑或者載體，是指用于治療給藥的賦形劑或者載體，它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。治療有效量的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽的用量介于0.001-500mg/kg體重/天之間，任何介于上述范圍內的用量皆為本發明的有效量。優選的，本發明的化合物的用量介于0.05-300mg/kg體重/天之間；更優選的，本發明的化合物的用量介于0.01-100mg/kg體重/天之間。所述的"治療有效量的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽"可用于腫瘤的單一用藥或者聯合用藥治療。本領域技術人員能夠理解，在實際給藥時的用量可高于或者低于上述劑量范圍。針對某一對象(如哺乳動物或者人)的"治療有效量"和具體治療方案可受諸多因素的影響，包括給藥對象的年齡、體重、一般情況、性別、飲食、給藥時間、疾病進程以及收治醫生的判斷等。本發明所述的藥物組合物可以是適合口服給藥的劑型例如片劑或者膠囊，也可以是例如以無菌溶液、懸浮液或者乳液用于胃腸外注射(包括靜脈內、皮下、肌肉內、血管內或輸注)，也可以是例如以軟膏或者乳膏用于局部給藥，也可以是例如以栓劑直腸給藥，還可以是通過直接注射進腫瘤中或者經定位輸入的途徑給藥。本發明所述的藥物組合物還可以經內窺鏡、氣管內、損傷部位、經皮、靜脈內、皮下或者腹膜內輸注。通常本發明所述的藥物組合物可以以常規方法使用本
技術領域：
已知的常規賦形劑或者載體制備。藥學上可以接受的固體賦形劑或者載體包括淀粉、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、碳酸鈉、磷酸鈣、憐酸二醇、碳酸鈣、藻酸、微晶纖維素、明膠；藥學上可以接受的液體載體包括例如無菌水、聚乙二醇、非離子表面活性劑(如羥丙基纖維素)和油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄欖油或者液體石蠟；只要適合活性成分的特性和所需要的特定給藥方式。在制備所述藥物組合物中通常使用的佐劑也可以被包括，例如調味劑、色素、防腐劑(如乙基或丙基-羥基苯甲酸酯)和抗氧化劑例如維生素E、維生素C、BHT禾卩BHA。片劑可以不包衣或者包衣以改變它們的崩解和隨后活性成分在胃腸道內的吸收或者增強它們的穩定性和/或外觀，在所述后兩種情況下可以使用本
技術領域：
已知的常規包衣劑和方法。用于口服的藥物組合物還可以是硬膠囊的形式，其中活性成分與惰性固體賦形劑例如碳酸鈣、磷酸鈣、微晶纖維或者高嶺土，或是軟膠囊的形式，其中活性成分與水或者油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄欖油或者液體石蠟混合。適于注射的藥物組合物形式包括無菌水溶液、分散液或者無菌粉(用于臨時制備無菌注射液或者分散液)。在所有情況下，這些形式必須是無菌的且必須是流體易于從注射器排出。在制備和儲存條件下必須是穩定的，且必須能防止微生物如細菌和真菌的污染和影響。載體可以是溶劑或者分散介質，例如水、醇、它們的適當混合物和植物油。中國專利申請(公開號CN1879672A)公開了MTT法測定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)對人結腸癌細胞(HCT-8)、人胃癌細胞(BGC-823)、人卵巢癌細胞(A-2780)生長抑制作用，結果證明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯能顯著抑制上述三種腫瘤細胞的生長。對S^o腹水型腫瘤小鼠，咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯有明顯的抗腫瘤作用，抑瘤率在30%和85%之間。上述體外實驗和小鼠腫瘤模型實驗的結果只能提示咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯具有開發成抗腫瘤藥物的前景。但是，人腫瘤發病機制非常復雜，人和鼠物種間存在巨大差異，咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對其它腫瘤細胞是否有抑制作用、其是否有體內抗人腫瘤的活性、其抗腫瘤的選擇性，這些問題都無法通過上述專利申請(公開號CN1879672A)公開的內容來預測，需要大量創造性的實驗來一一證明和回答。本發明所述化合物在美國國立癌癥研究所(NCI)經過5年研發建立的體外細胞篩選平臺(IVCLSP)上對包括白血病、黑色瘤、肺癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、腦瘤和前列腺癌等9種人腫瘤60種瘤株進行活性篩選，結果證明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對所有測試的瘤株均有顯著的生長抑制作用，ICso濃度在10-5-1(T7M之間，多數瘤株的ICso濃度在1(T6-1(T7M，證明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯具有比較廣譜的抗腫瘤作用。而且體外實驗還表明該化合物對正常細胞沒有毒性。本發明利用體外腫瘤細胞培養和人體腫瘤裸鼠異種移植模型證明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯體內對人消化系統惡性腫瘤，貼別是胃癌、結腸癌、肝癌有非常顯著的抑制作用，優于化療藥物順鉑。本發明用大量創造性的實驗和充足的實驗數據證明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對所篩選的腫瘤都有抑制作用，而且對中國人發病率高的消化系統惡性腫瘤，如胃癌、結腸癌有確實的體內抗腫瘤作用。含有咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯或者其前藥、藥學上可以接受的鹽的抗腫瘤藥物組合物極有可能在臨床上單獨或者與其他抗癌藥物一起發揮積極的治療作用。