專利名稱：一種滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，具體是一種滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法。
背景技術：
滇桂艾納香系菊科艾納香屬植物，《中華藥海》中記載，滇桂艾納香性味歸經淡、 甘平，入肝、腎、膀胱三經；功效主治活血止血-本品甘淡入肝，養肝活血、質澀，收斂止血， 具有活血不傷血、止血不留瘀之功，可用于各種出血癥；《新華本草綱要》中也提到其活血、 止血功能，可用于經期提前，產后血崩等婦科出血癥狀。 滇桂艾納香做為廣西民間用藥已有較長的歷史，在民間均以水煎湯劑服用，用于 治療婦女功能性子宮出血，產后出血等癥有獨特的療效。目前以滇桂艾納香開發的中成藥 物主要是廣西南寧桂西制藥廠生產的婦血康顆粒，婦血康膠囊等藥品。因此，滇桂艾納香是 一個極具開發利用價值的民間中草藥。國內各學科領域的專家學者對該植物所含化學成分 和藥物作用展開了大量的研究工作。從中發現了豆甾醇、表木栓醇、木栓酮、棕桐酸乙酯、 十八酸乙酯、咖啡酸、13 -谷甾醇、小麥黃素、小麥黃素7-0-13 -D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、芹 菜素7-0-13 -D-吡喃葡萄糖苷、木犀草、木犀草素7-0-13 -D-吡喃葡萄糖苷等化合物。但目 前國內外仍少見有關滇桂艾納香具體化學成分在藥理活性方面的研究報告。特別是對滇桂 艾納香植物所含多糖類物質的相關研究還非常有限。 各種研究表明，糖類物質具有多樣的生物功能，如在抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗衰 老、降血糖等方面具有獨特功效。由于多糖的生物活性非常廣泛且細胞毒性作用小，在癌癥 治療、糖尿病治療和抗病毒感染等多種疾病方面有相當顯著的治療效果。人們對多糖，特別 是中藥多糖進行了深入的研究和應用，其生物學意義受到了廣泛關注，成為醫藥界熱點領 域之一。
發明內容
本發明提供一種從滇桂艾納香植物中提取滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法。以
便于明確滇桂艾納香在治療婦女功能性子宮出血、產后出血等癥中發揮止血作用的具體化
學成分，為滇桂艾納香植物的進一步研究和藥物開發利用提供參考依據。 本發明為了解決上述技術問題的技術方案如下 滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法之一，包括如下步驟 (1)提取將滇桂艾納香干藥材每次加入15倍重量的去離子水或蒸餾水煎煮，共2 次，每次3小時，過濾，合并濾液。 (2)膜分離將提取的濾液用中空管狀陶瓷微濾膜及中空管狀有機超濾膜進行微 濾和超濾分離，得到分子量范圍在103至104之間的分離液，將該分離液用旋轉蒸發儀601: 減壓濃縮至約0. lg/mL。 (3)脫蛋白在冰浴及攪拌條件下，加入重量濃度為20%三氯乙酸水溶液，使多糖 溶液體系中三氯乙酸的重量濃度達到5%，靜置過夜后離心去除植物蛋白沉淀。
