專利名稱：：口蹄疫疫苗純化抗原工藝的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種口蹄疫疫苗純化抗原工藝。
背景技術：
：現行口蹄疫病毒滅活疫苗在質量方面主要有兩個問題1.安全性差，動物在注苗后出現不同程度的不良反應，輕者減食或停食23天或發生流產，重者發生死亡。其原因一是疫苗中的非目的蛋白成分高，二是原材料及生產過程中產生的內毒素。2.疫苗免疫效力不穩定，其表現是，注苗后，有時動物的血清沒有可檢測的抗體，或者免疫期短，只有23個月。疫苗中的非目的蛋白包括培養細胞時殘留的血清和水解乳蛋白，污染菌和它產生的內毒素，細胞蛋白和口蹄疫病毒的非結構蛋白。這些異源蛋白不僅是動物過敏反應原，而且有的是蛋白水解酶，能裂解完整病毒粒子，從而降低了疫苗的效力。目前，口蹄疫滅活疫苗僅用過濾工藝技術去除有限的細胞碎片，非目的蛋白的大部分不能去除，同時這一工藝方式使得抗原在處理過程中損失較大。
發明內容為了解決上述問題，本發明提供了一種口蹄疫疫苗純化抗原工藝，包括以下步驟(1)無菌控制下，向用于制備純化的病毒抗原的口蹄疫病毒液中加入氯仿，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的0.5~2%，攪拌混合；(2)28。C靜置3~24小時，然后分離得到上清液；(3)離心處理上清液，獲取純化的病毒抗原。較佳地，步驟(1)中，氯仿用已滅菌空氣過濾器除菌后通過蠕動泵直接打入裝有所述口蹄疫病毒液的反應釜中。較佳地，歩驟(1)中，攪拌混合的攪拌頻率為80~180轉/分鐘，攪拌時間為15~60分鐘，溫度控制在25~30°C。較佳地，步驟(2)中，靜置時壓力為0.05Mpa0.1Mpa左右。較佳地，步驟(3)中，離心處理上清液使用的離心機為連續流離心機，離心速度為2000-5000轉/分鐘。更佳地，步驟(1)中，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的11.5%;步驟(2)中，靜置時間為10~20小時；步驟(3)中，離心速度為25003500轉/分鐘。按照上述口蹄疫疫苗純化抗原工藝獲取純化的病毒抗原，然后進行抗原滅活和疫苗配制，就可以獲得免疫效果和安全性都得到提高的口蹄疫疫苗。具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行進一步說明。實施例一O型口蹄疫疫苗的制各1、抗原制備本品系用0型口蹄疫病毒接種BHK-21細胞培養，收獲細胞培養物所得。2、抗原進缸無菌控制下，將制備的口蹄疫病毒液通過打壓的方式打入已高壓滅菌的反應釜內。3、加入氯仿將氯仿用已滅菌空氣過濾器除菌后通過蠕動泵直接打入裝有所述口蹄疫病毒液的反應釜中，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的1%。4、攪拌混合將含有氯仿的抗原液用攪拌器攪拌混合，溫度控制在2530'C，攪拌頻率為45轉/分鐘，攪拌時間為30分鐘。5、倒缸及靜置混合均勻后過夜靜置15小時，同時將反應釜內液體降溫至2~8°C，反應釜內室壓力維持在0.1Mpa左右。6、排放廢液通過打開反應釜底部閥門將乳白色沉淀物排放至廢液收集桶內，棄掉的下層約為混合物總體積的2%。7、分離將卜.清液抽取至連續流離心機內，離心速度為3000轉/分鐘.從出口分離出的液體經蠕動泵收集到另一個反應釜內等候滅火處理。8、抗原滅活與疫苗配制按農業部頒布的口蹄疫疫苗制造規特.實施，主要操作流程為，抗原經二乙烯亞胺(BEI)滅活，與精制礦物油佐劑混合乳化制成雙相油乳劑疫苗。實施例二上述O型口蹄疫疫苗(實施例一所得疫苗)性能指標檢測試驗分成兩組，按照實施例一的方法，一組采用未純化抗原配制疫苗，另一組純化抗原配制疫苗。用雙縮脲法(藥典2005版)測定純化前后的總蛋白含量，前后分別測定5個試樣，平均值如表1所示。其表明按本發明方法處理過的純化疫苗的蛋白量去除明顯。<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>用動態比濁法測定純化前后的內毒素含量，純化前后分別測定5個試樣，平均值如表2所示。其表明按本發明方法處理過的純化疫苗內毒素去除明顯。表2抗原純化前后內毒素含量變化處理前內毒素含量(EU/ml)處理后內毒素含量(EU/ml)內毒素去除率8910.6987.9%通過146S抗原含量變化間接地表示有效抗原含量變化，用蔗糖密度梯度紫外光定量法檢測[」蹄疫146S抗原含量，純化前后分別測定5個試樣，平均值如表3所示。其表明按本發明方法對有效抗原損失較小。表3抗原純化前后病毒含量變化處理前病毒146S抗原含量Otg/ml)處理后病毒146S抗原含量(嗎/ml)146S降低率1.611.544.2%采用各5頭懷孕奶牛按相同方法接種疫苗，數據如表4所示，其表明按本發明方法處理過的純化疫苗比傳統方法制備的疫苗副反應減小表4疫苗在抗原純化前后在懷孕奶牛牛體注射流產情況未純化疫苗流產數(頭數/注射頭數)純化后疫苗流產數(頭數/注射頭數)1/50/5實施例三亞洲一型口蹄疫疫苗的制備1、抗原制備本品系用亞洲一型口蹄疫病毒接種BHK-21細胞培養，收獲細胞培養物所得。