專利名稱：一種白芍的有效組分及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療心血管疾病的中藥提取物，具體地說涉及從白芍中提 取的有效組分及其制備方法與用途。
背景技術：
心血管疾病嚴重烕脅人類的健康，近年來，隨著我國人口老年化以及人們 工作、生活、飲食結構及環境等的變化，冠心病等心腦血管疾病的發生率也逐 年增多，嚴重烕脅著人民的身心健康。天然產物中許多活性物質具有抗心肌缺 血、缺氧作用，其中一些已開發成治療冠心病和心絞痛的新藥，如治療冠心病 的藥物地奧心血康，它是由從中藥中提取的8種甾體皂甙制成的純中藥制劑； 心達康是以沙棘為原料提取加工而成的純天然藥物，其有效成分為沙棘總黃 酮。因而從天然產物中尋找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物質，是發 現、開發新藥的有效途徑之一。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質 是研究和發現新藥先導化學物，開發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物 中提取活性物質，用于開發成治療冠心病、安全性好、毒性低的新藥還很少， 從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗心肌缺血，用于治療冠心病和心絞 痛的新藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。
白芍(Pasonia lactiflora Pall)系毛莨科植物的去外皮干燥根，性微寒,味苦 酸。有養血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗的功能。我國民間用于治療胸腹脅肋疼 痛、瀉痢腹痛、自汗、陰虛發熱、月經不調、崩漏、帶下。現代研究表明，白 芍中主要含芍藥苷(paeoniflorin)類化合物，還含有苯甲酸，P-谷甾醇，l ,2 ，3 ,4 ,6 -黃倍酰單寧,倍單寧,以及沒食子鞣質,沒食子酸、沒食子酸乙酯,d-兒茶素等成 分。
發明內容
本發明的目的是提供一種白芍的有效組分，通過以下制備方法獲得將白 芍藥材粉碎后加入乙醇溶液，加熱回流提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏， 并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙
酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫
液n，棄之，然后再改換甲醇作為流動相，得洗脫液in，將洗脫液ni濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色 譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯 度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為95%的水溶液和5%的乙腈溶液；45分 鐘時，流動相為75%的水溶液和25%的乙腈溶液；55分鐘時，流動相為30% 的水溶液和70%的乙腈溶液。流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙 醇溶解，經制備液相色譜分離，在32.9 38.2min時間段收集溶液，減壓濃縮， 冷凍干燥，得有效組分一，在52.2 55.0min時間段收集溶液，減壓濃縮，冷凍 干燥，得有效組分二。
優選的白芍有效組分制備方法，包括下列步驟將白芍藥材粉碎后加入乙 醇溶液(體積百分比50°/。~95%)，加熱回流0.8 1.2小時，提取1 3次，合并濾 液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對 其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(體積比47 53:1)作為流動相，得洗脫液 I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(體積比8 13:1)作為流動相，得洗脫液II，棄之， 然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液m，將洗脫液III濃縮干燥后得樣品；用 制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱 (ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如 下0分鐘時，流動相為95%的水溶液和5%的乙腈溶液；45分鐘時，流動相 為75%的水溶液和25%的乙腈溶液；55分鐘時，流動相為30%的水溶液和70% 的乙腈溶液。流速為10ml/min,柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經制備 液相色譜分離，在32.9 38.2min時間段收集溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得有 效組分一，在52.2 55.0min時間段收集溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得有效組 分二。
最佳的白芍有效組分制備方法，包括下列步驟將白芍藥材粉碎后加入乙 醇溶液(體積百分比70%~80%)，加熱回流l小時，提取2次，合并濾液得提取 液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分 離，首先用石油醚和乙酸乙酯(體積比50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然 后改換氯仿和甲醇(體積比8:1)作為流動相，得洗脫液II，棄之，然后改換甲醇 作為流動相，得洗脫液III，用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的 分離條件色譜柱為制備柱(Zorbax SB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A) 和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為95%的水溶液和5%的乙 腈溶液；45分鐘時，流動相為75%的水溶液和25%的乙腈溶液；55分鐘時， 流動相為30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣
5品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在32.9 38.2min時間段收集溶液， 減壓濃縮，冷凍干燥，得有效組分一，在52.2 55.0min時間段收集溶液，減壓 濃縮，冷凍干燥，得有效組分二。
本發明的另一個目的是提供該白芍有效組分在制備治療、預防心血管疾病 藥物中的應用。
本發明的白芍有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的藥物賦形 劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。
本發明的白芍有效組分還可以作為活性成分之一，還含有其他藥物，加入 藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。
所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注 射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄 膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸 劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