(4)除鹽離心后的上清液用lmol/L的Na0H溶液中和至pH等于7;減壓濃縮至 約0. 2 0. 5g/mL，冷卻至室溫后加無水乙醇至溶液中乙醇的濃度為75 80%，在5t:冰 箱中靜置使鹽沉淀，離心分離除去沉淀的三氯乙酸納鹽；將上清液減壓蒸干除去乙醇后，用 100mL去離子水或蒸餾水溶解。 (5)脫色將上述脫鹽及去除乙醇后的多糖溶液，以DEAE陰離子交換柱色譜脫色 分離，用去離子水洗脫多糖，收集含糖溶液，減壓濃縮至糖含量O. 5g/mL，經冷凍干燥得初步 純化的棕黃色絮狀粗多糖。 (6)精制將(5)的粗多糖溶于10mL去離子水中，用0.45iim微孔過濾膜減壓過 濾后，過S印hadex G-10凝膠色譜分離去除殘余的鹽份和其他小分子雜質，再利用S印hadex G-50凝膠色譜進行純化，以超純水為流動相，經自動部分接收器定量接收，紫外光譜檢測， 合并單峰部分溶液，將該溶液減壓濃縮至糖含量0. 5 1. Og/mL，經冷凍干燥，獲得得精制 的滇桂艾納香水溶性多糖。 滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法之二，包括如下步驟 (1)提取將滇桂艾納香干藥材每次加入10倍重量的去離子水或蒸餾水煎煮，共3 次，每次2小時，過濾，合并濾液。 (2)膜分離將提取的濾液用中空管狀陶瓷微濾膜及中空管狀有機超濾膜進行微 濾和超濾分離，得到分子量范圍在103至104之間的分離液，將該分離液減壓濃縮至約0. 2g/ mL。 (3)脫蛋白在冰浴條件下，邊攪拌邊加濃度為20%三氯乙酸水溶液，使三氯乙 酸的濃度達到5%，在5t:冰箱中靜置過夜后離心去除植物蛋白沉淀；上清液用lmol/L的 NaOH溶液中和至pH等于7，減壓濃縮后過濾除去沉淀的鹽分。 (4)硅膠柱色譜分離將脫蛋白后的多糖濃縮溶液約O. 5g/mL。，均勻拌入200目硅 膠減壓蒸干后，干法上樣過硅膠柱，用甲醇和乙酸乙酯按不同比例混合的溶液體系梯度洗 脫。收集含糖部分洗脫液，減壓蒸干除完甲醇和乙酸乙酯后用約50mL的水溶解并過濾，經 冷凍干燥得初步純化的棕黃色粗多糖。 (5)脫色將粗多糖溶于5倍重量的去離子水。以DEAE陰離子交換柱色譜脫色分 離，用去離子水洗脫多糖。收集含糖溶液，減壓濃縮至約O. lg/mL。 (6)透析將脫色的多糖濃縮液用截留分子量為103Da的透析袋流水透析48h，去 離子水透析24h，除去鹽及小分子量雜質。減壓濃縮透析袋內溶液至0. 5 1. Og/mL。
(7)精制將多糖濃縮液用0.45iim微孔過濾膜減壓過濾后，再利用S印hadex G-50凝膠色譜進一步純化，以超純水為流動相，經自動部分接收器定量接收，紫外光譜檢 測，合并單峰部分溶液，減壓濃縮后冷凍干燥，獲得精制的滇桂艾納香水溶性多糖。
上述制備方法之一和制備方法之二中，所述步驟(2)膜分離所用膜分離設備為 合肥世杰膜工程有限責任公司生產，陶瓷微濾膜的截留分子量為1050&，有機超濾膜的截留 分子量分別為10勺a和103Da。 上述制備方法之一和制備方法之二中，所述減壓濃縮均利用旋轉蒸發儀在不高于 6(TC條件下減壓蒸發濃縮。 上述制備方法之一和制備方法之二制備的滇桂艾納香水溶性多糖的特征為(a) 滇桂艾納香多糖外觀為白色棉狀固體，是分子量分布均一的單純組分，其數均分子量和重均分子量分別為2654和2716 ; (b)滇桂艾納香水溶性多糖由甘露糖和果糖組成。 上述制備方法之一和制備方法之二制備的滇桂艾納香水溶性多糖具有止血功能，
可用于治療婦女功能性子宮出血、產后出血等癥。 本發明的優點是 1.本發明結合使用膜分離、硅膠柱色譜及凝膠柱色譜等方法分離純化水溶性多 糖，具有工藝流程簡單、節約能耗等優點。 2.產物純度較高，質量穩定；特別是在凝血復鈣實驗和小白鼠離體子宮實驗中具 備顯著的止血活性作用。
圖1是本發明滇桂艾納香水溶性多糖的GPC凝膠滲透色譜圖。
