專利名稱：用于移植治療骨缺損的復合物及其制造方法
技術領域：
本發明涉及了 一種用于移植治療骨缺損的復合物及其制造方法。
背景技術：
隨著生活節奏的加快，骨壞死的發生率逐年升高，如激素(包括食品與藥物激素)、外 傷、飲酒、風濕、骨質疏松、骨關節病、高血脂等均會導致骨缺血性壞死，目前全世界患此 病者約3000萬人，我國每年新發骨壞死的人數在15—30萬之間，累計需治療人數在500萬 一750萬之間。
人羊膜間充質細胞具有多分化潛能，表達大量的粘附分子，細胞外基質蛋白，以及細胞 因子和生長因子受體。應用基因表達序列分析和DNA微陣列等先進的分子技術證實人羊膜 間充質細胞表達干細胞的特征性抗原。人羊膜間充質細胞表達間充質干細胞標志蛋白 Vimentin、 STR0國1等；胚胎干細胞標志蛋白SSEA-3+、 SSEA-4+、 SSEA-1、 Nanog、 Oct-4; 神經干細胞標志蛋白Nestin、 Musashi-l等；還表達SOX2、 PAX6等干細胞相關標志物。 在培養的人羊膜間充質細胞中波形蛋白陽性者占97.5%，說明波形蛋白是HAMC的主要標志 物之一，還可以表現為Tuj 1 (+)、 NF-M ( + )、 GFAP ( + )、軟骨相關基因(如SOX-9、 SOX-5、 SOX-6)、骨形態蛋白(BMP) -2、 4和BMP受體，在體外應用BMP-2誘導人羊膜間充質軟 骨形成后可產生2型膠原和蛋白聚糖；將人羊膜間充質和BMP-2植入鼠的非軟骨組織內或與 膠原支架一起植入骨缺損處后可見人羊膜間充質發生了形態改變并伴有2型膠原沉積。應用 再生醫學原理，我們也進行了人羊膜間充質細胞和去細胞小牛骨復合物修復股骨頭缺損的初 步研究，組織形態學證實了股骨頭缺損區域骨組織的重建。
另外，人羊膜間充質干細胞作為一種多潛能細胞，體外培養時，在不同的誘導條件下間 充質細胞能夠向不同的組織分化，不僅可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌肉細胞 等，而且還可以跨胚層分化，如可以分化為外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細 胞等。另外，人羊膜間充質干細胞來源豐富、取材方便、易于分離；擴增能力優于成人骨髓 間充質干細胞；無細胞污染；無供體創傷等，上述優勢使人羊膜間充質細胞有望成為人類組 織工程和細胞治療的理想種子細胞，因此在組織損傷再生和修復重建中具有廣闊的應用前景。
發明內容
本申請的發明目的在于利用人羊膜間充質細胞具有分化成軟骨細胞的能力，將人羊膜間 充質細胞接種于醫用骨材料中制成的復合物，以及制造該復合物的方法。 為了實現本申請的發明目的，本申請采用以下技術方案
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物，其中該復合物包括人羊膜間充質細胞 和醫用骨材料，在每立方毫米的醫用骨材料中均勻地接種有105—106個人羊膜間充質細胞；
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物，其中所述醫用骨材料是具有若干個^^的 骨醫用載體材料，它的孔徑為200 — 40(Him;
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物，其中所述醫用骨材料為羥基磷灰石或去 細胞小牛骨；
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中
(a) .將人羊膜間充質細胞擴增到擴增到所需的數目；
(b) .在室溫下，將上述人羊膜間充質細胞均勻地接種到醫用骨材料上，每立方毫米的
醫用骨材料中接種有105 — 106個人羊膜間充質細胞；
(c) .在室溫下，將上述接種有人羊膜間充質細胞的醫用骨材料放置在培養液內平衡4
個小時以上后，即得到用于移植治療骨缺損的復合物。
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中所述的步驟(a)是將人 羊膜間充質細胞放置在培養液中，在溫度為36.5-37.5°C、飽和濕度、體積分數為5%的。02 培養箱中培養。每2—3天更換全部培養液，并棄去未貼壁的細胞，培養7 — 12天，待人羊 膜間充質細胞達到80%-90%融合時，將人羊膜間充質細胞從培養液中取出，用25g/L的胰酶 消化。在消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待65%以上的人羊膜間充質細胞的 胞體回縮并變圓，即終止消化。然后重復上述操作，將上述細胞分為若干份進行傳代接種培 養，直至達到所需細胞的數量；
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中將步驟(b)中的接種有 人羊膜間充質細胞的醫用骨材料放置在培養液內平衡4個至8個小時后，即得到用于移植治
療骨缺損的復合物；
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中所述培養液為VDMEM: VF12
為1: 1的DMEM /F12培養液，上述每升培養液中還包括20 ug的堿性成纖維生長因子和 20 ug的表皮生長因子；
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中所述醫用骨材料是具有若干個孔的骨醫用載體材料，它的孔徑為200—400pm，將人羊膜間充質細胞的單個細胞t直入 上述骨醫用載體材料的孔徑內；.