通過本發明方法獲得的白芍有效組分，具有顯著的抗氧化活性，分可在制 備治療、預防心血管疾病藥物中的應用。本發明方法設計合理，能快速準確的 得到有效成分，在生產中更易于藥物的質量控制。
具體實施例方式
本發明結合下面實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用 于說明本發明而并非對本發明的限制。 實施例一 白芍有效組分的制備
將200g白芍藥材粉碎后加入乙醇溶液，加熱提取得提取液，將提取液濃 縮成浸膏10g，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用 石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為
流動相，得洗脫液n，棄之，然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液in，將洗脫
液III濃縮干燥后得樣品2.3g;用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色 譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100% 乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段32.9 38.2min收集溶液，濃縮干燥 后得到有效組分一 0.20g，在時間段52.2 55.0min收集溶液，濃縮干燥后得到 有效組分二 0.18g。
實施例二白芍有效組分的制備
將500g白芍藥材粉碎后加入體積百分數為90%乙醇，加熱回流0.8 1.2小 時，提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏22.1g，并將其與
6硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(體積
比47 53:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(體積比8 13:1) 作為流動相，得洗脫液II，棄之，然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液III，將 洗脫液III濃縮干燥后得樣品5.1g;用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制
備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為 9 11ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在 時間段32.9~38.2min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分一 0.42g，在時間段 52.2 55.0min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分二 0.38g。 實施例三白芍有效組分的制備
取白芍藥材250g，將其粉碎后加入體積分數為80%乙醇，加熱回流1小 時，提取l次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏得9.8g，將浸膏和硅 膠拌樣，用正相硅膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(體積比50:1)作為 流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(體積比IO:I)作為流動相，得洗脫液 II，棄之，然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液III，將洗脫液III濃縮干燥后 得樣品2.1g樣品。用制備液相色譜繼續分離得到的樣品。制備色譜的分離條件 色譜柱為Agient制備柱(Zorbax SB-C18; 21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙 腈(B)，梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相為95%的水溶液和5%的乙腈溶 液；45分鐘時，流動相為75%的水溶液和25%的乙腈溶液；55分鐘時，流動 相為30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用 100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段32.9~38.2min收集溶液，濃 縮干燥后得到有效組分一 0.41g，在時間段52.2~55.0min收集溶液，濃縮干燥 后得到有效組分二 0.38g。
實施例四白芍有效組分的制備
取白芍藥材250g，將其粉碎后加入體積分數為70%乙醇，加熱回流1小 時，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏得ll.lg，將浸膏和 硅膠拌樣，用正相硅膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(體積比50:1)作 為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(體積比10:1)作為流動相，得洗脫
液n，棄之，然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液in，將洗脫液m濃縮干燥
后得樣品2.5g樣品。用制備液相色譜繼續分離得到的樣品。制備色譜的分離條 件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-d8;21.2mmx250mm)，流動相為水(A) 和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相為95%的水溶液和5%的乙 腈溶液；45分鐘時，流動相為75%的水溶液和25%的乙腈溶液；55分鐘時，
7流動相為30%的水溶液和70%的乙腈溶液。流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣 品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段32.9 38.2min收集溶液， 濃縮干燥后得到有效組分一 0.44g，在時間段52.2 55.0min收集溶液，濃縮干 燥后得到有效組分二 0.42g。
實施例五滴丸制劑的制備
取實施例三的白芍有效組分一 0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加 熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6 8r;液體石蠟中，除油，制得滴 丸400粒。
實施例六片劑的制備
取實施例三的白芍有效組分二適量與微晶纖維素混合均勻，加3%聚維酮 乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，6(TC干燥1小時，整粒，加入滑石粉適 量，混勻，壓片，即得。
實施例七膠囊劑的制備
取白芍有效組分一與花生油按2: 18的比例水溶式不銹鋼攪拌灌中，同時 加入適量明膠和甘油混合，放出再用膠體磨磨漿，磨出的混合液攪拌，制成藥 液；將甘油與蒸餾水在40-5(TC溫度下攪拌混溶，再將甘油液溫至80-90°C，取 明膠加入其中混合攪拌，直至全部溶化成膠液，然后在6(TC溫度下使膠液靜置 4小時，用制板機制成膠板供制丸工序使用；將上述制成的藥液和膠板送入壓 丸機制丸，然后在22-25"C溫度下吹風4小時作滾筒定型，又在25-30'C溫度下 吹風干燥16-20小時，檢選合格膠丸，用95%乙醇清洗，在25-3(TC下吹風干 燥4小時，即得。
