專利名稱：環(huán)氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物環(huán)氧二烯(Mycoepoxydiene，縮寫(xiě)為MycoE)，尤其是涉及一種環(huán) 氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)：
炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，機(jī)體通過(guò)多種途徑對(duì)其進(jìn)行精密的調(diào)控， 但是當(dāng)炎癥反應(yīng)不可控時(shí)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多種疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、 炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases)、神經(jīng)退化性疾病(neurodegenerative disorders)及 膿毒性休克(septic shock syndrome)等等，長(zhǎng)期的炎癥反應(yīng)刺激還會(huì)誘發(fā)機(jī)體癌變，這些都 嚴(yán)重威脅著人們的身心健康(Monaco, et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2004, 3， 35-42; Schwartsburd et al.， et al.， Cancer Metastasis Rev， 2003， 22， 95-102)，因此對(duì)機(jī)體過(guò)激的炎癥反應(yīng) 進(jìn)行有效的控制是目前開(kāi)發(fā)治療這些疾病藥物的主要靶向。
研究表明，上述疾病中的炎癥反應(yīng)雖然所表現(xiàn)的癥狀不同，但是介導(dǎo)這些炎癥反應(yīng)的介 質(zhì)是相同的，如腫瘤壞死因子-a(Tumour necrosis factor-a， TNF-a)、白介素-ip(Interleukin-l卩， IL-lp)、白介素-6 (IL-6)等促炎癥介質(zhì)；巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-la(macrophage inflammatory protein, MIP)、 MIP-l(3及IL-8等趨化因子； 一氧化氮(NO)、自由基(free radicals)等毒性 分子在炎癥反應(yīng)中都被誘導(dǎo)表達(dá)，從而加劇機(jī)體的炎癥程度(Heller et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94, 2150-2155; Feldmann et al.， Nat Med， 2003， 9， 1245-1250)，因此對(duì)這些促炎癥介 質(zhì)進(jìn)行抑制將有助于改善機(jī)體的炎癥反應(yīng)。
目前，吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林(aspirin)等非固醇類抗炎藥物(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)已經(jīng)廣泛地用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥相關(guān)的疾病 (Dayetal.，MedJAust， 1988， 148,195-199)，但是所用的NSAIDs—般都具有副作用，長(zhǎng)期服 用后會(huì)導(dǎo)致胃腸損傷及腎功能不正常等癥狀(Lichtenberger et al., Nat Med, 1995, 1， 154-158; Fernandez et al., Nat Med, 1995， 1, 602-603 )。因此，需要進(jìn)一步尋找有效抑制炎癥反應(yīng)的化合 物，為以后開(kāi)發(fā)低副作用的抗炎藥物提供新的思路。
化合物MycoE最早見(jiàn)于1999年的報(bào)道(Cai et al., Tetrahedron Letters, 1999， 40, 1479-1482)，它從一株稀有真菌OS-F66617發(fā)酵液中分離得到，但文獻(xiàn)未報(bào)道其具有抗炎癥生理活性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑的應(yīng)用，特別是在制備治療 內(nèi)毒素休克等由促炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
環(huán)氧二烯可作為促炎癥介質(zhì)抑制劑，所述環(huán)氧二烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為<image>image see original document page 4</image>環(huán)氧二烯的化學(xué)式為C16H1805，分子量為290.12。
所述環(huán)氧二烯可以來(lái)源于真菌發(fā)酵產(chǎn)物或化學(xué)合成。
所述環(huán)氧二烯可用于制備治療內(nèi)毒素休克由促炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥性疾病藥物。 所述炎癥性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、神經(jīng)退化性疾病、膿毒性休克等。 經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，環(huán)氧二烯能在體內(nèi)、外有效地抑制促炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-a(TNFa)、 白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、白細(xì)胞介素-lp和一氧化氮(NO)的表達(dá)，可作為促炎癥介質(zhì)抑制劑 用于制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、神經(jīng)退化性疾病、膿毒性休克等由促炎癥介質(zhì) 介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物。