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中所述醫用骨材料為夢5基
磷灰石或去細胞小牛骨；
本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其中所述的室溫為15 —28°C。
本發明是利用人羊膜間充質細胞具有分化成軟骨細胞的能力，將人羊膜間充質細胞接種 于醫用骨材料中制成的復合物。由于人羊膜組織是人類分娩廢棄物，并且是人羊膜間充質細 胞的主要來源，用人羊膜間充質細胞來制成移植治療骨缺損的復合物能夠規避和解決臨床應 用的安全性問題，以及相關的倫理和社會學問題，并且用人羊膜間充質細胞制成的用于移植 治療骨缺損的復合物與現有的用骨髓間充質干細胞制成的用于移植治療骨缺損的復合物豐目比 具有來源豐富、成活率高、取材方便、易于分離、低免疫原性和無細胞污染等優點，其J廣增 能力優于成人骨髓間充質干細胞。
人羊膜間充質細胞比現有的骨髓間充質干細胞在移植治療骨缺損中的優勢
在成年機體中，間充質干細胞(MSCs)存在于多種組織中，如骨髓、脂肪組織，f旦提 取相當困難。目前MS^的主要來源為成人骨髓，但成人骨髓MSCs (bonemarrow-MSCs， BM-MSCs)鄰胞數量極少，Pittenger等發現僅0.001%~0.01%的經過密度梯度分離的單核細 胞產生可塑性的貼壁細胞克隆，并且增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高， 供者MSCs的采集須行骨髓穿刺術，使來源受到限制。而人類羊膜作為胚胎發育的早期產物， 無論從解剖結構還是在發育行為上，都包含有較為幼稚的胚胎干細胞及趨于成熟的成體干細 胞成分；羊膜組織在胎兒娩出后即完成使命，對其研究不會涉及倫理道德問題；由于羊膜MSC 是來源于胎兒的產物，暴露于母體免疫系統監視下，MSCs表面人類白細胞抗原(human leucocyte antigen, HLA) -A、 B、 C低表達，不表達HLA-DR，從羊膜分離出MSCs樣細 胞，經體外擴增后成功植入新生大鼠和豬體內。上述優勢使人羊膜間充質細胞(hAMCs)有 望成為人類組織工程和細胞治療的理想種子細胞。
圖1為本發明的一種用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法的示意圖2為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到羊的骨缺損區域后，用抗人線粒體抗
體免疫組織化學染色后得到的圖片，圖中深色顆粒為陽性細胞群，提示羊股骨頭缺損區域內
存在人羊膜間充質細胞；
圖3為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到羊的骨缺損區域后，用蘇木素-伊紅染色由人羊膜間充質細胞移植治療羊股骨頭缺損的區域；圖中深色染色為載體材料，淺色為新
生軟骨組織；
圖4為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到羊的骨缺損區域后，用甲苯胺蘭染色
由人羊膜間充質細胞移植治療羊股骨頭缺損的區域；圖中深色為新生軟骨細胞；
圖5為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到骨缺損組織后，用骨橋素染色對該組織 進行染色，在400倍視野顯微鏡下所得到的圖像，圖中顯示了移植區沿新生骨組織排歹lf的抗 骨橋素抗體染色陽性細胞，說明成骨細胞分化成熟活躍
圖6為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到骨缺損組織后，用骨鈣素染色》t該組 織進行染色，在400倍視野顯微鏡下所得到的圖像，圖中顯示了移植區大量骨鈣素染色陽性 細胞，說明移植區有大量成熟成骨細胞，新骨形成活躍；
圖7為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到骨缺損組織后，用抗VIII因子對該組織 進行染色，在400倍視野顯微鏡下所得到的圖像，圖中顯示了移植區內沿新生血管壁可見大 量抗VIII因子抗原染色陽性的血管內皮細胞，提示血管生成活躍。