圖2是本發明滇桂艾納香水溶性多糖的紫外圖譜。
圖3是本發明滇桂艾納香水溶性多糖的紅外圖譜。
圖4是本發明滇桂艾納香水溶性多糖的高效液相色譜。
圖5是標準單糖的高效液相色譜。
具體實施例方式
對本發明滇桂艾納香水溶性多糖的成分分析
1.滇桂艾納香水溶性多糖分子量分布測試 對滇桂艾納香水溶性多糖采用凝膠滲透色譜(GPC)分析，如.圖1所示，單一對 稱峰型表明該多糖是分子量分布均一單純組份，用已知分子量的多糖為標樣，并且建立GPC 校正曲線。根據標準校正曲線求得該多糖的數均分子量和重均分子量分別為2654和2716。
2.紫外光譜檢測 對滇桂艾納香水溶性多糖進行紫外光譜檢測取滇桂艾納香多糖約lmg，加適量 水溶解，在波長200 600nm范圍內進行掃描，以去離子水作為空白。經紫外掃描280nm處 無吸收，如圖2所示，確定不含有多肽、蛋白質。
3.紅外光譜檢測 對滇桂艾納香水溶性多糖進行紅外光譜檢測取純化干燥的滇桂艾納香水溶性多 糖樣品約2mg，加適量KBr研磨至細，壓片，測定紅外光譜。如圖3所示，圖譜顯示滇桂艾納 香水溶性多糖在4000 500cm—1范圍內具有P -呋喃糖類物質的特征吸收峰。
4.單糖組成分析 對滇桂艾納香水溶性多糖進行單糖組成分析滇桂艾納香水溶性多糖經硫酸完全 水解后，利用高效液相色譜分析如圖4所示。通過與D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、L-鼠 李糖等單糖標品對照，如圖5所示，證實滇桂艾納香水溶性多糖由果糖和甘露糖構成。
下面結合實本發明的二個實施例對本發明作詳細說明。但需要說明的是，實施例
并不構成對本發明要求保護范圍的限制。
實施例1 滇桂艾納香水溶性多糖制備方法一，操作步驟依次如下 1.提取將3. Okg滇桂艾納香干藥材每次加入15倍重量的去離子水煎煮2次，每
6次3小時，過濾，合并濾液。 2.膜分離利用膜分離設備進行粗分，將步驟1提取的濾液過截留分子量為105Da 的陶瓷膜，分子量小于105Da的濾液通過截留分子量為104Da的有機膜，濾液繼續通過截留 分子量為103Da的有機膜，得到分子量范圍在103至104之間的截留液，減壓濃縮至500mL。
(3)脫蛋白在冰浴及攪拌條件下加入重量濃度為20%的三氯乙酸水溶液約 170mL，使溶液體系中三氯乙酸重量濃度為5% ， 5t:冰箱靜置過夜后離心去除沉淀的植物蛋 白。 4.除鹽脫蛋白后的上清液用lmol/L的NaOH溶液中和至pH值等于7，濃縮多糖 溶液至至糖含量0. 5g/mL，冷卻至室溫后加無水乙醇至溶液的乙醇濃度約為75 80%，使 三氯乙酸鈉鹽沉淀，于5t:冰箱靜置12h，離心除去沉淀的鹽份。將上清液減壓蒸干除去乙 醇后，用lOOmL去離子水或蒸餾水溶解。 5.脫色將上述脫鹽及去除乙醇后的多糖溶液以DEAE陰離子交換柱色譜脫色。以 去離子水洗脫多糖成分。減壓濃縮至糖含量約O. 5g/mL。經冷凍干燥得4g初步純化的淺黃 色絮狀粗多糖。6.精制將脫色完全的粗多糖溶于約10mL去離子水，用0. 45 y m的微孔過濾膜減 壓過濾后，過S印hadexG-lO凝膠柱色譜，分離去除殘余的鹽份和其他小分子雜質，再利用 S印hadex G-50凝膠色譜進行純化，以超純水為流動相，經自動部分接收器定量接收，紫外 光譜檢測。合并單峰部分溶液，冷凍干燥，得2. 70g純凈的滇桂艾納香水溶性多糖。