圖1為MTT法檢測(cè)Mycoepoxydiene對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在圖1中，橫坐標(biāo) 為MycoE的濃度梯度(nmol/L)，縱坐標(biāo)為560 nm處的吸光度值(560nm)。 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明MycoE對(duì)RAW264.7細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性；圖中MycoE濃度為0的組為DMSO空白 對(duì)照組。
圖2為MTT法檢測(cè)在細(xì)菌脂多糖刺激下Mycoepoxydiene對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。 在圖2中，橫坐標(biāo)為MycoE的濃度梯度(^imol/L)，縱坐標(biāo)為560nm處的吸光度值(560nm); MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在細(xì)菌脂多糖刺激下MycoE對(duì)RAW264.7細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性；圖中 MycoE濃度為0的組為DMSO空白對(duì)照組，LPS濃度為100 ng/mL。
圖3為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)TNF-a表達(dá) 的影響。在圖3中，橫坐標(biāo)為MycoE的濃度梯度(pmol/L)，縱坐標(biāo)為T(mén)NF-a的濃度(pg/mL);MycoE在1、 5、 10 pmol/L濃度下對(duì)經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)TNF-a 表達(dá)具有明顯的抑制作用；圖中MycoE濃度為0的組為DMSO空白對(duì)照組，其他濃度組分 別與DMSO組進(jìn)行t檢驗(yàn)；*表示/ <0.05， **表示; <0.01。
圖4為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)IL-1卩表達(dá)的 影響。在圖4中，橫坐標(biāo)為MycoE的濃度梯度(nmol/L)，縱坐標(biāo)為IL-1(3的濃度(pg/網(wǎng)protein); MycoE在5和10 pmol/L濃度下對(duì)經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)IL-1(5 表達(dá)具有明顯的抑制作用；圖中MycoE濃度為0的組為DMSO空白對(duì)照組，其他濃度組分 別與DMSO組進(jìn)行t檢驗(yàn)；*表示/ <0.05， **表示; <0.01。
圖5為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)IL-6表達(dá)的 影響。在圖5中，橫坐標(biāo)為MycoE的濃度梯度(pmol/L)，縱坐標(biāo)為IL-6的濃度(pg/mL); MycoE在5和10 pmol/L濃度下對(duì)經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)IL-6表 達(dá)具有明顯的抑制作用；圖中MycoE濃度為0的組為DMSO空白對(duì)照組，其他濃度組分別 與DMSO組進(jìn)行t檢驗(yàn)；**表示；t<0.01 。
圖6為Mycoepoxydiene對(duì)不同濃度細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì) TNF-a表達(dá)的影響。在圖6中，橫坐標(biāo)為細(xì)菌脂多糖的濃度梯度(ng/mL)，縱坐標(biāo)為T(mén)NF-a 的濃度(pg/mL); MycoE在10 pmol/L濃度下對(duì)經(jīng)不同濃度細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì) 胞中促炎癥介質(zhì)TNF-a表達(dá)具有明顯的抑制作用；圖中LPS組分別與LPS+MycoE組進(jìn)行t 檢驗(yàn)，MycoE濃度為10 pmol/L; **表示/ <0.01; 口為L(zhǎng)PS,國(guó)為L(zhǎng)PS+MycoE。
圖7為Mycoepoxydiene對(duì)不同濃度細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)IL-1 p 表達(dá)的影響。在圖7中，橫坐標(biāo)為細(xì)菌脂多糖的濃度梯度(ng/mL)，縱坐標(biāo)為IL-lp的濃度 (pg/Hg protein); MycoE在10 nmol/L濃度下對(duì)經(jīng)不同濃度細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì) 胞中促炎癥介質(zhì)IL-lp表達(dá)具有明顯的抑制作用；圖中LPS組分別與LPS+MycoE組進(jìn)行t 檢驗(yàn)，MycoE濃度為10 nmol/L; **表示； <0.01; 口為L(zhǎng)PS,國(guó)為L(zhǎng)PS+MycoE。
圖8為Mycoepoxydiene對(duì)不同濃度細(xì)菌脂多糖剌激的RAW264.7細(xì)胞中促炎癥介質(zhì)IL-6 表達(dá)的影響。在圖8中，橫坐標(biāo)為細(xì)菌脂多糖的濃度梯度(ng/mL)，縱坐標(biāo)為IL-6的濃度 (pg/mL); MycoE在10 ^imol/L濃度下對(duì)經(jīng)不同濃度細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中促 炎癥介質(zhì)IL-6表達(dá)具有明顯的抑制作用。圖中LPS組分別與LPS+MycoE組進(jìn)行t檢驗(yàn)，MycoE 濃度為10jamol/L;"表示/K0.01; 口為L(zhǎng)PS,國(guó)為L(zhǎng)PS+MycoE。