圖1是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的化學合成流程圖；圖2是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的氫譜圖；圖3是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的碳譜圖；圖4是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的結構示意圖；圖5是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的高效液相色譜圖6是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對9種人腫瘤57個瘤株的細胞生長的抑制作用，圖中Leukemia:白血病，Non-SmallCellLungCancer:非小細胞肺癌，ColonCancer:結腸癌，CNSCancer:中樞神經系統腫瘤，Melanoma:黑色素瘤，OvarianCancer:卵巢癌，RenalCancer:腎癌，ProstateCancer:前列腺癌，BreastCancer:乳腺癌；圖7是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人胃癌HGC27的細胞毒性；圖8是咖啡酸3，4-二輕基苯乙酯對人胃癌AGS的細胞毒性；圖9是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人胃癌MGC803的細胞毒性；圖10是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人胃癌SGC-7901的細胞毒性；圖11是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人胃癌BGC-823的細胞毒性；圖12是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人肝癌QGY7701的細胞毒性；圖13是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人肝癌SMMC7721的細胞毒性；圖14是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人肝癌Bd-7402的細胞毒性；圖15是咖啡酸3,4-二羥基苯乙酯對人肝癌HepG2的細胞毒性；圖16是咖啡酸3,4-二羥基苯乙酯對人結腸癌HCT116的細胞毒性；圖17是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人結腸癌SW-620的敏胞毒性；圖18是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對結腸癌SW-620的生長抑制作用(人體腫瘤裸鼠異種移植模型)，CADPE:咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯；CDDP:順鉑；圖19是咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)對人肝癌細胞周期傳遞的抑制作用(A:DMS0溶齊lj對照；B:CADPE25一。具體實施例方式以下結合附圖對本發明作進一步詳細描述。應當理解為，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或者按照制造廠商提供或者建議的條件。除另有定義或者說明，本文所使用的所有專業與科學術語與本領域技術人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內容相似或者均等的方法及材料皆可用于本發明中。實施例1咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的合成1、試藥3，4-二羥基苯乙酸，咖啡酸，亞硫酰氯(SOCl2)，四氫鋁化鋰(LiAlH4)，二環己基碳二亞胺(DCC)，無水甲醇，無水四氫呋喃(THF)，酒石酸，無水硫酸鈉。2、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的化學合成流程參照附圖1。3、方法(1)3，4-二羥基苯乙醇的合成將3，4-二羥基苯乙酸溶于無水甲醇中，在0t:條件下逐滴加入亞硫酰氯并攪拌15分鐘后，于室溫下放置16小時并不停攪拌。反應物經減壓濃縮后，其殘留物溶于無水四氫呋喃中，分歩加入四氫鋁化鋰后，于室溫下放置16小時并不停攪拌。反應物倒入5%酒石酸溶液中，用乙酸乙酯萃取。合并后的乙酸乙酯萃取液經無水硫酸鈉脫水后回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物。乙酸乙酯萃取物經硅膠柱層析，用環己垸和乙酸乙酯的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用薄層層析(TLC)在紫外燈下檢測每一流份，將含有3，4-二羥基苯乙醇的洗脫液合并后回收有機溶劑得到3，4-二羥基苯乙醇。(2)咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的合成將咖啡酸和3，4-二羥基苯乙醇溶解于無水四氫呋喃中，然后加入二環己基碳二亞胺。其混合物在室溫下攪拌8小時，加入微量蒸餾水繼續攪拌15分鐘。濾過，濾液在6(TC下減壓濃縮得棕色稠狀溶液。該棕色稠狀溶液經硅膠柱層析，用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作洗脫液，分段收集洗脫液，用TLC在紫外燈下檢測各流份，將含有咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的各流份合并后回收有機溶劑得化合物咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯。所合成的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯為無定形粉末，溶于甲醇和乙醇中，三氯化鐵反應陽性；紫外燈下顯藍色熒光。UV(MeOH，Xmax)212，223，251(肩峰)，293，326認；IR(KBr，cm-l)3429，1693，1606,1524，1448，1384，1263，1162，1116，1056;HRESIMS:m/z339.08408[M+Na]+(calcdforC17H16Na06,339.08446)。'