實施例2 滇桂艾納香水溶性多糖制備方法二，操作步驟依次如下 1.提取將3. Okg滇桂艾納香干藥材每次加入10倍重量的蒸餾水煎煮3次，每次 2小時，過濾，合并濾液。 2.膜分離利用膜分離設備進行粗分，將步驟1提取的濾液過截留分子量為105Da 的陶瓷膜，分子量小于105Da的濾液通過截留分子量為104Da的有機膜，濾液繼續通過截留 分子量為103Da的有機膜，得到分子量范圍在103至104之間的截留液，減壓濃縮至500mL。
3.脫蛋白在冰浴條件下，邊攪拌邊加重量濃度為20%三氯乙酸水溶液約170mL， 使三氯乙酸的重量濃度達到5%，冰箱靜置過夜后離心去除沉淀的植物蛋白。上清液用 lmol/L的NaOH溶液中和，濃縮至50mL約0. 2克g/mL后過濾除去沉淀的鹽分。
4.硅膠柱色譜分離將脫蛋白的多糖濃縮液約0. 5g/mL，均勻拌入100g硅膠(200
目)減壓蒸干，干法上樣過硅膠柱，用甲醇和乙酸乙酯按i : 4、2 : 3、3 : 2和4 : i不同 比例的混合體系梯度洗脫。收集合并甲醇、乙酸乙酯為4 : i的流動相洗脫的含糖溶液，減
壓蒸干甲醇和乙酸乙酯后用約50mL水溶解并過濾，經冷凍干燥得6g初步純化的棕黃色粗 多糖。 5.脫色將粗多糖溶于30mL去離子水，以DEAE陰離子交換柱色譜脫色。以去離 子水洗脫水溶性多糖。收集含糖溶液并減壓濃縮至80mL。 6.透析將脫色的多糖濃縮液用透析袋截留分子量為103Da流水透析48h，去離子 水透析24h，除鹽及小分子量雜質。將透析袋內溶液減壓濃縮至10mL。
7.精制將多糖濃縮液用0. 45iim的微孔過濾膜減壓過濾后再利用S印hadex G-50凝膠色譜進一步純化，以超純水為流動相，經自動部分接收器定量接收，紫外光譜檢
7合并單峰部分溶液，濃縮后冷凍干燥，獲得3. 15g純凈的滇桂艾納香水溶性多糖:
權利要求
一種滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法之一，其特征在于包括如下步驟(1)提取將滇桂艾納香干藥材每次加入15倍重量的去離子水或蒸餾水煎煮，共2次，每次3小時，過濾，合并濾液；(2)膜分離將提取的濾液用中空管狀陶瓷微濾膜及中空管狀有機超濾膜進行微濾和超濾分離，得到分子量范圍在103至104之間的分離液，將該分離液用旋轉蒸發儀60℃減壓濃縮至約0.1g/mL；(3)脫蛋白在冰浴及攪拌條件下，加入重量濃度為20％的三氯乙酸水溶液，使多糖溶液體系中三氯乙酸的重量濃度達到5％，靜置過夜后離心去除植物蛋白沉淀；(4)除鹽離心后的上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH等于7；減壓濃縮至約0.2～0.5g/mL，冷卻至室溫后加無水乙醇至溶液中乙醇的濃度為75～80％，在5℃冰箱中靜置使鹽沉淀，離心分離除去沉淀的三氯乙酸納鹽；將上清液減壓蒸干除去乙醇后，用100mL去離子水或蒸餾水溶解；(5)脫色將上述脫鹽及去除乙醇后的多糖溶液，以DEAE陰離子交換柱色譜脫色分離，用去離子水洗脫多糖，收集含糖溶液，減壓濃縮至糖含量0.5g/mL，經冷凍干燥得初步純化的棕黃色絮狀粗多糖；(6)精制將(5)的粗多糖溶于10mL去離子水中，用0.45μm微孔過濾膜減壓過濾后，過Sephadex G-10凝膠色譜分離去除殘余的鹽份和其他小分子雜質，再利用Sephadex G-50凝膠色譜進行純化，以超純水為流動相，經自動部分接收器定量接收，紫外光譜檢測，合并單峰部分溶液，將該溶液減壓濃縮至糖含量0.5～1.0g/mL，經冷凍干燥，獲得得精制的滇桂艾納香水溶性多糖。