圖9為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中NO表達(dá)的影響。在圖9 中，橫坐標(biāo)為MycoE的濃度梯度(nmol/L)，縱坐標(biāo)為NO的濃度(pmol/L)。 MycoE在5和10 nmol/L濃度下對(duì)經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中NO表達(dá)具有明顯的抑制作用； 圖中MycoE濃度為0的組為DMSO空白對(duì)照組，其他濃度組分別與DMSO組進(jìn)行t檢驗(yàn)；* 表示/ <0.05、 **表示/5<0.01。
圖10為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素休克后存活率的影響。在圖10 中，橫坐標(biāo)為細(xì)菌脂多糖的誘導(dǎo)時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為存活率(％);將MycoE以15mg/kg劑 量注射小鼠后，可有效的保護(hù)細(xì)菌脂多糖引起的小鼠內(nèi)毒素休克。
圖11為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素休克后血清IL-lp表達(dá)的影響。 在圖11中，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為IL-1(3的濃度(pg/mL);將MycoE以15 mg/kg劑量注 射小鼠后，可明顯的抑制細(xì)菌脂多糖引起的小鼠內(nèi)毒素休克中血清IL-1(3的表達(dá)；LPS組與 LPS+MyeoE組進(jìn)行t檢驗(yàn)，*表示/K0.05 。
圖12為Mycoepoxydiene對(duì)細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素休克后血清IL-6表達(dá)的影響。在 圖12中，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為IL-6的濃度(ng/mL)。將MycoE以15 mg/kg劑量注射 小鼠后，可明顯的抑制細(xì)菌脂多糖引起的小鼠內(nèi)毒素休克中血清IL-6的表達(dá)；LPS組與 LPS+MycoE組進(jìn)行t檢驗(yàn)，*表示/ <0.05 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。 實(shí)施例1、環(huán)氧二烯細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用MTT法檢測(cè)環(huán)氧二烯的細(xì)胞毒性。 試驗(yàn)方法如下
將RAW264.7細(xì)胞(lx105細(xì)胞/孔)接入96孔培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)，加入LPS (100ng/ml) 及不同濃度的MycoE (0.1、 1、 5、 10 nmol/L，用DMSO作為空白對(duì)照)共同作用24h或不 同濃度的MycoE (0.1、 1、 5、 10 pmol/L)單獨(dú)作用24h，然后加入MTT至終濃度0.5 mg/ml 作用4h,按100 nl/孔加入溶解液(10%SDS， 0.01 mol/LHCL)過(guò)夜后測(cè)定560nm處的吸光 度值(OD560)。
OD56o可反映細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，因此通過(guò)比較ODs6o值來(lái)判斷MycoE是否存在細(xì)胞毒性。 MTT法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、 2。試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)氧二烯在0.1 10 pmol/L濃度間對(duì)
RAW264.7細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性。
實(shí)施例2、環(huán)氧二烯在抑制細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用 本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞促炎癥介質(zhì)的濃度變化，從而判明環(huán)氧二烯是否可以抑制RAW264.7
細(xì)胞炎癥反應(yīng)。試驗(yàn)方法如下
1) MycoE濃度梯度。將RAW264.7細(xì)胞(1><105細(xì)胞/孔)接入96孔培養(yǎng)板，24h后 加入LPS至終濃度為100ng/ml束lj激6h，同時(shí)加入不同濃度的MycoE(O.l、 1、5、 1Opmol/L， 用DMSO作為空白對(duì)照)，觀察MycoE對(duì)LPS剌激促炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響。通過(guò)ELISA檢 測(cè)試劑盒檢測(cè)3種促炎癥介質(zhì)的濃度細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的腫瘤壞死因子-a (TNF-a)和白介 素-6 (IL-6)、細(xì)胞裂解液中的白介素-lp (IL-1(3)。