H(附圖2)和"C-NMR(附圖3):數據見表1。表1、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的氫和碳譜數據(Sppm，inMeOD-d4)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯具有如附圖4所示的結構，化學名稱為3-(3，4-dihydroxyphenyl)-acrylicacid2-(3，4-dihydroxyphenyl)-ethylester。實施例2咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯含量測定1、儀器高效液相色譜儀。2、試藥咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對照品(自制)；甲醇(色譜純)，乙酸(分析純)。色譜條件色譜柱"HypersilCI8高效液相色譜柱(250x4.6mm,5|_im);:25C;檢測波長326nm;流速1.5mL/min;流動相見表2。表2咖啡酸3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>4、對照品溶液的制備精密稱取在6(TC真空千燥后的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對照品25.0mg，置25ml容量瓶中，力B70%乙醇20ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。5、供試品溶液的制備精密稱取在6(TC真空干燥后的如實施例1所述合成的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯樣品50mg,置50ml容量瓶中，力n70。/o乙醇35ml，置水浴上微熱溶解，放冷，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。6、樣品測定取濃度為1.0mg/mL的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯供試品溶液10|aL進樣，在前述色譜條件下測定咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的峰面積，并計算咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的含量，HPLC譜圖見附圖5。本發明用實施例所述方法合成的咖啡酸3,4-二羥基苯乙酯的含量為93.2%(n=3,SD=0.22)。實施例3咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)體外對人惡性腫瘤白血病、黑色瘤、肺癌、腎癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、腦瘤和前列腺癌的生長抑制作用咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的體外細胞抗腫瘤活性由美國國立癌癥研究所(NCI)測定。其方法采用美國國立癌癥研究所(NCI)建立的標準方法(NationalCancerInstitute.DTPHumanTumorCellLineScreen,http:〃dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html)。由NCI經過5年建立的體外細胞篩選項目(IVCLSP)包括白血病、黑色瘤、肺癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、腦瘤和前列腺癌9種人腫瘤60種瘤株(注我國發病率和死亡率高的肝癌和胃癌未包括在NCI的IVCLSP中)。NCI測定了咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對以上9種人腫瘤57種瘤株的活性，每個細胞株測定5個不同濃度(10—4-10—8M)。實驗結果證明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對所有測試的瘤株均有顯著的生長抑制作用，ICso濃度在l(T5-l(T7M之間，多數瘤株的ICso濃度在10'6-1(T7M，實驗結果見表3和附圖6。表3咖啡酸3，4-二二羥基苯乙酯的體外抗癌活性細胞ic50細Bfnic50jag/mL細胞pg/mL白血病卵巢癌CCRF-CEM0.7470,.236IGROV12.860O.節HL國60(TB)2.5400.794OVCAR-35.1701.635K-5621.5600,.493OVCAR-47.3702.331M0LT陽43.0600,.968OVCAR-5>50>15.80RPMI-82260.6280,.199OVCAR-89.3202.948SR1.4900.,471SK-OV-313.704.333肺癌腎癌A549/ATCC17.705..599786-013.504.270EKVX14.904.,713A4988.0502.546HOP-6229.109.204AC頭2.9400.930HOP-920.7900.250CAK1-110.603.353NCI-H22613.304.207RXF-39315.504.903NCI-H2311.603.669SN12C9.0902.875NCI-H322M28.108.888TK-1028.108.888NCI-H46014.804.681UO-311.7500.554NCI-H5221.2600.399前列腺癌結腸癌DU-1459.7503.084COLO20518.805.946CNS癌HCC-299814.604.