專利名稱：：澤瀉醇a衍生物,其藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于藥物
技術領域：
，具體地說，涉及澤瀉醇A衍生物，以該衍生物為有效成分的治療乙型肝炎的藥物組合物，其制備方法，以及該藥物化合物和組合物在制備乙型肝炎抑制劑藥物和抗乙型肝炎藥物中的應用。
背景技術：
：據世界衛生組織報道，全球有超過20億人為乙型肝炎病毒攜帶者，其中約3億人為慢性終身感染并發病。這些慢性肝炎的病人易轉成慢性肝炎，是肝硬化、肝癌的主要病因。乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的公共衛生問題，而且治療慢性肝炎的費用是相當昂貴的，估計每年因病毒性肝炎導致直接經濟損失300億500億人民幣。近年來HBV疫苗免疫、各種抗病毒藥物的應用在控制HBV感染取得了一定的效果，但同時也導致HBV變異株出現，HBeAg陰性慢性乙型病毒性肝炎(CHBV)增多，停藥后HBV易反彈,而且費用高。為了有效地控制HBV,需要研制不同類型的臨床治療藥物。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)屬DNA嗜肝病毒科，主要是通過血液制品、母嬰和性接觸等途徑傳播，且易轉成慢性肝炎，是引發肝硬化、肝癌的主要病因之一。乙型肝炎病毒的復制過程涉及5步結合、侵入、轉錄、翻譯、基因復制和包裝。首先病毒顆粒通過受體附著于肝細胞，侵入胞漿后脫去外膜，形成核心顆粒。核心顆粒移至肝細胞核，HBVDNA核心顆粒脫殼而出，在細胞核內形成cccDNA。cccDNA是乙型肝炎病毒復制的模板，是肝細胞長期持續受感染的關鍵物質。cccDNA有2種功能，其一是合成病毒顆粒的各禾中構件，如HBsAg(hepatitisBvirussurfaceantigens,表面抗原，構成夕卜膜)，HBcAg(hepatitisviruscantigens,核心抗原，構成內膜)，HBeAg(hepatitisBviruseantigens,e抗原，分泌到血液中)；其二是合成下一代HBVDNA。大部分新合成的HBVDNA用于新病毒顆粒的包裝，部分則重新進入肝細胞核，成為cccDNA的另一個來源。部分新合成的HBVDNA首先與HBcAg組裝成核心顆粒，進而與HBsAg組裝成完整的HBV顆粒，向細胞外釋放。過剩的HBsAg有時獨自釋放入血液，形成小球型顆粒或管型顆粒。研究報道一些中草藥具有抗HBV活性,如葉下珠、白花蛇舌草等能抑制體外HBsAg和HBeAg的分泌，具有抗HBV作用，他們不良反應相對較小,可長期服用。其中一些植物的提取物對HBVDNA有不同程度的抑制作用。黃芩甙、苦參素對HBsAg和HBeAg具有體外抑制作用。，我國研制的聯苯雙酯是在人工合成五味子丙素過程中發現的一種具有降酶作用和治療肝炎的有效成分。甘草甜素制劑強力新甘草甜素注射液對病毒性肝炎患者有減輕癥狀、抗炎和降低轉氨酶等作用。強力新的換代產品甘利欣為甘草酸二銨左旋化合物,療效強于強力新。他們主要降低轉氨酶。目前國際公認的療效較好的抗乙肝病毒藥物主要為核苷類藥物如拉米夫定(lamivudine)、阿地福韋酯(adefovirdipivoxiil)、恩替卡韋(enticavir)、替比夫定(tibivudine)。這些藥物在體外或體內實驗中，對HBV病毒有抑制作用。其作用機制為藥物進入細胞內成為三磷酸化合物，通過底物的競爭，對病毒的聚合酶或反轉錄酶抑制，最終抑制病毒DNA的合成、病毒的增殖。因短期使用僅有暫時效果，適合長期用藥。但經過長期的治療后，病毒可能出現變異和耐受性，而且停藥后，病毒反彈高。為控制乙型肝炎的蔓延，醫學界還研究出有效的乙型肝炎疫苗，對公眾迸行免疫注射，主要用于預防，獲得了良好的效果。但對已感染HBV則無效。另外治療慢性乙型肝炎釆用的藥物是a-干擾素(IFNQ，其作用主要是免疫調節。但干擾素治療慢性乙型肝炎有其制約因素其一，它從未獲得真正成功，除非病人在治療前已出現對HBV的實質性免疫反應。其二，在干擾素誘導的HBeAg血清轉換之前，肝炎活動的突然一過性加重，表現為ALT升高，可導致肝硬化病人發生肝功能衰竭，偶爾出現死亡。.綜上所述，抗肝炎藥物有非常大的市場需求，但是現在臨床應用的抗肝炎藥物普遍存在耐藥性的問題，成功地開發出能解決藥物的耐藥性，臨床效率高且毒副作用較小的新一代抗乙型肝炎的藥物，將具有很強的市場競爭力和市場前景。迄今，現有技術中沒有澤瀉醇'A衍生物作為有效成分的藥物組合物的報道，也沒有其藥物組合物應用在制備或治療乙型肝炎藥物中的報道。