實施例八注射液的制備
取白芍有效組分一適量用4(TC注射用水溶解，加入適量藥用載體等滲劑， 調節溶液的pH值為7.0-8.0，加注射用水至全量，用超濾器超濾除熱源，測定 pH值后，用膜過濾，分裝后，高壓滅菌，檢驗、包裝，即得。
實施例九凍干粉針制劑的制備
取降香油1.5g,加入到13ml飽和的羥丙基P-環糊精中，攪拌溶解，濾過， 濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基(3-環糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥 丙基(3-環糊精的包合物粉末外，再取實施例三的白芍有效組分二0.5g、甘露醇 5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300 支，即得。實施例十白芍有效組分的藥理實驗
藥理模型H9C2心肌細胞抗氧化模型
配藥用適量DMSO溶解提取物組分，濃度為約50mg/ml，最后作用于細 胞的提取物組分濃度為50pg/ml。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。 儲存-20。C。細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%， 胎牛血清(Gibco) 10%，非必需氨基酸(Gibco) 1%，雙抗(青霉素，鏈霉素， 濃度都是10萬單位/ml) 0.1。/。混合培養H9C2細胞。H9C2細胞種板取96孔 板，由于邊緣效應，96孔板最外圍一圈加150jli1/孔PBS。其他孔按照1萬/孔 的細胞密度接種細胞，每孔150pl。同時留孔做空白對照，不接種細胞。把該 96孔板置于細胞培養箱(37°C， 95。/。空氣+5。/。C02)培養24小時。細胞加藥 每個提取物組分篩選做3次平行操作。用H9C2細胞培養液稀釋30%H2O2至 200^imol/l濃度，混勻，記做A液。提取物組分稀釋分兩步先精密移取50 mg/ml 的提取物組分1^1至200^1 A液中。再精密移取該稀釋液3(^1至含120ulA液 的H9C2接種板中。最后每孔體積為150pl。 DMSO組，取1^1至200|il A液中。 再精密移取該稀釋液30pl至含12(^lA液的H9C2接種板中。維生素C組，取 50mmo1/1的維生素C溶液1^1至200(li1 A液中。再精密移取該稀釋液30pl至含 120ulA液的H9C2接種板中。放置細胞培養箱(37°C， 95%空氣+5%0)2)培 養24小時。MTT法測定細胞保護率小心吸干凈每孔中體液，加入100^il/孔， 0.5mg/ml的MTT (將5mg/ml的MTT貯備液用H9C2細胞正常培養液稀釋10 倍)。放置于細胞培養箱(37°C， 95。/。空氣+5。/。C02)培養4小時。之后拿出 96孔板，吸去上清，盡量吸干凈，加入150]Lil/孔DMSO， 500rpm轉速搖床混 勻10分鐘，使沉淀充分溶解。立即在酶標儀595nm波長下測定每孔OD值。 治療率=(加藥孔OD值-加DMSO孔OD值)/ (加DMSO孔OD值-空白孔 OD值)xl00%
樣品白芍有效組分一白芍有效組分二空白陰性陽性
存活細胞數0.390,400.050.330.35
治療率(％)20.325.7-06.53
RSD (%)0.672.734.054.232.58
權利要求
1. 一種白芍有效組分，其特征在于通過以下制備方法獲得將白芍藥材粉碎后加入乙醇溶液，加熱回流提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，棄之，然后再改換甲醇作為流動相，得洗脫液III，將洗脫液III濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫程序為0分鐘時，流動相為95％的水溶液和5％的乙腈溶液，45分鐘時，流動相為75％的水溶液和25％的乙腈溶液，55分鐘時，流動相為30％的水溶液和70％的乙腈溶液；流速為9～11ml/min，柱溫為室溫；樣品用100％乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在32.9～38.2min時間段收集溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得有效組分一，在52.2～55.0min時間段收集溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得有效組分二。
2. 根據權利要求1所述的一種白芍有效組分，其特征在于制備方法中將白芍藥材粉碎后加入體積百分比50%~95%的乙醇溶液，加熱回流0.8 1.2小時，提取1 3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和體積比47 53:1的乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和體積比8 13:1的甲醇作為流動相，得洗脫液II，棄之，然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液m，將洗脫液III濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件如權利要求l。
3. 根據權利要求1所述的一種白芍有效組分，其特征在于制備方法中將白芍藥材粉碎后加入體積百分比70% 80%的乙醇溶液，加熱回流1小時，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和體積比50:1的乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和體積比8:1的甲醇作為流動相，得洗脫液n，棄之，然后改換甲醇作為流動相，得洗脫液in，用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件如權利要求1。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的一種白芍有效組分在制備治療、預防心血管疾病藥物中的應用。
5. 根據權利要求4所述的一種白芍有效組分的應用，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
6. 根據權利要求4所述的一種白芍有效組分的應用，其特征是所制備的藥物還含有其他藥物。
7. 根據權利要求4所述的一種白芍有效組分的應用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。
8. 根據權利要求7所述的一種白芍有效組分的應用，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥、注射給藥。
全文摘要
本發明提供一種白芍的有效組分，通過加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用液相色譜繼續分離，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。本發明提供的白芍有效組分可在制備治療、預防心血管疾病藥物中的應用。本發明方法設計合理，能快速準確的得到有效成分，在生產中更易于藥物的質量控制。
文檔編號A61K36/185GK101474264SQ200910095588
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月22日 優先權日2009年1月22日
發明者斌 吳, 瞿海斌, 程翼宇 申請人:浙江大學