2、抗原進缸無菌控制下，將制備的口蹄疫病毒液通過打壓的方式打入已高壓滅菌的反應釜內。3、加入氯仿將氯仿用已滅菌空氣過濾器除菌后通過蠕動泵直接打入裝有所述口蹄疫病毒液的反應釜中，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的1%。4、攪拌混合將含有氯仿的抗原液用攪拌器攪拌混合，溫度控制在2530'C，攪拌頻率為145轉/分鐘，攪拌時間為30分鐘。5、倒缸及靜置混合均勻后過夜靜置15小時，同時將反應釜內液體降溫至28°C，反應釜內室壓力維持在0.1Mpa左右。6、排放廢液通過打開反應釜底部閥門將乳白色沉淀物排放至廢液收集桶內，棄掉的下層約為混合物總體積的2%。57、分離將上清液抽取至連續流離心機內，離心速度為3000轉/分鐘，從出口分離出的液體經蠕動泵收集到另一個反應釜內等候滅火處理。8、抗原滅活與疫苗配制按農業部頒布的口蹄疫疫苗制造規程實施，主要操作流程為，抗原經二乙烯亞胺(BED滅活，與精制礦物油佐劑混合乳化制成的雙相油乳劑疫苗。實施例四上述亞洲一型口蹄疫疫苗(實施例三所得疫苗)性能指標檢測試驗分成兩組，按照實施例三的方法，一組采用未純化抗原配制疫苗，另一組純化抗原配制疫苗。用雙縮脲法(藥典2005版)測定純化前后的總蛋白含量，前后分別測定5個試樣，平均值如表1所示。其表明按本發明方法處理過的純化疫苗的蛋白量去除明顯。表l未純化抗原與純化抗原比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>用動態比濁法測定純化前后的內毒素含量，純化前后分別測定5個試樣，平均值如表2所示。其表明按本發明方法處理過的純化疫苗內毒素去除明顯。表2抗原純化前后內毒素含量變.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>通過146S抗原含量變化間接地表示有效抗原含量變化，用蔗糖密度梯度紫外光定量法檢測口蹄疫146S抗原含量，純化前后分別測定5個試樣，平均值如表3所示。其表明按本發明方法對有效抗原損失較小。表3抗原純化前后病毒含量變化<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用各5頭懷孕奶牛按相同方法接種疫苗，數據如表4所示，其表明按本發明方法處理過的純化疫苗比傳統方法制備的疫苗副反應減小表4疫苗在抗原純化前后在懷孕奶牛牛體注射流產情況<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1、口蹄疫疫苗純化抗原工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)無菌控制下，向用于制備純化的病毒抗原的口蹄疫病毒液中加入氯仿，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的0.5～2％，攪拌混合；(2)2～8℃靜置3～24小時，然后分離得到上清液；(3)離心處理上清液，獲取純化的病毒抗原。2、根據權利要求1所述的口蹄疫疫苗純化抗原工藝，其特征在于，步驟(1)中，氯仿用已滅菌空氣過濾器除菌后通過蠕動泵直接打入裝有所述口蹄疫病毒液的反應釜中。3、根據權利要求1所述的口蹄疫疫苗純化抗原工藝，其特征在于，步驟(1)中，攪拌混合的攪拌頻率為80~180轉/分鐘，攪拌時間為1560分鐘，溫度控制在2530'C。4、根據權利要求1所述的口蹄疫疫苗純化抗原工藝，其特征在于，歩驟(2)中，靜置時壓力為0.05Mpa0.1Mpa。5、根據權利要求1所述的口蹄疫疫苗純化抗原工藝，其特征在于，歩驟(3)中，離心處理上清液使用的離心機為連續流離心機，離心速度為2000-5000轉/分鐘。6、根據權利要求1所述的口蹄疫疫苗純化抗原工藝，其特征在于，步驟(1)中，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的1~1.5%;步驟(2)中，靜置時間為10~20小時；步驟(3)中，離心速度為25003500轉/分鐘。7、口蹄疫疫苗制備工藝，其特征在于，按照權利要求l所述的口蹄疫疫苗純化抗原工藝獲取純化的病毒抗原，然后進行抗原滅活和疫苗配制。全文摘要本發明提供了一種口蹄疫疫苗純化抗原工藝，包括以下步驟(1)無菌控制下，向用于制備純化的病毒抗原的口蹄疫病毒液中加入氯仿，氯仿體積為口蹄疫病毒液體積的0.5～2％，攪拌混合；(2)2～8℃靜置3～24小時，然后分離得到上清液；(3)離心處理上清液，獲取純化的病毒抗原。按照上述口蹄疫疫苗純化抗原工藝獲取純化的病毒抗原，然后進行抗原滅活和疫苗配制，就可以獲得免疫效果和安全性都得到提高的口蹄疫疫苗。文檔編號A61K39/125GK101664549SQ20091009243公開日2010年3月10日申請日期2009年9月8日優先權日2009年9月8日發明者盧永干,周勁松,榮李,鵬泰,王偉峰申請人:金宇保靈生物藥品有限公司