發明內容本發明的目的在于提供澤瀉醇A衍生物，含有效量的式(I)澤瀉醇A衍生物及可藥用載體的治療乙型肝炎的藥物組合物，其制備方法，以及式(I)澤瀉醇A衍生物或其藥物組合物在制備抗乙型肝炎抑制劑藥物和在制備治療乙型肝炎藥物中的應用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案.-結構式(I)所示的澤瀉醇A衍生物，式中，R為OCOCH2OMe時的化合物1即11,23,24,-三-(9-乙酰-25-0-甲氧乙酰澤瀉醇A;R為OCOCH2OEt時的化合物2即11,23,24,-三-6>-乙酰-25-0-乙氧乙酰澤瀉醇A。式(I)化合物的制備方法，以澤瀉中分離純化得到的澤瀉醇A為反應原料，在醋酸酐/吡啶體系中室溫攪拌反應12h，反應液傾入適量冰水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層分別用5%鹽酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓回收乙酸乙酯，得11,23,24-三乙酰澤瀉醇；向11,23,24-三乙酰澤瀉醇、適當的羧酸、4-二甲胺基吡啶的二氯甲烷溶液中加入見A^二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應24h，過濾除去白色沉淀，減壓回收二氯甲烷，得粗品，經硅膠柱層析，用石油醚丙酮洗脫得式(I)所示的澤瀉醇A衍生物。用于治療乙型肝炎的藥物組合物，其中含有治療有效量的式(I)化合物和藥學上可接受的載體。式(I)所示的澤瀉醇A衍生物在制備治療乙型肝炎藥物中的應用。式(I)所示的澤瀉醇A衍生物在制備治療乙型肝炎病毒抑制劑藥物中的應用。本發明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有0.1-99%,優選為0.5-90°/。的本發明化合物，其余為藥物學上可接受的，對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發明的藥物可經注射(靜注、肌注)和口服兩種形式給藥。具體實施例方式為了更好地理解本發明的實質，下面將用本發明的試驗例來說明本發明澤瀉醇A衍生物(I)的藥理作用結果，但不以此試驗例來限定本發明。試驗例1:澤瀉醇A衍生物(I)對HepG2.2.15細胞的藥物毒性和對HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用1材料和方法1.1材料澤瀉醇A衍生物(I);拉米夫定(lamivudine)(葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司，國藥準字H20030581);HepG2.2.15細胞(引自廣州空軍醫院)；高糖DMEM(GlSlCO);G418(GIBICO);胎牛血清(天津血研所)；L-谷氨酰胺(AMRESCO);青霉素，鏈霉素(石藥集團中諾藥業(石家莊)有限公司)。1.2HepG2.2.15細胞，用高糖DMEM液培養，培養液添加10%胎牛血清，0.03%L-谷氨酰胺，100mg/LG418,1()5iU/L青酶素，100mg/L鏈霉素，5。/。NaC03調pH至6.8—7,0。1.3儀器酶標儀Bio-RAD680(美國)；(302培養箱ThermoForma3310(美國)；倒置生物顯微鏡XD-101型(南京)等。1.4實驗過程用胰蛋白酶將HepG2.2.15細胞消化，用添加了0.03%L-谷氨酰胺，100mg/LG418,100IU青酶素，100IU鏈霉素的高糖DMEM液制成單細胞懸液，每孔按3x105xO.lmL'1分種于96孔板，O.lmL/孔，24h后換用含2。/。的胎牛血清，380pg/mL的含藥培養液，每種藥物設四個藥物濃度，每個濃度設三孔，四倍稀釋，同時設三孔不加藥物的細胞對照組及一孔空白細胞組，并以拉米夫定做陽性藥物對照；7d后收集上清，用ELISA法測定HBsAg和HBeAg的分泌情況。同時用MTT法測定藥物對細胞的毒性。1.5藥物對細胞半數毒性濃度(CC5o)的測定根據Mosmann建立的MTT法檢測藥物的細胞毒性(Y.Nakajima,Y.Saton,M.Katsumata,K.Tsujiyama,Y.Ida,andJ.Shoji,尸/y^oc/2ew/對y1994,36,119-127)。