2. —種滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法之二，其特征在于包括如下步驟(1) 提取將滇桂艾納香干藥材每次加入10倍重量的去離子水或蒸餾水煎煮，共3次， 每次2小時，過濾，合并濾液；(2) 膜分離將提取的濾液用中空管狀陶瓷微濾膜及中空管狀有機超濾膜進行微濾和 超濾分離，得到分子量范圍在103至104之間的分離液，將該分離液減壓濃縮至約0. 2g/mL ;(3) 脫蛋白在冰浴條件下，邊攪拌邊加濃度為20%三氯乙酸水溶液，使三氯乙酸的濃 度達到5%，在5t:冰箱中靜置過夜后離心去除植物蛋白沉淀；上清液用lmol/L的NaOH溶 液中和至pH等于7，減壓濃縮后過濾除去沉淀的鹽分；(4) 硅膠柱色譜分離將脫蛋白后的多糖濃縮溶液約O. 5g/mL。，均勻拌入200目的硅膠 減壓蒸干后，干法上樣過硅膠柱，用甲醇和乙酸乙酯按不同比例混合的溶液體系梯度洗脫。 收集含糖部分洗脫液，減壓蒸干除完甲醇和乙酸乙酯后用約50mL的水溶解并過濾，經冷凍 干燥得初步純化的棕黃色粗多糖；(5) 脫色將粗多糖溶于5倍重量的去離子水。以DEAE陰離子交換柱色譜脫色分離， 用去離子水洗脫多糖。收集含糖溶液，減壓濃縮至約0. lg/mL ;(6) 透析將脫色的多糖濃縮液用截留分子量為103Da的透析袋流水透析48h，去離子 水透析24h，除去鹽及小分子量雜質。減壓濃縮透析袋內溶液至0. 5 1. Og/mL ;(7) 精制將多糖濃縮液用0. 45 ii m微孔過濾膜減壓過濾后，再利用S印hadex G-50凝 膠色譜進一步純化，以超純水為流動相，經自動部分接收器定量接收，紫外光譜檢測，合并 單峰部分溶液，減壓濃縮后冷凍干燥，獲得精制的滇桂艾納香水溶性多糖。
3. 根據權利要求1或權利要求2所述一種具有止血活性作用的滇桂艾納香水溶性多糖 的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)膜分離所用陶瓷微濾膜的截留分子量為105Da，有 機超濾膜的截留分子量分別為104Da和103Da。
4. 根據權利要求1或權利要求2所述一種具有止血活性作用的滇桂艾納香水溶性多糖 的制備方法，其特征在于，所述減壓濃縮均利用旋轉蒸發儀在不高于6(TC條件下減壓蒸發 濃縮。
5. 根據權利要求1或權利要求2所述的一種具有止血活性作用的滇桂艾納香水溶性多 糖的制備方法，其特征在于，該方法制備的滇桂艾納香水溶性多糖的特征為(a)滇桂艾納 香多糖外觀為白色棉狀固體，是分子量分布均一的單純組分，其數均分子量和重均分子量 分別為2654和2716 ; (b)滇桂艾納香水溶性多糖由甘露糖和果糖組成。
6. 根據權利要求1或權利要求2所述的一種具有止血活性作用的滇桂艾納香水溶性多 糖的制備方法，其特征在于，該方法制備的滇桂艾納香水溶性多糖具有止血功能，可用于治 療婦女功能性子宮出血、產后出血等癥。
全文摘要
本發明公開了一種滇桂艾納香水溶性多糖的制備方法。該方法之一包括提取、膜分離、脫蛋白、除鹽、脫色、精制和精制。該方法之二包括提取、膜分離、脫蛋白、硅膠柱色譜分離、脫色、透析和精制。本發明具有工藝流程簡單、節約能耗、產物純度較高，質量穩定等優點。特別是本發明產品在凝血復鈣實驗和小白鼠離體子宮實驗中具備顯著的止血活性作用。
文檔編號A61K36/28GK101709093SQ200910114640
公開日2010年5月19日 申請日期2009年12月17日 優先權日2009年12月17日
發明者廖敏富, 林翠梧, 許子競, 黃麗 申請人:廣西大學