具體實施例方式
如圖1所示，本發明制造用于移植治療骨缺損的復合物的方法，包括以下步驟-
(a) 將人羊膜間充質細胞1放置在培養液3中，在溫度為36.5-37.5°C、飽和濕度、體 積分數為5%的。02培養箱中培養。每2—3天更換全部培養液3，并棄去未貼壁的細胞，培 養7—12天，待人羊膜間充質細胞1達到80%-90%融合時，將人羊膜間充質細胞1從培養 液3中取出。用25g/L的胰酶消化，在消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待65 %以上的人羊膜間充質細胞1的胞體回縮并變圓，即終止消化。然后重復上述操作，將上述 細胞分為若干份進行傳代接種培養，直至達到所需細胞數量；
(b) .在室溫下，將人羊膜間充質細胞1均勻地接種到羥基磷灰石或去細胞小牛骨2上， 每立方毫米的羥基磷灰石或去細胞小牛骨2中接種有105—106個人羊膜間充質細胞1;
(c) .在室溫下，將上述接種有人羊膜間充質細胞1的羥基磷灰石或去細胞小牛骨2放 置的培養液3內平衡4個小時以上后，最好為4至8個小時，即得到用于移植治療骨缺損的 復合物。
所述培養液3為VDMEM: VFu為1: 1的DMEM/F12培養液，上述每升培養液中還包括 20 ug的堿性成纖維生長因子和20 ug的表皮生長因子；上述培養液要符合HG/T 3935-2007
的規定。
上述的室溫通常是指溫度為15—28'C，由于羥基磷灰石或去細胞小牛骨2是具有若干個孔的骨醫用載體材料，它的孔徑通常為200—400pm，人羊膜間充質細胞1單個細胞的直徑通 常為200pm,將人羊膜間充質細胞1的單個細胞接種到羥基磷灰石或去細胞小牛骨2的孔《5 內后，人羊膜間充質細胞1的單個細胞與羥基磷灰石或去細胞小牛骨結合后，可以分化成軟 骨細胞。接種有人羊膜間充質細胞1的羥基磷灰石或去細胞小牛骨2在培養液3中平衡4至 8個小時后，人羊膜間充質細胞與羥基磷灰石或去細胞小牛骨結合并且開始分化。對于骨缺 損的患者來說，首先對患者進行手術取出病灶骨，然后，按照病灶骨的形狀，裁取上述復合 物并將其植入患者骨相應位置、固定和縫合，接種有人羊膜間充質細胞1的輕基磷灰石或去 細胞小牛骨2在植入骨缺損患者的損壞部位后，人羊膜間充質細胞1會繼續分化成軟骨細胞， 對患者的骨缺損部位起到修復作用。
從圖2—4分別為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到羊的骨缺損區域后，再分別 用抗人線粒體抗體免疫組織化學染色、用蘇木素-伊紅染色和用甲苯胺蘭染色后，得到的圖2 一4。從圖2中可以得出羊股骨缺損區域內存在人羊膜間充質細胞；從圖3和圖4中可以看
出移植了本發明的植有人羊膜間充質細胞的復合物后的羊的骨缺損區域內有新生軟骨細胞， 可以得出植有本發明的人羊膜間充質細胞的復合物可以治療羊的骨缺損。
從圖5 — 7分別為用本發明的移植治療骨缺損的復合物移植到骨缺損區域后，再分別用骨 橋素染色進行染色、用骨鈣素染色進行染色和用抗VIII因子進行染色后，得到的圖5 — 8。
從圖5可以看出成骨細胞分化成熟活躍；從圖6可以看出移植區有大量成熟成骨細胞， 新骨形成活躍；從圖7可以看出血管生成活躍。由此可以得出植有本發明的人羊膜間充 質細胞的復合物可以治療骨缺損。
利用上述方法可以制得本發明的用于移植治療骨缺損的復合物。
以上方法只是對本發明的解釋，不是對發明的限定，本發明所限定的范圍參見權利要求， 在不違背本發明的精神的情況下，本發明可以作任何形式的修改。
權利要求
1.一種用于移植治療骨缺損的復合物，其特征在于該復合物包括人羊膜間充質細胞(1)和醫用骨材料(2)，在每立方毫米的醫用骨材料中均勻地接種有1*105-106個人羊膜間充質細胞(1)。
2. 如權利要求1所述的用于移植治療骨缺損的復合物，其特征在于所述醫用骨材料(2)是具有若干個孔的骨醫用載體材料，它的孔徑為200—40(^m。