具體方法是向吸去上清的細胞孔中加入0.4mg/mLMTT，0.1mL/孔，37°C5%C02培養4h，去上清，每孔加入O.lmL二甲基亞砜，孵育10min，在酶標儀上測定溶液在490nm下的吸光度值。藥物對細胞的破壞百分率Tldestr。f(A細胞對照組-A供雜品組)/(A細胞對照組-A空自組)xioo，50%毒性濃度(CC5Q)為實驗孔存活細胞為對照孔50%時的藥物濃度。CC5。=Antilg[(C5。-<50%破壞率的百分數)/(>50%破壞率的百分數-<50°/。破壞率的百分數)xC+lgB〗，A:破壞率大于50%的藥物濃度；B:破壞率小于50%的藥物濃度；C=lgA—lgB。1.6藥物對細胞半數抑制濃度的測定采用酶聯免疫法(ELISA)測定。藥物對HBsAg、HBeAg的抑制百分率Ti^hibit。ry-(A細胞對照組-A供試樣品組)/A細胞對照組-A空白組)x100，50%抑制濃度(IC5Q)為HBsAg或HbeAg以抑制率為50%時的藥物濃度，計算方法同CC50。2.結果最終結果以選擇指數(SI，為評價藥物臨床應用前景的參數，SI=CC5o/IC5o)來評價，其中SI>2為無毒有效，1<SI<2為有毒有效，SI<l為有毒無效。具體結果見表l、表2和表3:表l澤瀉醇A衍生物(I)對HepG2.2.15細胞的毒性作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2.澤瀉醇A衍生物(I)對HepG2.2.15細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3.蹄疼將錄^湘頓^,翁i加職A或許綏(I)併吝AT^HepG2.2」5鑿薛^瞎MBsAg苦KBeAg浙l蹄w著建f^油。tuTil31將讓g糸瞎l碟避滯餅沐溫3建，g.:^裕.s:盟淳降敦鵬將每』碎3樹，命禁3EIth糸頸蹄餅沐溫。將讓窗」1:11,23,24,-山-o-z.驛-256-a辨z.薄禍^職A(4t命蓉1)苦11,23,24,-山-0-"讓-25-0-"灘^讓禍^職>(4h-^潘2)3建4"適寂11,23,24-山z,薄禍誠職As^-勢；sw:併10mL囫親溢臠書旨A98mg禍琉職A」.oml蹋驟SM.5ml異滯呦^^某沖商12h,沖降洚富A30ml突7Ki,P嫘ZJI樹齊(3X50ml)，z,嫘ZJg瑯凈^油5%^驟，瞎著菊驟M潘，ta普玲^:7K薄翁，統加油w7K敦驟奪+籙，弒m回^z,驟ZJ，逾11,23,24-^z,薄禍潞聵A(106mg,存^:86%)。11,23,24-^H薄禍^11A:一HNMR(CDC13,400Mnz)S4.88-4.96(2H,H-ll,23)，4.68(1H,d,J"2.4Kz,H-24)，2.10(3H,s,OCOCH3)，2.01(6H,s,2XOCOCH3)，0.97-1.18(24H,8XCH3).一"cNMR(CDC13,100MHZ)5219.9(s,c-3)，171.2(s,08CH3)，170.5(s,08CH3)，170.1(s,onocH3)，137.0(s,C-13)，135.5(s,C-17)，78.9(d,c畫24)，73.0(d,c-11)，7L7(s,C-25)，69.7(d,C-23)，56.9(s,C-14)，48.2(d,c-5)，46.9(s,c-4)，46.8(d,c-9)，40.6(s,c-8)，38.2(t,C-22)，36.6(s,c-lo)，34.2(t,c-7)，33.4(t,c-2)，31.1(t,c-l)，30.4(t,C-15)，29.5(q,C-28)，29.3(t,912)，29.2(t,C-16)，28.2(d,C-20)，26.8(q,C-26)，26.2(q,C-27)，25.4(q,C-19)，24.0(q,C-30)，22.6(q,C-18)，21.7(q,OCOGi3)，21.2(q,OCOQH3)，20.8(q,oco￡H3)，20.0(q,C-21)，19.9(t,c-6)，19.7(q,c-29)；FABMS(+)w/z61M+H+(14)，599M+H-H20+(18)，557(100)，539(14)，419(10)，338(17).