2) LPS濃度梯度。將RAW264.7細(xì)胞(lx105細(xì)胞/ L)接入96孔培養(yǎng)板，24h后加入 LPS至終濃度為IOO、 1000、 10000ng/ml刺激6h，同時(shí)加入終濃度為10 ^mol/L的MycoE， 觀察MycoE對(duì)不同濃度的LPS刺激促炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響。通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)3 種促炎癥介質(zhì)的濃度細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-a和IL-6、細(xì)胞裂解液中的IL-lp。
細(xì)胞裂解液配方為0.1% triton X-IOO， 1 mmol/L DTT， 50腿ol/L Tris—HCl (pH 8.0)。
將RAW264.7細(xì)胞(lx105細(xì)胞/孔)接入96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入LPS(IOO ng/ml) 及不同濃度的MycoE (0.1、 1、 5、 10 jAmol/L，用DMSO作為空白對(duì)照)刺激24 h，收集細(xì) 胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)Griess方法檢測(cè)一氧化氮(NO)的含量。
實(shí)施例2的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3 9。試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)氧二烯可抑制細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
實(shí)施例3、環(huán)氧二烯在抑制小鼠炎癥反應(yīng)中的應(yīng)用
本發(fā)明采用小鼠存活率試驗(yàn)、血清中促炎癥介質(zhì)檢測(cè)試驗(yàn)以判明環(huán)氧二烯是否可以抑制 小鼠炎癥反應(yīng)。 試驗(yàn)方法如下
1) 小鼠存活率實(shí)驗(yàn)。采用SPF級(jí)BALB/c小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將小鼠分為兩組，每組10只 小鼠第一組為按10mg/kg小鼠體重注射LPS;第二組為按15mg/kg小鼠體重注射MycoE， 30 min后按10 mg/kg小鼠體重注射LPS。注射LPS后，每12 h觀察一次小鼠的存活情況， 連續(xù)觀察5 d。
2) 小鼠血清中促炎癥介質(zhì)檢測(cè)。采用SPF級(jí)BALB/c小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將小鼠分為兩組， 每組3只小鼠第一組為按10 tng/kg小鼠體重注射LPS;第二組為按15 mg/kg小鼠體重注射 MycoE， 30 min后按10 mg/kg小鼠體重注射LPS。兩組小鼠在LPS注射10 h后提取血清， 然后通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清中IL-6和IL-lp促炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況。
實(shí)施例3的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10 12。試驗(yàn)結(jié)果表明，環(huán)氧二烯可有效抑制細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo) 的小鼠的炎癥反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.環(huán)氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑的應(yīng)用，所述環(huán)氧二烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為環(huán)氧二烯的化學(xué)式為C16H18O5，分子量為290.12。
2. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)氧二烯在制備治療內(nèi)毒素休克由促炎癥 介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述炎癥性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性 腸病、神經(jīng)退化性疾病、膿毒性休克。
全文摘要
環(huán)氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑的應(yīng)用，涉及一種化合物環(huán)氧二烯，尤其是涉及一種環(huán)氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。提供一種環(huán)氧二烯作為促炎癥介質(zhì)抑制劑的應(yīng)用，特別是在制備治療內(nèi)毒素休克等由促炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。特別是在制備治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等由促炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)環(huán)氧二烯能通過(guò)抑制多種促炎癥介質(zhì)的表達(dá)而對(duì)炎癥的進(jìn)程有著重要的調(diào)節(jié)作用，可用于制備抗炎藥物。該化合物可從真菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得，也可采用化學(xué)合成。
文檔編號(hào)A61P1/00GK101590036SQ20091011208
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者俞春東, 沈月毛, 揚(yáng) 趙, 強(qiáng) 陳, 陳騰輝, 黃耀堅(jiān) 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)