3. 如權利要求2所述的用于移植治療骨缺損的復合物，其特征在于所述醫用骨材料(2) 為羥基磷灰石或去細胞小牛骨。
4. 一種如權利要求1所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于(a) .將人羊膜間充質細胞(1)擴增到所需的數目；(b) .在室溫下，將上述人羊膜間充質細胞(I)均勻地接種到醫用骨材料(2)上，每 立方毫米的醫用骨材料中接種有1*105—106個人羊膜間充質細胞(1);(c) .在室溫下，將上述接種有人羊膜間充質細胞(1)的醫用骨材料(2)放置在培養 液(3)內平衡4個小時以上后，即得到用于移植治療骨缺損的復合物。
5. 如權利要求4所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于所述的 步驟(a)是將人羊膜間充質細胞(1)放置在培養液(3)中，在溫度為36.5-37.5'C、飽和 濕度、體積分數為5%的(:02培養箱中培養。每2—3天更換全部培養液(3)，并棄去未貼壁的 細胞，培養7 — 12天，待人羊膜間充質細胞(1)達到80%-90%融合時，將人羊膜間充質細胞(1)從培養液(3)中取出，用25g/L的胰酶消化。在消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消 化情況，待65%以上的人羊膜間充質細胞(1)的胞體回縮并變圓，即終止消化。然后重復上 述操作，將上述細胞分為若干份進行傳代接種培養，直至達到所需細胞數量。
6. 如權利要求5所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于將步驟 (b)中的接種有人羊膜間充質細胞(1)的醫用骨材料(2)放置在培養液(3)內平衡4個至8個小時后，即得到用于移植治療骨缺損的復合物。
7. 如權利要求4至6任一權利要求所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于所述培養液(3)為V。MEM: VF,2為1: 1的DMEM /F12培養液，上述每升培養液中還包括20 ug的堿性成纖維生長因子和20 ug的表皮生長因子。
8. 如權利要求7所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于所述醫 用骨材料(2)是具有若干個孔的骨醫用載體材料，它的孔徑為200—400pm，將人羊膜間充質細胞(1〉的單個細胞植入上述骨醫用載體材料的孔徑內。
9. 如權利要求8所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于所述醫 用骨材料(2)為羥基磷灰石或去細胞小牛骨。
10. 如權利要求4所述的用于移植治療骨缺損的復合物的制造方法，其特征在于所述 的室溫為15—28°C。
全文摘要
本發明涉及用于移植治療骨缺損的復合物及其制造方法，該復合物包括人羊膜間充質細胞和醫用骨材料，在每立方毫米的醫用骨材料中均勻地接種有1*10<sup>5</sup>-10<sup>6</sup>個人羊膜間充質細胞；該制造方法包括將人羊膜間充質細胞擴增到所需的數目，在室溫下，將上述細胞均勻地接種到醫用骨材料上；將上述接種有人羊膜間充質細胞的醫用骨材料放置在培養液內平衡4個小時以上后，即得到上述復合物，本發明利用人羊膜間充質細胞具有分化成軟骨細胞的能力，將人羊膜間充質細胞接種于醫用骨材料中制成復合物，人羊膜間充質細胞與現使用的骨髓間充質干細胞相比具有來源豐富、成活率高、取材方便、易于分離、低免疫原性和無細胞污染等優點，其擴增能力優于成人骨髓間充質干細胞。
文檔編號A61L27/38GK101628129SQ20091009130
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月18日 優先權日2009年8月18日
發明者劉艷軍, 吳亦芳, 張向利, 張紅霞, 曹克富, 李榮旗, 月 王, 王瑞蘭, 靜 肖, 范育紅, 郭麗麗 申請人:李榮旗