澤瀉醇A衍生物1的合成方法將上述反應得到的中間體化合物11,23,24-三乙酰澤瀉醇(61.6mg，0.1mmol)、甲氧乙酸(18mg，0.2mmol)、DMAP(2.5mg，0.04mmol)加入到CH2Cl2溶液中，冰水浴冷卻下加入DCC，室溫下攪拌反應直至原料反應完畢，將反應液過濾，濾液減壓濃縮，將粗品溶于適量二氯甲垸中，依次用5%鹽酸(15mLX3)、5%碳酸氫鈉(15mLX3)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得粗品，硅膠柱層析純化得目標化合物l(63.0mg，收率92%)即11,23,24，-三-6>-乙酰-25-(9-甲氧乙酰澤瀉醇A。質譜(MS)用VGAutoSpec-3000型質譜儀測定，采用FAB-MS技術；核磁共振譜。HNMR和13CNMR)用BrukerAM~400超導核磁共振儀測定，TMS作內標；青島海洋化工廠出品的200-300目硅膠作為柱層析材料。化合物1即11,23,24,-三-6>-乙酰-25-(9-甲氧乙酰澤灣醇A的結構數據分子式C39H60O10分子量688性狀白色無定型固體粉末收率92%光譜數據丄HNMR(CDC13,400MHz)S5.09(1H,2.8Hz,H-24),4.93-4.97(1H,m,H-ll)，4.84-4.91(1H,m,H-23),3.81(2H,s,OCOCH20CH3),3.35(3H，s,OCOCH2OCH3),2.08(3H,s,OCOCHs),1.97(3H,s,OCOCii3),1.95(3H,s，OCOCH3);13CNMR(100MHz)5219.8(s,C-3),170.05(s,0￡OCH3),170.01(s,0￡OCH3),169.5(s,OQOCH3),168.9(s,0￡OCH2OCH3),136.8(s,C-13),135.4(s,C-17),83.2(s,C-25),76.6(d,C-24),72.9(d,C-11),69.8(t,OCO￡H2OCH3),68.9(d，C-23),59.1(q,OCOCH20￡H3),56.7(s,C-14),48.1(d,C-5),46.8(s,C-4),46.7(d,C國9)40.6(s,C-8),37.9(t,C-22),36.4(s,C國IO),34.1(t,C-7),33.3(t,C-2),31.0(t,C-l),30.3(t，C-15),29.4(q,C-28),29.2(t,C-12),29.1(t,C-16),28.0(d,C-20),25.3(q,C-19)，23.9(q，C-30),23.1(q,C-26),22.38(q,C-27),22.35(q,C-18),21.6(q),21.0(q),20.6(q),20.0(q,C-21),19.8(t,C-6),19.6(q,C誦29);ESI國MS(positive):m/z711[M+Na]+.澤瀉醇A衍生物2的合成方法將上述反應得到的中間體化合物11,23,24-三乙酰澤瀉醇(61.6mg，O.lmmol)、乙氧乙酸(20.8mg，0.2mmol)、DMAP(2.5mg，0.04mmol)加入到CH2Cl2溶液中，冰水浴冷卻下加入DCC，室溫下攪拌反應直至原料反應完畢，將反應液過濾，濾液減壓濃縮，將粗品溶于適量二氯甲烷中，依次用5%鹽酸(15mLX3)、5%碳酸氫鈉(15mLX3)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得粗品，硅膠柱層析純化得目標化合物2(61.0mg，收率87%)即11,23,24,-三-0-乙酰-25-O乙氧乙酰澤瀉醇A。化合物2即11,23,24，-三-0-乙酰-25-0-乙氧乙酰澤瀉醇A的結構數據分子式C40H62O10分子量702性狀.*白色無定型固體粉末收率87%光譜數據丄HNMR(CDC13,400MHz)S5.09(1H,d,J=2.8Hz,H-24),4.96-4.99(1H,m,H-ll),4.86-4.92(1H,m,H-23),3.87(2H,s,OCOCH20CH2CH3),3.51(2H,q,J=6.8Hz,OCOCH2OQi2CH3),2.09(3H,s,OCOQi3),1.98(3H,s,OCOQis),1.97(3H,s,OCOCH3);13CNMR(100MHz)S219.9(s,C-3),170.1(s,O^OCH3),170.0(s,0￡OCH3),169.5(s,0￡OCH3),169.3(s,0￡OCH2OCH3),136.9(s,C-13),135.4