■618SF-2686.9302.192HCT-11611.203..543SF-29516.105.09HCT-152.2500,.712SF-5395.8301.844HT2928.509,.015SNB-1915.504.903KM127.9202,.505SNB-759.5003.005SW-62010.203.230U2518.8602.802惡性黑色瘤乳腺癌LOXIMVI6.3802,.018MCF73.861.221MALME-3M18.605883NCI/ADR-RES10.903.448SK-^tEL-23.0200.955MDA-MB-CC■231/AT11.103.511SK-MEL-286.5102.059HS578T9.753.084SK-MEL-58.1202568MDA-MB--4354.011.268UACC-25715.404.871BT-5498.672.742UACC-625.3301■686T-47D11.303.574實施例4咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)對人惡性胃癌細胞的抑制作用培養24小時的人胃癌細胞株HGC27，AGS,MGC803，SGC-7901(低分化)及BGC-823(低分化)在含不同濃度的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯的培養基中再培養72小時。用磺基羅丹明B(SulforhodamineB,SRB)染色分析方法測定細胞活力，用LiveandDeadassay檢測死亡細胞。實驗結果表明咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯低濃度可顯著抑制以上4種腫瘤細胞的增殖；隨著濃度的增加，咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯可直接殺死腫瘤細胞(見附圖7-11)，而且對正常細胞無毒性。實施例5咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)對人肝癌細胞的抑制作用用實施例4同樣的方法測定了咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人肝癌細胞株QGY-7701、SMMC-7721、Bel-7402禾BHepG2的細胞毒性。試驗結果證實咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對所測定過的4株人肝癌細胞均有非常顯著的毒性(見附圖12-15)。實施例6咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)對人結腸癌細胞的抑制作用用實施例4同樣的方法測定了咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對人結腸癌細胞株HCT-116和SW-620的細胞毒性。試驗結果與NCI試驗完全一致，在低能濃度(10nM)可完全抑制腫瘤細胞生長。隨著濃度的增加咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯可直接殺死腫瘤細胞(見附圖16-17)。實施例7咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(CADPE)對裸鼠異種移植人結腸癌的抑制作用人結腸癌(5xl06SW-620)接種于6周齡裸鼠(雌雄各半)背部皮下，于IO天后(此時腫瘤長至100-200mm"動物分為以下3組DMSO溶劑對照組、順鉬(CDDP)治療組(5mg/kg，ip)和CADPE治療組(5mg/kg,ip)，每組5只動物，每天給藥一次，每2天用測量直徑器測量腫瘤大小，連續24天。順鉑可部分抑制人結腸癌SW-620的生長；而咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯可非常顯著地抑制人結腸癌的生長(見附圖18),作用明顯優于化療藥物順鉑。實施例8咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯抑制腫瘤細胞周期傳遞于S期咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯對所有測定過的腫瘤細胞株包括人胃癌11SGC-7901,人肝癌Bel-7402和人結腸癌SW-620的細胞周期均有非常顯著的抑制作用。對人肝癌Bel-7402細胞，溶劑對照組(DMS0)G2期細胞為6.86%，S期細胞為22.2%;咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯10、25、50和100juM組，G2期細胞均為零，S期細胞分別為41.46%、42.02%、48.04禾t!41.8%。以上數據證明，低劑量咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯(10pM)即可完全抑制腫瘤細胞周期傳遞于S期(見附圖19)。權利要求1、咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的腫瘤選自消化系統腫瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中樞神經系統腫瘤，黑色素瘤或白血病。2、根據權利要求1所述的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述的消化系統腫瘤選自胃癌，結腸癌，肝癌或者胰腺癌。3、一種抗腫瘤藥物組合物，包含治療有效量的咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽，以及藥學上可接受的賦形劑或者載體，其特征在于所述的腫瘤選自消化系統腫瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，甜列腺癌，中樞神經系統腫瘤，黑色素瘤或白血病。4、根據權利要求3所述的抗腫瘤藥物組合物，其特征在于所述的消化系統腫瘤選自胃癌，結腸癌，肝癌或者胰腺癌。全文摘要本發明公開了咖啡酸3，4-二羥基苯乙酯、其前藥或者藥學上可以接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述腫瘤選自消化系統腫瘤，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，中樞神經系統腫瘤，黑色素瘤或白血病；所述消化系統腫瘤特別是指胃癌，結腸癌，肝癌或者胰腺癌。文檔編號A61P35/02GK101502506SQ200910114960公開日2009年8月12日申請日期2009年2月24日優先權日2009年2月24日發明者張治針,連曉媛申請人:連曉媛