(s,C-17),83.2(s,C-25),76.7(d,C-24),73.0(d,C-11),68.9(d,C-23),68.1(t,OCO￡H2OCH2CH3),66.9(t,OCOCH20￡H2CH3),56.7(s,C-14)，48.1(d,C-5),46.8(s,C-4),46.7(d,C-9),40.6(s,C-8),37.9(t,C-22),36.50,C國IO),34.1(t,C-7),33.3(t,C國2),31.0(t,C-l),30.4(t,C-15),29.4(q,C-28),29.2(t,C-12),29.1(t,C-16),28.0(d,C畫20):25.3(q,C-19),23.9(q,C-30),23.(q,C-26),22.38(q,C-27),22.36(q,C-18),21.7(q,OCO￡H3),21.0(q,OCO￡H3),20.6(q,OCOQH3),20.1(q:C-21),19.8(t,C-6),19.6(q,C-29),14.9(q,OCOCH2OCH2￡H3);ESI-MS(positive):w/z725[M+Na]+.實施例2:按實施例1的方法先制得澤瀉醇A衍生物11,23,24,-三-0乙酰-25-(9-甲氧乙酰澤灣醇A(化合物l)或11，23，24，-三-(9-乙酰-25-(9-乙氧乙酰澤瀉醇A(化合物2)，用少量的DMSO溶解后，按常規加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。實施例3:按實施例1的方法先制得化合物1或2，用少量的DMSO溶解后，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶解，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。實施例(將實施例1所得到的化合物1或2，按其與賦形劑重量比為9:1的比例加入賦形劑，制成粉劑。實施例5:按實施例1的方法先制得化合物1或2，按其與賦形劑重量比為5:1的比例加入賦形劑，制粒壓片。實施例6:按實施例1的方法先制得化合物1或2，按常規口服液制法制成口服液。實施例7:按實施例1的方法先制得化合物1或2，按其與賦形劑重量比為5:1的比例加入賦形劑，制成膠囊。實施例8:按實施例1的方法先制得化合物1或2，按其與賦形劑重量比為3:1的比例加入賦形劑，制成膠囊。權利要求1、結構式(I)所示的澤瀉醇A衍生物，式中，R為OCOCH2OMe時的化合物1即11，23，24，-三-O-乙酰-25-O-甲氧乙酰澤瀉醇A；R為OCOCH2OEt時的化合物2即11，23，24，-三-O-乙酰-25-O-乙氧乙酰澤瀉醇A。2、權利要求1式(I)化合物的制備方法，以澤瀉中分離純化得到的澤瀉醇A為反應原料，在醋酸酐/吡卩定體系中室溫攪拌反應12h，反應液傾入適量冰水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層分別用5%鹽酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓回收乙酸乙酯，得ll,23,24-三乙酰澤瀉醇；向11,23,24-三乙酰澤瀉醇、適當的羧酸、4-二甲胺基吡啶的二氯甲垸溶液中加入見iV-二環己基碳二亞胺，室溫攪拌反應24h，過濾除去白色沉淀，減壓回收二氯甲烷，得粗品，經硅膠柱層析，用石油醚丙酮洗脫得式(I)所示的澤瀉醇A衍生物。3、用于治療乙型肝炎的藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1式(I)化合物和藥學上可接受的載體。4、權利要求1式(I)所示的澤瀉醇A衍生物在制備治療乙型肝炎藥物中的應用。5、權利要求1式(I)所示的澤瀉醇A衍生物在制備治療乙型肝炎病毒抑制劑藥物中的應用。全文摘要式(I)所示的藥物化合物澤瀉醇A衍生物，用于治療乙型肝炎疾病，含有治療有效量的化合物澤瀉醇A衍生物(I)及藥學上可接受的載體的藥物組合物，澤瀉醇A衍生物的制備方法，以及在藥物中的應用，特別是在制備乙型肝炎抑制劑藥物和治療乙型肝炎藥物中的應用。文檔編號A61K31/56GK101602787SQ200910094689公開日2009年12月16日申請日期2009年7月3日優先權日2009年7月3日發明者俊周,泉張,張雪梅,江志勇,杰羅,陳紀軍,馬云保申請人:中國科學院昆明植物研究所